CN115181728A - 抑制丝氨酸代谢的物质在通过调节IGF1-p38轴调控巨噬细胞极化中的应用 - Google Patents
抑制丝氨酸代谢的物质在通过调节IGF1-p38轴调控巨噬细胞极化中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115181728A CN115181728A CN202210906548.7A CN202210906548A CN115181728A CN 115181728 A CN115181728 A CN 115181728A CN 202210906548 A CN202210906548 A CN 202210906548A CN 115181728 A CN115181728 A CN 115181728A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phgdh
- igf1
- protein
- substance
- macrophages
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 title claims abstract description 187
- 230000010287 polarization Effects 0.000 title claims abstract description 92
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 89
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 102100037579 D-3-phosphoglycerate dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract description 114
- 101000739890 Homo sapiens D-3-phosphoglycerate dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 113
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 54
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 28
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 104
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 claims description 63
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 claims description 63
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 claims description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 101150088952 IGF1 gene Proteins 0.000 claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 25
- 101150094707 PHGDH gene Proteins 0.000 claims description 24
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 claims description 16
- 101150034559 IGF1R gene Proteins 0.000 claims description 9
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- -1 small molecule compound Chemical class 0.000 claims description 7
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 6
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 4
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 101001034652 Homo sapiens Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 claims 13
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 74
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 25
- QBVIRPJBDIZKBC-UHFFFAOYSA-N ethyl 5-(furan-2-carbonylamino)-3-methyl-4-thiocyanatothiophene-2-carboxylate Chemical compound CC1=C(C(=O)OCC)SC(NC(=O)C=2OC=CC=2)=C1SC#N QBVIRPJBDIZKBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 21
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 abstract description 13
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 abstract description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 abstract description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 abstract 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 abstract 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 abstract 1
- 210000004979 bone marrow derived macrophage Anatomy 0.000 description 52
- 101710184277 Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 description 41
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 33
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 33
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 29
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 25
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 19
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 18
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 17
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 16
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 108010011005 STAT6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 12
- 102100023980 Signal transducer and activator of transcription 6 Human genes 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 201000007966 PHGDH deficiency Diseases 0.000 description 11
- 108700000932 Phosphoglycerate Dehydrogenase Deficiency Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 102200021564 rs121907988 Human genes 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 108010076864 Nitric Oxide Synthase Type II Proteins 0.000 description 10
- 102000011779 Nitric Oxide Synthase Type II Human genes 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 10
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 10
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 9
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 102100021723 Arginase-1 Human genes 0.000 description 8
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 101000752037 Homo sapiens Arginase-1 Proteins 0.000 description 7
- 101000800287 Homo sapiens Tubulointerstitial nephritis antigen-like Proteins 0.000 description 7
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 7
- 208000016105 neurometabolic disorder due to serine deficiency Diseases 0.000 description 7
- 201000007974 serine deficiency Diseases 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 6
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 6
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 6
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 5
- 108010000837 Janus Kinase 1 Proteins 0.000 description 5
- 108010019437 Janus Kinase 2 Proteins 0.000 description 5
- 208000006552 Lewis Lung Carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 102100033438 Tyrosine-protein kinase JAK1 Human genes 0.000 description 5
- 102100033444 Tyrosine-protein kinase JAK2 Human genes 0.000 description 5
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 4
- HFNKQEVNSGCOJV-OAHLLOKOSA-N ruxolitinib Chemical compound C1([C@@H](CC#N)N2N=CC(=C2)C=2C=3C=CNC=3N=CN=2)CCCC1 HFNKQEVNSGCOJV-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101150112082 Gpnmb gene Proteins 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 239000002144 L01XE18 - Ruxolitinib Substances 0.000 description 3
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 3
- 239000012826 P38 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 101150109676 Rgs1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 3
- 229960000215 ruxolitinib Drugs 0.000 description 3
- 101150024819 s1pr1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000042838 JAK family Human genes 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000003690 classically activated macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- MIDKPVLYXNLFGZ-UHFFFAOYSA-N n'-(1,8-dimethylimidazo[1,2-a]quinoxalin-4-yl)ethane-1,2-diamine;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=C(C)C=C2N3C(C)=CN=C3C(NCCN)=NC2=C1 MIDKPVLYXNLFGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- HBUBKKRHXORPQB-FJFJXFQQSA-N (2R,3S,4S,5R)-2-(6-amino-2-fluoro-9-purinyl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O HBUBKKRHXORPQB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- NOVSNECFFPLHQV-VGMFFHCQSA-N (2S)-2-amino-2-phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 NOVSNECFFPLHQV-VGMFFHCQSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 1
- 101710129000 Arginase-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000011814 C57BL/6N mouse Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- HMFDVPSBWOHOAP-YUMQZZPRSA-N Glutathione ethyl ester Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CSCC)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O HMFDVPSBWOHOAP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 101710197072 Lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 101100452300 Mus musculus Igf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001047513 Mus musculus Lethal(2) giant larvae protein homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091008099 NLRP3 inflammasome Proteins 0.000 description 1
- 101150100944 Nos2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010038555 Phosphoglycerate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700024319 S-ethyl glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 1
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000010864 dual luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019722 synbiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01095—Phosphoglycerate dehydrogenase (1.1.1.95)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/71—Oxidoreductases (EC 1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了抑制丝氨酸代谢的物质在通过调节IGF1‑p38轴调控巨噬细胞极化中的应用。本发明首先发现通过基因敲除或用PHGDH的抑制剂CBR‑5884处理来阻断丝氨酸生物合成途径,在体外和体内都能显著增强M(IFN‑γ)极化,但抑制M(IL‑4)极化。此外,限制外源丝氨酸和甘氨酸也会产生类似的效果。在机制上,本发明发现抑制内源性和外源性丝氨酸代谢通过减少SAM介导的IGF1启动子区组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)来促进IGF1的表达,随后IGF1通过激活p38依赖的JAK1‑JAK2‑STAT1轴,从而促进M(IFN‑γ)极化,抑制STAT6介导的M(IL‑4)表型。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及抑制丝氨酸代谢的物质在通过调节IGF1-p38轴调控巨噬细胞极化中的应用。
背景技术
巨噬细胞由骨髓单核细胞分化成熟而来,其受环境刺激后极化成不同表型和功能的细胞亚群,巨噬细胞极化到不同的激活状态,在宿主防御、炎症和肿瘤发展等过程中发挥不同的功能,主要包括经典激活型巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和替代激活型巨噬细胞(M2型巨噬细胞)。M1型巨噬细胞通常由干扰素(IFN-γ)和/或细菌脂多糖(LPS)激活,表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和促炎细胞因子,如IL-6、IL-1β和TNFα。M2型巨噬细胞通常由IL-4或IL-13激活,产生精氨酸酶1(ARG1)、巨噬细胞半乳糖型凝集素1(MGL1)和抗炎细胞因子,如IL-10。因此,M1型巨噬细胞具有杀菌、促炎和抗肿瘤的功能,而M2型巨噬细胞具有清除蠕虫、修复组织、抗炎和促肿瘤的功能。
目前越来越多的研究支持巨噬细胞活化与细胞代谢变化密切相关的观点。在巨噬细胞激活期间,各种代谢途径被重新编程以适应细胞功能的变化,从而促进特定的免疫表型。某些氨基酸代谢的改变是定义巨噬细胞亚群最早和最重要的特征之一。L-精氨酸在M1型巨噬细胞中被iNOS转化为NO,而在M2型巨噬细胞中被ARG1代谢。此外,谷氨酰胺已被证明通过α-酮戊二酸的产生来协调巨噬细胞的极化。然而,其他氨基酸的代谢是否在调控巨噬细胞极化中发挥作用,目前尚不清楚。
发明内容
本发明的一个目的是提供如下A1)-A3)中任一种物质的新用途。
A1)抑制丝氨酸代谢的物质;
A2)抑制PHGDH蛋白活性的物质;
A3)降低PHGDH蛋白含量的物质。
本发明提供了上述A1)-A3)中任一种物质在制备促进巨噬细胞向M1型极化和/或抑制巨噬细胞向M2型极化的产品中的应用。
上述应用中,所述抑制丝氨酸代谢的物质或抑制PHGDH蛋白活性的物质或降低PHGDH蛋白含量的物质通过减少S-腺苷甲硫氨酸介导的IGF1启动子区组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)来促进IGF1的表达,进而所述IGF1通过激活p38依赖的JAK1-JAK2-STAT1轴,从而促进巨噬细胞向M1型极化和/或抑制巨噬细胞向M2型极化。
进一步的,所述抑制丝氨酸代谢的物质可为抑制外源性丝氨酸代谢的物质和/或抑制内源性丝氨酸代谢的物质。
所述抑制外源性丝氨酸代谢的物质具体可为丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-苏氨酸转运体抑制剂L-苯甘氨酸。
所述抑制内源性丝氨酸代谢的物质具体可为抑制PHGDH蛋白活性的物质或降低PHGDH蛋白含量的物质。
更进一步的,所述抑制PHGDH蛋白活性的物质可为抑制PHGDH蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物。
所述降低PHGDH蛋白含量的物质可为抑制PHGDH蛋白合成或促进PHGDH蛋白降解或敲低或敲除PHGDH基因的物质。
在本发明的具体实施方式中,所述抑制PHGDH蛋白活性的物质为CBR-5884。
在本发明的具体实施方式中,所述敲低PHGDH基因的物质为抑制PHGDH基因表达的siRNA(如siPHGDH:5′-GGGAGCGGGAGATCGAGAA-3′)或shRNA。
在本发明的具体实施方式中,所述敲除PHGDH基因的物质可为PHGDH基因编辑系统;所述PHGDH基因编辑系统包括Cas9核酸酶和靶向PHGDH基因的sgRNA。
本发明的另一个目的是提供S-腺苷甲硫氨酸的新用途。
本发明提供了S-腺苷甲硫氨酸在制备抑制巨噬细胞向M1型极化和/或促进巨噬细胞向M2型极化的产品中的应用。
本发明还有一个目的是提供如下B1)或B2)所示的物质的新用途:
B1)抑制IGF1R或IGF1蛋白活性的物质;
B2)降低IGF1R或IGF1蛋白含量的物质。
本发明提供了上述B1)或B2)所示的物质在制备抑制巨噬细胞向M1型极化和/或促进巨噬细胞向M2型极化的产品中的应用。
进一步的,所述抑制IGF1R或IGF1蛋白活性的物质可为抑制IGF1R或IGF1蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物。
所述降低IGF1R或IGF1蛋白含量的物质可为抑制IGF1R或IGF1蛋白合成或促进IGF1R或IGF1蛋白降解或敲低或敲除IGF1R或IGF1基因的物质。
更进一步的,所述敲低IGF1R或IGF1基因的物质可为抑制IGF1R或IGF1基因表达的siRNA或shRNA。在本发明的具体实施方式中,所述敲低IGF1R的siRNA为5’-CCAACGAGCAAGTTCTTCGTT-3’或5’-CAATGGTAACTTGAGTTACTA-3’;所述敲低IGF1的siRNA为5′-CAGGCATTGTGGATGAGTGTT-3′。
所述敲除IGF1R或IGF1基因的物质可为IGF1R或IGF1基因编辑系统;所述IGF1R或IGF1基因编辑系统包括Cas9核酸酶和靶向IGF1R或IGF1基因的sgRNA。
本发明还有一个目的是提供一种用于调控巨噬细胞极化的产品。
本发明提供的用于调控巨噬细胞极化的产品的活性成分为如下物质中的至少一种:上述抑制丝氨酸代谢的物质、上述抑制PHGDH蛋白活性的物质、上述降低PHGDH蛋白含量的物质、S-腺苷甲硫氨酸、上述抑制IGF1R或IGF1蛋白活性的物质、上述降低IGF1R或IGF1蛋白含量的物质。
本发明最后一个目的是提供M1型巨噬细胞的制备方法或促进巨噬细胞向M1型极化的方法或M2型巨噬细胞的制备方法或促进巨噬细胞向M2型极化的方法。
本发明提供的M1型巨噬细胞的制备方法或促进巨噬细胞向M1型极化的方法为如下C1)-C4)中任一种:
C1)抑制巨噬细胞中的丝氨酸代谢;
C2)抑制巨噬细胞中PHGDH蛋白的活性或降低巨噬细胞中PHGDH蛋白的含量;
C3)降低巨噬细胞中S-腺苷甲硫氨酸的含量;
C4)增加巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的活性或提高巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的含量;
本发明提供的M2型巨噬细胞的制备方法或促进巨噬细胞向M2型极化的方法为如下D1)-D4)中任一种:
D1)促进巨噬细胞中的丝氨酸代谢;
D2)增加巨噬细胞中PHGDH蛋白的活性或提高巨噬细胞中PHGDH蛋白的含量;
D3)增加巨噬细胞中S-腺苷甲硫氨酸的含量;
D4)抑制巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的活性或降低巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的含量。
上述C1)所述方法中,所述抑制巨噬细胞中的丝氨酸代谢的方法为将上述抑制丝氨酸代谢的物质导入巨噬细胞中。
上述C2)所述方法中,所述抑制巨噬细胞中PHGDH蛋白的活性的方法为将上述抑制PHGDH蛋白活性的物质导入巨噬细胞中。所述降低巨噬细胞中PHGDH蛋白的含量的方法为将上述降低PHGDH蛋白含量的物质导入巨噬细胞中。
上述C3)所述方法中,所述降低巨噬细胞中S-腺苷甲硫氨酸的含量的方法为将降低S-腺苷甲硫氨酸含量的物质导入巨噬细胞中。
上述C4)所述方法中,所述增加巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的活性的方法为将增加IGF1R或IGF1蛋白活性的物质导入巨噬细胞中。所述提高巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的含量的方法为将提高IGF1R或IGF1蛋白含量的物质导入巨噬细胞中。
上述D1)所述方法中,所述促进巨噬细胞中的丝氨酸代谢的方法为将促进丝氨酸代谢的物质导入巨噬细胞中。
上述D2)所述方法中,所述增加巨噬细胞中PHGDH蛋白的活性的方法为将增加PHGDH蛋白活性的物质导入巨噬细胞中。所述提高巨噬细胞中PHGDH蛋白的含量的方法为将提高PHGDH蛋白含量的物质导入巨噬细胞中。
上述D3)所述方法中,所述增加巨噬细胞中S-腺苷甲硫氨酸的含量的方法为将增加S-腺苷甲硫氨酸含量的物质导入巨噬细胞中。
上述D4)所述方法中,所述抑制巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的活性的方法为将上述抑制IGF1R或IGF1蛋白活性的物质导入巨噬细胞中。所述降低巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的含量的方法为将上述降低IGF1R或IGF1蛋白含量的物质导入巨噬细胞中。
上述方法或按照上述方法制备得到的细胞在筛选调控巨噬细胞极化的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述M1型巨噬细胞为IFN-γ或/和LPS激活的M1型巨噬细胞。
上述任一所述M2型巨噬细胞为IL-4激活的M2型巨噬细胞。
上述任一所述PHGDH(磷酸甘油酸脱氢酶)在NCBI中的Gene ID为236539。
上述任一所述p38(促分裂素原活化蛋白激酶)在NCBI中的Gene ID为26416。
上述任一所述JAK1(Janus激酶1)在NCBI中的Gene ID为16451。
上述任一所述JAK2(Janus激酶2)在NCBI中的Gene ID为16452。
上述任一所述STAT1(转录激活因子1)在NCBI中的Gene ID为20846。
上述任一所述IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)在NCBI中的Gene ID为16001。
上述任一所述IGF1(胰岛素样生长因子1)在NCBI中的Gene ID为16000。
本申请受到天津市自然科学基金项目(20JCYBJC00220)的资助。
本发明首先发现通过基因敲除PHGDH或用PHGDH的抑制剂CBR-5884处理来阻断丝氨酸生物合成途径,在体外和体内都能显著增强M(IFN-γ)极化,但抑制M(IL-4)极化。此外,限制外源丝氨酸和甘氨酸也会产生类似的效果。在机制上,发现抑制内源性和外源性丝氨酸代谢通过减少SAM介导的IGF1启动子区H3K27me3的丰度来促进IGF1的表达,随后IGF1通过激活p38依赖的JAK1-JAK2-STAT1轴,从而促进M(IFN-γ)极化,抑制STAT6介导的M(IL-4)表型。综上所述,本发明发现并阐明了一个之前未知的机制,即丝氨酸代谢在调控巨噬细胞极化中发挥关键作用。
附图说明
图1为PHGDH通过其酶活性抑制M(IFN-γ)极化但促进M(IL-4)极化。
图2为体外丝氨酸代谢调控巨噬细胞极化。
图3为体内丝氨酸代谢调控巨噬细胞极化。
图4为丝氨酸代谢通过p38-JAK-STAT1信号轴调控巨噬细胞极化。
图5为丝氨酸代谢衍生的SAM调控巨噬细胞极化。
图6为丝氨酸代谢通过增加SAM依赖的IGF1启动子区H3K27me3的丰度来降低IGF1的表达。
图7为IGF1在体外和体内促进巨噬细胞向M1型极化、抑制巨噬细胞向M2型极化。
图8为丝氨酸代谢缺乏通过IGF1依赖的p38激活JAK-STAT1信号轴调控巨噬细胞极化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中涉及的小鼠实验材料及制备方法如下:
所有小鼠均以C57BL/6为背景,在天津医科大学动物实验室无特定病原体的条件下,在受控温度(22℃±2℃)下维持12h光/12h暗周期。除非另有说明,小鼠以标准饮食(#1010049,协同生物)和随意提供的水喂养。所有动物实验均经天津医科大学伦理委员会批准。
Phgdhfl/fl小鼠(Phgdh基因侧翼插入loxP序列的C57BL/6小鼠):由赛业生物科学公司(中国广州)采用CRISPR-Cas9技术培育而成。
IGF1Rfl/fl小鼠(IGF1R基因侧翼插入loxP序列的C57BL/6小鼠)记载于文献“Spadaro,O.,et al.,Growth Hormone Receptor Deficiency Protects against Age-Related NLRP3 Inflammasome Activation and Immune Senescence.Cell Rep,2016.14(7):p.1571-1580.”中。
Lyz2-Cre小鼠记载于文献“Shen,L.,et al.,Serine metabolism antagonizesantiviral innate immunity by preventing ATP6V0d2-mediated YAP lysosomaldegradation.Cell Metab,2021.33(5):p.971-987e6”中。
所有实验组均采用年龄和性别匹配的6-12周龄小鼠。小鼠的基因型用以下引物对鼠尾DNA进行PCR分析:
Phgdh lox-F:5’-GCGTTTACAGCCATCTTCCTTCC-3’;
Phgdh lox-R:5’-ATCCTAAGCTGCATCCTATC-3’;
IGF1R lox-F:5’-CTTCCCAGCTTGCTACTAGG-3’;
IGF1R lox-R:5’-CAGGCTGCAGAGAGACATGGG-3’;
Lyz2-cre-F:5’-CCGAAATGCAATTACG-3’;
Lyz2-cre-R:5’-TCTGGCTGCAGAATTTCTG-3’。
下述实施例涉及的质粒及其来源如下:
pKLO.1-shCtrl质粒、VSV-G质粒、psPAX2质粒、pKLO.1-shPhgdh质粒、空载体质粒和PHGDH表达质粒均记载于文献“Shen,L.,et al.,Serine metabolism antagonizesantiviral innate immunity by preventing ATP6V0d2-mediated YAP lysosomaldegradation.Cell Metab,2021.33(5):p.971-987 e6”中。
下述实施例中涉及的细胞系来源与培养方法、原代巨噬细胞及其分离与培养方法如下:
RAW264.7细胞(ATCC,TIB-71)、HCC70细胞(ATCC,CRL-2315)和T47D细胞(ATCC,HTB-133)是在含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素(PS)的RPMI1640培养基(Hyclone,#SH30809.01)中培养,培养条件:37℃、5%CO2。
MCF-7细胞(ATCC,HTB-22)和LLC细胞(ATCC,CRL-1642)是在含有10%胎牛血清和1%PS的DMEM培养基(Hyclone,#SH30243.01)中培养,培养条件:37℃、5%CO2。
MDA-MB-468细胞(ATCC,HTB-132)是在含有10%胎牛血清和1%PS的Leibovitz'sL-15培养基(Gibco,#11415-064)中培养,培养条件:37℃、无二氧化碳。
腹腔源巨噬细胞分离与培养方法:每只小鼠腹腔注射1ml硫胶质(3:100;#225650,BD)。第4天处死小鼠,经腹腔注射8ml预冷至4℃的含有3%FBS的PBS,缓慢提取腹腔液,离心分离。红细胞用红细胞裂解液(#R1010,Solarbio)裂解,再重悬在含有10%FBS的RPMI-1640培养基中培养,培养条件:37℃、5%CO2。
骨髓源巨噬细胞(BMDM)分离与培养方法:从小鼠的胫骨和股骨分离骨髓来源的巨噬细胞,在含有10%胎牛血清和30%L929培养上清液的RPMI1640培养基中培养,培养条件:37℃、5%CO2。
下述实施例中涉及的试剂及其来源如下:
CBR-5884(#HY-100012,MCE);L-phenylglycine((#237647,Sigma-Aldrich);SB203580(#HY-10256,MCE);Fludarabine(#HY-B0069,MCE);BMS-345541 hydrochloride(#HY-10518,MCE);AS1517499(#HY-100614,MCE);Ruxolitinib(#HY-50856,MCE);IFN-β(100ng/ml;#50708-MCCH,SinoBiological);Sodium formate(1mM;#247596,Sigma-Aldrich);Glutathione ethylester(1mM;#G1404,Sigma-Aldrich),S-Adenosylmethionine(0.2mM;#A506555,Sigma-Aldrich)。IFN-γ(100ng/ml;#50709-MNAH,SinoBiological)、IL-4(20ng/ml;#404-ML,R&D Systems)。
下述实施例中涉及的实验方法如下:
免疫荧光染色:用F4/80(1:200;#ab16911,abcam);CD11b(1:200;#ab133357,abcam);ARG1(1:1000;#93668S,cst);IL-6(1:200;#AF-406-NA,R&D Systems研发系统);IL-1β(1:200;#9722,abcam)和iNOS(1:200;#13120S,cst)一抗对5μm厚的冰冻切片进行免疫荧光染色。然后用Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594偶联的二抗在荧光显微镜下对染色的切片进行成像。用ImageJ软件对图像进行分析。
免疫组织化学染色:收集肿瘤标本,用4%多聚甲醛固定24-48h,乙醇梯度脱水,石蜡包埋后,切成5μm的切片,用一、二抗连续孵育,免疫组织化学染色。细胞核用DAPI染色,在荧光显微镜下进行图像分析。使用的抗体如下:CD4(1:200;#14-9766-82,Invitgen);CD8a(1:200;#14-0808-82,Invitgen);Foxp3(1:200;#14-5773-80,Invitgen)。
Western blot(WB)检测:细胞裂解采用RIPA裂解缓冲液,裂解缓冲液中添加了蛋白酶抑制剂。用SDS-PAGE分离等量蛋白质,进行免疫印迹分析,用特异性抗体分析目的蛋白水平。使用ECL化学发光试剂盒(WBKLS0500,MilliPore)实现可视化。所用抗体如下:PHGDH(1:1000;ab240744,Abcam);iNOS(1:1000;#13120S,CST);ARG1(1:1000;#93668S,CST);β-actin(1:1000;#sc-47778,Santa Cruz);Tubulin(1:1000;#ab7792,Abcam);FLAG(1:1000;#F1804,Sigma);p-JAK1(Y1034/1035)(1:1000;#74129S,CST);JAK1(1:1000;#3344S,CST);p-JAK2(Y1008)(1:1000;#8082S,CST);JAK2(1:1000;#3230S,CST);p-STAT1(Y701)(1:1000;#8826S,CST);STAT1(1:1000;#14994S,CST);p-p38(T180/Y182)(1:1000;#4511T,CST);p38(1:1000;#8690T,CST);p-STAT6(Y641)(1:1000;#56554S,CST);STAT6(1:1000;#5397S,CST);p-ERK(T202/Y204)(1:1000;#4370T,CST);ERK(1:1000;#4695T,CST);p-JNK(T183/Y185)(1:1000;#4668T,CST);JNK(1:1000;#9252T,CST);p-AKT(S473)(1:1000;#9271S,CST);AKT(1:1000;#D153569-0025,Sangon Biotech);p-mTOR(S2448)(1:1000;#5536T,CST);mTOR(1:1000;#2983T,CST);p-S6K(S371)(1:1000;#9208T,CST);S6K(1:1000;#AF0258,Beyotime)。
酶联免疫吸附试验和丝氨酸测定:用小鼠IGF1酶联免疫吸附试验试剂盒(#EK0378,Boster)测定条件培养基中的IGF1蛋白。用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)酶联免疫吸附试验试剂盒(#CEG414Ge,Cloud-Clone)或DL-丝氨酸分析试剂盒(#K743,BioVision)分别测定样品中的S-腺苷甲硫氨酸和丝氨酸浓度。检测按照试剂制造商的说明书进行。
流式细胞术:样品中的红细胞用红细胞裂解液(#R1010,Solarbio)裂解。然后将细胞过滤,制成单细胞悬液,在缓冲液(2%BSA)中进行特异性表面抗体染色。将细胞洗涤3次,然后在冰上与抗体孵育,再使用FACSVerse(BD)进行FACS。所使用的抗体是CD45-PE(#103105,Biolegend)、CD170-FITC(#155504,Biolegend)、F4/80-PE-Cy5(#123112,Biolegend)、CD11b-APC(#101211,Biolegend)、干扰素γ-Rα(#12753,Santa Cruz)、干扰素γ-Rβ(#12752,Santa Cruz)、Alexa Fuor488山羊抗仓鼠(Armenian)IgG抗体(#405508,Biolegend)。用FlowJo(Tree Star)软件进行数据分析。
RNA提取与RT-PCR:用TRIZOL试剂(#15596018,Invitgen)提取总RNA,然后用逆转录系统(#24408,Bimake)逆转录。用SYBR Green PCR Mix(#B21203,Bimake)和设计的引物在ABI-7300检测系统中进行定量RT-PCR分析。使用β-actin作为内参。qPCR的引物序列如下:
β-actin-F:5’-CCTCATTGTCCGGTCTGCTAC-3’;
β-actin-R:5’-CATCTTTCATCGAAGCTGTTGC-3’;
Nos2-F:5’-GAAACGCTTCACTTCCAATG-3’;
Nos2-R:5’-AATCCACAACTCGCTCCAA-3’;
Il-6-F:5’-TTGCCTTCTTGGGACTGAT-3’;
Il-6-R:5’-TTGCCATTGCACAACTCTT-3’;
Il-1β-F:5’-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3’;
Il-1β-R:5’-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3’;
Arg1-F:5’-CCACAGTCTGGCAGTTGGAAG-3’;
Arg1-R:5’-GGTTGTCAGGGGAGTGTTGATG-3’;
Mgl1-F:5’-CAGAATCGCTTAGCCAATGTGG-3’;
Mgl1-R:5’-TCCCAGTCCGTGTCCGAAC-3’;
Mgl2-F:5’-TTCAAGAATTGGAGGCCACT-3’;
Mgl2-R:5’-CAGACATCGTCATTCCAACG-3’;
Retnla-F:5’-CCAATCCAGCTAACTATCCCTCC-3’;
Retnla-R:5’-CACTTGGTGGTTTGCTACG-3’;
Tnf-α-F:5’-CCTCTTCTCATTCCTGCTTG-3’;
Tnf-α-R:5’-GTCACCCCGTCCACATCTT-3’;
Igf1-F:5’-CTGGACCAGAGACCCTTTGC-3’;
Igf1-R:5’-GGACGGGGACTTCTGAGTCTT-3′;
Rgs1-F:5’-TCTGGGATGAAATCGGCCAAG-3’;
Rgs1-R:5’-GCATCTGAATGCACAAATGCTT-3’;
Atp6v0d2-F:5’-CAGAGCTGTACTTCAATGTGGAC-3’;
Atp6v0d2-R:5’-AGGTCTCACACTGCACTAGGT-3’;
S1pr1-F:5’-ATGGTGTCCACTAGCATCCC-3’;
S1pr1-R:5’-CGATGTTCAACTTGCCTGTGTAG-3’;
Tgm2-F:5’-GACAATGTGGAGGAGGGATCT-3’;
Tgm2-R:5’-CTCTAGGCTGAGACGGTACAG-3’;
Slc6a8-F:5’-GCAGGGTGTGCATATCTCCAA-3’;
Slc6a8-R:5’-TACCCCCACTCACATCAGTCA-3’;
C77080-F:5’-CCACAGGGATTCCGAACCC-3’;
C77080-R:5’-CAGAGCACTCGCAGGACTC-3’;
Oit3-F:5’-CACCTGCGGTCCTAGATCCT-3’;
Oit3-R:5’-GCAAAGAGGTTGATTCTGGGA-3’;
Gpnmb-F:5’-GCTGGTCTTCGGATGAAAATGA-3’;
Gpnmb-R:5’-CCACAAAGGTGATATTGGAACCC-3’。
RNA-seq分析:收集WT和KO-BMDMs、有无丝氨酸缺乏处理的BMDMs以及siControl或siPHGDH的RAW264.7细胞,提取总RNA。使用MGISEQ-2000进行RNA-Seq,并根据标准协议(北京华大基因研究所)对转录数据进行分析和比对,所有测序数据已提交到国家生物技术信息中心基因表达总集(NCBI GEO)数据库,登录号为GEO:GSE165684;GSE196840。
丝氨酸和甘氨酸缺乏实验(SG饥饿处理):
巨噬细胞SG饥饿处理:巨噬细胞(腹腔来源源巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞)正常条件下在添加透析FBS(1:10;#26400-044,Gibco)、D-葡萄糖(17mM;#G7021,Sigma-Aldrich)、PS(1:100;#15140-122,Gibco)和丝氨酸(400μM;#S4311,Sigma-Aldrich)和甘氨酸(400μM;#G5417,Sigma-Aldrich)的MEM培养液(Thermo Scientific,#11090-081)中培养,SG饥饿处理是在缺乏丝氨酸和甘氨酸的培养基中进行培养。
小鼠SG饥饿处理:小鼠在实验前预先喂食对照饲料(#M10006,BioPike)或丝氨酸和甘氨酸缺乏的饲料(#M19053001,BioPike),为期两周。
染色质免疫沉淀(ChIP)分析:在H3K27me3ChIP实验中,BMDM用1%的甲醛交联,然后用125mM甘氨酸封闭。细胞裂解产物经超声处理后,用H3K27me3抗体(#ab6002,Abcam)进行免疫沉淀。用定量聚合酶链式反应检测回收的DNA免疫复合体和输入DNA(input DNA)中目的基因的启动子序列。将数据归一化到相应的输入DNA对照,并使用Simple Chip Plus超声染色质IP试剂盒(#56383,Cst)进行实验步骤。所用的引物如下:
IGF1-3000-F(IP:H3K27me3):5’-TCCTCTTTAGCACATTGTG-3’;
IGF1-3000-R(IP:H3K27me3):5’-GAGTGGAGGAAAGGGGCTCT-3’;
IGF1-2000-F(IP:H3K27me3):5’-CTGGAATACAAAGAAATG-3’;
IGF1-2000-R(IP:H3K27me3):5’-CCATTAGCTGGATGCTGGCCA-3’;
IGF1-1000-F(IP:H3K27me3):5’-AATGAGGTGGAA-3’;
IGF1-1000-R(IP:H3K27me3):5’-GGAGAAGGAATGCTGT-3’;
IGF1-200-F(IP:H3K27me3):5’-TCAAACCAACTA-3’;
IGF1-200-R(IP:H3K27me3):5’-GCTGGCTAGCAATACTCTCTC-3’。
双荧光素酶报告基因分析:将IGF1-Luc基因转入RAW264.7细胞,并以胸苷激酶调控的Renilla荧光素酶为内对照。按照图示处理细胞后,用裂解缓冲液收集细胞,并使用双重荧光素酶分析试剂盒(#E1910,Promega)分析荧光素酶活性。
下述实施例中的数据统计分析方法如下:
样本数量和显著性程度在附图中表示。显著性水平由t检验确定。荧光成像分析采用盲法。这些数据代表了三个独立的实验,数据以平均值±SEM值表示。使用GraphPadPrism软件进行统计分析。<0.05被认为有意义(NS,无显著意义(p≥0.05),*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
下述实施例中涉及的专业术语含义如下:
M(IFN-γ):M1型巨噬细胞。
M(IL-4):M2型巨噬细胞。
实施例1、PHGDH通过其酶活性抑制M(IFN-γ)极化但促进M(IL-4)极化
为了探究丝氨酸生物合成途径中的限速酶PHGDH是否在M1或M2巨噬细胞极化中发挥作用进行了如下实验:
一、特异性PHGDH抑制剂CBR-5884对巨噬细胞极化的影响
供试细胞:
WT-BMDMs:来源于野生型C57BL/6N小鼠的骨髓源巨噬细胞。
将WT-BMDMs经15μM CBR-5884预处理12h,然后用IFN-γ(100ng/ml)刺激12h后qPCR或WB检测M1标志物的表达。同时以不经CBR-5884预处理作为对照。
将WT-BMDMs经15μM CBR-5884预处理12h,然后用IL-4(20ng/ml)刺激24h后qPCR或WB检测M2标志物的表达。同时以不经CBR-5884预处理作为对照。
结果显示:用特异性PHGDH抑制剂CBR-5884处理WT-BMDMs能够显著上调M1型特异性标志物基因mRNAs的表达,包括Nos2、Il-6和Il-1βmRNAs,并显著增强M(IFN-γ)骨髓源巨噬细胞(BMDM)iNOS的蛋白表达(图1a,b)。相反,用特异性PHGDH抑制剂CBR-5884处理WT-BMDMs能够抑制M2特异性标记基因的表达,并降低M(IL-4)骨髓源巨噬细胞(BMDM)ARG1的蛋白表达(图1c,d)。
二、CRISPR-Cas9敲除巨噬细胞中PHGDH对巨噬细胞极化的影响
供试细胞:
PHGDH-WT:来源于Phgdhfl/flLyz2-Cre-小鼠的骨髓源巨噬细胞。
PHGDH-KO:来源于Phgdhfl/flLyz2-Cre+小鼠的骨髓源巨噬细胞。
将PHGDH-WT或PHGDH-KO BMDMs用IFN-γ(100ng/ml)刺激12h,然后qPCR或WB检测M1标志物的表达。同时以不添加IFN-γ作为对照。
将PHGDH-WT或PHGDH-KO BMDMs用IL-4(20ng/ml)刺激24h,然后qPCR或WB检测M2标志物的表达。同时以不添加IL-4作为对照。
结果显示:与PHGDH-WT相比,在Phgdh敲除的原代巨噬细胞中M1标记物上调(图1e,f),M2标记物下调(图1g,h)。该结果与步骤一中结果一致,
三、shRNA或siRNA敲低巨噬细胞中PHGDH对巨噬细胞极化的影响
1、shRNA敲低巨噬细胞中PHGDH
shCtrl+EV:将pKLO.1-shCtrl质粒、VSV-G质粒和psPAX2质粒导入293T细胞经包装产生慢病毒,然后用该慢病毒感染RAW264.7细胞,感染48h后,用8μg/ml的嘌呤霉素筛选稳定的细胞株(shCtrl)。将空载体质粒导入此细胞株,获得表达空载体质粒的对照细胞(记作shCtrl+EV细胞)。
shPHGDH+EV:将pKLO.1-shPhgdh质粒、VSV-G质粒和psPAX2质粒导入293T细胞经包装产生慢病毒,然后用慢病毒感染RAW264.7细胞,感染48h后,用8μg/ml的嘌呤霉素筛选稳定的细胞株,获得PHGDH敲低巨噬细胞(shPHGDH)。将空载体质粒(EV)导入PHGDH敲低巨噬细胞,获得表达空载体质粒的PHGDH敲低巨噬细胞(记作shPHGDH+EV细胞)。
shPHGDH+PHGDH:将pKLO.1-shPhgdh质粒、VSV-G质粒和psPAX2质粒导入293T细胞经包装产生慢病毒,然后用慢病毒感染RAW264.7细胞,感染48h后,用8μg/ml的嘌呤霉素筛选稳定的细胞株,获得PHGDH敲低巨噬细胞(shPHGDH)。将PHGDH表达质粒导入PHGDH敲低巨噬细胞(shRNA),获得表达PHGDH的PHGDH敲低巨噬细胞(记作shPHGDH+PHGDH细胞)。
shPHGDH+PHGDH-V425M:将pKLO.1-shPhgdh质粒、VSV-G质粒和psPAX2质粒导入293T细胞经包装产生慢病毒,然后用慢病毒感染RAW264.7细胞,感染48h后,用8μg/ml的嘌呤霉素筛选稳定的细胞株,获得PHGDH敲低巨噬细胞(shPHGDH)。将PHGDH-V425M表达质粒(PHGDH-V425M表达质粒是将PHGDH表达质粒中编码PHGDH蛋白第425位氨基酸的密码子由gtg突变为atg后得到的质粒,以使PHGDH-V425M表达质粒表达的PHGDH蛋白的第425位氨基酸由V突变为M)导入PHGDH敲低巨噬细胞(shPHGDH),获得表达酶活突变的PHGDH(V425M)的PHGDH敲低巨噬细胞(记作shPHGDH+PHGDH-V425M细胞)。
2、siRNA敲低巨噬细胞中PHGDH
siCtrl+EV:将siCtrl(siCtrl:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)通过Lipofectamine2000(#11668,Invitrogen)导入RAW264.7细胞(siCtrl)。随之将空载体质粒导入细胞,获得表达空载体质粒的对照细胞(记作siCtrl+EV细胞)。
siPHGDH+EV:将siPHGDH(siPHGDH:5′-GGGAGCGGGAGATCGAGAA-3′)通过Lipofectamine 2000(#11668,Invitrogen)导入RAW264.7细胞,经鉴定,获得PHGDH敲低巨噬细胞(siPHGDH)。将空载体质粒导入PHGDH敲低巨噬细胞(siPHGDH),获得表达空载体质粒的PHGDH敲低巨噬细胞(记作siPHGDH+EV细胞)。
siPHGDH+PHGDH:将siPHGDH(siPHGDH:5′-GGGAGCGGGAGATCGAGAA-3′)通过Lipofectamine 2000(#11668,Invitrogen)导入RAW264.7细胞,经鉴定,获得PHGDH敲低巨噬细胞(siPHGDH)。将PHGDH表达质粒导入PHGDH敲低巨噬细胞(siPHGDH,获得表达PHGDH的PHGDH敲低巨噬细胞(记作siPHGDH+PHGDH细胞)。
siPHGDH+PHGDH-V425M:将siPHGDH(siPHGDH:5′-GGGAGCGGGAGATCGAGAA-3′)通过Lipofectamine 2000(#11668,Invitrogen)导入RAW264.7细胞,经鉴定,获得PHGDH敲低巨噬细胞(siPHGDH)。将PHGDH-V425M表达质粒导入PHGDH敲低巨噬细胞(siPHGDH),获得表达PHGDH-V425M的PHGDH敲低巨噬细胞(记作siPHGDH+PHGDH-V425M细胞)。
将上述步骤1和2中制备的各细胞用IFN-γ(100ng/ml)刺激12h,然后qPCR或WB检测M1标志物的表达。同时以不添加IFN-γ作为对照。
将上述步骤1和2中制备的各细胞用IL-4(20ng/ml)刺激24h,然后qPCR或WB检测M2标志物的表达。同时以不添加IL-4作为对照。
结果显示:在IFN-γ刺激的条件下,在RAW264.7细胞中敲低PHGDH会使iNOS的蛋白表达升高。除此之外,在RAW264.7细胞中,敲低PHGDH的同时过表达PHGDH会使因敲低导致M1标志物的升高被回复。然而,过表达酶活突变的PHGDH-V425M不能够使这一现象被回复,提示PHGDH的酶活性对其抑制巨噬细胞M1极化至关重要。此外,PHGDH的酶活性对于促进巨噬细胞M2极化也同样至关重要(图1i-l)。
综上所述,PHGDH可通过其酶活性调控巨噬细胞的极化。
实施例2、体外丝氨酸代谢调控巨噬细胞极化
为了探究是否外源性丝氨酸也能够调控巨噬细胞极化进行了如下实验:
1、丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-苏氨酸转运体(ASCT)抑制剂L-苯甘氨酸(L-phenylglycine)对巨噬细胞极化的影响
供试细胞:WT-BMDMs。
将WT-BMDMs经50μM特异性ASCT抑制剂L-phenylglycine预处理12h,然后用IFN-γ(100ng/ml)刺激12h,再用qPCR或WB检测M1标志物的表达。同时以不添加IFN-γ作为对照。
将WT-BMDMs经50μM特异性ASCT抑制剂L-phenylglycine预处理12h,然后用IL-4(20ng/ml)刺激24h,再用qPCR或WB检测M2标志物的表达。同时以不添加IL-4作为对照。
结果显示:利用丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-苏氨酸转运体(ASCT)抑制剂L-苯甘氨酸预处理,可增加IFN-γ诱导的M1标志物表达,但降低IL-4诱导的M2标志物表达(图2a-d)。
2、缺乏丝氨酸(Ser)和/或甘氨酸(Gly)对M1巨噬细胞极化的影响
供试细胞:WT-BMDMs。
将WT-BMDMs进行丝氨酸和/或甘氨酸饥饿处理12h,然后用IFN-γ(100ng/ml)刺激12h,再用qPCR检测M1标记物表达或WB检测iNOS的表达。同时以不添加IFN-γ作为对照。
结果显示:在培养基中单独缺乏丝氨酸或甘氨酸不会增加M1标志物的表达,而只有它们同时缺乏(-SG)才会导致M1极化增加(图2e、f)。
3、同时缺乏丝氨酸和甘氨酸对M2巨噬细胞极化的影响
供试细胞:WT-BMDMs。
将WT-BMDMs进行丝氨酸和甘氨酸饥饿处理12h,然后用IL-4(20ng/ml)刺激24h,再用qPCR或WB检测M2标志物的表达。同时以不添加IL-4作为对照。
结果显示:在SG缺乏的BMDM中M2标志物的表达显著减少(图2g、h)。
4、同时缺乏丝氨酸和甘氨酸对PHGDH敲除巨噬细胞极化的影响
供试细胞:
PHGDH-WT:来源于Phgdhfl/flLyz2-Cre-小鼠的骨髓源巨噬细胞。
PHGDH-KO:来源于Phgdhfl/flLyz2-Cre+小鼠的骨髓源巨噬细胞。
将PHGDH-WT或PHGDH-KO细胞进行SG饥饿处理12h后,再用IFN-γ(100ng/ml)刺激12h,然后qPCR或WB检测M1标志物的表达。同时以不添加IFN-γ作为对照。
将PHGDH-WT或PHGDH-KO细胞进行SG饥饿处理12h后,再用IL-4(20ng/ml)刺激24h,然后qPCR或WB检测M2标志物的表达。同时以不添加IL-4作为对照。
结果显示:与PHGDH-WT细胞相比,外源性SG缺乏(SG饥饿处理)的PHGDH-KO细胞中M1极化标志物的表达显著上调(图2i,j),表明内源性丝氨酸生物合成和外源性丝氨酸摄取对M1极化有很强的联合抑制作用。此外,还观察到PHGDH缺乏和外源性丝氨酸剥夺对M2极化调节也有协同效应(图2K,l)。
综上所述,体外丝氨酸代谢可调控巨噬细胞极化。
实施例3、体内丝氨酸代谢调控巨噬细胞极化
为了进一步研究髓系PHGDH在体内巨噬细胞极化中的作用进行了如下实验:
1、PHGDH缺乏对小鼠肺癌生长的影响
将和小鼠皮下注射2×106个小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)细胞,从接种后第4天开始每隔2天测量肿瘤体积。接种后21天观察肿瘤情况和测量肿瘤重量,用图示抗体对和小鼠的肿瘤切片进行免疫荧光染色并进行组织学半定量。
结果显示:将LLC细胞移植到小鼠和小鼠皮下,发现髓系PHGDH缺乏显著地抑制肿瘤的生长(图3a,b)。免疫荧光染色显示表达IL-1β、iNOS或IL-6的巨噬细胞显著增多(图3c),表明体内PHGDH缺乏促进M(IFN-γ)极化而抑制M(IL-4)极化。
2、PHGDH缺乏对小鼠嗜酸性粒细胞招募的影响
结果显示:PHGDH缺乏减少了嗜酸性粒细胞的募集,并降低了巨噬细胞中ARG1的表达(图3d-g),表明PHGDH缺乏损害了体内巨噬细胞M(IL-4)的功能。
3、丝氨酸饥饿对体内M(IL-4)表型的影响
供试小鼠:野生型C57BL/6小鼠。
将供试小鼠分成如下四组,每组4只,每组处理方法如下:
CBR-5884+SG+:用PHGDH抑制剂CBR-5884处理且不进行SG饥饿处理。
CBR-5884+SG-:用PHGDH抑制剂CBR-5884处理且进行SG饥饿处理。
CBR-5884-SG+:不用PHGDH抑制剂CBR-5884处理且不进行SG饥饿处理。
CBR-5884-SG-:不用PHGDH抑制剂CBR-5884处理且进行SG饥饿处理。
PHGDH抑制剂CBR-5884处理方法:腹腔注射PHGDH抑制剂CBR-5884,注射剂量为50mg/kg。
SG饥饿处理方法:用丝氨酸和甘氨酸缺乏的饲料(#M19053001,BioPike)饲喂2周。
将各组小鼠腹腔注射几丁质2天后,用流式细胞仪检测小鼠腹腔中CD45+细胞中嗜酸性粒细胞的百分比或嗜酸性粒细胞总数,用qPCR检测小鼠腹腔巨噬细胞Arg1mRNA的表达。
结果显示:丝氨酸缺乏小鼠的嗜酸性粒细胞募集减少,巨噬细胞ARG1表达也减少(图3h-k),这进一步揭示了丝氨酸代谢在促进体内M(IL-4)巨噬细胞功能方面的重要作用。
综上所述,体内丝氨酸代谢可调控巨噬细胞极化。
实施例4、丝氨酸代谢通过p38-JAK-STAT1信号转导轴调控巨噬细胞极化
为了探索丝氨酸代谢是如何调控巨噬细胞极化的进行了如下实验:
1、用IFN-γ分别刺激PHGDH-WT和PHGDH-KO的BMDMs不同时间,然后使用相应抗体进行WB检测。
结果显示:在IFN-γ刺激下,PHGDH-KO的BMDMs显示出STAT1、上游激酶JAK1和JAK2的激活增强(图4a)。
2、将WT-BMDMs经SG饥饿处理12h后用IFN-γ刺激30min,然后使用相应抗体进行WB检测。
结果显示:在IFN-γ刺激下,SG缺乏也显示出STAT1、上游激酶JAK1和JAK2的激活增强(图4b),说明JAK-STAT1信号通路普遍受到丝氨酸的抑制。
3、在RAW264.7细胞中导入PHGDH表达质粒,得到过表达PHGDH的RAW264.7细胞,然后用IFN-γ刺激细胞不同时间后使用相应抗体进行WB检测。
结果显示:PHGDH过表达导致IFN-γ诱导的JAK-STAT1信号激活减少(图4c)。
4、在shCtrl或shPHGDH稳转的RAW264.7细胞中,用JAK(Ruxolitinib)、STAT1(Fludarabine)或p38(SB203580)抑制剂处理6h,最后用IFN-γ刺激12h后使用相应抗体进行WB检测。
结果显示:STAT1(fludarabine)、JAK(ruxolitinib)和p38(SB203580)的特异性抑制剂显著降低了PHGDH缺乏的RAW264.7细胞中STAT1和iNOS表达的增强(图4d),表明经典的JAK-STAT1信号通路是PHGDH缺乏诱导M(IFN-γ)基因上调的原因。
5、将PHGDH-WT和PHGDH-KO的BMDMs用p38抑制剂SB203580处理6h,然后用IFN-γ刺激不同时间后使用相应抗体进行WB检测。
结果显示:特异性p38抑制剂SB203580显著回复了PHGDH缺乏导致的p38-JAK-STAT1信号通路的激活(图4e)。
6、将WT-BMDMs经SG饥饿处理12h,然后用p38抑制剂SB203580处理6h,再用IFN-γ刺激30min后使用相应抗体进行WB检测。
结果显示:SG缺乏诱导的IFN-γ-JAK-STAT1信号的增强也依赖于p38活性(图4f)。
7、用PHGDH抑制剂CBR-5884处理WT-BMDMs 6h,然后用IL-4刺激不同时间后使用相应抗体进行WB检测。
结果显示:抑制PHGDH显著降低了STAT6的磷酸化(图4g)。
8、用IL-4刺激PHGDH-WT和PHGDH-KO的BMDMs不同时间后使用相应抗体进行WB检测。
结果显示:PHGDH缺乏显著降低了STAT6的磷酸化(图4h)。
9、将WT-BMDMs经SG饥饿处理12h,然后用IL-4刺激不同时间后使用相应抗体进行WB检测。
结果显示:丝氨酸缺乏显著降低了STAT6的磷酸化(图4i)。
10、将PHGDH-WT和PHGDH-KO的BMDMs用STAT6抑制剂AS1517499处理6h,然后用IL-4刺激24h,最后用qPCR或WB分析M2标志物的表达。
结果显示:PHGDH敲除抑制M(IL-4)极化的作用依赖于PHGDH缺乏导致的STAT6磷酸化水平的降低(图4j、k)。
11、将WT-BMDMs经SG饥饿处理12h后,用AS1517499处理6h,再用IL-4刺激24h后用WB检测ARG1的表达水平。
结果显示:丝氨酸缺乏抑制M(IL-4)极化的作用依赖于其导致的STAT6磷酸化水平的降低(图4j、k)。
12、将PHGDH-WT和PHGDH-KO的BMDMs用STAT1抑制剂Fludarabine处理6h,然后用IL-4刺激24h,最后用qPCR或WB分析M2标志物的表达。
结果显示:STAT1抑制剂fludarabine处理后,PHGDH敲除导致的M(IL-4)表型减少的现象被挽救(图4m、n)
13、将WT-BMDMs经SG饥饿处理12h后,然后用STAT1抑制剂Fludarabine处理6h,再用IL-4刺激24h,最后用WB检测ARG1的表达。
结果显示:STAT1抑制剂fludarabine处理后,丝氨酸缺乏导致的M(IL-4)表型减少的现象被挽救(图4o)。
综上所述,丝氨酸代谢通过激活p38依赖的JAK-STAT1信号轴调控巨噬细胞极化。
实施例5、丝氨酸代谢衍生的SAM调控巨噬细胞极化
为了研究具体是哪种SG衍生的代谢物调控巨噬细胞的极化进行了如下实验:
1、按照对WT-BMDMs处理方式的不同,分成如下各组:
WT-BMDMs(+SG):不进行任何处理。
WT-BMDMs(-SG):对WT-BMDMs进行SG饥饿处理。
WT-BMDMs(-SG+Formate):对WT-BMDMs进行饥饿处理,且在培养体系中添加1mM的甲酸盐(Formate)。
WT-BMDMs(-SG+GSH):对WT-BMDMs进行饥饿处理,且在培养体系中添加1mM的谷胱甘肽(GSH)。
WT-BMDMs(-SG+SAM):对WT-BMDMs进行饥饿处理,且在培养体系中添加1mM的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。
将各组细胞处理12h后,再用IFN-γ处理12h或IL-4处理24h,最后qPCR分析M1或M2标志物的表达。
结果显示:添加SAM挽救了SG缺乏诱导的巨噬细胞极化表型(图5a,b),而甲酸盐或GSH并不具有该功能。
2、按照对PHGDH-WT和PHGDH-KO的BMDMs细胞处理方式的不同,分成如下各组:
PHGDH-WT(不加丝氨酸且不加SAM):在PHGDH-WT的BMDMs细胞中不加入丝氨酸且不加入SAM。
PHGDH-KO(不加丝氨酸且不加SAM):在PHGDH-KO的BMDMs细胞中不加入丝氨酸且不加入SAM。
PHGDH-KO(加入丝氨酸):在PHGDH-KO的BMDMs细胞中加入400μM丝氨酸处理12h。
PHGDH-KO(加入SAM):在PHGDH-KO的BMDMs细胞中加入400μM SAM处理12h。
将上述各组细胞用IFN-γ刺激12h或IL-4刺激24h,qPCR分析M1或M2标志物的表达。
结果显示:外源性丝氨酸和SAM的加入显著抑制M(IFN-γ),但促进M(IL-4)极化(图5c-f)。此外,SAM处理将PHGDH-KO-BMDMs的极化表型恢复到WT-BMDMs的水平(图5e,f),而外源性丝氨酸的挽救作用是部分的(图5c,d)。
3、按照对PHGDH-WT和PHGDH-KO的BMDMs细胞处理方式的不同,分成如下各组:
PHGDH-WT(不加SAM):在PHGDH-WT的BMDMs细胞中不加入SAM。
PHGDH-KO(不加SAM):在PHGDH-KO的BMDMs细胞中不加入SAM。
PHGDH-WT(加入SAM):在PHGDH-WT的BMDMs细胞中加入400μM SAM处理12h。
PHGDH-KO(加入SAM):在PHGDH-KO的BMDMs细胞中加入400μM SAM处理12h。
将上述各组细胞用IFN-γ刺激12h或IL-4刺激24h后用相应抗体进行WB分析。
结果显示:SAM处理将PHGDH敲除导致的p38-JAK-STAT1信号通路的增强和STAT6信号通路的减弱恢复到WT-BMDM的水平(图5g、i)。
4、按照对WT-BMDMs处理方式的不同,分成如下各组:
WT-BMDMs(+SG-SAM):在WT-BMDMs细胞中不加入SAM。
WT-BMDMs(-SG-SAM):将WT-BMDMs细胞进行SG饥饿处理且不加入SAM。
WT-BMDMs(-SG+SAM):将WT-BMDMs细胞进行SG饥饿处理且加入400μM SAM处理12h。
将上述各组细胞用IFN-γ刺激12h或IL-4刺激24h后用相应抗体进行WB分析。
结果显示:SAM处理将丝氨酸缺乏导致的p38-JAK-STAT1信号通路的增强和STAT6信号通路的减弱恢复到WT-BMDM的水平(图5h、j)。
综上所述,丝氨酸代谢产生的SAM对调控巨噬细胞极化至关重要。
实施例6、丝氨酸代谢通过增加SAM依赖的IGF1启动子区H3K27me3的丰度来降低IGF1的表达
1、敲低WT-BMDMs中的Rgs1、Atp6v0d2、S1pr1、Tgm2、Slc6a8、C77080、Oit3、Gpnmb、Igf1,分别获得敲低Rgs1、Atp6v0d2、S1pr1、Tgm2、Slc6a8、C77080、Oit3、Gpnmb、Igf1的巨噬细胞。采用的siRNA序列具体如下:
siCtrl:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′;
siRgs1:5′-CCAAGTCCAAAGACATACTTT-3′;
siAtp6v0d2:5′-GCAGCTATATGATAGACAATA-3′;
siS1pr1:5′-CGTCTGGAAACGTCAATTCTT-3′;
siTgm2:5′-CCTGACAGAGTCAAACCTCAT-3′;
siSlc6a8:5′-CGTGTACTTCACTGCTACATT-3′;
siC77080:5′-GGCTGAACTTCGGAGCATTTC-3′;
siOit3:5′-CCCACTGCAAAGATGGATGAA-3′;
siGpnmb:5′-GATGTGTATGTGATAACAGAT-3′;
siIGF1:5′-CAGGCATTGTGGATGAGTGTT-3′。
将敲低Rgs1、Atp6v0d2、S1pr1、Tgm2、Slc6a8、C77080、Oit3、Gpnmb、Igf1的巨噬细胞经IFN-γ处理12h或经IL-4处理24h后采用qPCR分析M1或M2标志物的表达。
结果发现:和siCtrl相比,目标基因表达水平均显著降低(图6a)。但在各个敲低BMDM中发现,只有siIGF1可降低M(IFN-γ)并增强M(IL-4)巨噬细胞极化(图6b、c)。
2、qPCR检测PHGDH-WT和PHGDH-KO的BMDMs中的Igf1mRNA表达水平;ELISA检测PHGDH-WT和PHGDH-KO的BMDMs上清中的IGF1含量。
结果显示:与PHGDH-WT相比,PHGDH-KO细胞中Igf1mRNA表达水平上调(图6d)。此外,PHGDH-KO细胞培养上清液中的IGF1含量也升高(图6e)。
3、在RAW264.7细胞中转染空载体质粒或PHGDH表达质粒,得到对照细胞和过表达PHGDH的细胞。qPCR分析对照细胞和过表达PHGDH的细胞中Igf1mRNA表达水平,ELISA检测对照细胞和过表达PHGDH的细胞上清液中的IGF1含量。
结果显示:PHGDH过表达显著降低了RAW264.7细胞中IGF1的表达(图6f,g)。
4、将WT-BMDMs经SG饥饿处理,得到SG饥饿处理BMDMs,同时以不经饥饿处理的BMDMs作为对照,得到对照细胞。qPCR分析对照细胞和SG饥饿处理BMDMs中的Igf1mRNA表达水平,ELISA检测对照细胞和SG饥饿处理BMDMs细胞上清液中的IGF1含量。
结果显示:SG缺乏也增加了BMDMs中IGF1的表达(图6h,i)。
5、将siCtrl或siPHGDH导入RAW264.7细胞,得到对照细胞和PHGDH敲低细胞,然后将对照细胞和PHGDH敲低细胞经SG饥饿处理,同时以不经SG饥饿处理作为对照。双荧光素酶报告基因分析SG饥饿处理后的对照细胞和PHGDH敲低细胞中的Igf1-Luc活性。
结果显示:用Igf1启动子-报告基因转染细胞,发现在RAW264.7细胞中,PHGDH敲低显著上调了IGF1启动子活性,丝氨酸缺乏可以进一步增强这一作用(图6j),这共同表明Igf1的表达水平是在转录水平上受到丝氨酸代谢的影响。
6、在PHGDH-WT和PHGDH-KO的BMDMs中加入400μM SAM,qPCR分析BMDMs中IGF1mRNA表达水平。同时以不加入SAM作为对照。
结果显示:SAM处理显著降低了PHGDH缺乏引起的Igf1mRNA的上调(图6k)。
7、在转染siCtrl或siPHGDH的RAW264.7细胞中加入400μM SAM,然后分析细胞中的Igf1-Luc活性。同时以不加入SAM作为对照。
结果显示:SAM处理显著降低了PHGDH缺乏引起的Igf1启动子活性的增强(图6l)。
8、采用染色质免疫沉淀与qPCR(Chip-qPCR)相结合的方法分析H3K27me3在PHGDH-WT或PHGDH-KO的BMDMs中Igf1启动子的位置的富集情况。
结果显示:在PHGDH缺乏的细胞中,Igf1启动子中H3K27me3的丰度显著降低(图6m)。
9、在PHGDH-WT或PHGDH-KO的BMDMs中加入400μM丝氨酸或400μM SAM处理12h,然后用IFN-γ刺激12h或IL-4刺激24h,ChIP-qPCR分析Igf1启动子上H3K27me3的丰度。同时以不加入400μM丝氨酸或不加入400μM SAM或不用IFN-γ刺激或不用IL-4刺激的BMDMs作为对照。
结果显示:外源丝氨酸和SAM处理部分或完全回复了PHGDH敲除引起的Igf1启动子区H3K27me3的丰度降低(图6n-r)。
综上所述,丝氨酸代谢可以通过增加SAM依赖的Igf1启动子区H3K27me3的丰度来降低IGF1的表达。
实施例7、IGF1在体外和体内促进巨噬细胞向M1型极化、抑制巨噬细胞向M2型极化
1、采用牛鲍计数板显微镜计数和小鼠腹腔巨噬细胞(PMs)的细胞数量,用流式细胞术分析和小鼠PMs中F4/80和CD11b表达水平。qPCR检测IGF1R-WT和IGF1R-KO PMs中Igf1r mRNA的水平。
结果显示:髓系特异性敲除IGF1R小鼠构建成功,且与WT组小鼠相比,髓系特异性敲除IGF1R不会影响巨噬细胞的增殖和分化(图7a-d)。
2、用siCtrl或siIGF1R(siIGR1R-1或siIGR1R-2)转染BMDMs,然后用IFN-γ处理12h或IL-4处理24h,qPCR检测M1或M2标志物。
siIGR1R-1:5’-CCAACGAGCAAGTTCTTCGTT-3’;
siIGR1R-2:5’-CAATGGTAACTTGAGTTACTA-3’。
结果显示:敲低IGF1R降低M(IFN-γ)极化表型,但促进M(IL-4)极化表型(图7e,f)。
3、用siCtrl或siIGF1转染BMDMs,然后用IFN-γ或IL-4处理不同时间,再用相应抗体进行WB检测。
结果显示:敲低IGF1降低p38-JAK-STAT1信号轴的激活,但增强STAT6磷酸化(图7g,h)。
4、和小鼠(8周龄小鼠)皮下注射2×106个LLC细胞(n=9),从接种5天后每两天统计一次肿瘤体积。于接种后23天测定肿瘤重量,并采用免疫荧光染色对肿瘤组织中的M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞进行检测。
5、将siCtrl、siIGF1、siCtrl+siPHGDH或siIGF1+siPHGDH分别转染RAW264.7细胞,然后用IFN-γ刺激12h或IL-4刺激24h后进行qPCR分析。
结果显示:敲低IGF1降低M(IFN-γ)极化表型,但促进M(IL-4)极化表型;敲低PHGDH促进M(IFN-γ)极化表型,但抑制M(IL-4)极化表型,敲低PHGDH的同时敲低IGF1,这一现象会被回复(图7l,m)。
综上所述,IGF1在体外和体内促进巨噬细胞向M1型极化、抑制巨噬细胞向M2型极化。
实施例8、丝氨酸代谢缺乏通过IGF1依赖的p38激活JAK-STAT1信号调控巨噬细胞极化
1、分别将IGF1R-WT或IGF1R-KO的BMDMs用IFN-γ刺激12h或IL-4刺激24h后进行M1或M2标志物的qPCR分析。
结果显示:IGF1R敲除可抑制M(IFN-γ)极化表型,但促进M(IL-4)极化表型(图8a,b)。
2、分别将IGF1R-WT或IGF1R-KO的BMDMs用IFN-γ或IL-4刺激不同时间后用相应抗体进行WB分析。
结果显示:IGF1R敲除可抑制p38-JAK-STAT1信号轴的激活,但增强STAT6磷酸化(图8c,d)。
3、将siIGR1R-1或siIGR1R-2转入PHGDH-WT或PHGDH-KO的BMDMs,然后用IFN-γ刺激12h或指示时间,或用IL-4刺激24h或指示时间后进行qPCR或WB分析。
siIGR1R-1:5’-CCAACGAGCAAGTTCTTCGTT-3’;
siIGR1R-2:5’-CAATGGTAACTTGAGTTACTA-3’。
结果显示:在敲除PHGDH的BMDMs中,IFN-γ诱导的M1标志物表达增强,IL-4诱导的M2标志物表达减弱,但同时用siIGF1R敲低IGF1信号后,这一现象会被逆转(图8e-h)。而且还能挽救IFN-γ诱导的p38-STAT1磷酸化的增多和IL-4诱导的STAT6磷酸化减少(图8i,j)
4、将siCtrl或siIGF1R转入WT-BMDMs中,然后经SG饥饿处理,或加400μM SAM,再用IFN-γ刺激12h或30min或用IL-4刺激24h或30min,最后进行qPCR分析或WB检测。
结果显示:在缺乏SG的WT-BMDMs中,添加SAM恢复了p38-JAK-STAT1信号通路的升高或IL-4-STAT6信号通路的降低,而这种现象在同时敲低IGF1后会进一步增强(图8k-n)。这些结果表明SAM-IGF1轴介导了丝氨酸缺乏诱导的p38激活。
综上所述,丝氨酸代谢缺乏通过IGF1依赖的p38激活JAK-STAT1信号调控巨噬细胞极化。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.如下A1)-A3)中任一种物质在制备促进巨噬细胞向M1型极化和/或抑制巨噬细胞向M2型极化的产品中的应用;
A1)抑制丝氨酸代谢的物质;
A2)抑制PHGDH蛋白活性的物质;
A3)降低PHGDH蛋白含量的物质。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抑制丝氨酸代谢的物质或抑制PHGDH蛋白活性的物质或降低PHGDH蛋白含量的物质通过减少S-腺苷甲硫氨酸介导的IGF1启动子区组蛋白H3赖氨酸27三甲基化来促进IGF1的表达,进而所述IGF1通过激活p38依赖的JAK1-JAK2-STAT1轴,从而促进巨噬细胞向M1型极化和/或抑制巨噬细胞向M2型极化。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述抑制丝氨酸代谢的物质为抑制外源性丝氨酸代谢的物质和/或抑制内源性丝氨酸代谢的物质;
或,所述抑制外源性丝氨酸代谢的物质为丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-苏氨酸转运体抑制剂L-苯甘氨酸;
或,所述抑制内源性丝氨酸代谢的物质为抑制PHGDH蛋白活性的物质或降低PHGDH蛋白含量的物质。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用,其特征在于:所述抑制PHGDH蛋白活性的物质为抑制PHGDH蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物;
或,所述降低PHGDH蛋白含量的物质为抑制PHGDH蛋白合成或促进PHGDH蛋白降解或敲低或敲除PHGDH基因的物质;
或,所述敲低PHGDH基因的物质为抑制PHGDH基因表达的siRNA或shRNA;
或,所述敲除PHGDH基因的物质为PHGDH基因编辑系统;所述PHGDH基因编辑系统包括Cas9核酸酶和靶向PHGDH基因的sgRNA。
5.S-腺苷甲硫氨酸在制备抑制巨噬细胞向M1型极化和/或促进巨噬细胞向M2型极化的产品中的应用。
6.如下B1)或B2)所示的物质在制备抑制巨噬细胞向M1型极化和/或促进巨噬细胞向M2型极化的产品中的应用;
B1)抑制IGF1R或IGF1蛋白活性的物质;
B2)降低IGF1R或IGF1蛋白含量的物质。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述抑制IGF1R或IGF1蛋白活性的物质为抑制IGF1R或IGF1蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物;
或,所述降低IGF1R或IGF1蛋白含量的物质为抑制IGF1R或IGF1蛋白合成或促进IGF1R或IGF1蛋白降解或敲低或敲除IGF1R或IGF1基因的物质;
或,所述敲低IGF1R或IGF1基因的物质为抑制IGF1R或IGF1基因表达的siRNA或shRNA;
或,所述敲除IGF1R或IGF1基因的物质为IGF1R或IGF1基因编辑系统;所述IGF1R或IGF1基因编辑系统包括Cas9核酸酶和靶向IGF1R或IGF1基因的sgRNA。
8.一种用于调控巨噬细胞极化的产品,其活性成分为如下物质中的至少一种:权利要求1中所述的抑制丝氨酸代谢的物质、权利要求1中所述的抑制PHGDH蛋白活性的物质、权利要求1中所述的降低PHGDH蛋白含量的物质、S-腺苷甲硫氨酸、权利要求6中所述的抑制IGF1R或IGF1蛋白活性的物质、权利要求6中所述的降低IGF1R或IGF1蛋白含量的物质。
9.一种M1型巨噬细胞的制备方法或促进巨噬细胞向M1型极化的方法,为如下C1)-C4)中任一种:
C1)抑制巨噬细胞中的丝氨酸代谢;
C2)抑制巨噬细胞中PHGDH蛋白的活性或降低巨噬细胞中PHGDH蛋白的含量;
C3)降低巨噬细胞中S-腺苷甲硫氨酸的含量;
C4)增加巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的活性或提高巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的含量;
或,一种M2型巨噬细胞的制备方法或促进巨噬细胞向M2型极化的方法,为如下D1)-D4)中任一种:
D1)促进巨噬细胞中的丝氨酸代谢;
D2)增加巨噬细胞中PHGDH蛋白的活性或提高巨噬细胞中PHGDH蛋白的含量;
D3)提高巨噬细胞中S-腺苷甲硫氨酸的含量;
D4)抑制巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的活性或降低巨噬细胞中IGF1R或IGF1蛋白的含量。
10.权利要求9所述的方法或按照权利要求9所述方法制备得到的细胞在筛选调控巨噬细胞极化的药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210906548.7A CN115181728A (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 抑制丝氨酸代谢的物质在通过调节IGF1-p38轴调控巨噬细胞极化中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210906548.7A CN115181728A (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 抑制丝氨酸代谢的物质在通过调节IGF1-p38轴调控巨噬细胞极化中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115181728A true CN115181728A (zh) | 2022-10-14 |
Family
ID=83520626
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210906548.7A Pending CN115181728A (zh) | 2022-07-29 | 2022-07-29 | 抑制丝氨酸代谢的物质在通过调节IGF1-p38轴调控巨噬细胞极化中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115181728A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116036285A (zh) * | 2023-02-07 | 2023-05-02 | 河北大学附属医院 | 抑制stat6位点泛素化的物质在调控巨噬细胞极化中的应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130203618A1 (en) * | 2010-05-26 | 2013-08-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center Inc | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cellular proliferative disorders |
US20200054593A1 (en) * | 2016-10-31 | 2020-02-20 | Peking University | D-3-phosphoglycerate dehydrogenase allosteric inhibitor and use thereof |
CN112791088A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-05-14 | 浙江大学 | 一种天然抗肿瘤活性物质的用途 |
CN116350789A (zh) * | 2021-12-28 | 2023-06-30 | 中国医学科学院药物研究所 | 一种基于抑制phgdh活性的组合物的抗肿瘤用途 |
-
2022
- 2022-07-29 CN CN202210906548.7A patent/CN115181728A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130203618A1 (en) * | 2010-05-26 | 2013-08-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center Inc | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cellular proliferative disorders |
US20200054593A1 (en) * | 2016-10-31 | 2020-02-20 | Peking University | D-3-phosphoglycerate dehydrogenase allosteric inhibitor and use thereof |
CN112791088A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-05-14 | 浙江大学 | 一种天然抗肿瘤活性物质的用途 |
CN116350789A (zh) * | 2021-12-28 | 2023-06-30 | 中国医学科学院药物研究所 | 一种基于抑制phgdh活性的组合物的抗肿瘤用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JIA-YING ZHAO: "A retrospective overview of PHGDH and its inhibitors for regulating cancer metabolism", EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, 16 March 2021 (2021-03-16) * |
LYDIA N. RAINES等: "PERK is a critical metabolic hub for immunosuppressive function in macrophages", NATURE IMMUNOLOGY, vol. 23, 28 February 2022 (2022-02-28), pages 437 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116036285A (zh) * | 2023-02-07 | 2023-05-02 | 河北大学附属医院 | 抑制stat6位点泛素化的物质在调控巨噬细胞极化中的应用 |
CN116036285B (zh) * | 2023-02-07 | 2024-02-02 | 河北大学附属医院 | 抑制stat6位点泛素化的物质在调控巨噬细胞极化中的应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ogiwara et al. | Targeting the vulnerability of glutathione metabolism in ARID1A-deficient cancers | |
Huang et al. | Multiomics analyses reveal a critical role of selenium in controlling T cell differentiation in Crohn’s disease | |
Choi et al. | Glutamate signaling in hepatic stellate cells drives alcoholic steatosis | |
Zhu et al. | The E3 ligase VHL promotes follicular helper T cell differentiation via glycolytic-epigenetic control | |
Xia et al. | GABA transporter sustains IL-1β production in macrophages | |
Martínez et al. | RAP1 protects from obesity through its extratelomeric role regulating gene expression | |
Dai et al. | mTOR complex 2 phosphorylates IMP1 cotranslationally to promote IGF2 production and the proliferation of mouse embryonic fibroblasts | |
Beaumatin et al. | mTORC1 activation requires DRAM-1 by facilitating lysosomal amino acid efflux | |
Li et al. | LncRNA GAS5 inhibits Th17 differentiation and alleviates immune thrombocytopenia via promoting the ubiquitination of STAT3 | |
Shan et al. | Serine metabolism orchestrates macrophage polarization by regulating the IGF1–p38 axis | |
Re et al. | Loss of histone macroH2A1 in hepatocellular carcinoma cells promotes paracrine-mediated chemoresistance and CD4+ CD25+ FoxP3+ regulatory T cells activation | |
Oho et al. | TIPE2 (tumor necrosis factor α-induced protein 8-like 2) is a novel negative regulator of TAK1 signal | |
Keenan et al. | Polycomb repressive complex 2 is a critical mediator of allergic inflammation | |
Cordova et al. | GCN2 eIF2 kinase promotes prostate cancer by maintaining amino acid homeostasis | |
CN115181728A (zh) | 抑制丝氨酸代谢的物质在通过调节IGF1-p38轴调控巨噬细胞极化中的应用 | |
Zhou et al. | Phosphorylation of ELAVL1 (Ser219/Ser316) mediated by PKC is required for erythropoiesis | |
Gao et al. | Reduction of miR-744 delivered by NSCLC cell-derived extracellular vesicles upregulates SUV39H1 to promote NSCLC progression via activation of the Smad9/BMP9 axis | |
Liang et al. | miR-379-5p inhibits proliferation and invasion of the endometrial cancer cells by inhibiting expression of ROR1 | |
Hao et al. | Critical role of VHL/BICD2/STAT1 axis in crystal-associated kidney disease | |
Mariner et al. | Induction of proteasomal activity in mammalian cells by lifespan-extending tRNA synthetase inhibitors | |
Wang et al. | ARC is a critical protector against inflammatory bowel disease (IBD) and IBD-associated colorectal tumorigenesis | |
Wang et al. | Augmented ERO1α upon mTORC1 activation induces ferroptosis resistance and tumor progression via upregulation of SLC7A11 | |
Zhang et al. | Metabolic enzyme Suclg2 maintains tolerogenicity of regulatory dendritic cells diffDCs by suppressing Lactb succinylation | |
US20210030765A1 (en) | Hematopoiesis-enhancing agent | |
Zhao et al. | Multi-omics analysis revealed the dysfunction of ovary and testis induced by chronic hypoxia in Pelteobagrus fulvidraco |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |