CN115249358A - 一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法及系统、计算机设备 - Google Patents

Abstract

本发明属于人工智能技术领域，公开一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，包括以下步骤：通过目标检测网络对巨噬细胞图片进行识别，获得巨噬细胞；根据获得的巨噬细胞，通过颜色识别算法定量计算碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比；对碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比进行统计分析，获得巨噬细胞内碳颗粒定量结果。本申请实施例基于深度学习网络算法和二值化方法实现了从识别巨噬细胞，到定量统计碳颗粒在巨噬细胞内占比的功能。本申请实施例还公开了一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测系统、计算机设备。

Description

一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法及系统、计算机设备

技术领域

本发明涉及人工智能技术领域，特别涉及一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，还涉及一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测系统，还涉及一种计算机设备。

背景技术

雾霾的频繁爆发引起了人们对大气细颗粒污染的广泛关注，其对人体健康的危害成为公共卫生领域的热点话题。找到定量大气细颗粒暴露的合理生物标志物是评估大气细颗危害的关键步骤，而碳颗粒是大气细颗粒的重要无机组成，容易沉积在肺泡巨噬细胞中，而且不易代谢，因此，碳颗粒在巨噬细胞内的沉积量是评估大气细颗粒内暴露量的潜在生物标志物。目前大多借用Image J和Photoshop等软件，通过人工计数的方法定量巨噬细胞内碳颗粒的暴露量，传统定量方法处理过程复杂并且繁琐，无疑浪费了大量的时间和人力资源，并且所获得的结果主观性强并且不稳定。

机器学习在生物医学影像识别领域中的作用逐渐展现，基于此，如何借助机器学习提出一种快速且高效识别巨噬细胞内碳颗粒的方法，是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明实施例提供了一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法及系统，以解决现有技术中通过人工计数的方法定量巨噬细胞内碳颗粒的暴露量的问题。为了对披露的实施例的一些方面有一个基本的理解，下面给出了简单的概括。该概括部分不是泛泛评述，也不是要确定关键/重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围。其唯一目的是用简单的形式呈现一些概念，以此作为后面的详细说明的序言。

根据本发明实施例的第一方面，提供了一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法。

在一个实施例中，一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，包括以下步骤：

通过目标检测网络对巨噬细胞图片进行识别，获得巨噬细胞；

根据获得的巨噬细胞，通过颜色识别算法定量计算碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比；

对碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比进行统计分析，获得巨噬细胞内碳颗粒定量结果。

可选地，所述通过目标检测网络对巨噬细胞图片进行识别，获得巨噬细胞的步骤，包括：

导入巨噬细胞图片；

采用特征提取网络进行巨噬细胞图片的特征提取；

通过区域生成网络提取巨噬细胞图片的感兴趣区域，生成候选框，获得巨噬细胞掩膜图片；

将巨噬细胞掩膜图片输入头部网络，头部网络包括分割网络、边框回归和区域分类三个分支，完成对边界框的分类和回归并且分割出掩膜结果，输出巨噬细胞掩膜图片特征数据；

对巨噬细胞掩膜图片特征数据进行实时分析，执行目标检测，获得巨噬细胞。

可选地，所述通过区域生成网络提取巨噬细胞图片的感兴趣区域，生成候选框的步骤，包括：

每张图片生成N个候选框，并将候选框映射到目标检测网络最后一层卷积的特征图上。

可选地，所述通过区域生成网络提取巨噬细胞图片的感兴趣区域，生成候选框的步骤，具体包括：

区域生成网络的滑动窗口在每张巨噬细胞图片中移动，每个特征像素对应的原始图像位置生成15个锚，大小为(8，16，32，64，132)，宽高比为(0.5,1,2)；

然后将锚输入到大小为1*1的回归类层中，确定类别和位置；

最后，用非极大值抑制算法调整锚的位置，最终选定的锚被认定为感兴趣区域的候选框。

可选地，所述根据得到的巨噬细胞，通过颜色识别算法定量计算碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比的步骤，包括：

将单个巨噬细胞图像依次进行图像分割和二值化处理，区分出碳颗粒和巨噬细胞；

将单个巨噬细胞的掩模进行处理，采用逐像素遍历的方法计算出巨噬细胞的像素占比，并定义为巨噬细胞的相对面积；

根据逐像素遍历的方法计算出碳颗粒的像素占比，并定义为碳颗粒的相对面积；

根据巨噬细胞和碳颗粒的相对面积计算出碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比。

可选地，所述将单个巨噬细胞图像依次进行图像分割和二值化处理的步骤，具体包括：

将图片分为若干小块区域，然后在局部区域内进行像素分析，将图片分为对比度高分辨区域和对比度低分辨率区域；

对于对比度高分辨区域，将图像中每个像素的坐标记录为(x,y)，以该像素为中心的一个w*w大小的窗口，该窗口内的像素灰度平均值为m(x,y)，标准差为s(x,y)，针对该像素的局部阈值T(x,y)：

T(x,y)＝m(x,y)[1+k(s(x,y)/R-1)]

其中R为设定值，k的取值范围为[0.2,0.5]，T(x,y)受m(x,y)和s(x,y)调整；

对于对比度低分辨率区域，将像素划分为0，然后采用如下公式计算：

T(x,y)＝m(x,y)[1+p^e-qm(x,y)+k(s(x,y)/R-1)]

p、q、k、e为设定值。

可选地，所述将单个巨噬细胞图像进行二值化处理的步骤，进一步包括：

利用阈值分割，得到一张二值化的掩模图像，其中值为1的像素定义为碳颗粒区域，值为0的像素区域定义为巨噬细胞区域。

可选地，所述对碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比进行统计分析的步骤，包括：

统计分析得到平均值、标准差、中位数、25％和75％四分位数。

根据本发明实施例的第二方面，提供了一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测系统。

在一个实施例中，一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测系统，包括：目标检测网络、定量计算模块和统计模块；其中，

目标检测网络，被配置为：对巨噬细胞图片进行识别，获得巨噬细胞；

定量计算模块，被配置为：根据获得的巨噬细胞，通过颜色识别算法定量计算碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比；

统计模块，被配置为：对碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比进行统计分析，获得巨噬细胞内碳颗粒定量结果。

根据本发明实施例的第三方面，提供了一种计算机设备。

在一些实施例中，所述计算机设备包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现上述方法的步骤。

本发明实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

基于深度学习网络算法和二值化方法实现了从识别巨噬细胞，到定量统计碳颗粒在巨噬细胞内占比的功能。

减少了依赖人工进行碳颗粒计数过程的复杂性，避免了人为造成的主观误差，更符合科学研究的严谨性。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

图1是根据一示例性实施例示出的一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法的流程图；

图2是根据一示例性实施例示出的一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测系统的原理示意图；

图3是根据一示例性实施例示出的计算机设备的结构示意图。

具体实施方式

以下描述和附图充分地示出本文的具体实施方案，以使本领域的技术人员能够实践它们。一些实施方案的部分和特征可以被包括在或替换其他实施方案的部分和特征。本文的实施方案的范围包括权利要求书的整个范围，以及权利要求书的所有可获得的等同物。本文中，术语“第一”、“第二”等仅被用来将一个元素与另一个元素区分开来，而不要求或者暗示这些元素之间存在任何实际的关系或者顺序。实际上第一元素也能够被称为第二元素，反之亦然。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的结构、装置或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种结构、装置或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的结构、装置或者设备中还存在另外的相同要素。本文中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

本文中的术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本文和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。在本文的描述中，除非另有规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

本文中，除非另有说明，术语“多个”表示两个或两个以上。

本文中，字符“/”表示前后对象是一种“或”的关系。例如，A/B表示：A或B。

本文中，术语“和/或”是一种描述对象的关联关系，表示可以存在三种关系。例如，A和/或B，表示：A或B，或，A和B这三种关系。

在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

图1示出了本发明的一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法的一个实施例。

在该实施例中，所述巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，包括以下步骤：

步骤S1，通过目标检测网络对巨噬细胞图片进行识别，获得巨噬细胞；

步骤S2，根据获得的巨噬细胞，通过颜色识别算法定量计算碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比；

步骤S3，对碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比进行统计分析，获得巨噬细胞内碳颗粒定量结果。

在一个实施例中，步骤S1，通过目标检测网络对巨噬细胞图片进行识别，获得巨噬细胞的步骤，包括：

步骤S11，导入巨噬细胞图片；

步骤S12，采用特征提取网络进行巨噬细胞图片的特征提取；

步骤S13，通过区域生成网络(RPN)提取巨噬细胞图片的感兴趣区域(RoIs)，生成特征图候选框，获得巨噬细胞掩膜图片；

步骤S14，将巨噬细胞掩膜图片输入头部网络，头部网络包括分割网络、边框回归和区域分类三个分支，完成对边界框的分类和回归并且分割出掩膜结果，输出特征数据；

步骤S15，对巨噬细胞掩膜图片特征数据进行实时分析，执行目标检测，获得巨噬细胞。

可选地，目标检测网络为Mask-RCNN网络。

本申请实施例的受试对象为光学显微镜下拍摄的包含染色良好、形态完整的巨噬细胞图片，每张图片都具有独特性。可选地，导入的巨噬细胞图片为.tif格式。

可选地，本申请实施例还包括对导入的巨噬细胞图片进行预处理的步骤，包括：原始图片保存为RGB格式，经过处理将图片分辨率调整为1024*800；该图片被保存并随之作为下一个阶段的输入，以备生成候选框。

可选地，步骤S12中，本申请实施例选用Resnet50骨干网络进行巨噬细胞图片的特征提取，获得低级的特征和较高级的特征，并更好的进行特征融合。使用ResNet50结构作为骨干网络，相比于原始的ResNet，可以提高1％-2％的目标检测精度，且推理速度基本保持不变。可选地，巨噬细胞相似度阈值可调。可选的，在检测之前，根据用户对提取巨噬细胞形态的要求选择阈值。根据所选阈值的不同，可设定巨噬细胞准确度识别范围，数值越低，可被识别为巨噬细胞的概率越大，反之越低。

可选地，步骤S13，通过区域生成网络提取巨噬细胞图片的感兴趣区域，生成候选框的步骤，具体包括：每张图片生成N个候选框，并将候选框映射到目标检测网络最后一层卷积的特征图(feature map)上。

可选地，步骤S13，通过区域生成网络提取巨噬细胞图片的感兴趣区域，生成候选框的步骤，具体包括：

区域生成网络的滑动窗口在每张巨噬细胞图片中移动，每个特征像素对应的原始图像位置生成15个锚，大小为(8，16，32，64，132)，宽高比为(0.5,1,2)；

然后将锚输入到大小为1*1的回归类层中，确定类别和位置；

最后，用非极大值抑制算法调整锚的位置，最终选定的锚被认定为感兴趣区域的特征图。

可选地，步骤S15，采用ROIAlign计算方法对巨噬细胞掩膜图片特征数据进行实时分析，执行目标检测，获得巨噬细胞。

在一个实施例中，步骤S2，根据得到的巨噬细胞，通过颜色识别算法定量计算碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比的步骤，包括：

步骤S21，将单个巨噬细胞图像依次进行图像分割和二值化处理，区分出碳颗粒和巨噬细胞；

步骤S22，将单个巨噬细胞的掩模进行处理，采用逐像素遍历的方法计算出巨噬细胞的像素占比，并定义为巨噬细胞的相对面积；

步骤S23，根据逐像素遍历的方法计算出碳颗粒的像素占比，并定义为碳颗粒的相对面积；

步骤S24，根据巨噬细胞和碳颗粒的相对面积计算出碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比。

可选地，步骤S21，将单个巨噬细胞图像依次进行图像分割和二值化处理的步骤，具体包括：

将图片分为若干小块区域，然后在局部区域内进行像素分析，将图片分为对比度高分辨区域和对比度低分辨率区域；

对于对比度高分辨区域，将图像中每个像素的坐标记录为(x,y)，以该像素为中心的一个w*w大小的窗口，该窗口内的像素灰度平均值为m(x,y)，标准差为s(x,y)，针对该像素的局部阈值T(x,y)：

T(x,y)＝m(x,y)[1+k(s(x,y)/R-1)]

其中R为设定值，k的取值范围为[0.2,0.5]，T(x,y)受m(x,y)和s(x,y)调整；

对于对比度低分辨率区域，将像素划分为0，然后采用如下公式计算：

T(x,y)＝m(x,y)[1+p^e-qm(x,y)+k(s(x,y)/R-1)]，

p、q、k、e为设定值。

例如，R设定为0.5，p设定为2，q设定为10，k设定为0.25，e设定为2.72。

可选地，所述将单个巨噬细胞图像进行二值化处理的步骤，进一步包括：

利用阈值分割，得到一张二值化的掩模图像，其中值为1的像素定义为碳颗粒区域，值为0的像素区域定义为巨噬细胞区域。

在一个实施例中，步骤S3，对碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比进行统计分析的步骤，包括：统计分析得到平均值、标准差、中位数、25％和75％四分位数。

平均值的计算方法为：X＝(X1+X2+X3+…+Xn)/n，n为图片中巨噬细胞个数，Xn为第n个巨噬细胞内碳颗粒面积占比。

方差的计算方法为：

中位数、四分位数计算方法：

把数值按照从小到大排序后，中位数把数据分为两个，各占50％，中间的数值即为中位数；四分位数则把所有数集分为两个50％，下四分位数(25％)是将前50％分成两个25％，上四分位数(75％)是将后50％，分成两个25％。本申请实施例将多种统计方法融合其中，用户可根据对结果的需求选择统计方式，增加了自由度和开放度，实现了数据的个性化处理。

本申请实施例公开了统计巨噬细胞内碳颗粒占比的方法。本发明基于深度学习网络Mask R-CNN算法和二值化方法实现了从识别巨噬细胞，到定量统计碳颗粒在巨噬细胞内占比的功能。本发明从用户的角度出发，联合多种统计统计方法，统计碳颗粒占比的平均值、标准差、中位数以及四分位数等多种参数，以供用户选择合适的统计方法。

在一个实施例中，如图2所示，提供了一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测系统，包括：目标检测网络、定量计算模块和统计模块；其中，目标检测网络，被配置为：对巨噬细胞图片进行识别，获得巨噬细胞；定量计算模块，被配置为：根据获得的巨噬细胞，通过颜色识别算法定量计算碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比；统计模块，被配置为：对碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比进行统计分析，获得巨噬细胞内碳颗粒定量结果。

本申请实施例中巨噬细胞内碳颗粒定量检测系统的工作原理与上述各实施例提供的巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法的工作原理相同，这里不再赘述。

在一个实施例中，提供了一种计算机设备，该计算机设备可以是服务器，其内部结构图可以如图3所示。该计算机设备包括通过系统总线连接的处理器、存储器和网络接口。其中，该计算机设备的处理器用于提供计算和控制能力。该计算机设备的存储器包括非易失性存储介质、内存储器。该非易失性存储介质存储有操作系统、计算机程序和数据库。该内存储器为非易失性存储介质中的操作系统和计算机程序的运行提供环境。该计算机设备的数据库用于存储静态信息和动态信息数据。该计算机设备的网络接口用于与外部的终端通过网络连接通信。该计算机程序被处理器执行时以实现上述方法实施例中的步骤。

本领域技术人员可以理解，图3中示出的结构，仅仅是与本发明方案相关的部分结构的框图，并不构成对本发明方案所应用于其上的计算机设备的限定，具体的计算机设备可以包括比图中所示更多或更少的部件，或者组合某些部件，或者具有不同的部件布置。

在一个实施例中，还提供了一种计算机设备，包括存储器和处理器，存储器中存储有计算机程序，该处理器执行计算机程序时实现上述方法实施例中的步骤。

在一个实施例中，提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现上述方法实施例中的步骤。

本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例方法中的全部或部分流程，是可以通过计算机程序来指令相关的硬件来完成，所述的计算机程序可存储于一非易失性计算机可读取存储介质中，该计算机程序在执行时，可包括如上述各方法的实施例的流程。其中，本发明所提供的各实施例中所使用的对存储器、存储、数据库或其它介质的任何引用，均可包括非易失性和易失性存储器中的至少一种。非易失性存储器可包括只读存储器(Read-Only Memory，ROM)、磁带、软盘、闪存或光存储器等。易失性存储器可包括随机存取存储器(Random Access Memory，RAM)或外部高速缓冲存储器。作为说明而非局限，RAM可以是多种形式，比如静态随机存取存储器(Static Random Access Memory，SRAM)或动态随机存取存储器(Dynamic Random Access Memory，DRAM)等。

本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (10)

1.一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

通过目标检测网络对巨噬细胞图片进行识别，获得巨噬细胞；

根据获得的巨噬细胞，通过颜色识别算法定量计算碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比；

对碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比进行统计分析，获得巨噬细胞内碳颗粒定量结果。

2.如权利要求1所述的一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，其特征在于，

所述通过目标检测网络对巨噬细胞图片进行识别，获得巨噬细胞的步骤，包括：

导入巨噬细胞图片；

采用特征提取网络进行巨噬细胞图片的特征提取；

通过区域生成网络提取巨噬细胞图片的感兴趣区域，生成候选框，获得巨噬细胞掩膜图片；

将巨噬细胞掩膜图片输入头部网络，头部网络包括分割网络、边框回归和区域分类三个分支，完成对边界框的分类和回归并且分割出掩膜结果，输出巨噬细胞掩膜图片特征数据；

对巨噬细胞掩膜图片特征数据进行实时分析，执行目标检测，获得巨噬细胞。

3.如权利要求2所述的一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，其特征在于，

所述通过区域生成网络提取巨噬细胞图片的感兴趣区域，生成候选框的步骤，包括：

每张图片生成N个候选框，并将候选框映射到目标检测网络最后一层卷积的特征图上。

4.如权利要求3所述的一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，其特征在于，

所述通过区域生成网络提取巨噬细胞图片的感兴趣区域，生成候选框的步骤，具体包括：

RPN网络的滑动窗口在每张巨噬细胞图片中移动，每个特征像素对应的原始图像位置生成15个锚，大小为(8，16，32，64，132)，宽高比为(0.5,1,2)；

然后将锚输入到大小为1*1的回归类层中，确定类别和位置；

最后，用非极大值抑制算法调整锚的位置，最终选定的锚被认定为感兴趣区域的候选框。

5.如权利要求1所述的一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，其特征在于，

所述根据得到的巨噬细胞，通过颜色识别算法定量计算碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比的步骤，包括：

将单个巨噬细胞图像依次进行图像分割和二值化处理，区分出碳颗粒和巨噬细胞；

将单个巨噬细胞的掩模进行处理，采用逐像素遍历的方法计算出巨噬细胞的像素占比，并定义为巨噬细胞的相对面积；

根据逐像素遍历的方法计算出碳颗粒的像素占比，并定义为碳颗粒的相对面积；

根据巨噬细胞和碳颗粒的相对面积计算出碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比。

6.如权利要求5所述的一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，其特征在于，

所述将单个巨噬细胞图像依次进行图像分割和二值化处理的步骤，具体包括：

将图片分为若干小块区域，然后在局部区域内进行像素分析，将图片分为对比度高分辨区域和对比度低分辨率区域；

对于对比度高分辨区域，将图像中每个像素的坐标记录为(x,y)，以该像素为中心的一个w*w大小的窗口，该窗口内的像素灰度平均值为m(x,y)，标准差为s(x,y)，针对该像素的局部阈值T(x,y)：

T(x,y)＝m(x,y)[1+k(s(x,y)/R-1)]

其中R为设定值，k的取值范围为[0.2,0.5]，T(x,y)受m(x,y)和s(x,y)调整；

对于对比度低分辨率区域，将像素划分为0，然后采用如下公式计算：

T(x,y)＝m(x,y)[1+p^e-qm(x,y)+k(s(x,y)/R-1)]，

p、q、k、e为设定值。

7.如权利要求6所述的一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，其特征在于，

所述将单个巨噬细胞图像进行二值化处理的步骤，进一步包括：

利用阈值分割，得到一张二值化的掩模图像，其中值为1的像素定义为碳颗粒区域，值为0的像素区域定义为巨噬细胞区域。

8.如权利要求1所述的一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测方法，其特征在于，

所述对碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比进行统计分析的步骤，包括：

统计分析得到平均值、标准差、中位数、25％和75％四分位数。

9.一种巨噬细胞内碳颗粒定量检测系统，其特征在于，包括：目标检测网络、定量计算模块和统计模块；其中，

目标检测网络，被配置为：对巨噬细胞图片进行识别，获得巨噬细胞；

定量计算模块，被配置为：根据获得的巨噬细胞，通过颜色识别算法定量计算碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比；

统计模块，被配置为：对碳颗粒在巨噬细胞内的面积占比进行统计分析，获得巨噬细胞内碳颗粒定量结果。

10.一种计算机设备，包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述计算机程序时实现权利要求1至8中任一项所述的方法的步骤。

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