CN115176023A

CN115176023A - 紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶变体及其用途

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Publication number: CN115176023A
Application number: CN202180010365.0A
Authority: CN
Inventors: C·J·帕顿; H·江; S·H·龚
Original assignee: Amyris Inc
Current assignee: Amyris Inc
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2022-10-11
Also published as: US20230066313A1; EP4093880A1; BR112022013523A2; WO2021150960A1; EP4093880A4; CA3165502A1; MX2022009071A

Abstract

本文提供了用于青蒿酸的改良生产的经遗传修饰的宿主细胞、组合物和方法。所述宿主细胞被遗传修饰成含有表达新型经优化的紫穗槐‑4,11‑二烯12‑单加氧酶变体的异源核酸。本文还提供了用于筛选相对于亲代对照酶具有增加的酶活性的细胞色素p450酶变体的方法。

Description

紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶变体及其用途

序列表

本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此以引用的方式整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2021年1月14日，名称为51494-014WO2_Sequence_Listing_1.14.21_ST25，大小为16,855字节。

背景技术

细胞色素p450代表包含血红素作为辅因子并起单加氧酶作用的酶的超家族。在植物中，细胞色素p450超家族是最大的酶蛋白家族。事实上，据估计至多1％的植物基因组包含编码细胞色素p450的基因。该超家族的成员参与多种生物合成和代谢途径，并在多样系列的分子的合成中发挥关键作用。

快速发展的合成生物学领域涉及对生物体的重组再设计以赋予它们新的特性或功能。合成生物学的一个相对成功的应用是将植物来源的生物合成途径引入到宿主细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，以使得宿主细胞获得产生通常由宿主植物产生的化合物的能力。在大多数情况下，移植的生物合成途径需要优化以产生以商业上显著的水平产生所需化合物的重组宿主细胞。该过程通常涉及鉴定和优化特定途径酶，该特定途径酶的次优活性导致较差的途径性能和化合物生产。这些表现不佳的酶是生物合成途径中的瓶颈，并且往往通过突变和筛选的迭代轮次来进行优化。

从植物中获得的细胞色素p450往往是导入到宿主细胞中的生物合成途径的瓶颈。实例是酶紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶，其野生型型式在重组酵母中产生青蒿酸时是限速的。鉴于它们在植物生物合成途径中的普遍性，需要针对优化的变异细胞色素p450的改进的生成和筛选方法。

发明内容

在一方面，本发明提供了变异紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶多肽，其相对于SEQID NO:1的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸取代。

在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自A9D、I95L、I95V、E129N、R173I、V220I、T241N、K245C、L334M、Q346K、L351F、T421R、A443K、A443S、Q450K、S469C、T487C、L490C和V492M。在另一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自A9D、I95V、E129N、V220I、T241N、L351F和Q450K。在又一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自A9D、I95V、E129N、V220I、T241N、L334M、L351F和Q450K。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自A9D、E129N、V220I、L351I和Q450K。在其他实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代选自A9D、E129N、V220I、L351F和Q450K。

在一个实施方案中，本发明提供了编码变异酶的核酸。在另一个实施方案中，本发明提供了含有变异酶的宿主细胞。在进一步的实施方案中，所述宿主细胞能够产生选自青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸的化合物。在优选的实施方案中，所述宿主细胞能够产生青蒿酸。在其他实施方案中，所述宿主细胞含有编码选自青蒿(Artemisia annua)ADH1和青蒿ALDH1的多肽的核酸。

在又一个方面，本发明提供生成靶p450酶变体的方法，所述方法包括：获得编码所述靶p450变体的核酸库；用所述库转化宿主细胞群，使得每个库核酸可操作地连接到弱启动子；将单个经转化的宿主细胞铺板到多孔板的单个孔中；在产生试验化合物的条件下培养宿主细胞；测量由所述经转化的宿主细胞产生的试验化合物的水平；以及选择相对于对照增加试验化合物的水平的变体。

在该方法的一个实施方案中，所述弱启动子选自pGAL10、pGAL2、pGAL1_v22、pGAL1_v25、pGAL1_v2、pGAL3和pGAL2_v22。在该方法的另一个实施方案中，所述试验化合物是类异戊二烯。在该方法的另外的实施方案中，所述试验化合物选自半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜、类二倍半萜(sesterterpenoid)和类胡萝卜素。在该方法的优选实施方案中，所述试验化合物选自青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸。在该方法的又一个实施方案中，所述试验化合物是混源萜类(meroterpenoid)。在该方法的优选实施方案中，所述靶p450酶是紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶。

在又一个实施方案中，所述方法包括创建编码所述靶p450酶变体的第二核酸库，其中所述核酸包含所选变体的组合；用所述第二库转化宿主细胞群，使得每个第二库核酸可操作地连接到第二弱启动子；将单个经转化的宿主细胞铺板到多孔板的单个孔中；将所述宿主细胞在产生所述试验化合物的条件下培养；测量在多孔板的每个孔中产生的试验化合物的水平；以及选择相对于第二对照增加所述试验化合物的水平的二阶变体。在该方法的一个实施方案中，所述第二弱启动子不同于所述弱启动子。在该方法的另一个实施方案中，所述第二弱启动子与所述弱启动子是同一的。在该方法的另一个实施方案中，所述第二对照不同于所述对照。在该方法的又一个实施方案中，所述第二对照与所述对照是同一的。在该方法的进一步的实施方案中，所述第二库包含编码所选变体的所有可能组合的核酸。

附图说明

图1是一组比较在多孔板中生长(上图)和在罐中生长(下图)的产青蒿酸菌株的倍半萜滴度的图表。在这两种情况下，培养物是在疏水油(肉豆蔻酸异丙酯)存在下生长，如Paddon等人(2013,Nature496:528-532)所述。

图2是一组示出已将紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶编码序列置于各种弱启动子控制下的各种潜在筛选菌株中的氧化产物量和总倍半萜烯产量的图表。

图3是示出处在各种弱启动子控制下的表达野生型紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶编码序列的不同菌株的生长(ssOD)的图表。

图4是示出当在弱启动子下表达时顶级第一层酶变体的活性与野生型亲代酶的活性的比较的图表。活性是由相对于野生型CYP71AV1，CYP71AV1中表达单位点突变的菌株中的青蒿酸的产量在总倍半萜中所占的比率来示出的。

图5示出在微量滴定板中生长的处在高表达启动子控制下的表达最高单氨基酸变体或野生型P450的菌株的青蒿酸滴度。

图6是示出由表达野生型P450或在高表达生产菌株背景下从我们的低表达筛选菌株鉴定出的顶级组合库突变变体的菌株的青蒿酸产量的图表。在含有疏水覆盖层的96孔板的孔中生长。

图7是显示出以下的图表，即在疏水覆盖层(20％肉豆蔻酸异丙酯)存在下生长时，由强启动子表达改进的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶突变体的酵母菌株产生与由强启动子表达亲代紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的菌株相似的浓度的青蒿酸，但是在微量滴定板中在不存在疏水覆盖层的情况下生长时，产生明显多于表达亲代紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的菌株的青蒿酸。

图8显示在分批补料发酵中由通过在96孔板中从低表达启动子筛选鉴定出的表达改进的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶组合突变体的菌株(Y53787、Y53788和Y53842)或表达野生型P450的等基因菌株(Y50123)的青蒿酸、青蒿醛、青蒿醇和紫穗槐二烯(amorphadiene)产量。所示菌株是由强启动子表达组合突变/野生型紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶基因。

具体实施方式

“可操作地连接”是指并置，其中如此描述的组分处于容许它们以预期的方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子可操作地连接至该编码序列。

如本文所用，“宿主细胞”指代体内或体外真核细胞、原核细胞或来自作为单细胞实体培养的多细胞生物的细胞(例如，细胞系)，所述真核细胞或原核细胞可用作或已用作核酸的受体(例如，包含编码一个或多个生物合成途径基因产物诸如甲羟戊酸途径基因产物的核苷酸序列的表达载体)；并且包括已被核酸遗传修饰的原始细胞的子代。应该理解单细胞的子代可能由于天然、偶然或有意突变而未必在形态或基因组或总DNA互补序列上与原始亲代完全同一。“重组宿主细胞”(也称为“经遗传修饰的宿主细胞”)是已将异源核酸例如表达载体引入到其中的宿主细胞。例如，主题原核宿主细胞是通过向合适的原核宿主细胞中引入异源核酸(例如，对于原核宿主细胞而言为外来(在原核宿主细胞中通常不会天然存在)的外源核酸)或在原核宿主细胞中通常不存在的重组核酸而获得的经遗传修饰的原核宿主细胞(例如，细菌)；并且主题真核宿主细胞是通过向合适的真核宿主细胞中引入异源核酸(例如，对于真核宿主细胞而言为外来的外源核酸)或在真核宿主细胞中通常不存在的重组核酸而获得的经遗传修饰的真核宿主细胞。

如本文所用，术语“异源的”是指通常不会天然存在的。术语“异源核苷酸序列”是指通常不会天然存在于给定细胞中的核苷酸序列。因此，异源核苷酸序列可以是：(a)对于其宿主细胞是外来的(即，对于细胞是“外源的”)；(b)在宿主细胞中天然存在(即“内源性”)但在该细胞中以非自然量存在(即比宿主细胞中天然存在的量多或少)；(c)在宿主细胞中天然存在，但位于其天然基因座之外。

如本文所用，术语“净空(headroom)”是指生化途径内可用的额外可测量活性，其使得生化途径的改进能够被检测到。在一些情况下，生化途径的活性是通过测量一种或多种前体产物或终产物的水平来评价的。在这个背景下的净空意味着前体或终产物的产生尚未达到最大值，使得生化途径的一种或多种酶的活性的改进可以被检测为一种或多种前体或终产物的增加。本发明涉及一种情况，其中所述生化途径在该生长条件(例如在板上生长)的最大状态下运行，使得该途径没有净空，因此任何途径变体筛选不能使用该生长条件进行。在这种情况下，可以通过将编码途径酶的核酸置于弱启动子的控制下来恢复净空，从而降低生化途径的可测量活性。

如本文所用，术语“变体”是指在结构或序列上与具体列举的“参考”分子不同的分子，特别是多肽和多核苷酸。在优选的实施方案中，所述参考是野生型分子。关于多肽和多核苷酸，变体分别是指氨基酸或核苷酸序列的取代、添加或缺失。

如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性百分比”在两个或更多个多核苷酸或多肽序列的背景下使用时，是指两个或更多个相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的序列或子序列。例如，当在比较窗口或如使用序列比较算法或通过手动比对和目视检查测量的指定区域上进行比较和比对以获得最大对应时，所述序列在特定区域上与参考序列可能具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的同一性百分比。例如，通过计算序列中同一的核苷酸(或氨基酸残基)的数量除以减去任何空隙长度之后的总核苷酸(或氨基酸残基)长度的比率来确定同一性百分比。

为方便起见，两个序列之间的同一性程度可以使用本领域已知的计算机程序和数学算法确定。此类计算序列同一性百分比的算法一般会考虑比较区域上的序列空隙和错配。比较和比对序列的程序，如Clustal W(Thompson等人(1994)Nuclei Acids Res.，第22卷，第4673-4680页)、ALIGN(Myers等人，(1988)CABIOS，第4卷，第11-17页)、FASTA(Pearson等人，(1988)PNAS，第85卷，第2444-2448页；Pearson(1990)Methods Enzymol.，第183卷，第63-98页)和gapped BLAST(Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.，第25卷，第3389-3402页)可用于此目的。BLAST或BLAST 2.0(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.，第215卷，第403-410页)可从包括美国国立生物信息中心(NCBI)和互联网在内的多个来源获得，用于与序列分析程序BLASTP、BLASTN、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX结合使用。附加信息可以在NCBI网站上找到。

在某些实施方案中，序列比对和同一性百分比计算可以使用BLAST程序使用其标准默认参数来确定。对于核苷酸序列比对和序列同一性计算，BLASTN程序以其默认参数(空格罚分＝5，空格扩展罚分＝2，核酸匹配＝2，核酸错配＝-3，期望值＝10.0，字号＝11，查询范围内的最大匹配数＝0)使用。对于多肽序列比对和序列和序列同一性计算，BLASTP程序以其默认参数(比对矩阵＝BLOSUM62；空格成本：存在＝11，扩展＝1；组成调整＝有条件的组成分数、矩阵调整；期望值＝10.0；字号＝6；查询范围内的最大匹配数＝0)使用。替代地，可以使用以下程序和参数：Clone Manager Suite的Align Plus软件，版本5(Sci-Ed软件)；DNA比较：全局比较，标准线性评分矩阵，错配罚分＝2，空格罚分＝4，扩展空格罚分＝1。氨基酸比较：全局比较，BLOSUM 62评分矩阵。在本文所述的实施方案中，序列同一性是使用BLASTN或BLASTP程序使用其默认参数计算的。在本文所述的实施方案中，两个或更多个序列的序列比对是使用Clustal W使用建议的默认参数(去比对输入序列：否；Mbed类聚类引导树：是；Mbed类聚类迭代：是；组合迭代次数：默认(0)；最大引导树迭代：默认；最大HMM迭代：默认；顺序：输入)进行。

如本文所用，“紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶”是细胞色素p450酶，其催化紫穗槐-4,11-二烯的三次连续氧化以产生青蒿酸，其中青蒿醇和青蒿醛作为中间产物。紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的例示性示例序列是：

KSILKAMALSLTTSIALATILLFVYKFATRSKSTKKSLPEPWRLPIIGH

MHHLIGTTPHRGVRDLARKYGSLMHLQLGWPTIVVSSPKWAKEILTTYD

ITFANRPETLTGEIVLYHNTDVVLAPYGEYWRQLRKICTLELLSVKKVKS

FQSLREECWNLVQEIKASGSGRPVNLSENVFKLIATILSRAAFGKGIKD

QKELTEIVKEILRQTGGFDVADIFPSKKFLHHLSGKRARLTSLRKKIDNL

IDNLVAEHTVNTSSKTNETLLDVLLRLKDSAEFPLTSDNNIKAIILDMFGA

GTDTSSSTIEWAISELIKCPKAMEKVQAELRKALNGKEKIHEEDIQELSY

LNMVIKETLRLHPPLPLVLPRECRQPVNLAGYNIPNKTKLIVNVFAINRD

PEYWKDAEAFIPERFENSSATVMGAEYEYLPFGAGRRMCPGAALGLANVQ

LPLANILYHFNWKLPNGVSYDQIDMTESSGATMQRKTELLLVPSF。

如本文所用，“紫穗槐-4,11-二烯合酶”或“ADS”是催化2-反式，6-反式-法尼基二磷酸酯反应为紫穗槐-4,11-二烯加二磷酸酯的酶。紫穗槐-4,11-二烯合酶的例示性示例序列是：

如本文所用，“醇脱氢酶1”或“青蒿醇脱氢酶1”或“ADH1”是指催化青蒿醇转化为青蒿醛的酶。醇脱氢酶1的例示性示例序列是：

MAQKAPGVITCKAAVVWESSGPVVLEEIRVDPPKASEVRIKMLCASLCHT

DVLCTKGFPIPLFPRIPGHEGVGVIESIGKDAKGLKPGDIVMPLYLGECG

QCLNCKTGKTNLCHVYPPSFSGLMNDGTSRMSIARTGESIYHFASCSTWT

EYAVADCNYVLKINPKISYPHASFLSCGFTTGFGATWRETQVSKGSSVAV

FGIGTVGLGVIKGAQLQGASKIIGVDVNQYKAAKGKVFGMTDFINPKDHP

DKSVSELVKELTHGLGVDHCFECTGVPSLLNEALEASKIGIGTVVPIGAG

GEASVAINSLILFSGRTLKFTAFGGVRTQSDLPVIIDKCLNKEIQLDELL

THEIHLDNIQEAFEILKKPDCVKILIKF。

如本文所用，“醛脱氢酶1”或“青蒿醛脱氢酶1”或“ALDH1”是指催化青蒿素前体、青蒿醛和二氢青蒿醛的NAD(P)依赖性氧化从而产生青蒿酸和二氢青蒿酸的酶。醛脱氢酶1的例示性示例序列是：

MSSGANGSSKSASHKIKFTKLFINGEFVDSISGNFTDTINPATEEVLATV

AEGRKEDIDLAVKAAREAFDNGPWPRMSGEARRKIMLKFADLIDENADEL

TTLEVIDGGKLFGPVRHFEVPVSSDTFRYFAGAADKIRGATLKMSSNIQA

YTLREPIGVVGHIIPWNGPAFMFATKVAPALAAGCTMVIKPAEHTPLTVL

FLAHLSKLAGVPDGVINVVNGFGKTAGAAVSSHMDIDMVTFTGSTEVGRT

VMQAAALSNLKPVSLELGGKSPLIVFDDADVDKAAEFAILGNFTNKGEMC

VAGSRVFVQEGIHDVFVKKLEGAVKAWATRDPFDLATRHGPQNNKQQYDK

VLSCINHHGKKEGATLVTGGKPFGKKGYYIEPTLFTNVTDDMTIAKEEIFG

PVISVLKFKTVEEVIKRANATKYGLASGVFTKNIDVVNTVSRSLRAGAVW

VNCYLALDRDAPHGGYKMSGFGREQGLEALEHYLQIKTVATPIYDSPWL。

如本文所用，“靶p450酶”是指细胞色素p450酶，其是为产生优化变体而努力的目标。

如本文所用，“弱启动子”是指在宿主细胞中起作用以产生相对于试验化合物的产生而言次优量的靶p450酶的启动子。

如本文所用，“试验化合物”是指作为涉及靶p450酶的生物合成途径的中间产物或最终产物的化合物，其中所述中间产物或最终产物也是靶p450酶活性的下游，使得试验化合物的测量可指示所述靶p450酶或其变体的活性。

在一些实施方案中，宿主细胞包含选自由以下组成的组的类异戊二烯途径酶中的一种或多种或全部：(a)使两分子的乙酰辅酶A缩合以形成乙酰乙酰辅酶A的酶(例如，乙酰辅酶A硫解酶)；(b)使乙酰乙酰辅酶A与另一分子的乙酰辅酶A缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG辅酶A)的酶(例如HMG辅酶A合酶)；(c)使HMG辅酶A转化为甲羟戊酸的酶(例如HMG辅酶A还原酶)；(d)使甲羟戊酸转化为甲羟戊酸5-磷酸酯的酶(例如甲羟戊酸激酶)；(e)使甲羟戊酸-5-磷酸酯转化为甲羟戊酸-5-焦磷酸酯的酶(例如磷酸甲羟戊酸激酶)；(f)使甲羟戊酸-5-焦磷酸酯转化为异戊烯二磷酸酯(IPP)的酶(例如甲羟戊酸焦磷酸酯脱羧酶)；(g)使IPP转化为二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)的酶(例如IPP异构酶)；(h)可以使IPP和/或DMAPP分子缩合以形成含有超过五个碳的聚戊二烯化合物的聚戊二烯合酶；(i)使IPP与DMAPP缩合以形成香叶基焦磷酸酯(GPP)的酶(例如GPP合酶)；(j)使两分子的IPP与一分子的DMAPP缩合的酶(例如FPP合酶)；(k)使IPP与GPP缩合以形成法尼基焦磷酸酯(FPP)的酶(例如FPP合酶)；(l)使IPP和DMAPP缩合以形成香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的酶；以及(m)使IPP和FPP缩合以形成GGPP的酶。

在某些实施方案中，另外的酶是天然的。在有利的实施方案中，另外的酶是异源的。在某些实施方案中，两种或更多种酶可以组合在一种多肽中。

细胞株

本文提供的本发明的宿主细胞包括古细菌、原核细胞和真核细胞。

合适的原核宿主细胞包括但不限于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和革兰氏不定菌中的任一种。实例包括但不限于属于下列属的细胞：土壤杆菌属(Agrobacterium)、环脂酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属(Anabaena)、倒囊藻属(Anacystis)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、着色菌属(Chromatium)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、细杆菌属(Microbacterium)、席藻属(Phormidium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红杆菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、栅藻属(Scenedesmun)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)和发酵单胞菌属(Zymomonas)。原核菌株的实例包括但不限于：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、嗜氨短杆菌(Brevibacterium immariophilum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、百脉根中间根瘤菌(Mesorhizobium loti)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、布丁假单胞菌(Pseudomonas pudica)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、宋氏志贺菌(Shigella sonnei)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在特定的实施方案中，宿主细胞是大肠埃希氏菌细胞。

合适的古细菌宿主包括但不限于属于下列属的细胞：嗜热古菌属(Aeropyrum)、古球菌属(Archaeoglobus)、嗜盐杆菌属(Halobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、火球菌属(Pyrococcus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)和热原体属(Thermoplasma)。古细菌株的实例包括但不限于：闪烁古球菌(Archaeoglobusfulgidus)、嗜盐杆菌种(Halobacterium sp.)、詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)、火山热原体(Thermoplasma volcanium)、霍氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)和佩氏嗜热古菌(Aeropyrumpernix)。

合适的真核宿主包括但不限于真菌细胞、藻类细胞、昆虫细胞和植物细胞。在一些实施方案中，可用于本发明方法的酵母包括已在微生物保藏处(例如IFO、ATCC等)保藏并且属于下列属的酵母：芽孢酵母属(Aciculoconidium)、神食酵母属(Ambrosiozyma)、节束酵母属(Arthroascus)、Arxiozyma、棉阿舒囊霉属(Ashbya)、Babjevia、本森顿酵母属(Bensingtonia)、葡状子囊菌属(Botryoascus)、Botryozyma、酒香酵母属(Brettanomyces)、布勒掷孢酵母属(Bullera)、布勒担孢酵母属(Bulleromyces)、念珠菌属(Candida)、固囊酵母属(Citeromyces)、棍孢属(Clavispora)、隐球菌属(Cryptococcus)、微囊藻属(Cystofilobasidium)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、Dekkara、Dipodascopsis、双足囊菌属(Dipodascus)、Eeniella、Endomycopsella、Eremascus、假囊酵母属(Eremothecium)、担孢酵母属(Erythrobasidium)、Fellomyces、线黑粉酵母属(Filobasidium)、Galactomyces、地丝菌属(Geotrichum)、季氏酵母属(Guilliermondella)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、汉逊酵母属(Hansenula)、哈瑟酵母菌属(Hasegawaea)、胶珊瑚属(Holtermannia)、Hormoascus、生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克勒克酵母属(Kloeckera)、克勒克氏孢属(Kloeckeraspora)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Kondoa、Kuraishia、克氏担孢酵母属(Kurtzmanomyces)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、油脂酵母属(Lipomyces)、娄德罗菌属(Lodderomyces)、马拉色氏霉菌属(Malasserzia)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、木拉克酵母属(Mrakia)、Myxozyma、拿逊酵母属(Nadsonia)、Nakazawaea、针孢酵母属(Nematospora)、Ogataea、Oosporidium、管囊酵母属(Pachysolen)、Phachytichospora、Phaffia、毕赤酵母属(Pichia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、类酵母属(Saccharomycodes)、复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、Saitoella、Sakaguchia、Saturnospora、Schizoblastoporion、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、原孢酵母属(Sporopachydermia)、冠孢酵母属(Stephanoascus)、梗孢酵母属(Sterigmatomyces)、Sterigmatosporidium、Symbiotaphrina、合轴酵母属(Sympodiomyces)、Sympodiomycopsis、有孢圆酵母属(Torulaspora)、Trichosporiella、毛孢子菌属(Trichosporon)、三角酵母属(Trigonopsis)、Tsuchiyaea、Udeniomyces、Waltomyces、威克酵母属(Wickerhamia)、拟威克酵母属(Wickerhamiella)、拟威尔酵母属(Williopsis)、Yamadazyma、子囊菌酵母属(Yarrowia)、接合囊酵母属(Zygoascus)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、接合魏氏酵母亚属(Zygowilliopsis)和配合酵母菌属(Zygozyma)。

在一些实施方案中，宿主微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(以前称为乳酸酵母(Saccharomyces lactis))、马克斯克鲁维酵母(Kluveromyces marxianus)Arxula adeninivorans或多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)(目前称为安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))。在一些实施方案中，宿主微生物是念珠菌属的菌株，诸如解脂念珠菌(Candida lipolytica)、吉利蒙念珠菌(Candida guilliermondii)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、假热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)或产朊念珠菌(Candidautils)。

在优选的实施方案中，宿主微生物是酿酒酵母。在一些实施方案中，宿主是选自面包酵母、CEN.PK2、CBS 7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS 7963、CBS 7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、CAT-1、VR-1、BG-1、CR-1和SA-1的酿酒酵母菌株。在特定的实施方案中，酿酒酵母菌株是PE-2。在另一个特定的实施方案中，酿酒酵母菌株是CAT-1。在另一个特定的实施方案中，酿酒酵母菌株是BG-1。

弱启动子

本文公开的筛选方法依赖于减少细胞色素p450表达的原理，使得亲代酶和变异酶之间的相对活性差异可从一种或多种试验化合物产生的差异上来检测。因此，弱启动子是当可操作地连接至变异细胞色素p450时使酶的表达和产生的酶活性降低至次优范围的启动子。酶活性的次优范围可能比最佳酶活性(即，使用例如pGAL1的“强启动子”产生的活性量)小90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％。因此，可操作地连接至弱启动子的细胞色素p450将产生相对于由参考强启动子(即pGAL1)产生的试验化合物量的小于90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％的试验化合物。表1列出可用于酿酒酵母宿主细胞的弱启动子的例示性、非限制性实例。启动子的强度示出为活性相对于强启动子pGAL1的比率。

表1：弱启动子及其相对于pGAL1的活性的列表。

MEV途径和FPP产生

在一些实施方案中，本文提供的经遗传修饰的宿主细胞包含一种或多种可用于形成FPP的MEV途径的异源酶。所述一种或多种MEV途径的酶可以包括使乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A的酶；使两分子乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A的酶；使乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合形成HMG辅酶A的酶；或使HMG辅酶A转化为甲羟戊酸酯的酶。此外，经遗传修饰的宿主细胞可以包括使甲羟戊酸酯磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸酯的MEV途径酶；使甲羟戊酸5-磷酸酯转化为甲羟戊酸-5-焦磷酸酯的MEV途径酶；使甲羟戊酸-5-焦磷酸酯转化为异戊烯焦磷酸酯的MEV途径酶；或使异戊烯焦磷酸酯转化为二甲基烯丙基二磷酸酯的MEV途径酶。特别地，所述一种或多种MEV途径的酶选自乙酰辅酶A硫解酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、HMG辅酶A合酶、HMG辅酶A还原酶、甲羟戊酸酯激酶、磷酸甲羟戊酸酯激酶、甲羟戊酸焦磷酸酯脱羧酶和异戊基二磷酸酯:二甲基烯丙基二磷酸酯异构酶(IDI或IPP异构酶)。本发明的经遗传修饰的宿主细胞可以从一种或多种包含一种或多种MEV途径酶的编码序列的异源核苷酸序列表达一种或多种MEV的异源酶。

在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞包含编码可将异戊烯焦磷酸酯(IPP)转化为二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)的酶的异源核酸。此外，宿主细胞可以含有编码可使IPP和/或DMAPP分子缩合形成聚戊二烯基化合物的酶的异源核酸。在一些实施方案中，经遗传修饰的宿主细胞进一步含有编码可修饰IPP或聚戊二烯以形成类异戊二烯化合物(诸如FPP)的酶的异源核酸。

乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A的转化

经遗传修饰的宿主细胞可以含有编码可使两分子的乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A的酶(乙酰辅酶A硫解酶)的异源核酸。编码乙酰辅酶A硫解酶的核苷酸序列的实例包括(登记号NC_000913REGION：2324131.2325315(大肠埃希氏菌))；(D49362(脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)))；以及(L20428(酿酒酵母))。

乙酰辅酶A硫解酶催化两分子的乙酰辅酶A可逆地缩合生成乙酰乙酰辅酶A，但该反应在热力学上是处于不利地位的；乙酰乙酰辅酶A硫解与乙酰乙酰辅酶A合成相比处于更有利的地位。乙酰乙酰辅酶A合酶(AACS)(也称为乙酰辅酶A:丙二酰辅酶A酰基转移酶；EC2.3.1.194)使乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A。与乙酰辅酶A硫解酶相反，AACS催化的乙酰乙酰辅酶A合成因相关的丙二酰辅酶A脱羧在本质上是一种受能量促进的(energy-favored)反应。此外，AACS对乙酰乙酰辅酶A未表现出硫解活性，因此反应是不可逆的。

在表达乙酰辅酶A硫解酶和异源ADA和/或磷酸转乙酰酶(PTA)的细胞中，由促进乙酰乙酰辅酶A硫解的乙酰辅酶A硫解酶催化的可逆反应可产生大的乙酰辅酶A库(pool)。鉴于ADA的可逆活性，该乙酰辅酶A库可能反过来驱使ADA进行将乙酰辅酶A转化为乙醛的逆反应，从而减少ADA对乙酰辅酶A生成提供的益处。类似地，PTA的活性是可逆的，因此，大量的乙酰辅酶A库可能会驱使PTA进行将乙酰辅酶A转化为乙酰磷酸酯的逆反应。因此，在一些实施方案中，为了提供对乙酰辅酶A的强烈影响力以驱使ADA和PTA的正向反应，本文提供的经遗传修饰的宿主细胞的MEV途径利用乙酰乙酰辅酶A合酶来从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A形成乙酰乙酰辅酶A。

可以使用从链霉菌属某个种(Streptomyces sp.)菌株CL190获得的AACS(参见Okamura等人，(2010)，PNAS，第107卷，第11265-11270页)。来自链霉菌属某个种菌株CL190的编码核酸序列的代表性AACS包括登记号AB540131.1的序列，相应的AACS蛋白序列包括登记号D7URV0和BAJ10048的序列。可用于本发明的其他乙酰乙酰辅酶A合酶包括链霉菌属某个种(参见登记号AB183750；KO-3988BAD86806；KO-3988AB212624；和KO-2988BAE78983)、环圈链霉菌(S.anulatus)菌株9663(参见登记号FN178498和CAX48662)、游动放线菌属某个种(Actinoplanes sp.)A40644(参见登记号AB113568和BAD07381)；链霉菌属某个种C(参见登记号NZ_ACEW010000640和ZP_05511702)、达氏拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)DSM43111(参见登记号NZ_ABUI01000023和ZP_04335288)、溃疡分枝杆菌(Mycobacteriumulcerans)Agy99(参见登记号NC_008611和YP_907152)、海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)M(参见登记号NC_010612和YP_001851502)、链霉菌属某个种Mg1(参见登记号NZ_DS570501和ZP_05002626)、链霉菌属某个种AA4(参见登记号NZ_ACEV01000037和ZP_05478992)、玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)NRRL 15998(参见登记号NZ_ABYB01000295和ZP_04696763)、链霉菌属某个种ACTE(参见登记号NZ_ADFD01000030和ZP_06275834)、产绿色链霉菌(S.viridochromogenes)DSM 40736(参见登记号NZ_ACEZ01000031和ZP_05529691)、弗兰克菌属某个种(Frankia sp.)CcI3(参见登记号NC_007777和YP_480101)、巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis)(参见登记号NC_018681和YP_006812440.1)和龟嗜皮菌(Austwickia chelonae)(参见登记号NZ_BAGZ01000005和ZP_10950493.1)的乙酰乙酰辅酶A合酶。另外的合适的乙酰乙酰辅酶A合酶包括美国专利申请公布第2010/0285549号和第2011/0281315号中描述的乙酰乙酰辅酶A合酶。

也可用于本文提供的组合物和方法中的乙酰乙酰辅酶A合酶包括被说成是本文所述任何的乙酰乙酰辅酶A合酶的“衍生物”的那些分子。此类“衍生物”具有以下特征：(1)它与本文所述的任何乙酰乙酰辅酶A合酶共享实质同源性；以及(2)能够催化乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A不可逆地缩合形成乙酰乙酰辅酶A。如果乙酰乙酰辅酶A合酶衍生物的氨基酸序列与乙酰乙酰辅酶A合酶的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％相同，则该乙酰乙酰辅酶A合酶衍生物被说成与乙酰乙酰辅酶A合酶共享“实质同源性”。

乙酰乙酰辅酶A向HMG辅酶A的转化

在一些实施方案中，宿主细胞包含编码可使乙酰乙酰辅酶A与另一分子的乙酰辅酶A缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG辅酶A)(例如，HMG辅酶A合酶)的酶的异源核苷酸序列。编码此酶的核苷酸序列的实例包括：(NC_001145.补体19061.20536；酿酒酵母)、(X96617；酿酒酵母)、(X83882；拟南芥(Arabidopsis thaliana))、(AB037907；灰北里孢菌(Kitasatospora griseola))、(BT007302；智人(Homo sapiens))和(NC_002758、基因座标签SAV2546，基因ID 1122571；金黄色葡萄球菌)。

HMG辅酶A向甲羟戊酸酯的转化

在一些实施方案中，宿主细胞包含编码可使HMG辅酶A转化为甲羟戊酸酯的酶(例如HMG辅酶A还原酶)的异源核苷酸序列。HMG辅酶A还原酶可以是使用NADH的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶辅酶A还原酶。HMG辅酶A还原酶(EC 1.1.1.34；EC 1.1.1.88)催化(S)-HMG辅酶A还原脱酰为(R)-甲羟戊酸酯，并且可以被分为两类：I类和II类HMGr。I类包括来自真核生物和大多数古细菌的酶，II类包括某些原核生物和古细菌的HMG辅酶A还原酶。除了序列上的差异外，这两类酶在其辅因子特异性方面也不同。与专门利用NADPH的I类酶不同，II类HMG辅酶A还原酶在区分NADPH和NADH的能力方面有所不同(参见，例如Hedl等人，(2004)Journal of Bacteriology，第186卷，第1927-1932页)。

可用于本发明的HMG辅酶A还原酶包括能够利用NADH作为辅因子的HMG辅酶A还原酶，例如来自迈氏假单胞菌(P.mevalonii)、闪烁古球菌(A.fulgidus)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)的HMG辅酶A还原酶。在特定的实施方案中，HMG辅酶A还原酶能够仅利用NADH作为辅因子，例如来自迈氏假单胞菌(P.mevalonii)、波氏硅杆菌(S.pomeroyi)或食酸代夫特菌(D.acidovorans)的HMG辅酶A还原酶。

在一些实施方案中，使用NADH的HMG辅酶A还原酶来自迈氏假单胞菌(Pseudomonasmevalonii)。编码HMG辅酶A还原酶(EC 1.1.1.88)的迈氏假单胞菌(Pseudomonasmevalonii)的野生型mvaA基因的序列先前已有描述(参见Beach和Rodwell，(1989)，J.Bacteriol.，第171卷，第2994-3001页)。迈氏假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)的代表性mvaA核苷酸序列包括登记号M24015。迈氏假单胞菌的代表性HMG辅酶A还原酶蛋白序列包括登记号AAA25837、P13702、MVAA_PSEMV。

在一些实施方案中，使用NADH的HMG辅酶A还原酶来自波氏硅杆菌(Silicibacterpomeroyi)。波氏硅杆菌的代表性HMG辅酶A还原酶核苷酸序列包括登记号NC_006569.1。波氏硅杆菌的代表性HMG辅酶A还原酶蛋白质序列包括登记号YP_164994。

在一些实施方案中，使用NADH的HMG辅酶A还原酶来自食酸代夫特菌(Delftiaacidovorans)。食酸代夫特菌的代表性HMG辅酶A还原酶核苷酸序列包括NC_010002REGION：补体(319980..321269)。食酸代夫特菌的代表性HMG辅酶A还原酶蛋白质序列包括登记号YP_001561318。

在一些实施方案中，使用NADH的HMG辅酶A还原酶来自马铃薯(Solanumtuberosum)(参见Crane等人，(2002)，J.Plant Physiol.，第159卷，第1301-1307页)。

可用于本发明的实践中的使用NADH的HMG辅酶A还原酶还包括被说成是本文所述的任何使用NADH的HMG辅酶A还原酶的“衍生物”的那些分子，例如来自迈氏假单胞菌、波氏硅杆菌和食酸代夫特菌的那些分子。此类“衍生物”具有以下特征：(1)它与本文所述的任何使用NADH的HMG辅酶A还原酶共享实质同源性；以及(2)能够催化(S)-HMG辅酶A还原脱酰为(R)-甲羟戊酸酯，同时优先使用NADH作为辅因子。如果使用NADH的HMG辅酶A还原酶的衍生物的氨基酸序列与使用NADH的HMG辅酶A还原酶的氨基酸序列至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％相同，则该使用NADH的HMG辅酶A还原酶的衍生物被说成与使用NADH的HMG辅酶A还原酶共享“实质同源性”。

如本文所用，短语“使用NADH的”是指使用NADH的HMG辅酶A还原酶对作为辅因子的NADH的选择性超过NADPH，例如，通过证明对NADH的比活性高于对NADPH的比活性而证明的。对作为辅因子的NADH的选择性被表示为k_cat ^(NADH)/k_cat ^(NADPH)比率。本发明的使用NADH的HMG辅酶A还原酶可以具有至少5、10、15、20、25或大于25的k_cat ^(NADH)/k_cat ^(NADPH)比率。使用NADH的HMG辅酶A还原酶可以专门使用NADH。例如，专门使用NADH的使用NADH的HMG辅酶A还原酶在NADH在体外作为唯一辅因子提供时表现出一些活性，而在NADPH作为唯一辅因子提供时则没有显示出可检测的活性。可以利用本领域已知的用于确定辅因子特异性的任何方法来鉴定对作为辅因子的NADH具有偏好的HMG辅酶A还原酶(参见例如(Kim等人，(2000)，ProteinScience，第9卷，第1226-1234页)和(Wilding等人，(2000)，J.Bacteriol.，第182卷，第5147-5152页)。

在一些情况下，例如，通过辅因子结合口袋的定点诱变将使用NADH的HMG辅酶A还原酶工程改造为对NADH的选择性超过对NAPDH的选择性。用于对NADH选择性进行工程改造的方法描述于Watanabe等人(2007)，Microbiology，第153卷，第3044-3054页中，而用于确定HMG辅酶A还原酶的辅因子特异性的方法描述于Kim等人(2000)，Protein Sci.，第9卷，第1226-1234页中。

使用NADH的HMG辅酶A还原酶可以源自原生地包含甲羟戊酸酯降解途径的宿主物种，例如分解代谢作为其唯一碳源的甲羟戊酸酯的宿主物种。在这些情况下，使用NADH的HMG辅酶A还原酶(其通常在其原生宿主细胞内催化内化的(R)-甲羟戊酸酯氧化酰化为(S)-HMG辅酶A)被用来在包含甲羟戊酸酯生物合成途径的经遗传修饰的宿主细胞中催化逆反应，即(S)-HMG辅酶A向(R)-甲羟戊酸的还原脱酰。能够靠作为其唯一碳源的甲羟戊酸酯生长的原核生物已被描述于：(Anderson等人，(1989)，J.Bacteriol，第171卷，第6468-6472页)；(Beach等人，(1989)，J.Bacteriol.，第171卷，第2994-3001页)；Bensch等人，J.Biol.Chem.，第245卷，第3755-3762页)；(Fimongnari等人，(1965)，Biochemistry，第4卷，第2086-2090卷)；Siddiqi等人，(1962)，Biochem.Biophys.Res.Commun.，第8卷，第110-113页)；(Siddiqi等人，(1967)，J.Bacteriol.，第93卷，第207-214页)；以及(Takatsuji等人，(1983)，Biochem.Biophys.Res.Commun.，第110卷，第187-193卷)中。

宿主细胞可以含有使用NADH的HMGr和使用NADPH的HMG辅酶A还原酶两者。编码使用NADPH的HMG辅酶A还原酶的核苷酸序列的实例包括：(NM_206548；黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster))、(NC_002758，基因座标签SAV2545，基因ID1122570；金黄色葡萄球菌)，(AB015627；链球菌属某个种KO 3988)、(AX128213，提供编码截断的HMG辅酶A还原酶的序列；酿酒酵母)和(NC_001145：补体(115734.118898；酿酒酵母)。

甲羟戊酸酯向甲羟戊酸-5-磷酸酯的转化

宿主细胞可以含有编码可使甲羟戊酸酯转化为甲羟戊酸5-磷酸酯的酶(例如，甲羟戊酸酯激酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的示例性实例包括：(L77688；拟南芥)和(X55875；酿酒酵母)。

甲羟戊酸-5-磷酸酯向甲羟戊酸-5-焦磷酸酯的转化

宿主细胞可以含有编码可使甲羟戊酸5-磷酸酯转化为甲羟戊酸-5-焦磷酸酯的酶(例如磷酸甲羟戊酸酯激酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的示例性实例包括：(AF429385；巴西三叶胶(Hevea brasiliensis))、(NM_006556；智人)和(NC_001145.补体712315.713670；酿酒酵母)。

甲羟戊酸-5-焦磷酸酯向IPP的转化

宿主细胞可以含有编码可使甲羟戊酸-5-焦磷酸酯转化为异戊烯二磷酸酯(IPP)的酶(例如甲羟戊酸焦磷酸酯脱羧酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的示例性实例包括：(X97557；酿酒酵母)、(AF290095；屎肠球菌(Enterococcus faecium))和(U49260；智人)。

IPP向DMAPP的转化

宿主细胞可以含有编码可使经由MEV途径产生的IPP转化为二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)的酶(例如IPP异构酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的示例性实例包括：(NC_000913，3031087.3031635；大肠埃希氏菌)和(AF082326；雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))。

聚戊二烯合酶

在一些实施方案中，宿主细胞进一步包含编码可使IPP和/或DMAPP分子缩合形成含有多于五个碳的聚戊二烯化合物的聚戊二烯合酶的异源核苷酸序列。

宿主细胞可以含有编码可使一分子IPP与一分子DMAPP缩合形成一分子香叶基焦磷酸酯(“GPP”)的酶(例如，GPP合酶)的异源核苷酸序列。编码此类酶的核苷酸序列的非限制性实例包括：(AF513111；大冷杉(Abies grandis))、(AF513112；大冷杉(Abiesgrandis))、(AF513113；大冷杉(Abies grandis))、(AY534686；金鱼草(Antirrhinummajus))、(AY534687；金鱼草(Antirrhinum majus))、(Y17376；拟南芥)、(AE016877，基因座AP11092；蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；ATCC14579)、(AJ243739；甜橙(Citrussinensis))、(AY534745；仙女扇(Clarkia breweri))、(AY953508；Ips pini)、(DQ286930；番茄(Lycopersicon esculentum))、(AF182828；辣薄荷(Mentha x piperita))、(AF182827；辣薄荷(Mentha x piperita))、(MPI249453；辣薄荷(Mentha x piperita))、(PZE431697，基因座CAD24425；产玉米黄素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens))、(AY866498；胡黄连(Picrorhiza kurrooa))、(AY351862；葡萄(Vitis vinifera))和(AF203881，基因座AAF12843；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。

宿主细胞可以含有编码可使两分子IPP与一分子DMAPP缩合或者将一分子IPP添加至一分子GPP上从而形成一分子香叶基焦磷酸酯(“FPP”)的酶(例如，GPP合酶)的异源核苷酸序列。编码FPP合酶的核苷酸序列的非限制性实例包括：(ATU80605；拟南芥)、(ATHFPS2R；拟南芥)、(AAU36376；青蒿(Artemisia annua))、(AF461050；欧洲牛(Bos taurus))、(D00694；大肠埃希氏菌K-12)、(AE009951，基因座AAL95523；具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.Nucleatum)ATCC 25586)、(GFFPPSGEN；藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi))、(CP000009，基因座AAW60034；氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacteroxydans)621H)、(AF019892；向日葵(Helianthus annuus))、(HUMFAPS；智人)、(KLPFPSQCR；乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))、(LAU15777；白羽扇豆(Lupinus albus))、(LAU20771；白羽扇豆(Lupinus albus))、(AF309508；小家鼠(Mus musculus))、(NCFPPSGEN；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))、(PAFPS1；灰白银胶菊(Partheniumargentatum))、(PAFPS2；灰白银胶菊(Parthenium argentatum))、(RATFAPS；褐家鼠(Rattus norvegicus))、(YSCFPP；酿酒酵母)、(D89104；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、(CP000003，基因座AAT87386；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、(CP000017，基因座AAZ51849；酿脓链球菌)、(NC_008022，基因座YP_598856；酿脓链球菌MGAS10270)、(NC_008023，基因座YP_600845；酿脓链球菌MGAS2096)、(NC_008024，基因座YP_602832；酿脓链球菌MGAS10750)、(MZEFPS；玉米须(Zeamays))、(AE000657，基因座AAC06913；超嗜热菌(Aquifex aeolicus)VF5)、(NM_202836；拟南芥)、(D84432，基因座BAA12575；枯草芽孢杆菌)、(U12678，基因座AAC28894；大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA 110)、(BACFDPS；嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))、(NC_002940，基因座NP_873754；杜氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)35000HP)、(L42023，基因座AAC23087；流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)Rd KW20)、(J05262；智人)、(YP_395294；清酒乳杆菌清酒亚种(Lactobacillussakei subsp.sakei)23K)、(NC_005823，基因座YP_000273；问号钩端螺旋体哥本哈根血清型Fiocruz株(Leptospira interrogans serovar Copenhageni str.Fiocruz)L1-130)、(AB003187；藤黄微球菌(Micrococcus luteus))、(NC_002946，基因座YP_208768；淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)FA 1090)、(U00090，基因座AAB91752；根瘤菌属某个种(Rhizobium sp.)NGR234)、(J05091；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae))、(CP000031，基因座AAV93568；波氏硅杆菌(Silicibacter pomeroyi)DSS-3)、(AE008481，基因座AAK99890；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)R6)和(NC_004556，基因座NP 779706；苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)Temecula1)。

虽然上文中描述了甲羟戊酸酯途径的酶的实例，但在某些实施方案中，DXP途径的酶可被用作用于在本文所述宿主细胞、组合物和方法中产生DMAPP和IPP的替代或额外途径。酶和编码DXP途径的酶的核酸是众所周知的并且在本领域，例如WO 2012/135591中被表征。

培养基和条件

用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是微生物学或发酵科学领域的技术人员众所周知的(参见，例如，Bailey等人，Biochemical Engineering Fundamentals，第二版，McGraw Hill,New York,1986)。根据宿主细胞、发酵和工艺的具体要求，必须考虑需氧、微需氧或厌氧条件的适当培养基、pH值、温度和要求。

本文提供的生产青蒿酸的方法可以在合适的容器中在合适的培养基(例如，补充有或未补充泛酸)中进行，所述容器包括但不限于细胞培养板、微量滴定板、烧瓶或发酵罐。此外，该方法可以在本领域已知的任何发酵规模下进行，以支持微生物产品的工业生产。可以使用任何合适的发酵罐，包括搅拌罐发酵罐、气升发酵罐、气泡发酵罐或其任何组合。在使用酿酒酵母作为宿主细胞的特定实施方案中，可以使菌株在如Kosaric等人在Ullmann'sEncyclopedia of Industrial Chemistry(第6版，第12卷，第398-473页，Wiley-VCHVerlag GmbH&Co.KDaA,Weinheim,Germany)中所详细描述的发酵罐中生长。

在一些实施方案中，所述培养基是能够产生青蒿酸的经遗传修饰的微生物可以在其中生存的任何培养基。所述培养基可以是包含可同化的碳源、氮源和磷酸盐源的水性培养基。此类培养基还可以包括适当的盐、矿物质、金属和其他营养物。可以将碳源和每种必需的细胞营养物逐渐地或连续地添加到发酵培养基中，并且可例如根据基于将碳源转化为生物质的细胞的代谢或呼吸功能的预定细胞生长曲线，将每种所需的营养物基本上维持在被生长中的细胞有效同化所需的最低水平。

用于培养微生物的合适的条件和合适的培养基是本领域众所周知的。例如，合适的培养基可以补充有一种或多种额外的剂，诸如诱导剂(例如，当一种或多种编码基因产物的核苷酸序列处于可诱导启动子的控制之下时)、阻遏物(例如，当一种或多种编码基因产物的核苷酸序列处于可抑制启动子的控制之下时)，或选择剂(例如，选择用于包含遗传修饰的微生物的抗生素)。

所述碳源可以是单糖(简单糖)、二糖、多糖、不可发酵的碳源，或它们的一种或多种组合。合适的单糖的非限制性实例包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、核糖及其组合。合适的二糖的非限制性实例包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。合适的多糖的非限制性实例包括淀粉、糖原、纤维素、几丁质及其组合。合适的不可发酵碳源的非限制性实例包括乙酸盐和甘油。

培养基中碳源诸如葡萄糖的浓度可能足以促进细胞生长，但不会高到抑制所用微生物的生长。通常，培养物是与按用于达到所需生长和生物质的水平的水平添加的碳源(诸如葡萄糖)一起运行的。培养基中碳源(诸如葡萄糖)的浓度可大于约1g/L，优选大于约2g/L，并且更优选大于约5g/L。此外，培养基中碳源(诸如葡萄糖)的浓度通常小于约100g/L，优选小于约50g/L，并且更优选小于约20g/L。应该注意的是，培养物成分浓度的提及可以指初始和/或持续的成分浓度。在一些情况下，可能需要使培养基中的碳源能够在培养过程耗尽。

可以用于合适培养基中的可同化氮源包括简单氮源、有机氮源和复合氮源。此类氮源包括无水氨，铵盐以及动物、植物和/或微生物来源的物质。合适的氮源包括蛋白质水解物、微生物生物质水解物、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、尿素和氨基酸。通常，培养基中氮源的浓度大于约0.1g/L，优选大于约0.25g/L，并且更优选大于约1.0g/L。然而，超过一定浓度，氮源在培养基中的添加对微生物的生长不利。因此，培养基中氮源的浓度小于约20g/L，优选小于约10g/L，并且更优选小于约5g/L。进一步地，在一些情况下，可能需要使培养基中的氮源能够在培养过程中耗尽。

有效培养基可以含有其他化合物，诸如无机盐、维生素、痕量金属或生长促进剂。此类其他化合物也可以存在于有效培养基中的碳源、氮源或矿物源中，或者可以专门添加到培养基中。

培养基还可以含有合适的磷酸盐源。此类磷酸盐源包括无机磷酸盐源和有机磷酸盐源。优选的磷酸盐源包括磷酸盐，诸如磷酸二氢钠或磷酸一氢钠和磷酸二氢钾或磷酸一氢钾、磷酸铵，以及它们的混合物。通常，培养基中磷酸盐的浓度大于约1.0g/L，优选大于约2.0g/L，并且更优选大于约5.0g/L。然而，超过一定浓度，磷酸盐在培养基中的添加对微生物的生长不利。因此，培养基中磷酸盐的浓度通常小于约20g/L，优选小于约15g/L，并且更优选小于约10g/L。

合适的培养基还可以包括优选呈生理学上可接受的盐的形式的镁源，诸如七水硫酸镁，但可以使用贡献相似镁量的浓度的其他镁源。通常，培养基中镁的浓度大于约0.5g/L，优选大于约1.0g/L，并且更优选大于约2.0g/L。然而，超过一定浓度，镁在培养基中的添加对微生物的生长不利。因此，培养基中镁的浓度通常小于约10g/L，优选小于约5g/L，并且更优选小于约3g/L。进一步地，在一些情况下，可能需要使培养基中的镁源能够在培养过程中耗尽。

培养基还可以包含生物学上可接受的螯合剂，诸如柠檬酸三钠的二水合物。在此类情况下，培养基中螯合剂的浓度大于约0.2g/L，优选大于约0.5g/L，并且更优选大于约1g/L。然而，超过一定浓度，螯合剂在培养基中的添加对微生物的生长不利。因此，培养基中螯合剂的浓度通常小于约10g/L，优选小于约5g/L，并且更优选小于约2g/L。

培养基还可以初始包含生物学上可接受的酸或碱以维持培养基的期望pH。生物学上可接受的酸包括但不限于盐酸、硫酸、硝酸、磷酸及其混合物。生物学上可接受的碱包括但不限于氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾及其混合物。在一些实施方案中，使用的碱是氢氧化铵。

培养基还可以包含生物学上可接受的钙源，包括但不限于氯化钙。通常，培养基中钙源(诸如氯化钙二水合物)的浓度在约5mg/L至约2000mg/L的范围内，优选在约20mg/L至约1000mg/L的范围内，并且更优选在约50mg/L至约500mg/L的范围内。

培养基还可以包含氯化钠。通常，培养基中氯化钠的浓度在约0.1g/L至约5g/L的范围内，优选在约1g/L至约4g/L的范围内，并且更优选在约2g/L至约4g/L的范围内。

培养基还可以包含痕量金属。此类痕量金属可以作为储备溶液添加到培养基中，为方便起见，该储备溶液可以与培养基的其余部分分开制备。通常，添加到培养基中的此类痕量金属溶液的量大于约1mL/L，优选大于约5mL/L，并且更优选大于约10mL/L。然而，超过一定浓度，痕量金属在培养基中的添加对微生物的生长不利。因此，添加到培养基中的此类痕量金属溶液的量通常小于约100mL/L，优选小于约50mL/L，更优选小于约30mL/L。应该注意的是，除了在储备溶液中添加痕量金属外，还可以单独添加各个组分，每个组分均在独立对应于上述痕量金属溶液范围规定的组分量的范围内。

培养基可以包含其他维生素，诸如泛酸盐(pantothenate)、生物素、钙、泛酸盐、肌醇、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素。此类维生素可以作为储备溶液添加到培养基中，为方便起见，该储备溶液可以与培养基的其余部分分开制备。然而，超过一定浓度，维生素在培养基中的添加对微生物的生长不利。

本文所述的发酵方法可在常规培养模式下执行，常规培养模式包括但不限于分批、流加(fed-batch)、细胞再循环、连续和半连续发酵。在一些实施方案中，发酵以流加模式进行。在此种情况下，包括在发酵生产阶段过程中的泛酸盐在内的培养基的一些成分在培养过程中被消耗。在一些实施方案中，可以在例如生产阶段的开始时向培养物中补加相对高浓度的此类组分，以便在需要添加之前支持生长和/或青蒿酸生产一段时间。在整个培养过程中，随着水平被培养物耗尽，通过添加来保持这些成分的优选范围。培养基中组分的水平可以通过例如定期对培养基取样和测定浓度来监测。替代地，一旦制定了标准培养程序，就可以在整个培养过程中的特定时间以对应于已知水平的计时间隔进行添加。如本领域技术人员将认识到，在培养过程中，随着培养基的细胞密度增加，营养物的消耗速率也增加。此外，为了避免将外来微生物引入培养基中，使用本领域已知的无菌添加方法进行添加。此外，在培养过程中可以添加消泡剂。

培养基的温度可以是适合于经遗传修饰的细胞生长和/或青蒿酸生产的任何温度。例如，在给培养基接种接种物之前，可以使培养基达到并保持在约20℃至约45℃的范围内的温度，优选地保持在约25℃至约40℃的范围内的温度，更优选地在约28℃至约32℃的范围内的温度。培养基的pH值可以通过向培养基中添加酸或碱来控制。在此类情况下，当氢氧化铵被用于控制pH值时，它也可以方便地用作培养基中的氮源。优选地，将pH值维持在约3.0至约8.0，更优选地约3.5至约7.0，并且最优选地约4.0至约6.5。

在培养期间监测培养基的碳源浓度，诸如葡萄糖浓度。可以使用已知技术监测培养基的葡萄糖浓度，诸如使用葡萄糖氧化酶测试或高压液相色谱，其可用于监测上清液，例如培养基的无细胞组分中的葡萄糖浓度。碳源浓度通常被保持为低于发生细胞生长抑制的水平。虽然此浓度可能因生物体而异，但对于作为碳源的葡萄糖而言，细胞生长抑制发生在葡萄糖浓度高于约60g/L时，并且可以通过试验轻松确定。因此，当葡萄糖被用作碳源时，葡萄糖优选被供给到发酵罐中并被保持为低于检测限。替代地，培养基中的葡萄糖浓度被维持在约1g/L至约100g/L的范围内，更优选地在约2g/L至约50g/L的范围内，并且还更优选在约5g/L至约20g/L的范围内。尽管可以通过添加例如基本纯的葡萄糖溶液将碳源浓度保持在所需水平范围内，但通过添加原始培养基的等分试样来保持培养基的碳源浓度是可以接受的并且可能是优选的。使用原始培养基的等分试样可能是合乎需要的，因为可以同时保持培养基中其他营养物(例如氮源和磷酸盐源)的浓度。同样，通过添加痕量金属溶液的等分试样，可以保持培养基中的痕量金属浓度。

其他合适的发酵培养基和方法描述于例如WO 2016/196321中。

制作经遗传修饰的细胞的方法

本文还提供了用于生产被遗传工程改造成含有上述一种或多种修饰，例如，一种或多种编码紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶和/或例如针对青蒿酸的生物合成途径酶的异源核酸的宿主细胞的方法。异源酶在宿主细胞中的表达可以通过向宿主细胞中引入核酸来实现，该核酸包含在允许在宿主细胞中表达的调控元件控制下编码酶的核苷酸序列。核酸可以是染色体外质粒、可以将核苷酸序列整合到宿主细胞染色体中的染色体整合载体，或者可以经由同源性将核苷酸序列整合到宿主细胞染色体中的双链DNA的线性片段。

编码这些蛋白质的核酸可以通过本领域技术人员已知的任何方法引入宿主细胞中(参见，例如Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第75卷，第1292-1293卷；Cregg等人，(1985)，Mol.Cell.Biol.，第5卷，第3376-3385卷；Goeddel等人，编者，1990，Methods in Enzymology，第185卷，Academic Press,Inc.，CA；Krieger,1990,GeneTransfer and Expression--A Laboratory Manual,Stockton Press,NY；Sambrook等人，1989，Molecular Cloning--A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY；以及Ausubel等人，编者，现行版，Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates and Wiley Interscience,NY)。示例性技术包括原生质球(spheroplasting)、电穿孔、PEG 1000介导的转化和乙酸锂或氯化锂介导的转化。

宿主细胞中酶的量可以通过修改编码酶的基因的转录来改变。这可以通过如下方式来实现：修改编码酶的核苷酸序列的拷贝数(例如，通过使用更高或更低拷贝数的包含核苷酸序列的表达载体，或通过将额外拷贝的核苷酸序列引入到宿主细胞的基因组中或通过删除或破坏宿主细胞基因组中的核苷酸序列)、通过改变操纵子的多顺反子mRNA上的编码序列的顺序或将操纵子分解成各具有自己的控制元件的单个基因，或通过增加与核苷酸序列可操作地连接的启动子或操纵子的强度。替代地或此外，宿主细胞中酶的拷贝数可以通过修改编码酶的mRNA的翻译水平来改变。这可以通过如下方式来实现：修改mRNA的稳定性、修改核糖体结合位点的序列、修改核糖体结合位点与酶编码序列的起始密码子之间的距离或序列、修改位于酶编码区的起始密码子的5'侧“上游”或附近的整个顺反子间区域、使用发夹和特化序列稳定mRNA转录物的3'端、修改酶的密码子用法、改变用于酶的生物合成中使用的稀有密码子tRNA的表达，以及/或者例如通过使酶的编码序列突变来增加酶的稳定性。

酶在宿主细胞中的活性可以通过多种方式改变，所述方式包括使在宿主细胞中表现出增加或降低的溶解度的酶的修饰形式表达、使酶的改变形式表达(该改变形式缺乏借以抑制酶活性的结构域)、使对底物具有更高或更低的K_cat或者更低或更高的K_m的酶的修饰形式表达、使具有更高或更低热稳定性的酶的修饰形式表达、使在细胞的pH值下具有更高或更低活性的酶的修饰形式表达、使在亚细胞区室或细胞器中具有更高或更低蓄积的酶的修饰形式表达、使具有增加或减少的插入细胞膜或与细胞膜结合的能力的酶表达、使对执行反应所需的辅助蛋白具有更高或更低的亲和力的酶的修饰形式表达、使对必要辅因子或配体具有更高或更低亲和力的酶的修饰形式表达、使在活性位点中具有增加或减少的空间(从而差异地允许或排除该反应的不同底物)的酶的修饰形式表达，或者使或多或少受途径中另一个分子的反馈或前馈调节影响的酶的改变形式表达。

用于遗传修饰宿主细胞的核酸可以含有一种或多种可用于选择转化的宿主细胞和用于对宿主细胞施加选择压力以保持外源DNA的可选择标记物。

可选择标记物可以是抗生素抗性标记物。抗生素抗性标记物的实例包括BLA、NAT1、PAT、AUR1-C、PDR4、SMR1、CAT、小鼠dhfr、HPH、DSDA、KAN^R和SH BLE基因产物。来自大肠埃希氏菌(E.coli)的BLA基因产物赋予对β-内酰胺类抗生素(例如，窄谱头孢菌素、头霉素和碳青霉烯类(厄他培南)、头孢孟多和头孢哌酮)以及对所有抗革兰氏阴性菌青霉素类抗生素(替莫西林除外)的抗性；来自诺氏链霉菌(S.noursei)的NAT1基因产物赋予对诺尔丝菌素的抗性；来自产绿色链霉菌Tu94的PAT基因产物赋予对双丙氨磷(bialophos)的抗性；来自酿酒酵母的AUR1-C基因产物赋予对金担子素A (Auerobasidin A，AbA)的抗性；PDR4基因产物赋予对浅蓝菌素的抗性；SMR1基因产物赋予对甲嘧黄隆的抗性；来自Tn9转座子的CAT基因产物赋予对氯霉素的抗性；小鼠dhfr基因产物赋予对甲氨蝶呤的抗性；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)的HPH基因产物赋予对潮霉素B的抗性；大肠埃希氏菌的DSDA基因产物允许细胞在具有作为唯一氮源的D-丝氨酸的板上生长；Tn903转座子的KANR基因赋予对G418的抗性；来自印度异壁链霉菌(Streptoalloteichus hindustanus)的SH BLE基因产物赋予对Zeocin(博来霉素)的抗性。在分离本文所公开的经遗传修饰的宿主细胞后，可以删除抗生素抗性标记物。

可选择标记物可以通过挽救经遗传修饰的微生物中的营养缺陷体(例如营养型营养缺陷体)而起作用。在营养缺陷体中，亲代微生物在一种或多种在氨基酸或核苷酸生物合成途径中起作用的基因产物中含有功能性破坏，其使亲代细胞无法在未补充一种或多种营养物的培养基中生长。此类基因产物包括酵母中的HIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET15、TRP1、ADE2和URA3基因产物。然后可以通过用编码被破坏的基因产物的功能拷贝的表达载体或染色体整合构建体转化亲代细胞来挽救营养缺陷体表型，并且生成的经遗传修饰的宿主细胞可以基于亲代细胞的营养缺陷体表型的丧失来选择。使用URA3、TRP1和LYS2基因作为可选择标记物具有显著优势，因为正选择和负选择都是可能的。正选择是通过URA3、TRP1和LYS2突变的营养缺陷互补进行的，而负选择是基于特异性抑制剂，即分别阻止原养菌株的生长，但分别允许URA3、TRP1和LYS2突变体的生长的5-氟乳清酸(FOA)、5-氟邻氨基苯甲酸和氨基己二酸(aAA)。可选择标记物可以挽救能够通过已知选择方法鉴定的其他非致死缺陷或表型。

本文描述了在本发明的方法、组合物和宿主细胞中有用的特定基因和蛋白质；然而，这些基因的绝对同一性并不是必需的。例如，可以执行含有编码多肽或酶的序列的特定基因或多核苷酸的变化并针对活性筛选该变化。通常，此类变化涉及保守突变和沉默突变。可以使用本领域已知的方法针对功能性酶的表达筛选此类修饰或突变的多核苷酸和多肽。

由于遗传密码的内在简并性，编码基本相同或功能等效的多肽的其他多核苷酸也可用于表达酶。

修饰编码序列以增强其在特定宿主中的表达可能是有利的。遗传密码是冗余的，有64个可能的密码子，但大多数生物通常使用这些密码子的子集。物种中最常使用的密码子称为最佳密码子，并且那些不经常使用的密码子被归类为稀有或低利用率密码子。在有时被称为“密码子优化”或“物种密码子偏性控制”的过程中，可以替换密码子以反映宿主的偏爱密码子用法。其他宿主细胞的密码子优化可以使用密码子用法表轻松确定，或者可以使用市售软件(诸如来自Integrated DNA Technologies的CodonOp)执行。

可以制备含有特定原核或真核宿主所偏爱的密码子的优化编码序列(Murray等人，(1989)，Nucl Acids Res.，第17卷，第477-508页)，以增加翻译率或者以产生与从非优化序列产生的转录物相比具有所需特性(诸如更长的半衰期)的重组RNA转录物。还可以修改翻译终止密码子以反映宿主偏好。例如，酿酒酵母和哺乳动物的典型终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物的典型终止密码子是UGA，而昆虫和大肠埃希氏菌通常使用UAA作为终止密码子(Dalphin等人，(1996)，Nucl Acids Res.，第24卷，第216-218页)。

由于遗传密码的简并性质，在核苷酸序列上不同的多种DNA分子可被用于编码本公开的给定酶。本文中引用编码上述生物合成酶的原生DNA序列仅是为了说明本公开的实施方案，并且本公开包括编码本发明的方法中使用的酶的多肽和蛋白质的氨基酸序列的任何序列的DNA分子。以类似方式，多肽通常可以耐受其氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代、缺失和插入，而不会损失或显著损失所需活性。本发明包括具有与本文所述的特定蛋白质不同的氨基酸序列的此类多肽，只要经修饰的或变异的多肽具有参考多肽的酶活性即可。此外，由本文所示DNA序列编码的氨基酸序列仅说明本发明的实例。

此外，本发明涵盖可用于组合物、方法或宿主细胞的实践的酶的同源物。当氨基酸序列具有至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性时，两种蛋白质(或蛋白质的区域)被认为具有实质同源性。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入缺口以实现最佳比对，并且出于对应比较目的，可以忽略非同源序列)。出于比较目的而比对的参考序列的长度可以是参考序列的长度的至少30％，通常至少40％，更通常至少50％，甚至更通常至少60％，甚至更通常至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的某个位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在该位置是同一的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。考虑到缺口的数量和每个缺口的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一性位置的数量的函数，需要引入这些缺口以实现两个序列的最佳比对。

当针对蛋白质或肽使用“同源的”时，应认识到不同一的残基位置常常因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被另一个带有具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代的氨基酸取代。一般而言，保守氨基酸取代将不会实质性改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守置换彼此不同的情况下，可向上调整序列同一性百分比或同源性程度以校正该取代的保守性质。作出此调整的手段是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Pearson WR，(1994)，Methods inMol Biol，第25卷，第365-389页)。

以下六组各自含有为彼此的保守取代形式的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

多肽的序列同源性也被称为序列同一性百分比，通常使用序列分析软件测量。用于将分子序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较的典型算法是计算机程序BLAST。当搜索含有来自大量不同生物体的序列的数据库时，通常比较氨基酸序列。

此外，可以通过遗传/蛋白质工程技术，诸如定向进化或合理诱变来优化编码前述酶或者控制或调节其表达的任何调节元件的任何基因。此类作用允许本领域普通技术人员优化酶在酵母中的表达和活性。

此外，可以从其他真菌和细菌物种中鉴定出编码这些酶的基因，并且可以使其表达以调节青蒿酸途径。多种生物体可以作为这些酶的来源，所述生物体包括酵母菌属某些种(Saccharomyces spp.)，包括酿酒酵母(S.cerevisiae)和葡萄汁酵母(S.uvarum)；克鲁维酵母属某些种(Kluyveromyces spp.)，包括耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；毕赤酵母属某些种(Pichiaspp.)；汉逊酵母属某些种(Hansenula spp.)，包括多形汉逊酵母(H.polymorpha)；念珠菌属某些种(Candida spp.)；毛孢子菌属某些种(Trichosporon spp.)；接合糖酵母属(Yamadazyma spp.)，包括树干接合糖酵母(Y.Spp.stipitis)；球有孢圆酵母(Torulasporapretoriensis)；东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)；裂殖酵母菌属某些种(Schizosaccharomyces spp.)，包括粟酒裂殖酵母(S.pombe)；隐球菌属某些种(Cryptococcus spp.)；曲霉菌属某些种(Aspergillus spp.)；链孢霉属某些种(Neurospora spp.)或黑粉菌属某些种(Ustilago spp.)。来自厌氧真菌的基因的来源包括梨囊鞭菌属某些种(Piromyces spp.)、根囊鞭菌属某些种(Orpinomyces spp.)或新丽鞭菌属某些种(Neocallimastix spp.)。有用的原核酶的来源包括大肠埃希氏菌、运动发酵单胞菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌属某些种(Bacillus spp.)、梭菌属某些种(Clostridiumspp.)、棒状杆菌属某些种(Corynebacterium spp.)、假单胞菌属某些种(Pseudomonasspp.)、乳球菌属某些种(Lactococcus spp.)、肠杆菌属某些种(Enterobacter spp.)和沙门菌属某些种(Salmonella spp.)。

本领域技术人员已知的技术可能适用于鉴定额外的同源基因和酶。通常，类似基因和/或类似酶可以通过功能分析来鉴定，并且将具有功能相似性。已知适用于鉴定类似基因和类似酶的技术包括PCR、简并PCR、低严谨度核酸杂交、表达克隆和高通量筛选。例如，为了鉴定同源或类似的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶或任何青蒿酸生物合成途径基因、蛋白质或酶，技术可包括但不限于通过使用基于公布的目的基因/酶的序列的引物执行PCR来克隆基因，或者通过使用被设计用于扩增目的基因中的保守区域的简并引物执行简并PCR来克隆基因。此外，人们可以使用技术来鉴定具有功能同源性或相似性的同源或类似基因、蛋白质或酶。技术包括针对酶的催化活性通过针对所述活性的体外酶测定法检查细胞或细胞培养物(例如，如本文或Kiritani,K.(Branched-Chain AminoAcids Methods Enzymology,1970)中所述)，然后通过纯化分离出具有所述活性的酶，然后通过诸如以下的技术来确定酶的蛋白质序列：Edman降解、针对可能的核酸序列对PCR引物进行设计、通过PCR对所述DNA序列进行扩增，以及对所述核酸序列进行克隆。为了鉴定同源或相似的基因和/或同源或相似的酶、相似基因和/或相似的酶或蛋白质，技术还包括将关于候选基因或酶的数据与诸如BRENDA、KEGG或MetaCYC等的数据库进行比较。候选基因或酶可以根据本文的教导在上述数据库内鉴定。

实施例

实施例1：p450变异筛选菌株

产青蒿酸的酵母菌株，菌株Y26454表达CYP71AV1的野生型型式(编码青蒿紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的基因)。多线证据表明，在青蒿酸的生产规模发酵过程中，紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的活性是限速瓶颈，只有约60％的前体紫穗槐二烯转化为青蒿酸。然而，通过筛选活性增加的酶变体来改进菌株的尝试失败，因为当将Y26454在典型的基于96孔板的测定形式下培养时，几乎所有的紫穗槐二烯都转化为青蒿酸。板发酵和罐发酵之间Y26454性能的差异如图1所示。这种接近完全的反应没有提供足够的净空来鉴定任何与野生型酶相比活性增加的变体。

为了克服基于96孔板的筛选的障碍，开发了可提供降低的CYP71AV1基因表达的菌株，这基于这样的想法，即，表达次优水平的酶将会降低活性的阈值下限，在此基础上，即使是轻微或适度的活性增加也可以被测量到。最佳筛选菌株将是显示出紫穗槐二烯氧化减少但保持相对高的总倍半萜水平的菌株。通过将CYP71AV1基因置于一组启动子的控制下并测试每个菌株的紫穗槐二烯氧化减少但相对高的倍半萜水平，从而鉴定出具有这些品质的菌株(参见图2)。使用ssOD测量这些菌株的生长，该ssOD测量稀释剂中细胞的OD，该稀释剂可减少由倍半萜的存在引起的光学干扰(参见图3)。

实施例2：酵母转化方法

在优化的乙酸锂(LiAc)转化中，使用标准分子生物学技术将每个DNA构建体整合到酿酒酵母(CEN.PK113-7D)中。简而言之，使细胞在含有1％麦芽糖和2g/L赖氨酸的酵母提取物蛋白胨右旋糖(YPD)培养基中在30℃于振荡(200rpm)下生长过夜，将该细胞在100mL含有1％麦芽糖和2g/L赖氨酸的YPD中稀释至OD₆₀₀为0.1，并让该细胞生长至OD₆₀₀为0.6-0.8。对于每次转化，通过离心收获5mL培养物，将其在5mL无菌水中洗涤，再次离心，重新悬浮在1mL 100mM LiAc中，并转移到微量离心管中。将细胞离心(13,000xg)30秒，去除上清液，并将细胞重新悬浮在由240μL 50％PEG、36μL 1M LiAc、10μL煮鲑鱼精子DNA和74μL供体DNA组成的转化混合物中。对于需要表达核酸内切酶F-Cph1的转化，供体DNA包含携带在酵母TDH3启动子下表达的F-CphI基因的质粒用于表达。这将切割着陆垫中的F-CphI核酸内切酶识别位点，以促进目标靶基因的整合。在42℃下热激40分钟后，使细胞在YPD培养基中过夜恢复，然后将其铺板于选择性培养基上。DNA整合是通过用对整合具有特异性的引物进行的菌落PCR确认的。

实施例3：通过定点饱和诱变进行的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶进化

在这个实例中，提供了野生型紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶和改进在酿酒酵母中体内表达的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶活性以产生青蒿酸的特异性突变的活性数据。

通过从Twist Bioscience(San Francisco,CA)订购单位点饱和库来使紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶中的每个氨基酸残基突变。合成了具有整个紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶编码序列以及用于克隆目的的位于任一端上的150bp侧翼同源性的库，以使得除起始密码子之外的每个氨基酸位置都包含每个可能的氨基酸(野生型氨基酸加19个非野生型变体)，每个分子有一处突变。总体而言，该库包含可能的9880个变体(494个位置×每个位置20个可能的氨基酸)中的9762个变体，其中477个位置包含所有20个可能的变体。只有3个位置具有多于2个取代未能合成(构建体要么违反了设计约束(例如通过引入限制性位点)，要么在QC期间未被检测到)。将每个氨基酸位置处的20个变体汇集在一起，并通过使用150bp的侧翼同源性指导整合来将针对每个位置的库单独转化到我们的筛选菌株中，从而导致突变异紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶在相对弱的pGAL2启动子下表达。从每个转化中挑选出40个单独的菌落，用于在96孔板中筛选青蒿酸的产生，以获得2倍的突变覆盖率。

初步筛选鉴定出了导致变体酶相对于亲代野生型酶具有增加的活性的以下氨基酸取代：A9D、I95L、I95V、E129N、R173I、、T241N、K245C、L334M、Q346K、、T421R、A443K、A443S、Q450K、S469C、T487C、L490C和V492M(参见图4)。选择这些顶级变体中10种变体的子集(A9D、I95V、E129N、V220I、T241N、L334M、L351F、T421R、A443K和Q450K)来生成我们的组合库，从而将整个序列中的突变隔开。该库是通过将整个氨基酸序列分解为3个用于合成的片段而生成的。片段1跨越突变A9D、I95V和E129N；片段2包含V220I、T241N和L334M；片段3包含L351F、T421R、A443K和Q450K。对片段1和2的所有8种可能组合(针对3个位置中每一个位置的野生型或突变氨基酸的所有可能组合)进行排序，并对片段3的16种组合进行排序。该片段包含与相邻片段同源的区域。将所有32个基因片段汇集在一起，并通过重叠延伸(OE)PCR组装成全长P450序列。来自OE-PCR反应的样本被送去进行序列分析，以确认所有位置都存在野生型和突变变体。然后将氨基酸变体组合库转化到低P450表达筛选菌株中。筛选鉴定出了相对于亲代野生型和我们的低启动子强度菌株中的第一轮变体具有增高的活性并且在生产菌株中具有与野生型相当滴度的组合变体(参见表2)。特别地，发现以下氨基酸取代组合对酶活性增强有益：A9D、I95V、E129N、V220I、T241N、L351F和Q450K；A9D、I95V、E129N、V220I、T241N、L334M、L351F和Q450K；A9D、E129N、V220I、L351I和Q450K；以及A9D、E129N、V220I、L351F和Q450K。

实施例4：改进的单突变变体

改进的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶单突变变体是通过在具有疏水覆盖层的96孔板中从弱启动子表达时青蒿酸的改进的产量优于含覆盖层的板中的野生型P450来鉴定的。

将具有实施例3中鉴定出的具有氨基酸取代的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶突变体的子集(参见图4)转化到具有较高P450表达水平的宿主菌株中，并在具有疏水覆盖层的96孔板中测量青蒿酸产量。与表达野生型P450(包括I95V、V220I、F238N和A443K)的等基因菌株相比时，这些突变体中的一些突变体导致明显更高的青蒿酸滴度(图5)。

实施例5：改进的组合变体

紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的组合突变变体是通过与在生产菌株背景中从强启动子表达时的野生型P450相比，在具有疏水覆盖层的96孔板中从弱启动子表达时改进的青蒿酸产量产生相似的AA滴度来鉴定的。

在我们的弱启动子筛选菌株中对我们的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的组合突变变体进行的筛选鉴定出几种使青蒿酸产量相对于野生型菌株增加了2倍以上的氨基酸变体的组合。用驱动P450的高表达启动子，将这些突变P450移植到生产菌株。然后在96孔板中测量在存在疏水覆盖层的情况下生长的菌株的青蒿酸滴度。这些菌株的子集的数据如图6所示。组合突变菌株的青蒿酸滴度与具有野生型P450的等基因菌株在统计学上无法区分。这突出了在低表达菌株中筛选改进的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶变体的需要。

实施例6：变体表征

通过在具有疏水覆盖层的96孔板中从弱启动子表达时改进的青蒿素产量所鉴定出的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的改进的单个和多个氨基酸变体被发现优于无疏水覆盖层的96孔板中的亲代菌株(WT P450)。

在无覆盖层的96孔微量滴定板中，也测试了从低表达筛选菌株鉴定并移植到我们的高表达生产背景中的改进的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶变体。将P450变体Y49851(E129N)和组合变体Y49841(A9D、F229Y)与表达野生型P450(Y26454)的等基因菌株相比较。虽然当针对在存在疏水覆盖层的情况下生长的菌株测量时，滴度相当相似，但是在不存在覆盖层的情况下生长时可以看到相对于等基因野生型菌株的显著改进(图7)。

通过在96孔板中从弱启动子表达时改进的青蒿酸产量所鉴定的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的组合突变变体，与在具有覆盖层的罐中从强启动子表达时的亲代菌株(含WT P450)相比产生更高浓度的AA。

将实施例6中鉴定的紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的三个顶级组合突变变体在具有疏水覆盖层的发酵罐中运行。与表达野生型紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶的等基因菌株相比时，所有三种突变变体的产量和生产力都更高/青蒿酸和青蒿醛滴度(P450下游的氧化产物)增加，而紫穗槐二烯滴度降低(图8)。当将这些相同的菌株在96孔板模型中运行时，未检测到青蒿酸滴度的显著差异(图6)。

表2：组合突变的活性

其他实施方案

尽管已经结合其具体的实施方案描述本发明，但应理解本发明能够具有另外的修改，并且本申请旨在涵盖大体上符合本发明原理的、包括虽然不属于本发明所公开内容范围但属于本发明所属领域的公知技术或常用的技术手段并可以应用于上文中阐述和所附权利要求的范围所列出的必要特征中的任何变型、用途或者变更。

例如，除了上面公开的组合物和方法之外，本发明的特征在于以下枚举的实施方案中列举的主题。

本发明的示例性枚举的实施方案

实施方案1.一种变异紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶多肽，其具有经由一个或多个氨基酸取代而与SEQ ID NO:1的氨基酸序列不同的氨基酸序列。

实施方案2.如实施方案1所述的变异多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代包括A9D、I95L、I95V、E129N、R173I、V220I、T241N、K245C、L334M、Q346K、L351F、T421R、A443K、A443S、Q450K、S469C、T487C、L490C和/或V492M。

实施方案3.如实施方案1或2所述的变异多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代包括A9D、I95V、E129N、V220I、T241N、L351F和/或Q450K，任选地其中所述一个或多个氨基酸取代包括A9D、I95V、E129N、V220I、T241N、L351F和Q450K。

实施方案4.如实施方案1或2所述的变异多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代包括A9D、I95V、E129N、V220I、T241N、L334M、L351F和/或Q450K，任选地其中所述一个或多个氨基酸取代包括A9D、I95V、E129N、V220I、T241N、L334M、L351F和Q450K。

实施方案5.如实施方案1或2所述的变异多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代包括A9D、E129N、V220I、L351I和/或Q450K，任选地其中所述一个或多个氨基酸取代包括A9D、E129N、V220I、L351I和Q450K。

实施方案6.如实施方案1或2所述的变异多肽，其中所述一个或多个氨基酸取代包括A9D、E129N、V220I、L351F和/或Q450K，任选地其中所述一个或多个氨基酸取代包括A9D、E129N、V220I、L351F和Q450K。

实施方案7.如实施方案1至6中任一项所述的变异多肽，其中所述变异多肽的氨基酸序列与所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列为至少90％同一的(例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一或更高的同一)，任选地其中所述变异多肽的氨基酸序列与所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列为至少95％同一的，任选地其中所述变异多肽的氨基酸序列与所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列为至少96％同一的，任选地其中所述变异多肽的氨基酸序列与所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列为至少97％同一的，任选地其中所述变异多肽的氨基酸序列与所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列为至少98％同一的，任选地其中所述变异多肽的氨基酸序列与所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列为至少99％同一的。

实施方案8.如实施方案1至7中任一项所述的变异多肽，其中所述变异多肽的氨基酸序列仅因所述一个或多个氨基酸取代而与SEQ ID NO:1的氨基酸序列不同。

实施方案9.一种核酸，其编码前述实施方案中任一项所述的多肽。

实施方案10.一种宿主细胞，其包含实施方案1至8中任一项所述的多肽。

实施方案11.一种宿主细胞，其包含实施方案9所述的核酸。

实施方案12.如实施方案10或11所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生选自青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸的化合物。

实施方案13.如实施方案12所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生青蒿酸。

实施方案14.如实施方案10至13中任一项所述的宿主细胞，其进一步包含编码选自青蒿ADH1和青蒿ALDH1的多肽的核酸。

实施方案15.一种产生靶p450酶的变体的方法，其包括：

获得编码靶p450的变体的核酸库；

用所述库转化宿主细胞群，使得每个库核酸可操作地连接到弱启动子；

将单个经转化的宿主细胞铺板到多孔板的单个孔中；

在产生试验化合物的条件下培养所述宿主细胞；

测量由所述经转化的宿主细胞产生的所述试验化合物的水平；和

选择相对于对照增加所述试验化合物的水平的变体。

实施方案16.如实施方案15所述的方法，其中所述弱启动子选自pGAL10、pGAL2、pGAL1_v22、pGAL1_v25、pGAL1_v2、pGAL3和pGAL2_v22。

实施方案17.如实施方案15或16所述的方法，其中所述试验化合物是类异戊二烯。

实施方案18.如实施方案17所述的方法，其中所述试验化合物选自半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜、类二倍半萜和类胡萝卜素。

实施方案19.如实施方案18所述的方法，其中所述试验化合物选自青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸。

实施方案20.如实施方案15或16所述的方法，其中所述试验化合物是混源萜类。

实施方案21.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述靶p450酶是紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶。

实施方案22.如前述实施方案中任一项所述的方法，其还包括：

创建编码所述靶p450变体的第二核酸库，其中所述核酸包含所选择变体的组合；

用所述第二库转化宿主细胞群，使得每个第二库核酸可操作地连接到第二弱启动子；

将单个经转化的宿主细胞铺板到多孔板的单个孔中；

在产生所述试验化合物的条件下培养所述宿主细胞；

测量在所述多孔板的每个孔中产生的所述试验化合物的水平；和

选择相对于第二对照增加所述试验化合物的水平的二阶变体。

实施方案23.如实施方案22所述的方法，其中所述第二弱启动子不同于所述弱启动子。

实施方案24.如实施方案22所述的方法，其中所述第二弱启动子与所述弱启动子是同一的。

实施方案25.如实施方案22所述的方法，其中所述第二对照不同于所述对照。

实施方案26.如实施方案22所述的方法，其中所述第二对照与所述对照是同一的。

实施方案27.如实施方案22所述的方法，其中所述第二库包含编码所选择的变体的所有可能组合的核酸。

序列附录

青蒿紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶(SEQ ID NO:1)

KSILKAMALSLTTSIALATILLFVYKFATRSKSTKKSLPEPWRLPIIGH

MHHLIGTTPHRGVRDLARKYGSLMHLQLGWPTIVVSSPKWAKEILTTYD

ITFANRPETLTGEIVLYHNTDVVLAPYGEYWRQLRKICTLELLSVKKVKS

FQSLREECWNLVQEIKASGSGRPVNLSENVFKLIATILSRAAFGKGIKD

QKELTEIVKEILRQTGGFDVADIFPSKKFLHHLSGKRARLTSLRKKIDNL

IDNLVAEHTVNTSSKTNETLLDVLLRLKDSAEFPLTSDNNIKAIILDMFGA

GTDTSSSTIEWAISELIKCPKAMEKVQAELRKALNGKEKIHEEDIQELSY

LNMVIKETLRLHPPLPLVLPRECRQPVNLAGYNIPNKTKLIVNVFAINRD

PEYWKDAEAFIPERFENSSATVMGAEYEYLPFGAGRRMCPGAALGLANVQ

LPLANILYHFNWKLPNGVSYDQIDMTESSGATMQRKTELLLVPSF

青蒿ADH1(SEQ ID NO:2)

MAQKAPGVITCKAAVVWESSGPVVLEEIRVDPPKASEVRIKMLCASLCHT

DVLCTKGFPIPLFPRIPGHEGVGVIESIGKDAKGLKPGDIVMPLYLGECG

QCLNCKTGKTNLCHVYPPSFSGLMNDGTSRMSIARTGESIYHFASCSTWT

EYAVADCNYVLKINPKISYPHASFLSCGFTTGFGATWRETQVSKGSSVAV

FGIGTVGLGVIKGAQLQGASKIIGVDVNQYKAAKGKVFGMTDFINPKDHP

DKSVSELVKELTHGLGVDHCFECTGVPSLLNEALEASKIGIGTVVPIGAG

GEASVAINSLILFSGRTLKFTAFGGVRTQSDLPVIIDKCLNKEIQLDELL

THEIHLDNIQEAFEILKKPDCVKILIKF

青蒿ALDH1(SEQ ID NO:3)

MSSGANGSSKSASHKIKFTKLFINGEFVDSISGNFTDTINPATEEVLATV

AEGRKEDIDLAVKAAREAFDNGPWPRMSGEARRKIMLKFADLIDENADEL

TTLEVIDGGKLFGPVRHFEVPVSSDTFRYFAGAADKIRGATLKMSSNIQA

YTLREPIGVVGHIIPWNGPAFMFATKVAPALAAGCTMVIKPAEHTPLTVL

FLAHLSKLAGVPDGVINVVNGFGKTAGAAVSSHMDIDMVTFTGSTEVGRT

VMQAAALSNLKPVSLELGGKSPLIVFDDADVDKAAEFAILGNFTNKGEMC

VAGSRVFVQEGIHDVFVKKLEGAVKAWATRDPFDLATRHGPQNNKQQYDK

VLSCINHHGKKEGATLVTGGKPFGKKGYYIEPTLFTNVTDDMTIAKEEIFG

PVISVLKFKTVEEVIKRANATKYGLASGVFTKNIDVVNTVSRSLRAGAVW

VNCYLALDRDAPHGGYKMSGFGREQGLEALEHYLQIKTVATPIYDSPWL

青蒿ADS(SEQ ID NO:4)

MSLTEEKPIRPIANFPPSIWGDQFLIYEKQVEQGVEQIVNDLKKEVRQLLKEALDIPMKHANLLKLIDEIQRLGIPYHFEREIDHALQCIYETYGDNWNGDRSSLWFRLMRKQGYYVTCDVFNNYKDKNGAFKQSLANDVEGLLELYEATSMRVPGEIILEDALGFTRSRLSIMTKDAFSTNPALFTEIQRALKQPLWKRLPRIEAAQYIPFYQQQDSHNKTLLKLAKLEFNLLQSLHKEELSHVCKWWKAFDIKKNAPCLRDRIVECYFWGLGSGYEPQYSRARVFFTKAVAVITLIDDTYDAYGTYEELKIFTEAVERWSITCLDTLPEYMKPIYKLFMDTYTEMEEFLAKEGRTDLFNCGKEFVKEFVRNLMVEAKWANEGHIPTTEEHDPVVIITGGANLLTTTCYLGMSDIFTKESVEWAVSAPPLFRYSGILGRRLNDLMTHKAEQERKHSSSSLESYMKEYNVNEEYAQTLIYKEVEDVWKDINREYLTTKNIPRPLLMAVIYLCQFLEVQYAGKDNFTRMGDEYKHLIKSLLVYPMSI