CN115197088A - 一种喜树碱衍生物中间体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种喜树碱衍生物中间体的制备方法。具体涉及一种如式(IV)所示化合物的制备方法，包括式(V)所示化合物与酸反应的步骤，以及分离式(IV)所示化合物的步骤。该方法收率高、反应条件温和，适合工业化生产。

Description

一种喜树碱衍生物中间体的制备方法
技术领域
本公开属于医药领域，涉及一种喜树碱衍生物中间体的制备方法。
背景技术
抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)将单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的细胞毒素相连，充分利用了抗体对正常细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的特异性和细胞毒素的高效性，同时又避免了前者疗效偏低和后者毒副作用过大等缺陷。这也就意味着，与以往传统的化疗药物相比，抗体药物偶联物能精准地结合肿瘤细胞并降低对正常细胞的影响(Mullard A,(2013)Nature Reviews DrugDiscovery,12:329–332；DiJoseph JF,Armellino DC,(2004)Blood,103:1807-1814)。
用于抗体药物偶联物的具有细胞毒性的小分子有几类，其中有一类是喜树碱衍生物，它们通过抑制拓扑异构酶I而具有抗肿瘤作用。报道喜树碱衍生物依喜替康(化学名：(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’:6,7]咪唑并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)应用于抗体偶联药物(ADC)的文献有WO2014057687、WO2020063676、WO2020063673、CN112125915A等。
Figure BDA0003577506970000011
EP0495432B1公开了伊喜替康化合物及其制备方法，其中化合物B是重要的反应中间体。CN111065621A、CN111470998A公开了化合物B的改进的制备方法。
Figure BDA0003577506970000012
发明内容
本公开的目的在于提供一种新的喜树碱衍生物中间体的制备方法。
本公开一方面提供了一种如式(IV)所示化合物的制备方法，包括式(V)所示化合物与酸反应的步骤，以及分离式(IV)所示化合物的步骤，
Figure BDA0003577506970000021
其中，
Ra、Rb各自独立地选自被氨基保护基保护的氨基，
Z为酸根，选自无机酸或有机酸，优选盐酸、醋酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、草酸、柠檬酸、苯磺酸、取代的苯磺酸、苯甲酸、取代的苯甲酸、马来酸、三氟乙酸、甲磺酸、取代的甲磺酸、二氯乙酸、二氟乙酸，更优选盐酸。取代的甲磺酸、苯磺酸或苯甲酸是指甲磺酸、苯磺酸或苯甲酸被选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、C1-C6卤代烷基、卤素、氰基、羟基、氨基中的一个或多个取代基所取代。
在某些实施方式中，Ra、Rb各自独立地选自被乙酰基、甲氧基乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、新戊酰基、甲酰基或苯甲酰基保护的氨基，优选被乙酰基或三氟乙酰基保护的氨基，更优选被乙酰基保护的氨基。
在某些实施方式中，Ra、Rb均为被乙酰基保护的氨基。
在某些实施方式中，所述酸选自无机酸或有机酸，优选盐酸、醋酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、草酸、柠檬酸、苯磺酸、取代的苯磺酸、苯甲酸、取代的苯甲酸、马来酸、三氟乙酸、甲磺酸、取代的甲磺酸、二氯乙酸、二氟乙酸，更优选盐酸。取代的甲磺酸、苯磺酸或苯甲酸是指甲磺酸、苯磺酸或苯甲酸被选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、C1-C6卤代烷基、卤素、氰基、羟基、氨基中的一个或多个取代基所取代。
所述的式(V)所示化合物与酸反应的步骤中使用的溶剂可以是常规溶剂，例如二甲基甲酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氧六环、甲苯、二甲亚砜、乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、水中的一种或多种，优选四氢呋喃、乙酸乙酯、二氧六环、甲苯、二甲亚砜、乙醚、异丙醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述的式(V)所示化合物与酸的摩尔比为1:1～1:10。
分离式(IV)所示化合物的方法可以是常规的方法，例如过滤、除去溶剂等。在式(IV)所示化合物分离前或分离后，可任选地进行纯化，例如重结晶、打浆、柱层析等。
由于式(V)所示化合物存在两个氨基保护基，采用现有技术中的方法选择性脱除保护基Rb的过程中，由于过度水解，部分保护基Ra也被脱除，导致大量过度水解杂质混入产物中。本公开的制备方法可以较好地抑制保护基Ra的脱除，降低过度水解杂质的生成。另外，盐形式的式(IV)所示化合物的储存稳定性相比游离碱更佳。
Figure BDA0003577506970000031
本公开还提供了一种依喜替康或其可药用盐的制备方法，包括式(IV)所示化合物与式(VI)所示化合物反应制备式(III)所示化合物的步骤，
Figure BDA0003577506970000032
其中，
Ra为被氨基保护基保护的氨基，R1’选自氨基或Ra，
Z为酸根，选自无机酸或有机酸，优选盐酸、醋酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、草酸、柠檬酸、苯磺酸、取代的苯磺酸、苯甲酸、取代的苯甲酸、马来酸、三氟乙酸、甲磺酸、取代的甲磺酸、二氯乙酸、二氟乙酸，更优选盐酸。
在某些实施方式中，所述氨基保护基选自乙酰基、甲氧基乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、新戊酰基、甲酰基或苯甲酰基，优选乙酰基或三氟乙酰基，更优选乙酰基。
在某些实施方式中，所述方法还包括式(V)所示化合物与酸反应制备式(IV)所示化合物的步骤，
Figure BDA0003577506970000033
其中，Ra、Rb、Z的定义如前所述。
在某些实施方式中，所述方法还包括分离式(IV)所示化合物的步骤。
在某些实施方式中，R1’选自Ra，所述方法还包括式(III)所示化合物脱保护基制备依喜替康的步骤。
脱氨基保护基可采用常规的试剂脱除，例如酸、碱或氢化条件等等。
本公开还提供了一种固体形式的式(IV)所示化合物，
Figure BDA0003577506970000041
其中Ra、Z的定义如前所述。
在某些实施方式中，Ra为被乙酰基保护的氨基，Z为盐酸。
所述的固体形式可以是无定形或任意晶型。固体的形态可以是粉末、颗粒、块状固体等等。
本公开所述的式(IV)所示化合物中化合物与酸根的比例可以是1:0.5～1:3，优选1:1。
本公开还提供了一种如式(I)所示化合物或其可药用盐的制备方法，包括本公开所述的依喜替康或其可药用盐的制备方法，
Figure BDA0003577506970000042
其中，
R1、R2各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、3-6元环烷基、6-10元芳基或5-10元杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、芳基、杂芳基任选被一个或多个选自C1-C6烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、3-6元环烷基、6-10元芳基或C1-C6烷氧基的取代基所取代，
或者，R1和R2与其相连接的碳原子一起形成任选被一个或多个选自C1-C6烷基、卤素、羟基、氨基、氧代或C1-C6烷氧基的取代基所取代的3-6元环烷基；
R3、R4、R5各自独立地选自氢原子或C1-6烷基；
R6选自氢原子、氘原子、C1-6烷基、6-10元芳基或5-10元杂芳基，其中所述的烷基、芳基、杂芳基任选被一个或多个选自C1-C6烷基、卤素、羟基、氨基和氧代的取代基所取代；
n为2至8的整数；
m为0至4的整数。
在某些实施方式中，R1选自氢原子、C1-6烷基、3-6元环烷基、6-10元芳基或5-10元杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、芳基、杂芳基任选被一个或多个选自C1-C6烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、3-6元环烷基、6-10元芳基或C1-C6烷氧基的取代基所取代，
R2选自氢原子或任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、氧代的取代基所取代的C1-C6烷基，
或者，R1和R2与其相连接的碳原子一起形成任选被一个或多个选自C1-C6烷基、卤素、羟基、氨基、氧代或C1-C6烷氧基的取代基所取代的3-6元环烷基。
在某些实施方式中，R1选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、3-6元环烷基取代的C1-6烷基、6-10元芳基取代的C1-6烷基、3-6元环烷基、6-10元芳基或5-10元杂芳基，R2为氢原子，或者R1和R2与其相连接的碳原子一起形成3-6元环烷基；优选R1选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、3-6元环烷基，R2为氢原子，或者R1和R2与其相连接的碳原子一起形成3-6元环烷基。
在某些实施方式中，R3、R4、R5均为氢原子。
在某些实施方式中，R6选自氢原子、C1-6烷基，卤代C1-6烷基或羟基C1-6烷基，更优选氢原子。
在某些实施方式中，所述的式(I)所示化合物选自
Figure BDA0003577506970000051
可采用现有技术公开的方法以依喜替康或其可药用盐为反应物制备式(I)所示化合物，例如WO2014057687、WO2020063676、WO2020063673、CN112125915A等公开的方法，在此全文引入。
可选的方案包括，例如，方案一：
Figure BDA0003577506970000061
方案二：
Figure BDA0003577506970000062
方案三：
Figure BDA0003577506970000071
等等，
其中，Rc选自被氨基保护基保护的氨基，Rd选自氨基或被氨基保护基保护的氨基。
所述氨基保护基可以叔丁基氧基羰基、9－芴基甲基氧基羰基、苄基氧基羰基等在肽合成中通常使用的氨基的保护基。作为其他的氨基的保护基，可举出乙酰基等烷酰基；甲氧基羰基、乙氧基羰基等烷氧基羰基；对甲氧基苄基氧基羰基、对(或邻)硝基苄基氧基羰基等芳基甲氧基羰基；苄基、三苯基甲基等芳基甲基；苯甲酰基等芳酰基；2，4－二硝基苯磺酰基、邻硝基苯磺酰基等芳基磺酰基。优选9－芴基甲基氧基羰基。
在所述方案中，若R6为氢，则方案中方括号部分的反应不存在。
本公开还提供一种制备抗体-药物偶联物的方法，包括：本公开所述的制备式(I)所示化合物的步骤，以及Ab还原后，与式(I)所示化合物偶联反应，得到式(X)所示的抗体-药物偶联物的步骤，
Figure BDA0003577506970000081
其中Ab为抗体或抗原结合片段，k为1至20(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意两数值之间任意数值)，
R1、R2、R3、R4、R5、R6、m、n如前所述。
还原剂优选TCEP，特别地，优选还原抗体上的二硫键。
在某些实施方式中，所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体；优选为单克隆抗体。
在某些实施方式中，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体或抗Mesothelin抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自Trastuzumab、Pertuzumab、Nimotuzumab、Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、Brentuximab、Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96、Glematumamab，或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，k为2至8，优选为5至9。非限制性实施例包括3、4、5、6、7.2、7.5、8、8.5、9。
在某些实施方式中，所述方法包括
Figure BDA0003577506970000091
可采用现有技术公开的方法将式(I)所示化合物或抗体或抗原结合片段制备抗体-药物偶联物，例如WO2014057687、WO2020063676、WO2020063673、CN112125915A等公开的方法，在此全文引入。
本公开所述的“烷基”优选C1-C6烷基。
本公开所述的“烯基”优选C2-C6烯基。
本公开所述的“炔基”优选C2-C6炔基。
本公开所述的“亚烷基”优选C1-C6亚烷基。
本公开所述的“亚链烯基”优选C2-C6亚链烯基。
本公开所述的“亚链炔基”优选C2-C6亚链炔基。
本公开所述的“烷氧基”优选C1-C6烷氧基。
本公开所述的“烷硫醚基”优选C1-C6烷硫醚基。
本公开所述的“环烷基”优选3至12元，更优选3至6元环烷基。
本公开所述的“稠环烷基”优选为6至14元，更优选为7至10元稠环烷基。
本公开所述的“杂环基”优选3至12元，更优选3至6元杂环基。
本公开所述的“稠杂环基”优选6至14元，更优选为7至10元稠杂环基。
本公开所述的“芳基”优选为6至14元，更优选为6至10元芳基。
本公开所述的“杂芳基”优选为5至12元，更优选为5至10元杂芳基。
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
术语“抗体-药物偶联物”，指配体通过稳定的连接单元与具有生物活性的药物相连。在本公开中“抗体-药物偶联物”(antibody drug conjugate，ADC)，指把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的连接单元与具有生物活性的糖皮质激素相连。其中抗体或抗体片段可通过其中的特定基团(例如链间二硫键)与包含接头的糖皮质激素分子相结合。
术语“载药量”是指抗体-药物偶联物群体中，每个抗体-药物偶联物分子载有的药物平均数量，也可以表示为药物量和抗体量的比值。载药量的范围可以是每个抗体(Ab)连接1-20个，优选1-10个糖皮质激素(D)。在本公开的实施方式中，载药量表示为k，示例性的可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意两数值之间数值的均值。优选1-10，更优选1-8，或2-8，或2-7，或3-8，或3-7，或3-6，或4-7，或4-6，或4-5的均值。可用常规方法如UV/可见光光谱法、质谱、ELISA试验、单抗分子大小变异体测定法(CE-SDS)和HPLC特征鉴定偶联反应后每个ADC分子的药物平均数量。
术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体，优选人源化抗体和全人源抗体。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能用鼠制备抗体。制备时用特定抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。进一步描述参与人源化可使用小鼠抗体的方法的文献包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature，321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。
术语“全人源抗体”、“全人抗体”或“完全人源抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。本公开为全人源单克隆抗体。全人抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phage display)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B细胞抗体制备技术等。
术语“抗原结合片段”是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
F(ab')2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
Fab'是通过切割上述F(ab')2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。
此外，可以通过将编码抗体的Fab'片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab'来生产所述Fab'。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定义只应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界，包括“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则(参见Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(参见Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003))等。例如，对于经典格式，遵循Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT规则，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT规则，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定。
术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996))。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如：大约小于10-8M、10- 9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或GSepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
氨基酸序列“同一性”指在比对氨基酸序列及必要时引入间隙，以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，第一序列中与第二序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以通过属于本领域技术的范围内的多种方式来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至6个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。“碳环”指的是环烷基中的环系。
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；更优选包含3至6个环原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢咪唑基、二氢呋喃基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等，优选哌啶基、吡咯烷基。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。“杂环”指的是杂环基中的环系。
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环。“芳环”指的是芳基中的环系。芳基非限制性实例包括：
Figure BDA0003577506970000161
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基，优选苯基。
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至12元，例如咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基等，优选为咪唑基、吡唑基、嘧啶基或噻唑基；更优选为吡唑基或噻唑基。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。“杂芳环”指的是杂芳基中的环系。杂芳基非限制性实例包括：
Figure BDA0003577506970000162
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
“羧基保护基”是本领域已知的适当的用于羧基保护的基团，参见文献(“Protective Groups in Organic Synthesis”，5Th Ed.T.W.Greene&P.G.M.Wuts)中的羧基保护基团，作为示例，所述的羧基保护基可以是取代或非取代的C1-10的直链或支链烷基、取代或非取代的C2-10的直链或支链烯基或炔基、取代或非取代的C3-8的环状烷基、取代或非取代的C5-10的芳基或杂芳基、或(C1-8烷基或芳基)3硅烷基等。
“氨基保护基”是本领域已知的适当的用于氨基保护的基团，参见文献(“Protective Groups in Organic Synthesis”，5Th.Ed.T.W.Greene&P.G.M.Wuts)中的氨基保护基团，优选地，所述的氨基保护基可以是(C1-10烷基或芳香基)酰基，例如：甲酰基，乙酰基，苯甲酰基等；可以是(C1-6烷基或C6-10芳基)磺酰基；也可以是(C1-6烷氧基或C6-10芳基氧基)羰基，例如：Boc或Cbz；还可以是取代或非取代的烷基，例如：三苯甲基(Tr)、2,4-二甲氧基苄基(DMB)、对甲氧基苄基(PMB)或苄基(Bn)。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
本公开所述化合物的化学结构中，键
Figure BDA0003577506970000171
并未指定构型，即如果化学结构中存在构型异构，键
Figure BDA0003577506970000172
可以为
Figure BDA0003577506970000173
或
Figure BDA0003577506970000174
或者同时包含
Figure BDA0003577506970000175
和
Figure BDA0003577506970000176
两种构型。本公开所述化合物的化学结构中，键
Figure BDA0003577506970000177
并未指定构型，即可以为Z构型或E构型，或者同时包含两种构型。
具体实施方式
以下将结合具体实例详细地解释本公开，使得本专业技术人员更全面地理解本公开具体实例仅用于说明本公开的技术方案，并不以任何方式限定本公开。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：Finnigan LCQadvantage MAX)。
高效液相色谱法(HPLC)分析使用Agilent HPLC 1200DAD、Agilent HPLC1200VWD和Waters HPLC e2695-2489高压液相色谱仪。
手性HPLC分析测定使用Agilent 1260DAD高效液相色谱仪。
高效液相制备使用Waters 2767、Waters 2767-SQ Detecor2、Shimadzu LC-20AP和Gilson-281制备型色谱仪。
手性制备使用Shimadzu LC-20AP制备型色谱仪。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
硅胶柱色谱法一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。
实施例中无特殊说明，反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
实施例1
Figure BDA0003577506970000181
向反应瓶中加入乙醇(2.55L)、浓盐酸(0.425L，12mol/L)，开启搅拌及加热，升温至35℃，加入化合物A(170g)，搅拌反应。反应结束后停止加热，降温至-5℃搅拌，过滤，乙醇洗涤滤饼，滤饼真空干燥，得固体化合物B-1(151.9g，收率91.1％)。经HPLC测定其中含有过度水解杂质0.15％。
实施例2
Figure BDA0003577506970000182
向反应瓶中加入化合物B-1(151.8g)，化合物C(146.3g)，甲苯(2.732L)，甲烷磺酸(10.2g)，乙酸(607mL)，回流反应，反应结束后降温，减压浓缩，得中间体D-1粗品。将D-1粗品转移至反应瓶中，加入甲苯(1.518L)，纯化水(3.036L)，甲烷磺酸(1.518L)，回流反应，反应结束，反应液降温至65℃，过滤，甲醇/水(1:1)混合溶液洗涤滤饼，滤液减压浓缩。浓缩后残余物转移至反应瓶中，升温至45～50℃，滴加甲醇(5.465L)，然后滴加纯化水(304mL)，保温搅拌2小时。降至室温，过滤，甲醇洗涤滤饼，滤饼干燥，得化合物D(105.1g，收率37.3％)。
实施例3
Figure BDA0003577506970000191
向反应瓶中加入化合物D(105g)，化合物E(100.6g，根据WO2020063676公开的方法制备)，二氯甲烷(3.15L)，甲醇(1.05L)，降温至0℃，加入DMTMM(87.3g)，无水碳酸钾(81.9g)，保温搅拌反应。反应结束后，加入纯化水(1.0L)搅拌。然后加入二氯甲烷(3.1L)搅拌，静置，收集有机相。有机相减压浓缩得粗品，粗品经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇(40:1)洗脱)，得化合物F(154.2g，收率92.7％)。经HPLC测定其纯度为99.5％。
实施例4
Figure BDA0003577506970000192
将化合物F(10mg，11.88umol)置于反应瓶中，加入DCM(2mL)，二乙胺(870ug，11.88umol)，氩气保护室温搅拌反应。反应结束后，反应液减压浓缩，，正己烷洗涤残余物，吸去清液，残余物用减压浓缩，得到化合物G共7.4mg，产品不经纯化直接进行下一步反应。
实施例5
Figure BDA0003577506970000193
将化合物G(10.5mg,16.9454umol)置于反应瓶中，加入DMF，冰浴冷却,冰浴下加入化合物H(8mg,16.9316umol)，升至室温，搅拌反应。反应结束后，产品高效液相色谱制备纯化(分离条件：制备柱ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流动相：A-水(5mmolNH4OAc),B-乙腈)，得到化合物I-1共2.7mg。
实施例6
Figure BDA0003577506970000201
根据CN 111065621A实施例5-1的方法，投入170g化合物A，得到116.4g化合物B，收率80％，经HPLC测定其中含有过度水解杂质1.5％。
实施例7
根据CN 111470998A实施例3步骤f的方法，投入170g化合物A，得到135.4g化合物B，收率93％，经HPLC测定其中含有过度水解杂质4％。
由于已根据其特殊的实施方案描述了本公开，某些修饰和等价变化对于精通此领域的技术人员是显而易见的且包括在本公开的范围内。

Claims (22)

1.一种如式(IV)所示化合物的制备方法，包括式(V)所示化合物与酸反应的步骤，以及分离式(IV)所示化合物的步骤，
Figure FDA0003577506960000011
其中，
Ra、Rb各自独立地选自被氨基保护基保护的氨基，
Z为酸根，选自无机酸或有机酸，优选盐酸、醋酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、草酸、柠檬酸、苯磺酸、取代的苯磺酸、苯甲酸、取代的苯甲酸、马来酸、三氟乙酸、甲磺酸、取代的甲磺酸、二氯乙酸、二氟乙酸，更优选盐酸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中Ra、Rb各自独立地选自被乙酰基、甲氧基乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、新戊酰基、甲酰基或苯甲酰基保护的氨基，优选被乙酰基或三氟乙酰基保护的氨基，更优选被乙酰基保护的氨基。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中所述反应的酸选自无机酸或有机酸，优选盐酸、醋酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、草酸、柠檬酸、苯磺酸、取代的苯磺酸、苯甲酸、取代的苯甲酸、马来酸、三氟乙酸、甲磺酸、取代的甲磺酸、二氯乙酸、二氟乙酸，更优选盐酸。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其中所述的式(V)所示化合物与酸的摩尔比为1:1～1:10。
5.一种依喜替康或其可药用盐的制备方法，包括式(IV)所示化合物与式(VI)所示化合物反应制备式(III)所示化合物的步骤，
Figure FDA0003577506960000012
其中，
Ra为被氨基保护基保护的氨基，R1’选自氨基或Ra，
Z为酸根，选自无机酸或有机酸，优选盐酸、醋酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、草酸、柠檬酸、苯磺酸、取代的苯磺酸、苯甲酸、取代的苯甲酸、马来酸、三氟乙酸、甲磺酸、取代的甲磺酸、二氯乙酸、二氟乙酸，更优选盐酸。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中所述氨基保护基选自乙酰基、甲氧基乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、新戊酰基、甲酰基或苯甲酰基，优选乙酰基或三氟乙酰基，更优选乙酰基。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，所述方法还包括式(V)所示化合物与酸反应制备式(IV)所示化合物的步骤，
Figure FDA0003577506960000021
其中，
Ra、Rb各自独立地选自被氨基保护基保护的氨基，
Z为酸根，选自无机酸或有机酸，优选盐酸、醋酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、草酸、柠檬酸、苯磺酸、取代的苯磺酸、苯甲酸、取代的苯甲酸、马来酸、三氟乙酸、甲磺酸、取代的甲磺酸、二氯乙酸、二氟乙酸，更优选盐酸。
8.根据权利要求5-7任意一项所述的制备方法，其中所述方法还包括分离式(IV)所示化合物的步骤。
9.根据权利要求5-8任意一项所述的制备方法，其中R1’选自Ra，所述方法还包括式(III)所示化合物脱保护基制备依喜替康的步骤。
10.一种如式(I)所示化合物或其可药用盐的制备方法，包括权利要求5-9任意一项所述的制备依喜替康或其可药用盐的步骤，
Figure FDA0003577506960000022
其中，
R1、R2各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、3-6元环烷基、6-10元芳基或5-10元杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、芳基、杂芳基任选被一个或多个选自C1-C6烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、3-6元环烷基、6-10元芳基或C1-C6烷氧基的取代基所取代，
或者，R1和R2与其相连接的碳原子一起形成任选被一个或多个选自C1-C6烷基、卤素、羟基、氨基、氧代或C1-C6烷氧基的取代基所取代的3-6元环烷基；
R3、R4、R5各自独立地选自氢原子或C1-6烷基；
R6选自氢原子、氘原子、C1-6烷基、6-10元芳基或5-10元杂芳基，其中所述的烷基、芳基、杂芳基任选被一个或多个选自C1-C6烷基、卤素、羟基、氨基和氧代的取代基所取代；
n为2至8的整数；
m为0至4的整数。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其中R1选自氢原子、C1-6烷基、3-6元环烷基、6-10元芳基或5-10元杂芳基，其中所述的烷基、环烷基、芳基、杂芳基任选被一个或多个选自C1-C6烷基、卤素、羟基、氨基、氧代、3-6元环烷基、6-10元芳基或C1-C6烷氧基的取代基所取代，
R2选自氢原子或任选被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、氧代的取代基所取代的C1-C6烷基，
或者，R1和R2与其相连接的碳原子一起形成任选被一个或多个选自C1-C6烷基、卤素、羟基、氨基、氧代或C1-C6烷氧基的取代基所取代的3-6元环烷基。
12.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中R1选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、3-6元环烷基取代的C1-6烷基、6-10元芳基取代的C1-6烷基、3-6元环烷基、6-10元芳基或5-10元杂芳基，R2为氢原子，或者R1和R2与其相连接的碳原子一起形成3-6元环烷基；优选R1选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、3-6元环烷基，R2为氢原子，或者R1和R2与其相连接的碳原子一起形成3-6元环烷基。
13.根据权利要求10-12任意一项所述的制备方法，其中R3、R4、R5均为氢原子。
14.根据权利要求10-13任意一项所述的制备方法，其中R6选自氢原子、C1-6烷基，卤代C1-6烷基或羟基C1-6烷基，更优选氢原子。
15.根据权利要求10所述的制备方法，其中所述的式(I)所示化合物选自
Figure FDA0003577506960000041
16.一种制备抗体-药物偶联物的方法，包括权利要求10-15任意一项所述的制备式(I)所示化合物的步骤，以及Ab还原后，与式(I)所示化合物偶联反应，得到式(X)所示的抗体-药物偶联物的步骤，
Figure FDA0003577506960000042
其中Ab为抗体或抗原结合片段，k为1至20，R1、R2、R3、R4、R5、R6、m、n如权利要求1所述。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其中所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体；优选为单克隆抗体。
18.根据权利要求16或17所述的制备方法，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体或抗Mesothelin抗体或其抗原结合片段。
19.根据权利要求16-18任意一项所述的制备方法，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自Trastuzumab、Pertuzumab、Nimotuzumab、Enoblituzumab、Emibetuzumab、Inotuzumab、Pinatuzumab、Brentuximab、Gemtuzumab、Bivatuzumab、Lorvotuzumab、cBR96、Glematumamab，或其抗原结合片段。
20.根据权利要求16-19任意一项所述的制备方法，其中k为2至8，优选为5至9。
21.根据权利要求16-20任意一项所述的制备方法，其中所述方法包括
Figure FDA0003577506960000051
22.一种固体形式的式(IV)所示化合物，
Figure FDA0003577506960000052
其中Ra、Z的定义如权利要求1所述，优选Ra为被乙酰基保护的氨基，Z为盐酸。
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