CN115232860A - 家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库构建方法及试剂盒 - Google Patents
家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库构建方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因突变检测技术领域，公开了一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法和试剂盒。本发明所述构建方法和试剂盒基于多重PCR扩增子测序技术，涉及LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1四个单基因突变，以及家族性高胆固醇血症相关多基因位点12个位点：rs2479409；rs629301；rs1367117；rs4299376；rs1564348；rs1800562；rs3787354；rs11220462；rs8017377；rs6511720；rs429386；rs7412，能够兼容于多种测序平台，同时具有建库步骤简洁、成本节约和应用范围广等诸多优势。
Description
技术领域
本发明属于基因突变检测技术领域，具体涉及一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒。
背景技术
家族性高胆固醇血症(FH)是一种脂代谢疾病，其主要临床表现为血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平明显升高，皮肤/腱黄色瘤、角膜环等，由于 FH患者从出生就处于高血清LDL-C水平暴露状态，所以动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)风险明显升高。
家族性高胆固醇血症在人群中发病率为1/500，在早发心肌梗死人群中FH 的患病率高达23.6％。家族性高胆固醇大部分由遗传因素导致，其中包括单基因突变导致及多基因突变导致。单基因突变导致的家族性高胆固醇血症是由如下四个基因导致：LDLR、APOB、PCSK9、LDLRAP1，单基因家族性高胆固醇血症主要为显性遗传，少见隐性，包括两种，杂合型FH(HeFH)及纯和型FH(HoFH)，其中杂合型FH比较多见。在临床诊断为家族性高胆固醇血症的患者中，仅有约 40％能够检测到上述4个基因的致病或可能致病性变异，而对于80％经过临床诊断且上述4个基因检测阴性的患者，可采用多基因模型解释，该模型为12个单核苷酸多态性(SNP)，采用打分的方法解释。多基因导致的家族性高胆固醇血症并不遵循孟德尔遗传。对于家族性高胆固醇血症患者，只有单基因导致的疾病才需要家族级联筛查。
目前普遍应用的家族性高胆固醇血症检测方法主要为全外显子测序和液相捕获测序法。这两种方法均为探针捕获建库与二代测序结合的方法，该方法存在以下缺点：实验操作繁琐、检测周期长、成本高、GC富集区的存在等问题，难以满足临床检测要求。
目前也有已公开专利利用PCR方法来检测家族性高胆固醇血症基因突变，例如专利“一种遗传性家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒”，但是该专利只对单基因家族性高胆固醇血症进行检测，并不能解释四个单基因检测隐性的患者患病原因，其次其建库测序分析Q30百分比较低，意味着其对上述几个基因的覆盖度及均匀度较差，存在漏检的可能。
因此，本领域需要可用于同时检测单基因与多基因家族性高胆固醇血症的，且具有高灵敏度、高通量、低成本的方法和试剂盒。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒。
本发明所采用的技术方案为：一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法，包括如下步骤：
S1、第一轮多重PCR反应：包括T1反应管体系、T2反应管体系和T3反应管体系；所述T1反应管体系包括第一引物池和第一反应液；所述T2反应管体系包括第二引物池和第二反应液；所述T3反应管体系包括第三引物池和第三反应液；
所述第一引物池包括86对引物，86对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQID NO.1-SEQ ID NO.172所示；
所述第二引物池包括87对引物，87对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQID NO.173-SEQ ID NO.346所示；
所述第三引物池包括15对引物，15对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQID NO.347-SEQ ID NO.377所示；
S2、多重PCR反应合并：选取T1反应管体系运行PCR扩增反应，获得反应产物A；T2反应管体系运行PCR扩增反应，获得反应产物B；选取T3反应管体系运行PCR扩增反应，获得反应产物C；将上述反应产物A、反应产物B与反应产物C混合合并，获得合并产物；
S3、磁珠纯化合并产物；
S4、第二轮序列PCR反应、第二轮磁珠纯化及文库浓度测量与质检，完成文库构建。
作为优选地，所述T1反应管体系体积为10-12.5μL；
所述T2反应管体系体积为10-12.5μL；
所述T3反应管体系体积为1-5μL。
作为优选地，所述第二轮序列PCR反应体系体积为30-40μL。
作为优选地，所述多重PCR反应合并中，在制备合并产物时的反应产物A、反应产物B与反应产物C体积分别为11.5μL、13.5μL和5μL。
作为优选地，所述第一反应液包括Enhancer buffer NB缓冲液、Enhancer bufferM缓冲液、IGT-EM808酶混合液、gDNA和ddH2O；
所述第二反应液包括Enhancer buffer NB缓冲液、Enhancer buffer M缓冲液、IGT-EM808酶混合液、gDNA和ddH2O。
作为优选地，第三反应液包括IGT-GC Buffer缓冲液、IGT-GC Enhancer缓冲液、IGT-GC dNTP、Enhancer buffer NB缓冲液、IGT-GC Polymerase聚合酶、 gDNA和ddH2O。
作为优选地，所述磁珠纯化合并产物中，磁珠纯化处理流程为：
向合并产物加入磁珠，混匀、室温孵育、移除上清、加入YF buffer B混匀、二次室温孵育、移除上清、加入乙醇溶液，静置、加入Nuclease-free water，重悬磁珠，室温静置、吸取上清液，转移到新的PCR管内，管内上清液为合并后的多重PCR产物。
作为优选地，所述第二轮磁珠纯化处理流程为：向PCR反应体系内加入磁珠，混匀、室温孵育、移除上清、加入YF buffer B，混匀、二次室温孵育、静置、加入Nuclease-freewater或1×TE buffer(pH 8.0)，混匀、重悬磁珠、吸取上清液，转移到新的PCR管中，管中上清为制备好的多重PCR文库。
一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测试剂盒，其包含上述构建方法中的T1反应管体系、T2反应管体系和T3反应管体系。
本发明的有益效果为：
(一)本发明采用多重PCR扩增子建库技术，同时对单基因家族性高胆固醇血症4个致病基因(LDLR，APOB，PCSK9，LDLRAP1)全外显子区域及其上下游各20bp以及12个多基因致病位点(rs2479409；rs629301；rs1367117； rs4299376；rs1564348；rs1800562；rs3787354；rs11220462；rs8017377；rs6511720； rs429386；rs7412)进行捕获建库。
(二)本发明专利采用MultipSeq多重扩增子捕获技术，采用两步PCR扩增方法来完成目标区域扩增和建库。该技术能够在保证扩增均一性的前提下，对SNP、Indel等几千甚至上万个突变位点进行快速靶向线性扩增后，使用主流测序平台进行测序与深度分析。
(三)试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构建，具有文库构建周期短，比对率高，均一性好，重复性好，操作简便等优点，此外，该发明还可以采用多种样本进行文库构建，如唾液gDNA，血液gDNA等。
(四)上述该检测文库的构建方法，将整个流程简化，降低人力成本，降低检测数据量，降低成本。
附图说明：
图1为文库质量检测中的文库样本使用Qsep400全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度测量示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例：
本发明专利采用MμLtipSeq多重扩增子捕获技术，采用两步PCR扩增方法来完成目标区域扩增和建库。该技术能够在保证扩增均一性的前提下，对SNP、 Indel等几千甚至上万个突变位点进行快速靶向线性扩增后，使用主流测序平台进行测序与深度分析。
本发明包含多个扩增子，由3个反应管组成，分别为T1，T2，T3(3个)。试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构建，具有文库构建周期短，比对率高，均一性好，重复性好，操作简便等优点，此外，该发明还可以采用多种样本进行文库构建，如唾液gDNA，血液gDNA等。
本试剂盒文库构建流程共分为几个大步骤，分别为第1轮多重PCR反应，产物合并，磁珠纯化合并产物，第二轮接头序列PCR反应，磁珠纯化，浓度测量与质检。
一、第一轮多重PCR反应
(1)多重PCR反应体系
第一轮多重PCR反应分为3个反应管，使用的多重引物分别为Primer pool T1，Primer pool T2，Primer pool T3。3个primer pool反应管内的其他试剂相同。
T1和T2反应管体系(30μL)：
备注：gDNA的起始量为50ng/管；DNA的浓度为Qubit(Life Technologies)的定量结果。
(2)多重PCR反应条件
T1/T2运行PCR仪程序：热盖105℃
95℃for 3min 30s、98℃for 20s，循环18次；60℃for 4min，72℃for 5min。
T3运行PCR仪程序：热盖105℃
95℃for 3min 30s、98℃for 20s，循环20次；60℃for 2min、72℃for 5min。
二、第1轮PCR反应产物合并
第1轮PCR反应结束后，3个反应管的PCR产物按照下表进行合并，总体积为30μL。
三、磁珠纯化合并产物
(1)向30μL PCR合并产物加入27μL室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；
(2)室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
(3)彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入50μL YF buffer B用移液器轻缓吸打混匀20次；
(4)室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
(5)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s；
(6)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μL移液器移除底部残留乙醇溶液)；
(7)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
(8)将PCR管从磁力架取下，加入24μL Nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
(9)将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；
(10)用移液器吸取13.5μL上清液，转移到新的200μL PCR管内，管内上清液为合并后的多重PCR产物。
四、第2轮接头序列PCR反应
(1)反应体系
| Reagent(组分) | Volume(体积，μL) |
| PCR product mixture | 13.5 |
| Enhancer buffer M | 2.5 |
| ddH<sub>2</sub>O | 2 |
| IGT-I5 Index(10uM) | 1 |
| IGT-I7 Index(10uM) | 1 |
| IGT-EM808polymerase mixture | 10 |
备注：PCR product mixture为上一步纯化后的多重PCR产物。
(2)反应条件
运行PCR仪程序：热盖105℃
95℃for 3min 30s、98℃for 20s，循环9次；60℃for 1min、72℃for 5min。
五、第2轮磁珠纯化
(1)向30μL PCR反应体系内加入27μL室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；
(2)室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
(3)彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入50μL YF buffer B，用移液器轻缓吸打混匀20次；
(4)室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
(5)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s；
(6)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；
(7)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
(8)将离心管从磁力架取下，加入24μL Nuclease-free water或1×TE buffer(pH 8.0)，用移液器轻缓吸打混匀20次，重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
(9)将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；
(10)用移液器吸取20μL上清液，转移到新的PCR管中，管中上清为制备好的多重PCR文库。
六、文库定量
取2μl文库使用Qubit 3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度。
七、文库质量检测
如图1所示，取1μl文库样本使用Qsep400全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度测量。其中，横坐标为时间，纵坐标为相对荧光单位，即为采集到的信号强度。
T1引物池引物序列列表：
T2引物池引物序列列表：
T3引物池引物序列列表：
实验例
1、检测样本
所检测的样本来源于某志愿者的血液。
2、检测方法
DNA提取：按照常规方法提取待测样本的DNA作为模板
PCR扩增：
第一轮扩增反应体系同上文中所述第一轮PCR反应扩增体系。
第一轮PCR反应扩增条件同上文所述第一轮PCR反应扩增条件。
第一轮PCR扩增后产物纯化步骤同上文所述第一轮PCR扩增后产物纯化。
第一轮PCR反应之后3管PCR产物合并如上文所述第一轮PCR产物合并。
第二轮PCR扩增体系同上文所述第二轮PCR反应扩增体系。
第二轮PCR反应扩增条件同上文所述第二轮PCR反应扩增条件。
第二轮PCR扩增后产物纯化步骤同上文所述第一轮PCR扩增后产物纯化。
对第二轮纯化后的文库进行定量，如上文所述文库定量步骤。
对第二轮纯化后的文库进行质量检测，如上文所述文库质量检测。文库靶片段分布区间在280bp-420bp之间。
3、检测结果
使用本试剂盒构建出的合格文库，在illumina公司的Nova 6000 (NEXTSeq550)测序平台上的实测数据如下，将文库上机测序，并进行生物信息学分析。首先对测序数据进行质量评估，对经过评估后的测序数据量进行统计，并进行参考序列比对和depth数据统计，最终结果如下表所示：
备注：Raw base(Mb)：测序原始数据量大小
QCrate(％)：质控率
Total reads mapping rate(％)：总读长匹配效率
Total reads capture rate(％)：总读长捕获效率
Coverage rate(％)：覆盖度
Target mean depth：目标区域平均测序深度
T 30X coverage rate(％)：测序深度30X以上覆盖度
T 20X coverage rate(％)：测序深度30X以上覆盖度
采用上述方法对全外显子测序阳性的2例样本进行测序，验证该方法准确性。样本检测结果如下表所示：
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 奥美
<120> 家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库构建方法及试剂盒
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<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P9 上游引物
<400> 17
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<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P9 下游引物
<400> 18
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<210> 19
<211> 19
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> T1P10 上游引物
<400> 19
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<220>
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<400> 20
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<210> 21
<211> 17
<212> DNA
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<222> (1)..(17)
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<400> 21
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<211> 22
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> T1P16 下游引物
<400> 32
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<400> 42
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<222> (1)..(22)
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<400> 52
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<211> 22
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<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P31 下游引物
<400> 62
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<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
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<400> 63
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> T1P33 下游引物
<400> 66
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<220>
<221> misc_feature
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<211> 18
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> T1P34 下游引物
<400> 68
ggacccgtct ctgggtga 18
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
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<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P36 下游引物
<400> 72
ccatgtttga ggattgtgtc acg 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P37 上游引物
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P37 下游引物
<400> 74
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<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> T1P38 上游引物
<400> 75
aggtgtggct gtcaggaca 19
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P38 下游引物
<400> 76
tctcgatatt cacgatcacg gc 22
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> T1P39 上游引物
<400> 77
catggcgagg ctgaggt 17
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> T1P39 下游引物
<400> 78
ggatctcgct ttgttgctca 20
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T1P40 上游引物
<400> 79
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<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P40 下游引物
<400> 80
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<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> T1P41 上游引物
<400> 81
tgcactttgt atattggttg aaactgt 27
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T1P41 下游引物
<400> 82
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<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P42 上游引物
<400> 83
ctagaggttt tgctgtgcca ga 22
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T1P42 下游引物
<400> 84
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<210> 85
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> T1P43 上游引物
<400> 85
ctgtgctatg tgaaagttca attgga 26
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> T1P43 下游引物
<400> 86
actgcaagat ttttcagacc aactc 25
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T1P44 上游引物
<400> 87
cttttccatc tggatcggta agga 24
<210> 88
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T1P44 下游引物
<400> 88
ccatcaatac attatggccc ttcg 24
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> T1P45 上游引物
<400> 89
gggatataat cactgaagat tgtgttgatc 30
<210> 90
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> T1P45 下游引物
<400> 90
gatgtaatct cgatgtatag ggaactgt 28
<210> 91
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> T1P46 上游引物
<400> 91
ggactttcga atatacctgg gacag 25
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T1P46 下游引物
<400> 92
ctgtaccagg aactgttgac tcag 24
<210> 93
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T1P47 上游引物
<400> 93
tgttctgcag atttcttctc agct 24
<210> 94
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> T1P47 下游引物
<400> 94
tctctctgtt tagtcctctc cagat 25
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P48 上游引物
<400> 95
ccaattctcc actcgctctt gg 22
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> T1P48 下游引物
<400> 96
ctcatctgtt tttctgcttt caggg 25
<210> 97
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> T1P49 上游引物
<400> 97
ctgaagtcct tcatatttgc catcttc 27
<210> 98
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> T1P49 下游引物
<400> 98
tctggttagg atagaattct cccagt 26
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P50 上游引物
<400> 99
caagtggcat tatacacggg aga 23
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P50 下游引物
<400> 100
gagataaccg tgcctgaatc tca 23
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P51 上游引物
<400> 101
tggtaggttg agggcaaatg atg 23
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P51 下游引物
<400> 102
gcatcttcgt gtttcaactg cc 22
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P52 上游引物
<400> 103
gtcaaggtgt gccttttctt gg 22
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P52 下游引物
<400> 104
gaacatacaa gcaaagccac cc 22
<210> 105
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> T1P53 上游引物
<400> 105
caaggttcca gatatcatca attttgga 28
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P53 下游引物
<400> 106
cttcaatgct gtactctacc gct 23
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T1P54 上游引物
<400> 107
gcttttgtgg ttgttgccac t 21
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> T1P54 下游引物
<400> 108
gtcatcacac tgaataccaa tgctg 25
<210> 109
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> T1P55 上游引物
<400> 109
gcttgagatt tctagggaca tgaagg 26
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P55 下游引物
<400> 110
agctgaaaaa tctcacgacg agc 23
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> T1P56 上游引物
<400> 111
tcaaaggatt tgatgctctg actga 25
<210> 112
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> T1P56 下游引物
<400> 112
tcctttaaca attcctgaaa tgcgtc 26
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P57 上游引物
<400> 113
gaacctagca cttacttgcc aac 23
<210> 114
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P57 下游引物
<400> 114
aagggaaggc agagtttact gg 22
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T1P58 上游引物
<400> 115
gagggagcca gattcataaa cca 23
<210> 116
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T1P58 下游引物
<400> 116
actggacttc tctagtcagg ct 22
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P1 上游引物
<400> 117
aggaatggga tagctggaag gt 22
<210> 118
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_recomb
<222> (1)..(22)
<223> T2P1 下游引物
<400> 118
actcttccat gctcctcctt ct 22
<210> 119
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> T2P2 上游引物
<400> 119
tctggtggct cacagcaag 19
<210> 120
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> T2P2 下游引物
<400> 120
acagggaggg ggcaatct 18
<210> 121
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P3 上游引物
<400> 121
cctaaagtct acctgctgca gt 22
<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P3 下游引物
<400> 122
tcagggtttc caatcctttc cc 22
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P4 上游引物
<400> 123
tcacaaaagg gatggaggac ag 22
<210> 124
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P4 下游引物
<400> 124
tctcctctgg actctttgga gt 22
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T2P5 上游引物
<400> 125
ccgttccatc atcatcctct ctc 23
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T2P5 下游引物
<400> 126
ggaaatccac agggatctag ctc 23
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P6 上游引物
<400> 127
gggtttctta ctgcctcagg aa 22
<210> 128
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P6 下游引物
<400> 128
ggttctgcct gatagcatga gt 22
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T2P7 上游引物
<400> 129
gatcagcttg gaactgtgat cct 23
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T2P7 下游引物
<400> 130
agactaacct gtctcgcttt tcc 23
<210> 131
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P8 上游引物
<400> 131
aagaggtggg tcagtttcga ac 22
<210> 132
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P8 下游引物
<400> 132
ctagtgggtg tcattgcaag gt 22
<210> 133
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P9 上游引物
<400> 133
acagcctccc atttactgat gg 22
<210> 134
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P9 下游引物
<400> 134
atgggcaata gcttccagaa gg 22
<210> 135
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T2P10 上游引物
<400> 135
cagggctttc taatctccag agtc 24
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P10 下游引物
<400> 136
ggttccatgt ttgtttccag cc 22
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> T2P11 上游引物
<400> 137
cccagggaag ggaaacaagg 20
<210> 138
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> T2P11 下游引物
<400> 138
ttcctcccct cagggcaa 18
<210> 139
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P12 上游引物
<400> 139
gagacatcag tccactggat gg 22
<210> 140
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P12 下游引物
<400> 140
cttgtctcaa gggaggttgg ag 22
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P13 上游引物
<400> 141
tcagctcctg aatcaggtcg a 21
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P13 下游引物
<400> 142
aggactcctg cacagtacag t 21
<210> 143
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> T2P14 上游引物
<400> 143
gctgcccctc tgtgttctc 19
<210> 144
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P14 下游引物
<400> 144
ctctggggtc tgacttggat c 21
<210> 145
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> T2P15 上游引物
<400> 145
ggggtccaag ccctaaagc 19
<210> 146
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> T2P15 下游引物
<400> 146
tctgcccaga agaggcca 18
<210> 147
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> T2P16 上游引物
<400> 147
gccatctcct ccccaggtt 19
<210> 148
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P16 下游引物
<400> 148
cacagggatt atcatggggc g 21
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> T2P17 上游引物
<400> 149
tagggaaggg ctagcctgtg 20
<210> 150
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> T2P17 下游引物
<400> 150
tgcagtcttg cccccgg 17
<210> 151
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P18 上游引物
<400> 151
gaaaccaact cagagaggtg ca 22
<210> 152
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P18 下游引物
<400> 152
tcctgctcct aatccctttc ca 22
<210> 153
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> T2P19 上游引物
<400> 153
aaatcatccc cagccctgac 20
<210> 154
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P19 下游引物
<400> 154
gtcatgaatg ggcaagtctg tg 22
<210> 155
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P20 上游引物
<400> 155
ccttgtgcct tctagggctc t 21
<210> 156
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> T2P20 下游引物
<400> 156
agcaggacac tccccaagc 19
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> T2P21 上游引物
<400> 157
gcccagcaaa ggcttttgag 20
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P21 下游引物
<400> 158
tggaggggtc tctggttagt g 21
<210> 159
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> T2P22 上游引物
<400> 159
tacttgttgc tggcgctga 19
<210> 160
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P22 下游引物
<400> 160
tgaggggatg catagaaagt gc 22
<210> 161
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P23 上游引物
<400> 161
cagtgaagaa gagtctggag tc 22
<210> 162
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T2P23 下游引物
<400> 162
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<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P24 上游引物
<400> 163
ggttctcaga ctcctggctt g 21
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P24 下游引物
<400> 164
tgctaccttc tatgactgtg cc 22
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P25 上游引物
<400> 165
agcttctgca gctgcttctt g 21
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P25 下游引物
<400> 166
agcaagtgtg tgaggacttg ac 22
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> T2P26 上游引物
<400> 167
tctcaagcct tgcttgctga 20
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<211> 19
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> T2P26 下游引物
<400> 168
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> T2P27 下游引物
<400> 170
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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<400> 171
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<210> 172
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
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<400> 172
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> T2P29 上游引物
<400> 173
cccttgccct gcatgct 17
<210> 174
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> T2P29 下游引物
<400> 174
tctgccaccc tcccctg 17
<210> 175
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> T2P30 上游引物
<400> 175
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<210> 176
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> T2P30 下游引物
<400> 176
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<210> 177
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P31 上游引物
<400> 177
tagtcagtgt gctccttgct tg 22
<210> 178
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T2P31 下游引物
<400> 178
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<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> T2P32 上游引物
<400> 179
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<210> 180
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> T2P32 下游引物
<400> 180
cagaagatgc ggcgggac 18
<210> 181
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P33 上游引物
<400> 181
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<210> 182
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P33 下游引物
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<210> 183
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P34 上游引物
<400> 183
gtcttgggtc tgcttgtact gt 22
<210> 184
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P34 下游引物
<400> 184
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<210> 185
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P35 上游引物
<400> 185
tgcagagctt tcttctcctt gg 22
<210> 186
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P35 下游引物
<400> 186
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<210> 187
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P36 上游引物
<400> 187
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<210> 188
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P36 下游引物
<400> 188
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<210> 189
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P37 上游引物
<400> 189
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<210> 190
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T2P37 下游引物
<400> 190
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<210> 191
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
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<210> 192
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
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<400> 193
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<210> 194
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
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<210> 197
<211> 23
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T2P41 上游引物
<400> 197
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<210> 198
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> T2P41 下游引物
<400> 198
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<210> 199
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
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<210> 200
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
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<400> 200
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<210> 201
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P43 上游引物
<400> 201
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<210> 202
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P43 下游引物
<400> 202
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<210> 203
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P44 上游引物
<400> 203
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<210> 204
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P44 下游引物
<400> 204
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<210> 205
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P45 上游引物
<400> 205
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<210> 206
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P45 下游引物
<400> 206
agagggagaa ggaagggaga ag 22
<210> 207
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P46 上游引物
<400> 207
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<210> 208
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P46 下游引物
<400> 208
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<210> 209
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P47 上游引物
<400> 209
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<210> 210
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P47 下游引物
<400> 210
ctcttgagca tggtgctagg tt 22
<210> 211
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T2P48 上游引物
<400> 211
cgtgtgttgt gtgtgtctaa cac 23
<210> 212
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T2P48 下游引物
<400> 212
gagaaagagt tagccattcg tgc 23
<210> 213
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> T2P49 上游引物
<400> 213
cagcagccgg cctctc 16
<210> 214
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> T2P49 下游引物
<400> 214
aggagggccc tgcgg 15
<210> 215
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P50 上游引物
<400> 215
gcagtgtgca tttgggaagt tc 22
<210> 216
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T2P50 下游引物
<400> 216
caagactgta cattgctccc tgg 23
<210> 217
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_
<222> (1)..(22)
<223> T2P51 上游引物
<400> 217
agtagattga gctgcagcct ga 22
<210> 218
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T2P51 下游引物
<400> 218
cagtacataa actccaaggc gacc 24
<210> 219
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T2P52 上游引物
<400> 219
ctcaccctcc atttcttgat cact 24
<210> 220
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> T2P52 下游引物
<400> 220
gcaaagatgg agattaggga gca 23
<210> 221
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P53 上游引物
<400> 221
cctgcttgag gtctctttgt gt 22
<210> 222
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> T2P53 下游引物
<400> 222
gtcttagatt ttctgcacat gggc 24
<210> 223
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P54 上游引物
<400> 223
agccctgggt aatagacatg ga 22
<210> 224
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P54 下游引物
<400> 224
tggagggaag acagggattc tt 22
<210> 225
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P55 上游引物
<400> 225
atcatggcat ctgcagagat cc 22
<210> 226
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P55 下游引物
<400> 226
aaggagtgta ggatggagga gt 22
<210> 227
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> T2P56 上游引物
<400> 227
tgtactgctg aattccggga ct 22
<210> 228
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> T2P56 下游引物
<400> 228
ttccccacgc ctggtcttta t 21
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> T2P57 上游引物
<400> 229
ccactcccag ggtcttggat 20
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> T2P57 下游引物
<400> 230
agagggtgcg gtacggtaag 20
<210> 231
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> T3P1 上游引物
<400> 231
gcaggaggca aggctat 17
<210> 232
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> T3P1 下游引物
<400> 232
ttggcctggg ggagca 16
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> T3P2 上游引物
<400> 233
gagtgaaaat ggtcccgaat 20
<210> 234
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> T3P2 下游引物
<400> 234
tacctcccca cactgatg 18
<210> 235
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> T3P3 上游引物
<400> 235
tgttcccaca gcctcc 16
<210> 236
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> T3P3 下游引物
<400> 236
gaagggcctg gcccaga 17
Claims (9)
1.一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、第一轮多重PCR反应：包括T1反应管体系、T2反应管体系和T3反应管体系；所述T1反应管体系包括第一引物池和第一反应液；所述T2反应管体系包括第二引物池和第二反应液；所述T3反应管体系包括第三引物池和第三反应液；
所述第一引物池包括86对引物，86对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.172所示；
所述第二引物池包括87对引物，87对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.173-SEQ ID NO.346所示；
所述第三引物池包括15对引物，15对引物的上下游引物的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.347-SEQ ID NO.377所示；
S2、多重PCR反应合并：选取T1反应管体系运行PCR扩增反应，获得反应产物A；T2反应管体系运行PCR扩增反应，获得反应产物B；选取T3反应管体系运行PCR扩增反应，获得反应产物C；将上述反应产物A、反应产物B与反应产物C混合合并，获得合并产物；
S3、磁珠纯化合并产物；
S4、第二轮序列PCR反应、第二轮磁珠纯化及文库浓度测量与质检，完成文库构建。
2.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述T1反应管体系体积为10-12.5μL；
所述T2反应管体系体积为10-12.5μL；
所述T3反应管体系体积为1-5μL。
3.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述第二轮序列PCR反应体系体积为30-40μL。
4.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述多重PCR反应合并中，在制备合并产物时的反应产物A、反应产物B与反应产物C体积分别为11.5μL、13.5μL和5μL。
5.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述第一反应液包括Enhancer buffer NB缓冲液、Enhancer buffer M缓冲液、IGT-EM808酶混合液、gDNA和ddH2O；
所述第二反应液包括Enhancer buffer NB缓冲液、Enhancer buffer M缓冲液、IGT-EM808酶混合液、gDNA和ddH2O。
6.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法，其特征在于，第三反应液包括IGT-GC Buffer缓冲液、IGT-GC Enhancer缓冲液、IGT-GC dNTP、Enhancer buffer NB缓冲液、IGT-GC Polymerase聚合酶、gDNA和ddH2O。
7.根据权利要求1所述的家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述磁珠纯化合并产物中，磁珠纯化处理流程为：
向合并产物加入磁珠，混匀、室温孵育、移除上清、加入YF buffer B混匀、二次室温孵育、移除上清、加入乙醇溶液，静置、加入Nuclease-free water，重悬磁珠，室温静置、吸取上清液，转移到新的PCR管内，管内上清液为合并后的多重PCR产物。
8.根据权利要求1所述的一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述第二轮磁珠纯化处理流程为：向PCR反应体系内加入磁珠，混匀、室温孵育、移除上清、加入YF buffer B，混匀、二次室温孵育、静置、加入Nuclease-free water或1×TE buffer(pH 8.0)，混匀、重悬磁珠、吸取上清液，转移到新的PCR管中，管中上清为制备好的多重PCR文库。
9.一种家族性高胆固醇血症的通用基因检测试剂盒，其特征在于，其包含上述权利要求1-8任一所述的构建方法中的T1反应管体系、T2反应管体系和T3反应管体系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210419120.XA CN115232860A (zh) | 2022-04-20 | 2022-04-20 | 家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库构建方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210419120.XA CN115232860A (zh) | 2022-04-20 | 2022-04-20 | 家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库构建方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115232860A true CN115232860A (zh) | 2022-10-25 |
Family
ID=83668352
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210419120.XA Pending CN115232860A (zh) | 2022-04-20 | 2022-04-20 | 家族性高胆固醇血症的通用基因检测文库构建方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115232860A (zh) |
-
2022
- 2022-04-20 CN CN202210419120.XA patent/CN115232860A/zh active Pending
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