CN115216447A - 一种器官芯片的在线光透明试剂及透明方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于器官芯片、生物医学工程、组织光学技术领域，更具体地，涉及一种器官芯片的在线光透明试剂及透明方法。本发明提供的一种适用于器官芯片的在线光透明试剂，通过在该试剂中引入碘克沙醇溶液以及合适浓度的用于调节器官芯片内渗透压和/或维持器官芯片生理功能的金属离子，使得该光透明试剂能在透明化器官芯片的同时不影响器官芯片的功能，有助于生物医学成像观察，并能够高精度大通量地获取器官芯片的精细结构信息。

Description

一种器官芯片的在线光透明试剂及透明方法
技术领域
本发明属于器官芯片、生物医学工程、组织光学技术领域，更具体地，涉及一种器官芯片的在线光透明试剂及透明方法。
背景技术
器官芯片是通过细胞在体外芯片中进行培养，实现模拟生物体器官功能的一项新兴科学技术。通过巧妙的仿生设计，器官芯片可以在一定程度上模拟真实器官的形态和功能，可以为医学、药学和生命科学研究提供与真实生物体相仿的模型，为药物研发和筛选、疾病模型构建等研究提供替代动物和临床实验的数据。当前已有多种器官芯片被发展出来，并已被应用到具体临床研究中。
对器官芯片的研究和发展离不开对芯片中人工微器官的精准三维测量。传统医学影像技术如CT、MRI等可以实现对真实器官的三维成像测量，但是这些方法的分辨率太低，无法应用到微型化芯片上的成像测量中。光学显微成像技术为高分辨地获取组织器官的结构信息提供了重要手段。要获取生物组织三维结构信息，传统的方法多采用组织切片的方式，先将样本切成几微米至几十微米的薄片，再通过荧光显微镜获得细胞乃至亚细胞分辨率的图像，但是这种方法容易导致部分结构信息的丢失，且费时费力，通量极低，不能满足器官芯片高通量培养观察的需求。并且部分器官芯片中存在大量非生物组织的结构，这种切片方法显然不太适用。另一种方法则是利用光学切片显微镜，如激光共聚焦扫描显微镜、双光子显微镜和光片照明荧光显微镜等，或是其他断层成像技术如OCT等获取目标的精细结构信息。
然而，器官芯片具有多层复杂结构，其中培养的人工微器官往往也具有一定厚度，由于各组分之间折射率不匹配，使得光在样本中的传播路线朝各个方向偏移，表现出强烈的散射倾向，从而限制了上述光学成像系统的成像深度，进而导致组织的成像质量随深度的增加而逐渐降低，增加了对器官芯片高质量成像的难度。
近年兴起的组织光透明技术通过多种物理、化学的策略均衡样本各成分的折射率，旨在减少样本中的光散射现象，提高样本透明度，让样本变得对光“透明”，但现有的方法多用于离体的真实组织或器官，或是斑马鱼胚胎等本身便于观察的样本。
对于器官芯片而言，由于它们对培养环境极其敏感，因此尚缺乏适宜的在线透明方法，无法进行长期活体跟踪观测。总的来说，现有的方法对器官芯片进行高分辨率高通量观测时，均需要利用固定液将样本固定，采取多种有机或无机试剂处理，无法应用于活体在线观察。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种器官芯片的在线光透明试剂及透明方法，通过在光透明试剂中引入合适浓度范围的金属离子，用于调节器官芯片渗透压以及维持器官芯片生理功能，解决了现有技术无法对器官芯片进行长期活体在线透明和跟踪观测等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种器官芯片的在线光透明试剂，其包含用于培养所述器官芯片的培养液，还包括碘克沙醇，所述碘克沙醇在该透明试剂中的质量百分数为10％-35％；
该透明试剂中还含有用于调节器官芯片渗透压和/或维持器官芯片生理功能的金属离子；所述金属离子的总浓度范围为50-150mM。
优选地，所述金属离子为钾离子、钙离子、镁离子、钠离子和锌离子中的一种或多种。
优选地，该透明试剂中钾离子的浓度范围1-4mM；钙离子的浓度范围0.3-0.9mM；镁离子的浓度范围0.3-0.5mM，锌离子的浓度范围为0-6μM，钠离子的浓度范围为50-120mM。
优选地，所述培养液为DMEM培养基、F12培养基、MEM培养基、RPMI1640培养基或以上培养基的衍生培养基。
优选地，所述器官芯片为心脏器官芯片，所述碘克沙醇在该透明试剂中的质量百分数为24％-26.1％；该透明试剂中钙离子浓度为0.75-0.85mM，钾离子浓度为3.45-3.55mM；镁离子浓度为0.35-0.45mM，钠离子的浓度为55-100mM。
优选地，所述器官芯片为类脑器官芯片，所述碘克沙醇在该透明试剂中的质量百分数为17.1％-24％；该透明试剂中钙离子浓度为0.35-0.45mM，钾离子浓度为1.95-2.05mM，镁离子浓度为0.35-0.45mM，锌离子浓度为4.5-5.5μM，钠离子的浓度为50-100mM。
优选地，所述器官芯片为肿瘤芯片，所述碘克沙醇在该透明试剂中的质量百分数为27.3％-33.3％，该透明试剂中钙离子浓度为0.35-0.45mM，钾离子浓度为1.95-2.05mM，镁离子浓度为0.35-0.45mM，钠离子的浓度为70-80mM。
按照本发明的另一个方面，提供了一种利用所述的光透明试剂进行器官芯片的在线光透明的方法，包括如下步骤：
(1)对器官芯片进行排气泡处理后，以2-200μL/min的速度向所述器官芯片中灌注如权利要求1至7任一项所述的光透明试剂，持续灌注0.4-0.6小时；或将所述器官芯片中的人工微组织浸泡在所述光透明试剂中0.8-1.2小时；使得所述器官芯片透明，得到透明处理后的器官芯片；
(2)将步骤(1)得到的透明处理后的器官芯片在显微镜下进行在线观察。
优选地，所述的方法，还包括步骤：
(3)观察完毕后，将培养液以2-200μL/min的速度向所述器官芯片中灌注，持续灌注0.4-0.6小时；或将所述器官芯片中的人工微组织重新浸泡在培养液中，得到恢复后的器官芯片。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种适用于器官芯片的在线光透明试剂，通过在该试剂中引入碘克沙醇以及合适浓度的用于调节器官芯片渗透压和/或维持器官芯片生理功能的金属离子，其中碘克沙醇用于匹配细胞质与培养环境的折射率；合适的金属离子种类和浓度范围，使得该光透明试剂能在透明化器官芯片的同时不影响器官芯片的功能，有助于生物医学成像观察，高精度大通量地获取器官芯片的精细结构信息。
(2)利用本发明光透明试剂进行器官芯片的活体在线光透明方法简单，使用的材料均简单易得，准备流程所需的时间均很少，有利于对器官芯片的即时观察。且该方法操作简单，成本低廉，且兼容多种荧光标记及成像方法，为器官芯片的精准测量提供了便利。
(3)本发明器官芯片的在线光透明试剂及对应的透明方法弥补了现有技术器官芯片在线活体透明方法的缺失。本发明透明方法可与多种成像技术比如共聚焦成像、双光子成像或光片荧光显微成像等有效结合，为获取人工微器官的三维结构信息提供了高分辨、高通量的解决方案。
附图说明
图1为本发明器官芯片的在线光透明试剂的组成示意图。
图2为本发明一些实施例中器官芯片的层状结构示意图。
图3为本发明一些实施例中第一图案层即培养层的芯片图案。
图4为本发明一些实施例中第二图案层即观察层的图案。
图5为本发明一些实施例中器官芯片的整体结构示意图。
图6为本发明实施例1肿瘤器官芯片在线透明前后肿瘤微器官的荧光对比图。
图7为本发明实施例2器官芯片在线透明前后，适配芯片上肿瘤微器官的对比图。
图8为本发明实施例3心脏器官芯片在线透明前后心脏微器官的荧光对比图。
在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：
1-透明基底；2-第一图案层；21-微流控主通道；22-第一通孔；23-中间通道；3-第二图案层；31-第二通孔；4-透明盖板层；5-主通道进液孔；6-主通道出液孔；7-中间通道进液孔；8-中间通道出液孔；9-连接层；10-凸台。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种适用于器官芯片的在线光透明试剂，如图1所示，其包含用于培养所述器官芯片的培养液，还包括碘克沙醇，所述碘克沙醇在所述透明试剂中的质量百分数为12％-35％；该透明试剂中还含有用于调节器官芯片渗透压和/或维持器官芯片生理功能的金属离子；所述金属离子的总浓度范围为50-150mM。
本发明透明试剂配制时可将培养液和碘克沙醇溶液混合，然后加入合适种类和浓度的金属离子，碘克沙醇溶液为碘克沙醇溶于去离子水中得到的溶液，较佳实施例中可直接采用医用碘克沙醇注射液。配制该透明试剂时，可按照60wt％的碘克沙醇溶液和所述培养液的体积比为1∶4-1∶1来配制，碘克沙醇的分子结构如式(一)所示：
Figure BSA0000278115470000051
CN110579442A公开了一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法及其应用，采用碘克沙醇原溶液或者其结晶后的碘克沙醇晶体，调节活体模式生物样品光片成像的成像环境，使得成像环境中的相邻介质之间的折射率匹配。本发明的申请人最初采用该方法直接对器官芯片比如心脏器官芯片、类脑器官芯片或肿瘤芯片进行在线光透明观察或成像时，发现部分器官芯片中的细胞很快就会凋亡，导致在线透明观察实验失败。经过大量的实验摸索，本发明的申请人发现对于器官芯片，透明试剂中需要含有能够调节器官芯片渗透压和/或维持器官芯片生理功能的金属离子，并确保其在合适的浓度范围内，才能够实现器官芯片活体在线透明观察或成像。而且实验发现，不同于生物体中器官的渗透压以及功能要求，器官芯片虽然模拟生物环境，但可能由于体外缺少相应的内环境稳态调节机制，对金属离子的浓度要求更为苛刻。
一些实施例中，所述金属离子为钾离子、钙离子、镁离子、钠离子和锌离子中的一种或多种。
较佳实施例中，该透明试剂中钾离子的浓度范围1-4mM；钙离子的浓度范围0.3-0.9mM；镁离子的浓度范围0.3-0.5mM，钠离子的浓度范围为50-120mM，锌离子的浓度范围为0-6μM。
培养液作为光透明试剂的基础成分，实际应用中可根据不同的器官芯片类型选择相应的细胞培养液，所述培养液可以为经典细胞培养基，比如DMEM培养基、F12培养基、MEM培养基、RPMI1640培养基、这些经典培养基的衍生培养基或其他培养液。比如对于心脏器官芯片，一般选择RPMI1640培养基；对于类脑芯片，一般选择F12培养基；对于肿瘤芯片，一般根据肿瘤类型选择培养液，一般多为DMEM及RPMI1640培养基。培养液可以通过直接购买液体培养液，也可购买固体培养基加双蒸水配制得到合适浓度的培养液。
所述器官芯片为心脏器官芯片时，将医用碘克沙醇注射液和培养液按照体积比为1∶1.3-1∶1.5，较佳为1∶1.4进行配制；对应地，该透明试剂中碘克沙醇的质量百分数为24％-26.1％，较佳为25％；该透明试剂中钙离子浓度为0.75-0.85mM，钾离子浓度为3.45-3.55mM；镁离子浓度为0.35-0.45mM，钠离子的浓度为55-100mM。这些金属离子及其浓度范围能够确保心脏微器官没有功能障碍，能够正常放电和起搏。
所述器官芯片为类脑器官芯片时，将医用碘克沙醇注射液和所述培养液按照体积比为1∶1.5-2.5；较佳为1∶2进行配制该透明试剂；然后额外加入金属离子，使得该透明试剂中钙离子浓度为0.35-0.45mM，钾离子浓度为1.95-2.05mM，镁离子浓度为0.35-0.45mM，钠离子的浓度为50-100mM，锌离子浓度为4.5-5.5μM。实验发现，缺少钾、钙和镁将导致类脑的功能发生障碍，不能正常进行神经电活动，缺少锌将影响类脑的生理活性。对应地，该透明试剂中碘克沙醇的质量百分数为17.1％-24％，较佳为20％。
所述器官芯片为肿瘤芯片时，将医用碘克沙醇注射液和所述培养液按照体积比为1∶0.8-1∶1.2进行配制，然后加入金属离子，使得该透明试剂中钙离子浓度为0.35-0.45mM，钾离子浓度为1.95-2.05mM，镁离子浓度为0.35-0.45mM，钠离子的浓度为70-80mM，对应地该透明试剂中碘克沙醇的质量百分数为27.3％-33.3％。
一些实施例中，对于心脏器官芯片或类脑器官芯片，实验发现除培养液和碘克沙醇溶液以外，还需要额外加入金属离子，以满足器官芯片的渗透压以及生理功能要求；而肿瘤芯片由于没有特殊的功能要求，可以仅加入一些维持肿瘤芯片渗透压的金属离子，比如钠离子；如果培养液中本身的金属离子足以维持肿瘤芯片渗透压，也可不用额外加入。
当需要在透明试剂中额外加入金属离子时，可以以金属氯化物的形式加入。可以先将需要加入的金属离子配制成浓度较高的混合调整试剂，然后根据需要加入合适体积的调整试剂于碘克沙醇和培养液的混合液中，由于调制试剂浓度很高，一般向混合液中加入的调制试剂体积很小，对混合液中碘克沙醇的浓度的影响基本可以忽略。
本发明还提供了一种利用所述的光透明试剂进行器官芯片的在线光透明的方法，包括如下步骤：
(1)对器官芯片进行排气泡处理后，以2-200μL/min的速度向所述器官芯片中灌注如上所述的光透明试剂，持续灌注0.4-0.6小时；或将所述器官芯片中的人工微组织浸泡在所述光透明试剂中0.8-1.2小时；使得所述器官芯片透明，得到透明处理后的器官芯片；
(2)将步骤(1)得到的透明处理后的器官芯片在显微镜下进行在线观察。
一些实施例中，还包括器官芯片的恢复步骤：
(3)观察完毕后，将培养液以2-200μL/min的速度向所述器官芯片中灌注，持续灌注0.4-0.6小时；或将所述器官芯片中的人工微组织重新浸泡在培养液中，得到恢复后的器官芯片。
本发明一些实施例中，提供的一种适用于器官芯片长期在线活体透明观察的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、取60％医用碘克沙醇注射液(Sigma)，和培养液以一定比例混合，然后用移液枪混匀，并加入氯化钙、氯化钾、氯化锌、氯化钠等中的一种或多种调整离子浓度，得到透明试剂。
S2、透明：将前述得到的光透明试剂装填在泵中，排尽芯片中的气泡后，以2-200μL/min的速度向芯片中持续灌注光透明试剂，持续半小时。若所使用的芯片不能或不便灌注，可以将人工微器官(或称人工微组织)浸泡在光透明试剂中一小时。处理期间，应始终保持合适的温度和气体环境。
S3、观察：灌注结束后，即可将芯片移至显微镜下观察。
S4、恢复：将培养液以2-200μL/min的速度向芯片中持续灌注60分钟，然后放回培养箱即可。若所使用的芯片不能或不便灌注，将人工微器官恢复到培养液环境即可。
对于具有流体通道的器官芯片，可以通过向器官芯片流体通道中灌注本发明光透明试剂，使器官芯片中的人工微组织浸泡在该光透明试剂中进行透明或恢复；对于不具有流体通道的器官芯片，可直接把该器官芯片中的人工微组织浸泡在本发明光透明试剂中进行透明或恢复即可。
本发明提出的适用于器官芯片的活体在线光透明试剂和透明方法可以适用于各种器官芯片，器官芯片广义上除了包含含有流体通道的器官芯片，也包含各种人工微器官(也称人工微组织)，微器官或器官芯片可以从市面上采购获得，或按照现有技术的方法自行培养和制作。对于培养三维人工微器官，比如心肌球、肿瘤球、类脑等人工微器官，只需要将细胞悬液(50-100万每毫升)通入芯片中，然后离心，浸泡在培养液中培养即可；其中对于心脏器官芯片或类脑器官芯片，在培养时需要加入相应的细胞因子，可参考现有技术的三维人工微器官的培养方法，将三维人工微器官培养在器官芯片的培养孔中。
本发明提供的适用于器官芯片的活体在线光透明试剂、透明方法以及器官芯片结构获得的透明组织样本，可用于共聚焦成像、双光子成像或光片荧光显微成像中，获取人工微器官的三维高分辨结构信息。
本发明一些实施例中，自制器官芯片并用于在线透明和在线观察，通过器官芯片结构设计，透明后可直接采用共聚焦成像、双光子成像或光片荧光显微成像来在线观察器官芯片，观察结束后将该器官芯片采用培养液进行恢复，恢复完毕后可再次投入使用，始终能够保持器官芯片的功能。
如图2所示，本发明一些实施例中采用的一种适用于在线透明和在线观察的器官芯片，自下而上层叠设置有透明基底层1、连接层9、第一图案层2、第二图案层3以及透明盖板层4；所述第一图案层2和第二图案层3分别采用PDMS基材，其中：所述第一图案层2含有所述器官芯片的芯片图案。第一图案层2的芯片图案如图3所示，所述芯片图案包括微流控主通道21和分散布置在所述微流控主通道21上且与所述微流控主通道21相连通的若干个第一通孔22。
所述第二图案层3含有的图案包括若干个第二通孔31，且所述第二图案层3中的若干个第二通孔31与所述第一图案层2中的若干个第一通孔22一一对应且相连通；第二图案层3的图案如图4所示。器官芯片的整体结构示意图如图5所示。工作时，第二图案层3中的第二通孔31作为观察孔使用，第一图案层2中的第一通孔22作为人工微器官的培养孔使用，第一通孔22和第二通孔31位置一一对应且相连通，相互配合实现了培养孔和观察孔的分离，有利于减少镜头与样本间的介质复杂程度以提高观测质量。
所述第二图案层3的底部和所述透明基底层1的顶部分别与所述微流控主通道21的顶部和底部相连接，用于使得所述微流控主通道21成为封闭的通道。
所述第二图案层3两端相对于所述透明盖板层4为突出设置，且两端的突出部分分别设置有与所述微流控主通道21相连通的主通道进液孔5和主通道出液孔6，如图3所示。
所述第一图案层2和所述第二图案层3均为通过软光刻方法制备得到的不同图案的PDMS块体。第一图案层2的制作方法如下：首先绘制第一图案层的光刻图纸，并制造相应的掩模，然后通过软光刻在硅片上形成对应的阳模，并向硅片上倒入PDMS预聚物，并在80℃烘箱内固化60min，固化完成后，取下已经形成图案的PDMS块，裁剪为合适的大小，即得到第一图案层。软光刻具体为：首先在硅片上旋涂预设厚度的光刻胶，然后进行前烘，完成后将掩模覆盖在硅片上，在光刻机中进行对准曝光，曝光完成后进行后烘。随后进行显影和定影即可。
第二图案层的制作方法如下：首先绘制第二图案层的光刻图纸，并制造相应的掩模，然后通过软光刻在硅片上形成对应的阳模，并向硅片上倒入PDMS预聚物，并在80℃烘箱内固化60min，固化完成后，取下已经形成图案的PDMS块，裁剪为合适的大小，即得到第二图案层。
所述第一图案层2上的第一通孔22两两之间还设置中间通道23；所述第二图案层两端的突出部分上还设置有中间通道进液孔7和中间通道出液孔8。额外设置中间通道，使得每一个第一通孔22不仅具有来自于微流控主通道的流体经过，而且还有从另一个方向的中间通道的流体经过，而且从中间通道23中循环通入透明试剂，利用扩散效应使得中间通道中的透明试剂缓慢进入芯片中的培养室，可以降低流体剪切力对培养室中人工微器官的影响。对于心脏微器官，从中间通道中循环通入透明试剂可持续0.5-1h；对于肿瘤微器官，可持续通入0.5-2h；对于类脑器官，可持续通入6-12h。较佳实施例中，所述微流控主通道与所述中间通道相互垂直。
所述主通道进液孔5、主通道出液孔6、中间进液孔7和中间出液孔8均为凸台10设置，通过该凸台10将主通道进液孔5、主通道出液孔6、中间进液孔7和中间出液孔8引出，便于进液和出液。图中共设置有6个凸台，分别对应一个主通道进液孔5、一个主通道出液孔6、两个中间进液孔7和两个中间出液孔8。
所述第一通孔22和第二通孔31的横截面形状相同，其为圆形或多边形，多边形比如六边形或八边形；所述第一通孔22的底部为U形底，U形底有利于细胞的三维培养。可通过以下方法制备得到U形底：在第一图案层2制备好以后，用移液器取0.005-0.015g未固化的PDMS预聚物，滴入第一图案层2的第一通孔22中，静置3-8分钟后，PDMS预聚物可以在表面张力的作用下自发形成U型底面，然后加温固化，得到具有U型底通孔的第一图案层。
连接层9的材料为PDMS，且所述连接层9采用的PDMS材料的硬度小于所述第一图案层2采用的PDMS材料的硬度，有利于使所述第一图案层2与透明基底层1连接稳固，且PDMS-PDMS界面相较于PDMS-玻璃界面，更有利于PDMS铺开，有助于U型底的形成。且此时所述第二图案层的底部和所述连接层的顶部分别与所述微流控主通道的顶部和底部相连接，用于使得所述微流控主通道成为封闭的通道。所述连接层9的厚度为5-20μm范围。
所述第一图案层2的厚度为1.5±0.1mm，所述第二图案层3的厚度为100±10μm。所述透明基底层1为载玻片或盖玻片；所述透明盖板层4为载玻片或盖玻片。
一些较佳实施例中，第一通孔22和第二通孔31的横截面形状为圆形，按照载玻片-连接层-第一图案层2-第二图案层3-盖玻片-物料进出口凸台的顺序，将各层部件使用Plasma处理依次键合，并确保第一图案层2和第二图案层3的圆形通孔位置一一对应，最后连接相应的微流控设施即可，得到的微流控器官芯片的整体结构示意图如图5所示。本发明提供的上述适配本发明透明试剂和透明方法的器官芯片设计，解决了现有技术器官芯片原位透明方法所需时间较长、产生形变较大以及在线器官芯片透明方法的缺失问题。
为了让本发明之上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举数实施例，来说明本发明所述之适用于器官芯片的光透明方法及其应用。
实施例1
本实施例1样本为根据thermo公司提供的微孔板(Nunclon Sphera 96孔、经Nunclon Sphera处理、U形底微孔板货号174929)自行培养的肿瘤微器官，培养方法如下：以5万个每毫升肿瘤细胞悬液接种到每孔中，每孔200微，然后以500G离心，其中肿瘤细胞为转染了GFP蛋白的hct116，培养基为rpmi1640；通过在线透明方法对样本进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制相应的透明试剂：取1mL前述60wt％医用碘克沙醇注射液和DMEM培养液以1∶1混合，然后用移液枪混匀，得到透明试剂。最终所得的透明试剂中金属离子浓度为：钾离子的浓度为1.8mM；钙离子的浓度0.2mM；镁离子的浓度0.2mM，钠离子的浓度约为80mM。
(2)透明：将肿瘤微器官取出，浸泡在光透明试剂中1小时。
(3)观察：将肿瘤微器官放置于成像设备下观察，在观察时，可以看到采用本实施例透明试剂对肿瘤微器官进行透明前后，成像信号强度如图6所示得到提升(图6内容(a)为透明前，内容(b)为透明后)，且肿瘤细胞可以保持活体状态，各项生理功能不受影响。
(4)恢复：将肿瘤微器官转移到培养液环境，并放回培养箱，该肿瘤微器官还可以保持正常的增殖生长。
实施例2
本实施例利用自制芯片培养装置对培育的肿瘤器官芯片通过在线透明方法进行在线透明和观察，具体包括如下步骤：
(1)制作适配的芯片：绘制第一图案层2和第二图案层3对应的芯片中间层的光刻图纸，并制造相应的掩模，然后通过软光刻在硅片上形成对应的阳模，并向硅片上倒入PDMS预聚物，并在80℃烘箱内固化20min，固化完成后，取下已经形成图案的PDMS块，裁剪为合适的大小，得到第一图案层2和第二图案层3；按照载玻片-连接层-第一图案层2-第二图案层3-盖玻片-主通道进液孔的凸台、主通道出液孔的凸台、中间进液孔的凸台和中间出液孔的凸台的顺序，将各层部件依次键合，并在第一图案层2中孔洞内填入0.01gPDMS预聚物，离心形成U型底面，并再次固化；固化完成后，连接相应的微流控设施，得到如图2所示的微流控芯片。
(2)人工微器官培育：在前述所得芯片中通入1百万个/mL的肿瘤细胞悬液，肿瘤细胞为转染了GFP蛋白的hct116，培养基为RPMI1640，并以400G离心5分钟，随后静置培养。
(3)配制相应的透明试剂：取前述1mL60％碘克沙醇注射液，和标准的DMEM培养液以1∶1混合，然后用移液枪混匀，最终所得的透明试剂中金属离子浓度为：钾离子的浓度为1.8mM；钙离子的浓度0.2mM；镁离子的浓度0.2mM，钠离子的浓度为80mM。
(4)透明：将前述得到的光透明试剂装填在微流泵中，排尽芯片中的气泡后，以40μL/min的速度向芯片中持续灌注光透明试剂，持续半小时。
(5)观察：灌注结束后，将芯片移至显微镜下观察，如图7所示，其中内容(a)为光透明前不同深度成像图，内容(b)为光透明后不同深度成像图。可以看到，光透明后芯片中的肿瘤微器官逐渐变得透明，同时其结构仍可以保持完整，且成像深度得到明显提升。
(6)恢复：将培养液以40μL/min的速度向芯片中持续灌注60分钟，然后放回培养箱即可。
实施例3
本实施例样本为心脏微器官(由东南大学苏州医疗器械研究院生产并提供)，通过在线透明方法对样本进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制离子浓度调整试剂：在双蒸水中加入3.5mM的氯化钾，0.8mM的硝酸钙和0.4mM氯化镁，定容至10mL。
(2)配制光透明试剂：取1mL60％医用碘克沙醇注射液(sigma)，和RPMI1640培养液以体积比1∶1.4混合，然后用移液枪混匀，并加入前述离子调整试剂10μL调整离子浓度，得到最终的钙离子浓度为0.8mM，钾离子浓度为3.5mM；镁离子浓度为0.4mM，钠离子的浓度约为90mM。
(3)透明：将心脏微器官，浸泡在光透明试剂中30min。
(4)观察：将心脏微器官放置于成像设备下观察，如图8所示(内容(a)表示透明前，内容(b)表示透明后)，能够观察到透明前观察不到的心脏微器官内部内部的细胞分布差异，且在透明时，心脏微器官可以保持跳动。
(5)恢复：将心脏微器官转移到培养液环境，并放回培养箱。
实施例4
本实施例4样本为类脑(由武汉睿健生物医药公司生产并提供)，通过在线透明方法对样本进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制离子浓度调整试剂：在双蒸水中加入1.8mM的氯化钾，0.4mM的硝酸钙和0.4mM氯化镁，0.5μM硫酸锌，定容至10mL。
(2)配制光透明试剂：取1mL60％医用碘克沙醇注射液(sigma)，和F12培养液以体积比1∶2混合，调整浓度至20％。然后用移液枪混匀，并加入10μL步骤(1)制备的调整试剂，得到的该透明试剂中钙离子浓度为0.4mM，钾离子浓度为1.8mM，镁离子浓度为0.4mM，锌离子浓度为0.5μM，钠离子的浓度为100mM。
(3)透明：将类脑浸泡在光透明试剂中8h。
(4)观察：将类脑放置于成像设备下观察，在观察中可以看到之前无法观察到的细节，同时类脑可以保持正常的功能，神经放电不受影响。
(5)恢复：将类脑转移到培养液环境，并放回培养箱。
对比例1
样本为心脏微器官(由东南大学苏州医疗器械研究院生产并提供)，通过在线透明方法对样本进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制光透明试剂：取60％医用碘克沙醇注射液(sigma)，和RPMI1640培养液以1∶1.4混合，然后用移液枪混匀，得到透明试剂。该透明试剂中没有额外引入金属离子，所得的试剂中离子浓度为：钾离子的浓度为1.6mM；钙离子的浓度为0.5mM；镁离子的浓度为0.2mM，钠离子的浓度为90mM，这些金属离子为培养液本身含有的金属离子。
(2)透明：将心脏微器官，浸泡在光透明试剂中30min。
(3)观察：将心脏微器官放置于成像设备下观察。观察到的图像较为清晰。
(4)恢复：将心脏微器官转移到培养液环境，并放回培养箱。由于透明试剂中未额外引入心脏微器官所需的用于调节器官芯片渗透压和/或维持器官芯片生理功能的金属离子，表现为心脏微器官搏动不可逆受损。
对比例2
样本为心脏微器官(由东南大学苏州医疗器械研究院生产并提供)，对样本进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制离子浓度调整试剂：在双蒸水中加入3.5mM的氯化钾，0.8mM的硝酸钙和0.4mM氯化镁，定容至10mL。
(2)配制光透明试剂：取1mL60％医用碘克沙醇注射液(sigma)，和RPMI1640培养液以体积比1∶1混合，然后用移液枪混匀，并加入前述离子调整试剂10μL调整离子浓度，得到最终的钙离子浓度为0.8mM，钾离子浓度为3.5mM；镁离子浓度为0.4mM，钠离子的浓度为80mM。
(3)透明：将心脏微器官，浸泡在光透明试剂中30min。
(4)观察：将心脏微器官放置于成像设备下观察。与实施例3其他条件都相同，只是由于碘克沙醇注射液和培养液的体积比不同，未采用针对心脏微器官的个性化碘克沙醇浓度，观察不到清晰的成像，成像效果欠佳。
(5)恢复：将心脏微器官转移到培养液环境，并放回培养箱。
对比例3
样本为类脑(由武汉睿健生物医药公司生产并提供)，对该样本进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制光透明试剂：取60％医用碘克沙醇注射液(sigma)，和DMEM培养液以1∶2混合，然后用移液枪混匀，得到透明试剂。所得的透明试剂离子浓度为：钾离子的浓度为1.2mM；钙离子的浓度为0.26mM；镁离子的浓度为0.26mM，钠离子的浓度为100mM。这些金属离子为培养液中的金属离子，未额外加入金属离子。
(2)透明：类脑浸泡在光透明试剂中8h。
(3)观察：将类脑放置于成像设备下观察。可以观察到较为清晰的图像。
(4)恢复：将类脑转移到培养液环境，并放回培养箱。由于透明时未能维持金属离子的合适浓度，可能表现为类脑的电发放抑制，以及长期观察时，类脑增殖受阻。
对比例4
样本为类脑(由武汉睿健生物医药公司生产并提供)，对该样本进行处理，具体包括如下步骤：
(1)配制离子浓度调整试剂：在双蒸水中加入1.8mM的氯化钾，0.2mM的硝酸钙和0.2mM氯化镁，5μM硫酸锌，定容至10mL。
(2)配制光透明试剂：取1mL60％医用碘克沙醇注射液(sigma)，和F12培养液以体积比1∶1混合，然后用移液枪混匀，然后加入10μL步骤(1)配制的调整试剂，得到透明试剂，其中钙离子浓度为0.4mM，钾离子浓度为1.8mM，镁离子浓度为0.4mM，锌离子浓度为5μM，钠离子的浓度为100mM。
(3)透明：类脑浸泡在光透明试剂中8h。
(4)观察：将类脑放置于成像设备下观察。与实施例4其他条件都相同，只是由于碘克沙醇注射液和培养液的体积比不同，由于未采用针对类脑的个性化碘克沙醇浓度，不能观察到清晰的图像，成像效果欠佳。
(5)恢复：将类脑转移到培养液环境，并放回培养箱。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种器官芯片的在线光透明试剂，其特征在于，其包含用于培养所述器官芯片的培养液，还包括碘克沙醇，所述碘克沙醇在该透明试剂中的质量百分数为10％-35％；
该透明试剂中还含有用于调节器官芯片渗透压和/或维持器官芯片生理功能的金属离子；所述金属离子的总浓度范围为50-150mM。
2.如权利要求1所述的光透明试剂，其特征在于，所述金属离子为钾离子、钙离子、镁离子、钠离子和锌离子中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的光透明试剂，其特征在于，该透明试剂中钾离子的浓度范围1-4mM；钙离子的浓度范围0.3-0.9mM；镁离子的浓度范围0.3-0.5mM，锌离子的浓度范围为0-6μM，钠离子的浓度范围为50-120mM。
4.如权利要求1所述的光透明试剂，其特征在于，所述培养液为DMEM培养基、F12培养基、MEM培养基、RPMI1640培养基或以上培养基的衍生培养基。
5.如权利要求1所述的光透明试剂，其特征在于，所述器官芯片为心脏器官芯片，所述碘克沙醇在该透明试剂中的质量百分数为24％-26.1％；该透明试剂中钙离子浓度为0.75-0.85mM，钾离子浓度为3.45-3.55mM；镁离子浓度为0.35-0.45mM，钠离子的浓度为55-100mM。
6.如权利要求1所述的光透明试剂，其特征在于，所述器官芯片为类脑器官芯片，所述碘克沙醇在该透明试剂中的质量百分数为17.1％-24％；该透明试剂中钙离子浓度为0.35-0.45mM，钾离子浓度为1.95-2.05mM，镁离子浓度为0.35-0.45mM，锌离子浓度为4.5-5.5μM，钠离子的浓度为50-100mM。
7.如权利要求1所述的光透明试剂，其特征在于，所述器官芯片为肿瘤芯片，所述碘克沙醇在该透明试剂中的质量百分数为27.3％-33.3％，该透明试剂中钙离子浓度为0.35-0.45mM，钾离子浓度为1.95-2.05mM，镁离子浓度为0.35-0.45mM，钠离子的浓度为70-80mM。
8.一种利用如权利要求1至7任一项所述的光透明试剂进行器官芯片的在线光透明的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对器官芯片进行排气泡处理后，以2-200μL/min的速度向所述器官芯片中灌注如权利要求1至7任一项所述的光透明试剂，持续灌注0.4-0.6小时；或将所述器官芯片中的人工微组织浸泡在所述光透明试剂中0.8-1.2小时；使得所述器官芯片透明，得到透明处理后的器官芯片；
(2)将步骤(1)得到的透明处理后的器官芯片在显微镜下进行在线观察。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括步骤：
(3)观察完毕后，将培养液以2-200μL/min的速度向所述器官芯片中灌注，持续灌注0.4-0.6小时；或将所述器官芯片中的人工微组织重新浸泡在培养液中，得到恢复后的器官芯片。
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