CN115201175A - 受激拉曼散射技术在尿酸盐晶体体内外成像中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了受激拉曼散射技术在尿酸盐晶体体内外成像中的应用;通过论证SRS的可行性,在组织和细胞中,基于MSU指纹拉曼峰,成像MSU在组织细胞内的沉积;本发明通过SRS连续监测MSU晶体成核、生长以及与周围组织细胞的相互作用,为了解MSU与周围组织之间的基本相互作用提供了理想的分析工具,并为快速诊断痛风和其他基于MSU的疾病提供了潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及受激拉曼散射技术在尿酸盐晶体体内外成像中的应用。
背景技术
痛风是一种全身性疾病,目前通风的发病率和疾病负担均日益增加。痛风的主要病理机制是血清中尿酸浓度升高(超过6.8mg/dL)以及关节腔内沉积了过度饱和的尿酸盐(MSU)晶体,且MSU晶体会沉积在软骨、滑膜或肌腱表面。
慢性痛风的一线治疗策略是通过药物或手术减少MSU的沉积,快速准确的原位检测MSU在痛风的诊断和治疗中都是至关重要的。化学特异性检测在面对复杂情况时尤其重要。然而,无论是金标准组织学检查,还是补偿偏光显微镜(CPLM)都不能提供MSU晶体足够的化学特异性,CPLM和病理诊断的假阴性率较高且处理组织较耗时。
晶体鉴定主要在滑膜液中进行,但痛风人群可能经历非典型疾病过程;即许多患者在首次发病前关节表面已经有MSU晶体沉积,且相当一部分痛风患者往往等到出现软骨损伤、韧带损伤甚至骨折的首发症状时才被诊断出来;此外,在进行病理检查之前,痛风关节炎可能会与疑似感染、肿瘤或类风湿关节炎形成混淆。
因此,能够快速、特异性识别新鲜组织中MSU的方法是优化手术策略的迫切需要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供受激拉曼散射(SRS)技术在尿酸盐晶体体内外成像中的应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
提供受激拉曼散射技术在尿酸盐晶体体内外成像中的应用。
优选地,所述尿酸盐晶体的体内成像包括:尿酸盐晶体成核、生长以及与周围组织细胞相互作用的成像。
优选地,所述尿酸盐晶体的体外成像包括:尿酸盐晶体的沉积的成像。
优选地,所述受激拉曼散射技术所采用的受激拉曼散射系统以光学参量振荡器的双输出商用脉冲飞秒激光束作为光源,以基本1040nm激光器作为斯托克斯(Stokes)光束,以OPO可调谐激光作为泵浦光。
优选地,所述泵浦光的功率为70-90mW,所述斯托克斯光束的功率为150-170mW。
优选地,所述斯托克斯光束由10MHz的电光调制器进行强度调制,并通过二向色镜与泵浦光对准。
优选地,每个视场的大小为512×512像素,横向分辨率为~350nm,像素停留时间为2μs。
本发明采用以上技术方案,与现有技术相比,具有如下技术效果:
本发明通过论证SRS的可行性,在组织和细胞中,基于MSU指纹拉曼峰,成像MSU在组织细胞内的沉积;本发明通过SRS连续监测MSU晶体成核、生长以及与周围组织细胞的相互作用,为了解MSU与周围组织之间的基本相互作用提供了理想的分析工具,并为快速诊断痛风和其他基于MSU的疾病提供了潜力。
附图说明
图1为本发明的技术路线图;
图2为多色SRS对大鼠模型(注射后3天)新鲜组织假性痛风的鉴别和微晶体的早期检测;
图3为痛风性关节炎患者滑膜液中MSU的检测;
图4为慢性痛风组织的SRS、H&E和免疫荧光评价;
图5为SRS、H&E和免疫荧光的三组慢性痛风组织的定量分析;
图6为SRS显微镜对不同MSU晶体在结构上进行分类;
图7为SRS显微镜对不同MSU晶体在与巨噬细胞共培养。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,但不作为本发明的限定。
实施例1
1.SRS系统搭建
使用来自光学参量振荡器(OPO,Insight DS+,Newport,CA)的双输出商用飞秒脉冲(fs)激光束作为光源,基本1040nm激光器作为Stokes光束(~150fs),可调谐OPO输出(690~1300nm,120fs)作为泵浦光。Stokes光束由10MHz的电光调制器(EOM)进行强度调制,并通过二向色镜(DMSP1000,Thorlabs)与泵浦光对准,使用1/4波片将线偏振光束变为圆偏振光束以降低激光束的偏振效应。
飞秒脉冲激光通过高色散玻璃棒(SF57)产生线性啁啾,脉冲宽度展宽至几个皮秒(泵浦光:~3.8ps,Stokes光束:~1.8ps),以获得较高的受激拉曼散射光谱分辨率,同时,也可通过设置泵浦光与斯托克斯光之间的相对时间间隔进而设置特定的拉曼波数,通过扫描两束光束之间的时延,得到SRS光谱。
将泵浦激光的波长设置为976nm,以匹配MSU的拉曼峰(630cm-1)。
将泵浦激光的波长设置为937nm,以匹配二水焦磷酸钙盐(CPPD)的拉曼峰(1050cm-1)。
采用801nm泵浦激光与1040nm斯托克斯激光相互作用,匹配脂质或者蛋白的拉曼峰,进而成像脂质/蛋白质。
2.SRS图像的生成
首先,将对准后的光束送入激光扫描显微镜(FV1200,Olympus),通过物镜(UPLSAPO 60XWIR,NA 1.2water,Olympus)聚焦痛风样品;通过带通滤波器(CARS ET890/220,Chroma)对痛风样本中MSU产生的受激拉曼损耗(SRL)信号进行滤波以消除Stokes光束,用锁相放大器(HF2LI,Zurich Instruments)进行解调,从而得到每个像素的SRS信号;其次,使用两个扫描振镜扫描激光,生成SRS图像。
MSU样品的泵浦光功率和Stokes光束的光功率保持在80mW和160mW左右。每个视场大小为512×512像素(180×180μm),横向分辨率为~350nm,像素停留时间为2μs。
3.SHG图像的生成
使用epi扫描模式,通过窄带通滤波器(FF01-520/10,Semrock),利用光电倍增管(PMT)对1040nm Stokes光束激发的SHG信号进行检测,生成SHG图像,以显示痛风组织中胶原纤维的分布。
实施例2
1.人类手术标本中的MSU沉积成像以及分析
通过SRS和CPLM(Olympus Corporation,Japan),用红色板补偿器滴入滑膜液,在显微镜载玻片中鉴定MSU晶体。
收集来自不同患者的软骨组织或滑膜组织的术中标本。患者均为中年男性,且诊断为高尿酸血症5年以上,由于关节肿块导致活动受限,符合手术指征。术中采集肘关节、第一跖趾和踝关节标本。定量诊断部分,根据距离痛风石中心0mm、10mm以及20mm的距离,将2个完整的包膜痛风石分为3组,每组切除4个3mm×3mm×3mm的标本。将标本置于4%多聚甲醛溶液中固定24小时,浸泡在OCT冰冻切片包埋剂中。每组内3张切片分别采用SRS镜检、H&E染色或免疫荧光双标染色后进行光学显微镜成像,便于对比诊断效果。
2.动物研究
选取9只8周龄的雄性SD大鼠(上海动物研究中心)。第0天,将9只大鼠随机分为3组,给大鼠吸入3%异氟醚诱导麻醉后再吸入1.5%异氟醚维持麻醉。在大鼠的膝关节外侧作3mm的切口。分别将3mL的MSU悬浮液、CPPD悬浮液和50mg.mL-1混合晶体悬浮液注入关节腔。第3天处死大鼠,取大鼠的关节腔滑膜进行进一步分析。
3.细胞系研究
选用自ATCC购买的小鼠RAW264.7细胞系,与MSU共培养。通过SRS连续监测MSU晶体成核、生长、与周围组织细胞相互作用。
4成像处理
图像处理的所有步骤都使用ImageJ软件。
4.1痛风组织的成像处理
首先,用SHG图像减去SRS图像提取胶原纤维通道;其次,将MSU和胶原纤维通道合并成双色图像,从而清晰地显示出MSU和胶原纤维的分布。使用奥林巴斯软件的自动拼接成像程序进行大规模组织成像。
4.2CPDD模型的成像处理
参见4.1痛风组织的成像处理
5定量分析
用ImageJ软件对SRS和SHG图像进行定量分析。
首先,设置强度轮廓的阈值,获得合适的MSU SRS信号并抑制背景。计算MSU的平均SRS强度,分析MSU在各视场中的密度;其次,计算MSU的平均强度和面积,分析MSU的平均SHG强度,得到结晶比。
6.组织学分析
选用IL-1β抗体(16806-1-AP:1:2000)和TNF-α抗体(60291-1-lg:1:2000)。
免疫荧光染色,样品切片随后与一抗孵育,与CY3/fitc结合的二抗孵育后,使用荧光显微镜(Eclipse C1,尼康,日本)观察信号,使用图像系统(DS-U3,尼康,日本)对样品进行成像。
7.免疫荧光分析
采用免疫荧光平均光密度值(AO)分析,定量TNF-α/IL-1β的表达。
每组随机选取至少5200倍的视场进行拍照。采用Image-pro Plus 6.0软件(MediaCybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)将荧光单色照片转换为黑白图像;对每张图像进行分析,得到组织的积分光密度(IOD)和像素面积;计算平均光密度值,计算公式为:AO=IOD/AREA。
8统计分析
采用SPSS 13.0、GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计学分析。
所有数据集采用t检验正态性,若正态性检验不合格,则采用Mann Whitney秩和检验进行组内比较。SRS信号强度、面积、荧光AO比较采用单因素方差分析进行正态性评价,正态性检验不合格则采用Kruskal-Wallis检验,Dunn's多重比较检验。相关性分析采用Pearson r正态检验,正态检验不合格则采用Spearman r检验。结果以平均值±S.E.M.或中位数四分位数表示。P<0.05被认为具有显著性。
9结果
如图2所示,图2A为SRS对大鼠急性痛风模型(注射MSU悬浮液)的检测结果,如图所示,MSU(绿色,630cm-1)被胶原蛋白(红色,SHG)包围。图2B为SRS对大鼠假性痛风(注射CPDD悬浮液)的鉴别,如图所示,CPPD模型的滑膜蛋白(灰色,2930cm-1)中检测到CPPD(蓝色,1050cm-1)的沉积。图2C为SRS对大鼠联合模型(注射混合晶体悬浮液)的检测结果,如图所示,联合模型滑膜组织中MSU微晶和CPPD微晶有明显区别。图2D-E为MSU、CPDD的SRS谱。
如图3所示,图3A为MSU微晶体在慢性痛风关节炎患者滑膜液中的SRS成像;图3B为MSU微晶体在慢性痛风关节炎患者滑膜液中的CPLM成像;图3C为MSU晶体弓在滑膜液中的SRS成像;图3D为MSU晶体弓在滑膜液中的CPLM成像。
如图4所示,图4A显示GA患者的痛风组织分别取自中心、距离中心10mm和20mm三组,右侧为覆盖矩形区域(左侧)的大尺度SRS/SHG图像;图4B为组织中SRS、H&E和免疫荧光的代表性图像。
如图5所示,图5A为每个视场中MSU的面积百分比;图5B为每个视场的MSU(每像素)平均SRS强度;图5C为各视场的MSU累积强度;图5D为MSU在各视场中的结晶率。N=40,Kruskal-Wallis检验后进行Dunn多重比较检验,****P<0.0001。
如图6所示,图6A为MSU晶体(红色,630cm-1)、细胞内脂质(绿色,2930cm-1)和蛋白质(蓝色,2930cm-1)的代表性SRS和处理图像图;6B为具有代表性的吞噬过程实时图像,证明了SRS显微镜具有成像细胞内晶体的能力;图6C为胞内MSU晶体的代表性SRS和处理图像;图6D为五组间主成分分析(每组n=20);图6E为MSU晶体从100个视场(FOV)的SRS图像的定性评估;图6F为ROC曲线,显示了根据SRS图像对MSU晶体进行分类的每个指标的敏感性和特异性。
如图7所示,图7A为SRS细胞水平MSU晶体吞噬的代表性图像。显示了在0-16h时间内,MSU晶体(红色,630cm-1)、细胞内脂质(绿色,2930cm-1)和蛋白质(蓝色,2930cm-1)的代表性SRS和处理图像;图7B为收集细胞吞噬晶体后,纵横比、圆度,胞内脂滴面积与密度的多重比较。
综上所述,本发明通过论证SRS的可行性,在组织和细胞中,基于MSU指纹拉曼峰,成像MSU在组织细胞内的沉积;本发明通过SRS连续监测MSU晶体成核、生长以及与周围组织细胞的相互作用,为了解MSU与周围组织之间的基本相互作用提供了理想的分析工具,并为快速诊断痛风和其他基于MSU的疾病提供了潜力。
以上所述仅为本发明较佳的实施例,并非因此限制本发明的实施方式及保护范围,对于本领域技术人员而言,应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案,均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.受激拉曼散射技术在尿酸盐晶体体内外成像中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述尿酸盐晶体的体内成像包括:尿酸盐晶体成核、生长以及与周围组织细胞相互作用的成像。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述尿酸盐晶体的体外成像包括:尿酸盐晶体的沉积的成像。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述受激拉曼散射技术所采用的受激拉曼散射系统以光学参量振荡器的双输出商用脉冲飞秒激光束作为光源,以基本1040nm激光器作为斯托克斯光束,以OPO可调谐激光作为泵浦光。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述泵浦光的功率为70-90mW,,所述斯托克斯光束的功率为150-170mW。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述斯托克斯光束由10MHz的电光调制器进行强度调制,并通过二向色镜与泵浦光对准。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,每个视场的大小为512×512像素,横向分辨率为~350nm,像素停留时间为2μs。
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CN202210760873.7A CN115201175A (zh) | 2022-06-30 | 2022-06-30 | 受激拉曼散射技术在尿酸盐晶体体内外成像中的应用 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113230260A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-10 | 复旦大学附属华山医院 | 一种持续性痛风性关节炎动物疾病模型的构建方法 |
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2022
- 2022-06-30 CN CN202210760873.7A patent/CN115201175A/zh active Pending
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CN113230260A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-10 | 复旦大学附属华山医院 | 一种持续性痛风性关节炎动物疾病模型的构建方法 |
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