CN115176017A - 修饰的细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种产生无染色体细菌细胞的方法，包括：i)通过在细菌细胞中表达能够识别并且双链切割天然染色体DNA的核酸内切酶降解细菌细胞中的天然染色体DNA，其中，所述核酸内切酶的表达受到诱导型或抑制型启动子的控制；并且ii)用编码一种或多种生化能量途径或其部分的酶的重组核酸转化细菌细胞，所述生化能量途径或其部分为无染色体细菌细胞提供能量。本发明还涉及相关的组合物、无染色体细菌细胞以及治疗。

Description

修饰的细胞
本发明涉及一种产生无染色体细菌细胞(SimCell)的方法、它们的用途以及相关的组合物、产品和方法。
合成生物学涉及如核酸、基因和蛋白质等生物材料的操作和组装，以产生新的生物成分或系统。这些可以包括人工酶、新的基因回路以及代谢途径，具有可以通过计算机建模来预测的行为。然而，天然存在的细胞与合成生物学之间存在利益冲突。细胞的目的是在适应和繁殖的驱动并且使用生物学过程、途径和保护措施的完整补充来平衡其环境影响的所有方面下存活，以最终将其基因传递给后代。另一方面，合成生物学涉及利用生物学过程和生物体以最高效率水平实施特定功能或感兴趣的任务。此固有冲突导致细胞行为的繁琐复杂性和可变性(这反过来可以有害于合成的基因回路的性能)、由于来自天然基因网络的有害干扰而导致的不可预测的基因表达以及来自大多数生物体中普遍存在的转座因子的潜在防御性破坏。
合成生物学的一种尝试为从零开始构建细胞，即所谓的自下而上方法。实现此的一种方法是通过化学合成的脂质双层膜和必需的生物分子(例如，核酸和酶)的自组装以产生原始细胞。
另一种方法为创建称为“SimCell”的无染色体底盘(chassis)，例如通过利用现存细胞的异常分裂，以及引入设计的基因回路或人工染色体或质粒(Hutchison et al.,2016,Science,351)。这种方法允许对现存生物体重新编程，替换天然染色体，同时维持预先存在的细胞机制(Rampley et al.,2017,Scientific.Rep.,7)。对现存细胞重新编程的一种技术是基因组移植；然而，这是极其低效的，150000个靶细胞中最多只有1个被成功移植，而在不同菌株之间移植基因组会进一步降低效率(Lartigue et al.,2007,Science,317,632-638)。另一种方法是产生无染色体细胞。用于尝试实现此的一种技术是通过生成小细胞，由此ΔminC/minD突变体可以产生无染色体的小细胞(Rampley et al.,2017,Scientific.Rep.,7)。然而，一些细菌缺乏minC/minD基因(例如，类球红细菌(Rhodobactersphaeroides))，所以这不是普遍适用的方法，并且基因组上特定基因的敲除可能很麻烦。此外，这些细胞具有缺陷，如使用寿命差。
因此，需要开发可替代的或改进的方法以产生保持代谢活性并具有更高稳定性的无染色体(非复制的)细胞，例如执行感兴趣的生物学任务。
根据第一方面，本发明提供了一种产生无染色体细菌细胞的方法，包括：
i)通过在所述细菌细胞中表达能够识别并且双链切割天然染色体DNA的核酸内切酶降解细菌细胞中的天然染色体DNA，其中，所述核酸内切酶的表达受到诱导型或抑制型启动子的控制；并且
ii)用编码一种或多种生化能量途径或其部分的酶的重组核酸转化所述细菌细胞，所述生化能量途径或其部分为所述无染色体细菌细胞提供能量。
有利地，本发明提供了一种新的和广泛适用的方法以产生无染色体的和可重新编程的(reprogrammable)细菌细胞，本文中称为“SimCell”。根据本发明的方法产生的SimCell有利地具有显著的使用寿命和稳定性，例如与之前描述的其它小细胞相比。例如，SimCell维持其核心功能，如转录和翻译，并且能够发挥功能连续10天，且能够保存至少5个月。得到的SimCell包含完整的细胞膜及其相关蛋白质以及细胞质中的完整分子补体，以激活细胞机制的功能，并且其使染色体DNA被降解。这样的SimCell具有生化活性和可修饰性，例如，用于引入编码非内源基因组或甚至核心基因操作系统的重组DNA，使细胞能够表达人工基因或微型基因组并实施所需的功能。得到的无染色体细胞可以用于产生感兴趣的分子或实施特定的感兴趣的生化能量途径，例如产生、降解或代谢化学物质和生化物质。包括其它应用在内，此类细胞还会允许将治疗剂递送至体内靶标(Vickers et al.,2010,Nat.Chem.Biol.,875-877)。此外，这些细胞能够将它们的大部分能量和资源用于重组DNA的指定功能，而不受内源染色体DNA编码的不良内源性途径和网络的干扰。
核酸内切酶
用于降解所述染色体DNA的核酸内切酶可以包括归巢核酸内切酶。用于降解所述染色体DNA的核酸内切酶可以在细菌细胞的染色体DNA的至少1、2、3、4、5、6或7个位点识别并进行双链断裂(DSB)。在一个实施方案中，所述核酸内切酶可以识别10-bp或更多的识别序列。在一个实施方案中，所述核酸内切酶可以识别15-bp或更多的识别序列。在另一个实施方案中，所述核酸内切酶可以识别20-bp或更多的识别序列。在另一个实施方案中，所述核酸内切酶可以识别26-bp或更多的识别序列。在一个实施方案中，所述核酸内切酶可以识别一种序列，该序列可能出现在4.5×1015或更多的基因序列中的1个中，如基因、基因回路(gene-circuit)或微型基因组。
用于降解所述染色体DNA的核酸内切酶可以识别并切割23S细菌核糖体RNA编码基因(rrl)中存在的序列。在一个实施方案中，用于降解所述染色体DNA的核酸内切酶识别序列5'-TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA-3'(SEQ ID NO：5)，或由所述序列的1、2、3、4或5个核苷酸替换、添加或缺失组成的其变体。在一个实施方案中，用于降解所述染色体DNA的核酸内切酶为I-CeuI，或其同源物。I-CeuI可以是衣藻属物种(Chlamydomonas spp.)I-CeuI。在一个实施方案中，I-CeuI可以包含CAA78934.1的氨基酸序列(欧洲核苷酸档案库(EuropeanNucleotide Archive)：https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/CAA78934)。在一个实施方案中，I-CeuI可以包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，I-CeuI可以由SEQ ID NO：2的序列或其变体编码。
本领域技术人员将认识到编码用于降解染色体DNA的核酸内切酶(如I-CeuI)的核酸序列可以进行密码子优化，以用于细菌细胞物种(如罗尔斯通氏菌属物种(Ralstoniaspp.))中的表达。
核酸内切酶，如I-CeuI，可以包括野生型核酸内切酶的修饰的/工程化(例如突变的)形式。修饰可以包括一种或多种突变，其使核酸内切酶能够在相对于野生型的不同序列识别并且切割和/或具有与野生型不同的活性。突变可以在负责识别核酸序列的活性位点中。
有利地，I-CeuI允许大多数细菌染色体的降解，因为其活性引起在23S细菌核糖体RNA(rRNA)编码基因(rrl)中的双链断裂。
核酸内切酶可以在核酸上编码，并且所述方法可以包括用编码核酸内切酶的核酸转化细菌细胞。在一个实施方案中，核酸内切酶在质粒上编码。因此，所述方法可以包括用编码核酸内切酶的质粒转化细菌细胞。
核酸内切酶的表达控制
核酸内切酶(如I-CeuI)的表达可以受到诱导型启动子或抑制型启动子的控制。在一个实施方案中，核酸内切酶(如I-CeuI)的表达可以受到抑制型启动子的控制。优选地，核酸内切酶(如I-CeuI)的表达受到严格调节，其中在缺乏启动子的诱导或脱抑制的情况下，核酸内切酶的基础表达水平不存在或检测不到。
用于核酸内切酶(如I-CeuI)的启动子可以受到四环素抑制子(TetR)基因的控制。在一个实施方案中，其中，细菌细胞为大肠杆菌(E.coli)，用于核酸内切酶(如I-CeuI)的启动子可以受到四环素抑制子(TetR)基因的控制。核酸内切酶(如I-CeuI)的表达可以通过提供脱水四环素(anhydrotetracycline)来诱导。
用于核酸内切酶(如I-CeuI)的启动子可以受到EilR的控制。抑制型启动子可以包含EilR结合位点。在一个实施方案中，抑制型启动子包括“丛林表达(Jungle Express)”(JEx)抑制子系统，例如如Ruegg等人(Nature Communications第9期,论文编号:3617(2018))所述，其通过引用并入本文。可以在任何细菌细胞中使用包含EilR结合位点的抑制型启动子，如JEx。在另一个实施方案中，包含EilR结合位点的抑制型启动子，如JEx，可以用于假单胞菌属物种(Pseudmonas spp.)(例如恶臭假单胞菌(Pseudmonas putida))和/或罗尔斯通氏菌属物种(Ralstonia spp.)(例如富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha))。在另一个实施方案中，包含EilR结合位点的抑制型启动子，如JEx，可以用于埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)，如大肠杆菌。
在所述细菌细胞中表达所述核酸内切酶可以包括将所述细菌细胞暴露于诱导物分子。例如，其中，所述启动子受到TetR的控制，所述核酸内切酶(如I-CeuI)的表达可以通过提供脱水四环素(ATc)作为诱导物来诱导。在另一个实施例中，其中，所述启动子受到EilR的控制，所述核酸内切酶(如I-CeuI)的表达可以通过提供EilR结合分子作为诱导物来诱导。所述EilR结合分子(即诱导物)可以包含能够结合并且拮抗EilR的染料分子，如结晶紫。所述EilR结合分子(即诱导物)可以包含：结晶紫、孔雀绿、四环素、基于咪唑鎓盐的离子液体(如咪唑鎓、吡啶鎓)中的任一种；或其组合。
多个DSB的产生对细菌细胞是致命的，因此编码核酸内切酶(如I-CeuI，其识别并切割细胞的染色体DNA)的菌株不能存活，除非核酸内切酶的表达受到控制。因此，编码核酸内切酶的细菌细胞转化子(transformant)的转化和选择(例如，用于克隆/工程化编码核酸内切酶的质粒，和/或引入编码核酸内切酶的质粒以用于随后的SimCell产生)需要控制核酸内切酶(如I-CeuI)的表达。有利地，核酸内切酶的表达的严格调节确保避免了可以使SimCell形成机制失活的各种细菌的细胞防御。这种防御包括转座因子的失活或细胞为使核酸内切酶基因(如I-CeuI基因)失活而产生的其它突变(碱基对改变、缺失)，如Fan等人(2019.ACS Synthetic biology 8:2141-2151)所讨论的，其通过引用并入本文。不受理论束缚，可以理解的是，如果细胞中存在核酸内切酶，即使以低水平存在，也可以触发防御机制，并且基因可能会失活。通过严格控制，细胞不会被警告它正含有有毒物质，因此基因的完整性将得到保持。
提供用于转化细菌细胞的编码的核酸内切酶
所述方法可以包括提供在用于转化细菌细胞的核酸上编码的核酸内切酶。所述方法可以包括通过将编码核酸内切酶基因的序列重组到用于转化细菌细胞的核酸中来提供编码核酸内切酶的核酸的步骤。编码核酸内切酶基因的序列可以是PCR产物，或从另一种核酸(如克隆质粒)中切除的产物。因此，编码核酸内切酶基因的序列可以从供体核酸模板通过PCR产生，或从供体核酸(如克隆质粒)通过切除产生。
编码用于重组到用于转化细菌细胞的核酸中的核酸内切酶基因的序列可以另外编码用于表达的启动子，如本文所描述的抑制型启动子或诱导型启动子。可替代地，可以在用于转化细菌细胞的核酸中提供用于表达的启动子(即，核酸内切酶基因被重组到核酸中，该核酸携带合适的启动子用于核酸内切酶基因的表达)，如本文所描述的抑制型启动子或诱导型启动子。本领域技术人员将认识到用于表达核酸内切酶基因的启动子应当可操作地连接至核酸内切酶基因以影响核酸内切酶的表达(这也可以取决于诱导或脱抑制)。
核酸内切酶控制
为了提供编码核酸内切酶基因的序列，例如作为使用供体模板的PCR产物，或从供体核酸(如克隆质粒)切除的产物，供体核酸可以编码核酸内切酶基因的序列。供体核酸可以编码不能被表达的形式的核酸内切酶基因的序列。例如，核酸内切酶基因可以是无启动子的，或至少不受功能启动子的控制。另外地或可替代地，核酸内切酶基因的表达可以被供体核酸中的二级结构(如发夹环(hairpin loop))阻止。在供体核酸中，当核酸内切酶基因提供有启动子时，可以提供这种二级结构(例如发夹环)。所述发夹环可以由供体核酸中的反向互补序列提供。供体核酸中的反向互补序列可以与核酸内切酶基因和/或其任何相关的启动子的序列反向互补，或与足够接近核酸内切酶基因和/或其任何相关的启动子的序列反向互补，以阻止核酸内切酶基因的表达。所述发夹环可以被布置以在核酸内切酶基因和/或其任何相关的启动子中形成发夹环。在一个实施方案中，所述二级结构，如发夹环，被布置以在核酸内切酶基因的启动子中形成发夹环。
在一个实施方案中，在细菌细胞中表达核酸内切酶包括以下步骤：
i)提供编码核酸内切酶基因的供体核酸，其中，所述核酸内切酶基因是无启动子的；或者，其中，所述核酸内切酶基因可操作地连接至启动子，并且所述供体核酸还被布置以形成发夹环以阻止所述核酸内切酶的表达；
ii)使用所述供体核酸作为模板以形成编码所述核酸内切酶的PCR产物，并且将所述PCR产物插入用于转化所述细菌细胞的核酸中，其中，将所述核酸内切酶基因插入一位置，使得其受到所述诱导型或抑制型启动子的控制；或者
或将所述供体核酸上编码的核酸内切酶基因与用于转化所述细菌细胞的核酸重组，其中，将所述核酸内切酶基因重组到一位置，使得其受到所述诱导型或抑制型启动子的控制。
本领域技术人员将认识到，二级结构，如发夹环，可以通过序列的设计在核酸序列中产生。双螺旋质粒中的发夹环将是稳定的(即，发夹环的形成不太可能发生)。然而，发夹环可以在单链DNA或RNA中形成，使得当转录发生时，所述发夹环可以形成以阻断进一步的转录或翻译。
所述反向互补序列的长度可以是至少6、8、10、12或15个核苷酸。在另一个实施方案中，所述反向互补序列的长度可以是约10-1000个核苷酸。在另一个实施方案中，所述反向互补序列的长度可以是约10-500个核苷酸。在另一个实施方案中，所述反向互补序列的长度可以是约10-100个核苷酸。在另一个实施方案中，所述反向互补序列的长度可以是约10-50个核苷酸。在另一个实施方案中，所述反向互补序列的长度可以是约10-20个核苷酸。在另一个实施方案中，所述反向互补序列的长度可以是约15个核苷酸。所述反向互补序列可以足够长以在二级结构形成的位置是特异性的。
所述二级结构，如发夹环，可以破坏核酸内切酶的表达，例如通过确保核酸内切酶基因和/或启动子的序列不能被mRNA聚合酶或转录可能需要的其它酶或辅助因子使用。有利地，确保核酸内切酶不能从供体核酸表达，例如通过发夹环，可以确保核酸内切酶对携带或克隆供体核酸的细胞不是有害(如致命)的。核酸内切酶基因的供体复制可以不在模板中表达，以保持其完整性并允许长期储存。
编码核酸内切酶的核酸，如质粒，也可以编码选择标记。所述选择标记可以包含抗生素抗性基因，以能够鉴定成功地用核酸(如质粒)转化的细胞。
能量途径
在一实施方案中，在诱导核酸内切酶的表达之前，用编码一种或多种生化能量途径或其部分的酶的核酸转化细菌细胞。在一可替代的实施例中，在诱导核酸内切酶的表达之后，例如在表达的诱导停止之后，用编码一种或多种生化能量途径或其部分的酶的核酸转化细菌细胞。
所述生化能量途径可以涉及并且能够产生ATP和NAD(H)，例如通过将葡萄糖转化为丙酮酸盐。此外，所述生化能量途径可以涉及并且能够产生NADPH、H+、GTP和FADH2中的一种或多种分子。在一个实施方案中，所述生化能量途径为糖酵解途径。糖酵解途径的酶可以在本文SEQ ID NO：4中鉴定的糖酵解途径编码序列或其变体中编码。在另一个实施方案中，所述生化能量途径为戊糖磷酸途径。可替代地，所述生化能量途径包括糖酵解途径与戊糖磷酸途径的组合或其部分。在一个实施方案中，提供了直至并包括生成Ru5P的戊糖磷酸途径的至少一部分。
所述生化能量途径可以是好氧或厌氧途径。所述生化能量途径可以是来自能够从碳源(如CO2、碳水化合物和/或单糖)产生ATP和NADH的化能自养生物或异养生物的任何途径。
因此，在一个实施方案中，用编码所述糖酵解途径的一种或多种或所有酶的核酸转化所述细菌细胞。在一个实施方案中，用编码糖酵解的上部和/或下部分解代谢途径的核酸转化所述细菌细胞。可以提供完整的糖酵解途径。所述生化能量途径可以通过用包含SEQID NO：4的序列或由SEQ ID NO：4的序列组成的核酸转化细菌细胞来提供。
生化能量途径的“其部分”的提及应理解为是指可以被编码或表达的对生化能量途径关键的至少一种、两种、三种、四种或更多种酶。本领域技术人员将熟悉细菌中的生化能量途径，例如糖酵解，以及生成ATP和NAD(H)所需的必要成分。在生化能量途径(如糖酵解途径)可以典型地包含许多酶的情况下，将认识到的是，一些酶对于生成ATP和NAD(H)可以不是关键的，或者它们可以与一种或多种可替代的酶互换。因此，生化能量途径可以由被布置为从碳源生成至少ATP和NAD(H)的酶的任何组合构成。生化能量途径中的酶还可以包含膜转运蛋白。另外地或可替代地，生化能量途径可以包含TCA循环、发酵途径、呼吸途径或其部分，或其组合。
在一个实施方案中，用编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶和/或磷酸甘油酸激酶的核酸转化所述细菌细胞。本领域技术人员将认识到，分别需要甘油醛-3-磷酸脱氢酶和磷酸甘油酸激酶来制备NADH和ATP。在该途径可以补充一种或多种生化能量途径中间体以供所述细菌细胞的酶使用的情况下，并非每种酶都是必需的。
在一实施方案中，所述细菌细胞可以提供有编码一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种生化能量途径或其部分或其杂合组合(hybrid combination)的核酸。
一种或多种生化能量途径的酶对于细菌细胞可以是异源的。在一个实施方案中，酶为重组的。编码一种或多种生化能量途径或其部分的酶的核酸可以是质粒。在一个实施方案中，整个生化能量途径的酶被编码在单个核酸(如质粒)上。在另一个实施方案中，整个生化能量途径的酶被编码在两个或更多个核酸(如两个或更多个质粒)上。糖酵解的上部和下部分解代谢途径可以被编码在单个核酸上，该单个核酸可以是质粒。糖酵解的上部和下部分解代谢途径可以被编码在不同核酸上，该不同核酸可以是多个质粒。在提供两种或更多种核酸用于编码一种或多种生化能量途径或其部分的酶的情况下，所述方法可以包括用两种或更多种核酸转化细菌细胞。
生化能量途径的表达可以被调节。例如，所述生化能量途径的表达可以受到诱导型或抑制型启动子的控制。在另一个实施方案中，所述生化能量途径的表达可以是组成型的。特别地，可以编码组成型启动子以促进生化能量途径的成分/酶或操纵子的表达。整个生化能量途径的表达可以受到单个启动子的控制。
在一实施方案中，一种或多种生化能量途径或其部分的表达受到诱导型启动子的控制，但可以不被诱导。特别地，诱导型启动子可以具有“泄漏的”基础的表达水平，这可以足以向SimCell提供能量。
在一个实施方案中，一种或多种生化能量途径或其部分的表达受到lac抑制子(lacl)的控制。Lacl抑制子可以与Ptrc启动子一起使用。通过提供IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)可以诱导lacl抑制下的启动子的表达。然而，在一个实施方案中，一种或多种生化能量途径或其部分的表达不由IPTG诱导，并且SimCell依赖于非诱导的(即泄漏的)基础表达。本领域技术人员将认识到，由于结合动力学较差，Lacl抑制子允许泄漏的表达。如果在不存在诱导物的情况下等效的诱导型或抑制型启动子系统允许基础的(泄漏的)表达水平，则可以使用该等效的诱导型或抑制型启动子系统。如果在不存在诱导物的情况下诱导型或抑制型启动子系统允许基础的表达水平，并且相对于存在诱导物的情况下的诱导的表达，基础的表达水平至少低10倍，则可以使用该诱导型或抑制型启动子系统。
在另一个实施方案中，一种或多种生化能量途径或其部分的表达受到pBAD(阿拉伯糖启动子)的控制。在另一个实施方案中，编码生化能量途径或其部分的一种或多种酶的核酸包含一种或多种编码pBAD的序列。
有利地，一种或多种生化能量途径或其部分的基础表达(所谓的“泄漏的”表达)，可以被依赖用于向SimCell提供能量，而不会使SimCell过载并诱发过早死亡，或缺乏稳定性或使用寿命。这种“泄漏的”表达可以定义为在不存在诱导物的情况下检测由核酸编码的分子的表达，并且其中，检测到的表达高于没有核酸的菌株(如大肠杆菌K-12)。
Simcell可以通过重新引入，例如，一种或多种其它能量生成途径(例如，TCA、戊糖磷酸、发酵、呼吸作用)、光能途径(例如，利用变形菌视紫质(proteorhodopsin))、DNA修复途径、核糖体再生途径以及营养补充来进一步增加。特别地，可以用编码一种或多种其它能量生成途径、DNA修复途径、核糖体再生途径的酶的核酸转化细菌细胞。可以用核酸转化Simcell以表达光活性亚视黄醇(retinylidene)蛋白。还可以向培养基中提供营养补充物质以提高Simcell的使用寿命/稳定性。培养基可以补充有核苷酸、氨基酸和辅助因子中的一种或多种。
表达产物
在一个实施方案中，用编码表达产物的核酸转化细菌细胞或得到的无染色体细菌细胞(SimCell)。所述产物可以包括多肽，如肽或蛋白质。在另一个实施方案中，所述产物可以包括核酸，如RNA或DNA。RNA可以包括mRNA、miRNA、siRNA、tRNA或rRNA。多肽可以是生物活性剂(例如生物制品)。多肽可以是酶。多肽可以是药物或前药。可以编码多肽和核酸产物。所述表达产物可以包括抗体，或抗体片段，或其模拟物。所述表达产物可以包括免疫原性肽或多肽，如用于哺乳动物的疫苗。所述表达产物可以包括生物药物，如用于癌症治疗或预防的生物药物。所述表达产物可以包括胰岛素，例如用于糖尿病治疗。
所述表达产物可以包括酶催化剂，其能够产生生化物质(biochemical)，如治疗药物。可以提供多种酶催化剂用于表达，使得可以提供多步反应以产生生化物质。治疗药物可以包括细胞毒性药物，例如邻苯二酚(catechol)。所述表达产物可以包括SalA和/或SalR。本领域技术人员将认识到，当水杨酸(阿司匹林)存在时，它与SalR结合以产生活性形式的SalR*，然后启动salA和salR的转录(正反馈)。然后，SalA或水杨酸羟化酶在NADH存在下将水杨酸转化为邻苯二酚。
另外地或可替代地，可以提供水杨酸羟化酶(salA)以产生氯邻苯二酚或羟基邻氨基苯甲酸酯。
在一个实施方案中，用编码复制产物的核酸转化细菌细胞或得到的无染色体细菌细胞(SimCell)，如克隆。例如，无染色体细菌细胞(SimCell)可以用于产生质粒或病毒核酸，如病毒载体。例如，无染色体细菌细胞(SimCell)可以用于产生用于基因治疗的DNA疫苗或核酸。在一个实施方案中，用编码病毒颗粒(或其部分)的核酸和伴随的病毒核酸(或其部分)转化细菌细胞或得到的无染色体细菌细胞(SimCell)。所述病毒可以是基于真核生物的病毒，如哺乳动物病毒。所述病毒可以是减毒或非复制病毒。在一个实施方案中，所述表达产物可以包括HPV疫苗，如HPV多肽和/或编码HPV基因的核酸。在另一个实施方案中，所述表达产物可以包括噬菌体或其部分。
所述表达产物可以包括膜多肽(即，包含布置为锚定在膜双层中的疏水结构域的多肽)。膜多肽可以用于靶向无染色体细菌细胞(SimCell)，例如靶向身体中的某些组织或细胞。另外地或可替代地，膜多肽可以用作能够定位无染色体细菌细胞(SimCell)的表面标记物。
两种或更多种表达产物或复制产物可以在核酸上编码或在多个核酸上编码以在无染色体细菌细胞(SimCell)中表达。例如，膜多肽可以在SimCell中编码并表达，用于将SimCell靶向特定细胞或组织，同时编码并表达生物活性多肽。
表达产物的表达可以受到调节。例如，表达产物的表达可以受到诱导型或抑制型启动子的控制。例如，表达产物的表达可以受到可由红霉素诱导的MphR调节系统的控制。在另一个实施方案中，表达产物的表达可以是组成型的。特别地，可以编码组成型启动子以促进表达产物的表达。在一个实施方案中，表达产物的表达可以由强启动子(如病毒启动子)控制。启动子可以包括CMV启动子SV40。在一个实施方案中，表达产物的表达可以由表1中列出的任何启动子控制，这些也如Davis等人(Nucleic Acids Research，2011，V01.39，No.31131-1141)所描述，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，启动子可以包括如本文所描述的启动子D(prod)。
表1：
启动子 -35六聚体 -10六聚体
启动子A tttacg taggct
启动子B tttacg taatat
启动子C tttacg tatgat
启动子D tttacg tataat
启动子1 tttacg gtatct
启动子2 gcggtg tataat
启动子3 tttacg gaggat
启动子4 tttacg gatgat
启动子5 tttacg taggat
启动子6 tttacg taaaat
j23113 ctgatg gattat
j23150 tttacg tattat
j23151 ttgatg acaatg
j23101 tttaca tattat
杀死并控制含染色体或主动分裂的细菌细胞
在一实施方案中，所述方法还可包括：诱导在步骤ii后其中染色体DNA保持完整的任何细菌细胞的死亡(杀死)。在另一个实施方案中，所述方法还可包括：诱导任何主动分裂的细菌细胞的死亡(杀死)。在一实施方案中，所述杀死可以包括用能够杀死主动分裂的细胞的试剂(如D-环丝氨酸)处理细菌细胞。合适地，可以在使用核酸内切酶后16小时至24小时之间用D-环丝氨酸处理细胞或细胞的群体。本领域技术人员将认识到，可以在任何时间点(例如当细胞群体达到所需浓度时)添加能够杀死主动分裂的细胞的试剂，如D-环丝氨酸。
能够杀死主动分裂的细菌细胞的试剂，如D-环丝氨酸可以进一步施用至无染色体细菌细胞的培养物中，以确保抑制或杀死任何主动分裂的细菌细胞或能够主动分裂的细菌细胞。在一个实施方案中，能够杀死主动分裂的细菌细胞的试剂，如D-环丝氨酸可以连续或定期施用至无染色体细菌细胞的培养物中，以确保抑制或杀死任何主动分裂的细菌细胞或能够主动分裂的细菌细胞。
所述能够杀死主动分裂的细菌细胞的试剂可以包括能够抑制细菌细胞壁生物合成的抗生素，如D-环丝氨酸。所述能够杀死主动分裂的细菌细胞的试剂可以包括不是孔蛋白(porin)的抗生素。本领域技术人员将熟知可以用于阻止主动分裂的细菌细胞的生长或杀死主动分裂的细菌细胞的一系列已知抗生素。
细菌细胞
所述细菌细胞可以包括和合适的细菌物种，例如具有被核酸内切酶识别并切割的染色体DNA的细菌物种。在一个实施方案中，所述细菌细胞选自埃希氏菌属物种、假单胞菌属物种和罗尔斯通氏菌属物种的细菌物种。在一个实施方案中，所述细菌细胞为埃希氏菌属物种。所述埃希氏菌属物种可以是大肠杆菌。在另一个实施方案中，所述细菌细胞为假单胞菌属物种。所述假单胞菌属物种可以是恶臭假单胞菌。在另一个实施方案中，所述细菌细胞为罗尔斯通氏菌属物种。所述罗尔斯通氏菌属物种可以是富养罗尔斯通氏菌。
在一个实施方案中，所述方法包括产生无染色体细菌细胞的群体(即多个)。特别地，可以通过本文的方法提供细菌细胞的群体并且将其转化为无染色体细菌细胞(SimCell)。
可以修饰细菌细胞的染色体DNA以表达标记物，以允许成功鉴定已成功降解它们的染色体DNA的那些细胞或细胞的群体。由于所述标记物的表达减少，将这种标记物并入染色体DNA也会允许分选出成功诱导的SimCell。本领域技术人员将容易理解，许多标记物与标记物类别可以用于此目的，并且将能够容易地选择并遗传修饰细菌细胞以表达选择的标记物。例如，所述标记物可以是视觉标记物，如荧光标记物，如GFP、YPP或mCherry。可替代地，所述标记物可以是生化标记物，如酶，其可以通过通常已知的测定方法检测。
本领域技术人员会理解，可以以多种方式根据本发明方面将核酸(如质粒)提供或转化至细菌细胞中。例如，热休克转化或电穿孔可以用于将核酸(如质粒)引入细菌细胞。
其它方面
根据另一方面，本发明提供了一种通过本文中本发明的方法产生的无染色体细菌细胞。
根据另一方面，本发明提供了一种无染色体细菌细胞，包含：
i)编码核酸内切酶的重组核酸，其中，所述核酸内切酶的表达受到诱导型或抑制型启动子的控制；和
ii)编码一种或多种生化能量途径或其部分的酶的核酸，所述生化能量途径或其部分为所述无染色体细菌细胞提供能量。
所述无染色体细菌细胞还可以包含编码表达产物的核酸。
根据另一方面，本发明提供了一种组合物，包含：根据本发明的或根据本发明的方法制备的无染色体细菌细胞的群体。
所述组合物可以是药物组合物。所述组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，所述组合物包含缓冲液(buffer)或盐水。所述组合物可以是无菌的(即没有活的/复制的生物体)。
根据另一方面，本发明提供了根据本发明的无染色体细菌细胞或根据本发明的组合物，用作药物。
根据另一方面，本发明提供了根据本发明的无染色体细菌细胞或根据本发明的组合物，用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
根据另一方面，本发明提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用根据本发明的无染色体细菌细胞或根据本发明的组合物。
所述受试者可以是哺乳动物，并且优选是人类，但可以可替代地为猴、猿、猫、狗、羊(sheep)、牛(cow)、马、兔或啮齿动物。
在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病包括病毒感染，如HPV感染。在另一个实施方案中，待治疗或预防的疾病包括微生物感染，如细菌、病毒、真菌、寄生虫或原虫感染。在另一个实施方案中，待治疗或预防的疾病包括癌症。
有利地，HPV疫苗可以预防人类乳头瘤病毒(HPV)感染。HPV可以有助于抵抗由HPV引起的癌症，包括宫颈癌、口腔和咽喉(头颈)癌以及肛门和生殖器区域的一些癌症。它还有助于防止生殖器疣。根据本发明的SimCell能够表达和分泌HPV肽并激活人体免疫系统。
在一个实施方案中，待治疗或预防的疾病包括糖尿病，例如其中，表达产物为胰岛素。
作为药物的用途可以用于治疗癌症。在一个实施方案中，癌症包括肺癌，如A549腺癌。在另一个实施方案中，癌症包括脑癌(例如胶质母细胞瘤)，如Mo59K胶质母细胞瘤。在另一个实施方案中，癌症包括软组织癌，如RD横纹肌肉瘤。
根据另一方面，本发明提供了根据本发明的无染色体细菌细胞或根据本发明的组合物，用作疫苗。
所述疫苗可以包括病毒疫苗，如HPV疫苗或抗癌疫苗。
根据另一方面，本发明提供了根据本发明的无染色体细菌细胞或根据本发明的组合物作为生物传感器和/或生物催化剂的用途。
根据另一方面，本发明提供了一种生产产品(即，如本文所描述的表达产物)和/或生化物质的方法，所述方法包括：使用根据本发明的无染色体细菌细胞或根据本发明的组合物，对表达产物进行表达，并且任选地，还通过使用所述表达产物作为生物催化剂生产生化物质。
生产产品和/或生化物质的方法可以在体外(in vitro)或体内(in vivo)。生产产品和/或生化物质的方法可以包括：在促进表达产物的表达的条件下，培养根据本发明的无染色体细菌细胞，或根据本发明的组合物。在一个实施方案中，其中，所述表达产物的表达受到调节，所述方法可以包括使用诱导物。为了生产生化物质，可以提供前体或中间体分子用于转化为所述生化物质。本领域技术人员将容易地应用合适的条件，如合适的温度、气体、介质、营养物质、能源和碳源，以激活SimCell并能够进行产物表达。
在一个实施方案中，其中，根据本发明的无染色体细菌细胞或根据本发明的组合物用作生物传感器，所述无染色体细菌细胞可以被布置为表达能够结合至待检测的靶分子的多肽或肽。
根据另一方面，本发明提供了一种编码核酸内切酶的核酸，其中，所述核酸内切酶的表达受到诱导型或抑制型启动子的控制。
所述核酸可以包含反向互补序列，用于在所述核酸中形成二级结构，如发夹环。所述反向互补序列可以与核酸内切酶的序列和/或启动子序列反向互补。在一个实施方案中，所述反向互补序列与布置以表达核酸内切酶的启动子的序列反向互补。所述核酸可以包含SEQ ID NO：3的序列(pGeneArt-ICeuI)或其变体。
根据本发明的核酸可以是质粒。本文所描述的核酸可以是DNA。
变体，例如SEQ ID NO：1的I-CeuI的变体，可以包含功能变体(即具有相同功能)。
在提及变体多肽或核苷酸序列的情况下，本领域技术人员将理解，可以允许一个或多个氨基酸残基或核苷酸替换、缺失或添加，任选地在序列中可以允许两处替换，使得其保持其功能。本领域技术人员会理解，1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基或核苷酸可以被替换、添加或去除而不影响功能。提及序列同一性可以通过使用标准/默认参数的BLAST序列比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)来确定。例如，所述序列可以具有99％的同一性并且根据本发明仍然起作用。在其它实施方案中，所述序列可以具有98％的同一性并且根据本发明仍然起作用。在另一个实施方案中，所述序列可以具有95％的同一性并且根据本发明仍然起作用。在另一个实施方案中，所述序列可以具有90％、85％或80％的同一性并且根据本发明仍然起作用。在一个实施方案中，变异和序列同一性可以根据全长序列。在其它实施方案中，变异可以限于非保守序列和/或活性位点之外的序列，例如结合结构域。因此，蛋白质的活性位点或结合位点可以是100％同一性的，而侧翼序列可以包含所述的同一性变化。这种变体可称为“保守的活性位点变体”。
氨基酸替换可以是保守性替换。例如，修饰的残基可以包含与野生型替换的残基基本相似的性质。例如，替换的残基可以包含与野生型替换的残基基本相似或相同的电量或疏水性。例如，替换的残基可以包含与野生型替换的残基基本相似的分子量或空间体积。关于“变体”核酸序列，本领域技术人员会理解，1、2、3、4、5或更多个密码子可以被替换、添加或去除而不影响功能。例如，可以考虑保守替换。
本领域技术人员会理解，本发明的任何一个实施方案和/或方面的优选特征可以应用于本发明的所有其它实施方案和/或方面。
附图说明
图1：本研究中表征的构建的SimCell的主要特征。
a为了区分SimCell和正常细胞，使用由阿拉伯糖操纵子控制的具有GFP的染色体表达的菌株以指示染色体的完整性。三种额外的质粒用于降解染色体、重新引入糖酵解并产生蛋白质(mCherry、不稳定的mCherry或ilux操纵子)。B对于SimCell生成(染色体降解)，pJKR-HTetR-ICeuI被构建以使I-CeuI核酸内切酶的产生置于由ATc诱导的TetR调节系统的控制下。为了提高使用寿命，通过pSEVA224-GB3携带的糖酵解途径将ATP和NADH补充到细胞中。糖酵解途径基因由IPTG诱导的lac系统控制。然而，I-CeuI和糖酵解基因没有被诱导用于这项工作中提出的大多数实验。最后，菌株包含pJKR-O-mphR的变异，其根据应用产生mCherry、不稳定的mCherry或发光。此质粒利用由红霉素诱导的MphR调节系统。
图2：对照菌株用于定义GFP和mCherry的表达边界。
a对照菌株(无I-CeuI)的荧光显微图像显示GFP和mCherry生物传感器的完整性。亲本菌株(I-CeuI-)没有被诱导(左)、诱导用于GFP表达(中)或诱导mCherry表达(右)。bFL1(GFP)和FL3(mCherry)通道直方图具有不同的群体，当两个群体在实验组中不明显时，这些群体用于定义无表达和GFP表达(SimCell同一性门(identity gate))或mCherry表达(蛋白质产生)。
图3：流式细胞术分析的FL1(GFP)和FL3(mCherry)通道直方图与相应的显微图像。
a没有糖酵解途径的I-CeuI+菌株(pSEVA224-GB3)包含SimCell和正常细胞的混合群体。基于这两种有些不同的群体，约91.32％的细胞为SimCell(GFP-)。在SimCell群体中，仅有13.18％产生了mCherry。b在具有糖酵解途径的I-CeuI+菌株(pSEVA224-GB3)中，约94.36％的细胞为SimCell(GFP-)，与没有糖酵解的菌株相比，具有稍高的比例。在SimCell群体中，56.20％产生了mCherry，与没有糖酵解的菌株相比，具有很大改进。
图4：用药物D-环丝氨酸处理I-CeuI+培养物以杀死亲本细胞以产生纯SimCell培养物。
a未诱导(上图)和诱导(下图)的不具有糖酵解的SimCell培养物用于产生GFP和mCherry。b未诱导(上图)和诱导(下图)的具有糖酵解的SimCell培养物用于产生GFP和mCherry。没有细胞发出绿色荧光，这意味着D-环丝氨酸有效杀死亲本细胞并产生纯SimCell培养物。当补充糖酵解(pSEVA224-GB3)时，更高比例的SimCell(无GFP表达)表达了mCherry。
图5：SimCell的寿命基于ATP/NADH的细胞可用性。SimCell可以产生约10天的发光，这表明它们有足够的能量货币(energy currency)来维持相当长的一段时间的功能。与早期不具有糖酵解的菌株相比，具有糖酵解途径的菌株具有显著的能量优势。然而，这种发光产生的差异在第5天后趋于平稳。实施了非配对(独立性)t检验：*p<0.005，**p<0.001。
图6：SimCell中细胞机制(蛋白质合成、调节与降解)的使用寿命。从不稳定的mCherry检测到的荧光在10天后停止增加，这可能是转录和翻译没有足够能量进行操作的点。这对应于发光产生所暗示的ATP的可用性(图3.20)。SimCell在很长一段时间(28天)内都具有不稳定的mCherry的可检测水平，因为蛋白酶的活性是ATP依赖性的。实施了非配对(独立性)t检验：*p<0.001。
图7：SimCell(I-CeuI+菌株)的能量与代谢的变化的图形总结。红色元素(标有*)表示蛋白质的上调，而蓝色元素表示蛋白质的下调。细胞偏好产生了ATP/NADH的糖酵解和戊糖磷酸途径的部分，而消耗了ATP的部分被下调。TCA循环在很大程度上被关闭。发酵和有氧呼吸再生了NAD+以反馈到糖酵解途径。显示了被上调以生成质子梯度的复合物(其它复合物被下调)。得到的质子梯度应当驱动ATP合成酶为能量匮乏的细胞产生ATP。
图8：SimCell(I-CeuI+菌株)中DNA、RNA和蛋白质代谢的变化的图形总结。蛋白质丰度的变化影响了转录和翻译装置。红色元素(标有*)表示蛋白质的上调，而蓝色元素表示蛋白质的下调。通过从头合成(de novo synthesis)和补救途径促进(脱氧)核苷/核苷酸合成。通过RNA聚合酶蛋白和与全局转录调节相关的σ因子上调转录。虽然与50S和30S核糖体亚基相关的蛋白质丰富，但70S核糖体组装被下调。细胞可能会暂停翻译，直到它们遇到更有利的营养和能量条件。
图9：SimCell生成过程中关于SOS应答(SOS response)和细胞分裂的预测事件的示意图。与对照组相比，与DNA损伤应答相关的蛋白质在I-CeuI+菌株中改变了它们的表达谱。该细胞最初是“正常”的，具有完整的染色体并且经历正常的细胞分裂。当I-CeuI核酸内切酶导致DNA损伤时，启动SOS应答，导致细胞分裂的抑制(FtsZ的下调)和细胞的伸长。随着染色体降解，在尝试DNA修复后，SOS基因被下调。其它细胞分裂蛋白(如ZapA和ZipA)的活性缓慢恢复。
图10：从水杨酸(SA)中产生邻苯二酚的pSalAR-GFP的基因回路的示意图。当SA存在时，它与SalR结合产生活性形式：SalR*，然后其启动salA和salR的转录(正反馈)。然后，SalA或水杨酸羟化酶在NADH存在下将SA转化为邻苯二酚。Psal有一些泄漏的表达，因此SalA和SalR的基础水平已经存在而无需诱导。
图11：使用LC对亲本细胞和SimCell产生的邻苯二酚的量化。在用不同浓度的SA和阿司匹林诱导后，对具有pSalAR-GFP或pSalA Km xylR(阴性对照，有缺陷的salA)的菌株产生的每个细胞的邻苯二酚的摩尔数进行量化。标记有“无糖酵解”或“有糖酵解”的菌株分别具有pSEVA224或pSEVA224-GB3。标记有“亲本”或“SimCell”的菌株分别具有pJKR-H-TetR或pJKR-HTetR-ICEuI。用更高浓度的诱导物产生了更多的邻苯二酚。在SimCell中，糖酵解途径的添加显著提高了邻苯二酚的产量。实施了非配对(独立性)t检验：*p<0.001。
图12：邻苯二酚的抗癌效果。将成纤维细胞和癌细胞系A549、Mo59K和RD用不同浓度的邻苯二酚处理(PBS为对照)，导致癌细胞的细胞活力显著降低。对细胞活力测定实施了配对(依赖性)t检验：*p<0.005，**p<0.001。
图13：SimCell产生的邻苯二酚的抗癌效果。成纤维细胞和A549、Mo59K和RD癌细胞与SimCell、D-环丝氨酸以及不同浓度的SA和阿司匹林一起孵育以产生邻苯二酚。当SimCell被诱导产生抗癌药物邻苯二酚时，细胞活力显著下降。用500μM SA诱导的SimCell导致了癌细胞活力的最大下降。对细胞活力测定实施了配对t检验：*p<0.05，**p<0.005。
图S1：本研究中使用的质粒的SnapGene图谱。a，pGeneArt-ICeuI；b，pJKR-HTetR-ICeuI；c，pSEVA224-GB3；d，pJKR-O-mphR；e，pJKR-OmphR-ilux；f，pJKR-OmphR-ASV；g，pSalAR-GFP。
图S2：广谱宿主范围SimCell生成质粒的SnapGene图谱。a，pRH121；b，pJC580。
图S3：具有ssrA蛋白酶标签的ASV变体的不稳定的mCherry产生的荧光。在添加此标签后，mCherry具有约96分钟的半衰期。
图S4：一组生物传感器的诱导动力学。对照菌株大肠杆菌K-12(无质粒)用作无荧光的基线。HTetR和LTetR是指TetR质粒的拷贝数(分别为高和低)。用细胞密度OD600标准化荧光输出。a阿拉伯糖操纵子(araBAD)、TetR、AcuR调节系统未被诱导以检测来自启动子的任何泄漏活性。AcuR和araBAD具有最泄漏的表达，其次是HTetR和LTetR。b阿拉伯糖操纵子(araBAD)、TetR、AcuR调节系统被诱导用于产生GFP。HTetR利用低诱导物浓度(1μM ATc)产生了高水平的GFP。c CdaR的表达谱。这是单独绘制的，因为CdaR具有高水平的荧光而没有诱导，这遮掩了其它生物传感器之间的差异。d MphR的表达谱，其产生mCherry。
图S5：在I-CeuI诱导后，DAPI的荧光强度随时间丢失。用DAPI染色菌株的类核DNA。大肠杆菌(E.coli)、恶臭假单胞菌(P.putida)和富养罗尔斯通氏菌(R.eutropha)菌株含有具有I-CeuI的质粒，而没有I-CeuI的大肠杆菌作为对照。a延时视频的屏幕截图显示，I-CeuI+菌株的荧光强度逐渐下降，但在对照(I-CeuI-)中并非如此。b细胞随时间变化的标准化荧光强度。具有I-CeuI+的菌株显示出DAPI的快速损失，而对照(I-CeuI-)表现出的微小改变可能是由于噪声所致。
图S6：具有糖酵解途径的I-CeuI+和TCeuI-菌株在琼脂中生长过夜。a在只有正常细胞(无I-CeuI)的培养物中，它们很容易形成集落并产生GFP和mCherry。b在I-CeuI+菌株中，少量剩余的亲本细胞形成集落并产生GFP和mCherry，而大部分细胞没有形成集落，表明它们是表达mCherry而非GFP(无染色体)的SimCell(非复制的)。
图S7：产生蛋白质的I-CeuI+糖酵解+菌株的延时视频的屏幕截图。用DAPI染色细胞，随着SimCell的生成，荧光减少。然后，无染色体SimCell产生了mCherry。
图S8：在4℃和-80℃储存的纯化的SimCell的保质期。在储存1天、1周、1个月和5个月后测试了它们的功能。在4℃储存似乎保留了(a)不具有糖酵解或(b)具有糖酵解的SimCell的代谢活性，比在-80℃储存更好。(c)基于显微图像的功能性SimCell的比例的估算。储存严重影响了可以产生mCherry的SimCell数量。
图S9：糖酵解途径的诱导压垮了SimCell。在纯化前的糖酵解诱导中，将IPTG和葡萄糖添加到含有SimCell和亲本细胞的混合物的过夜培养物中。在纯化后的糖酵解诱导中，将IPTG和葡萄糖添加到纯化的SimCell培养物中。使用纯化前的糖酵解诱导，SimCell可以产生约10天的发光，但纯化后诱导的SimCell不能产生任何发光。
图S10：SimCell努力通过诱导糖酵解途径产生mCherry-ASV。在纯化前的糖酵解诱导中，将IPTG和葡萄糖添加至含有SimCell和亲本细胞的混合物的过夜培养物中。在纯化后的糖酵解诱导中，将IPTG和葡萄糖添加至纯化的SimCell培养物中。利用纯化前的糖酵解诱导，从不稳定的mCherry检测到的荧光在5天后停止增加(可能是转录和翻译没有足够能量操作这一点)。当纯SimCell培养物产生更多糖酵解蛋白时，产生的mCherry数量可以忽略不计，因为SimCell被转录和翻译的能量消耗压垮。
图S11：SimCell中产生发光的数学模型。a发光产生数据的线形示意图。b数学模型的图形结果与发光产生的实验数据随时间变化的趋势非常相似。当糖酵解途径被诱导时，SimCell被额外的能量负担压垮，从而不能产生发光。与不具有糖酵解途径的SimCell相比，当糖酵解蛋白以背景水平存在时，在产生更好的发光方面有附加的益处。但是，这种益处最终会在5天后消失，且SimCell背景糖酵解与无糖酵解的性能相当。
图S12：lac报告基因系统的完整性。具有在lac操纵子控制下的染色体GFP报告基因的大肠杆菌BW31005菌株：a被1mM IPTG诱导用于GFP表达，b不被1mM IPTG诱导用于GFP表达。在没有任何诱导的情况下，由于Lac I抑制子与Ptrc启动子的弱结合，存在GFP的泄漏表达。
图S13：DH5α菌株的相对蛋白质丰度分布的树状图及其相关的热图。使用聚类分析(cluster analysis)并对数据实施行缩放(row scaled)。在I-CeuI+菌株中，与对照菌株(无载体、空白载体)的蛋白质组相比，蛋白质组具有不同的丰度分布。a被检测和鉴定的所有蛋白质。b与能量和代谢相关的蛋白质。c与中心法则相关的蛋白质。d与DNA损伤应答相关的蛋白质。e与细胞周期和分裂相关的蛋白质。
图S14：大肠杆菌引起的邻苯二酚产生。具有阿司匹林和水杨酸的LB琼脂平板没有颜色(上图)，而邻苯二酚则明显呈棕色(下图)。当将具有pSalAR-GFP的大肠杆菌铺在具有诱导物阿司匹林(中下图)或水杨酸(右下图)的琼脂上时，产生了邻苯二酚并且其扩散出细胞，将琼脂染成棕色。没有诱导物的板没有变成棕色(左下图)。
图S15：用补充剂处理的成纤维细胞、A549、Mo59K和RD癌细胞的细胞活力。用诱导物水杨酸(SA)或阿司匹林、D-环丝氨酸或SimCell孵育这些哺乳动物细胞系。将PBS用作对照。这些添加物对哺乳动物细胞系的活力没有不利影响。
图S16：在细胞活力测定期间用结晶紫染色的细胞系的明场图像。细胞在补充有PBS(对照)、1mM邻苯二酚、500μM水杨酸(SA)或用500μM SA诱导的用于产生邻苯二酚的SimCell的培养基中生长。SA本身对细胞系没有不利影响。邻苯二酚显著降低了癌细胞的细胞活力，而从SA合成邻苯二酚的SimCell对癌细胞的细胞活力也有一些可视的效果。a，成纤维细胞，b，A549肺癌细胞，c，Mo59K脑癌细胞，以及d，RD软组织癌细胞。
图S17：亲本细胞和纯化的SimCell的Zeta电位分布。
图S18：a无I-CeuI的大肠杆菌菌株和b有I-CeuI的大肠杆菌菌株中OD600和CFU/mL的关系。
图S19：SimCell中产生发光的数学模型。(a-b)实验设置和模型概念的示意图。细胞中可用的能量受到货物(cargo)基因的表达以及转录和翻译机制的影响。糖酵解蛋白的产生，特别是当用IPTG诱导时，会对这些机制造成沉重的代谢负荷。(c)来自图4a的发光产生数据的线形示意图。(d)数学模型的图形结果与发光产生的实验数据随时间变化的趋势非常相似。当糖酵解途径被诱导时，SimCell被额外的能量负担压垮，从而不能产生发光。与不具有糖酵解途径的SimCell相比，当糖酵解蛋白以背景水平存在时，在产生更好的发光方面有附加的益处。但是，这种益处最终会在5天后消失，且SimCell背景糖酵解与无糖酵解的性能相当。(d)来自图4b的荧光(mCherry-ASV)产生数据的线形示意图。(f)用于产生mCherry-ASV的模型的图形模拟与模型非常相似。糖酵解途径的优势较不明显，可能是因为与由五种基因组成的luxCDABE操纵子相比，mCherry-ASV仅为一种基因。该模型预测糖酵解的诱导将短暂地产生mCherry浓度的小幅增加，这在实验中被观察到。这是因为合适浓度的糖酵解蛋白最终将被释放出来，但在糖酵解蛋白的益处实现之前，转录和翻译机制会已经耗尽。
图S20：诱导SalAR回路后随时间变化的GFP水平可以作为产生邻苯二酚的动力学的指标。通过具有pSalAR-GFP质粒以及(a)无额外的糖酵解途径(pSEVA224)或(b)有额外的糖酵解途径(pSEVA224-GB3)的亲本细胞产生GFP。亲本细胞对SA诱导表现出剂量依赖性应答。(c)诱导的细胞的荧光输出与未用SA诱导的细胞的荧光输出的比率。在亲本细胞中，当用100μM和500μM SA诱导时，GFP产量分别增加了约1.5倍和2倍。(d)大肠杆菌引起的邻苯二酚产生。具有阿司匹林和水杨酸的LB琼脂平板没有颜色(上图)，而邻苯二酚则明显呈棕色(下图)。当将具有pSalAR-GFP的大肠杆菌铺在具有诱导物2mM阿司匹林(中下图)或2mM水杨酸(右下图)的琼脂上时，产生了邻苯二酚并从细胞中扩散出来，将琼脂染成棕色。没有诱导物的板没有变成棕色(左下图)。(e)随着诱导物浓度增加，上清液的颜色变深，表明邻苯二酚的产生和输出。SA：水杨酸，ASA：乙酰水杨酸(阿司匹林)。数据显示平均值±SE，n＝3。
图S21：野生型大肠杆菌K12、亲本细胞和SimCell的拉曼(Raman)分析。每个光谱表示来自30个单细胞的单细胞拉曼光谱(SCRS)的平均值，并且阴影区域表示SCRS的标准偏差。与大肠杆菌K12或亲本细胞相比，SimCell显示的DNA的特征拉曼条带的信号明显较弱。
实施例——从无染色体底盘构建功能性最小细胞
概要
从大肠杆菌、恶臭假单胞菌和富养罗尔斯通氏菌(其天然染色体被I-CeuI核酸内切酶介导的双链断裂(DSB)和内源性核酸酶去除)中生成了一种新型的最小细胞，称为SimCell(简单细胞)。我们表明，保留在这些无染色体SimCell中的功能性细胞机制能够处理各种基因回路(例如，MphR-红霉素调节的mCherry和luxCDABE，由10个基因组成的糖酵解途径，以及水杨酸可诱导的salAR-gfp)。蛋白质组学分析显示，某些蛋白质的丰度被调节以最大化细胞资源，该细胞资源帮助SimCell维持核心功能，如转录和翻译。无染色体SimCell可以发挥功能连续10天，并且能够保存至少5个月。据观察，SimCell中的能量生成与基因表达之间存在微妙的平衡，并且开发了数学模型以描述这种权衡。最后，SimCell被用作生物催化剂，以从水杨酸(阿司匹林的代谢物)生产邻苯二酚，一种强效抗癌药物，其对肺癌(A549)、脑癌(Mo59K)和软组织(RD)癌细胞系具有治疗性质。本研究表明，SimCell是一种新的底盘，其能够用于制备用于安全递送与施用的有价值的天然产物。
引言
合成生物学涉及应用工程原理以利用可以通过计算机建模预测的行为来设计并构建新的生物功能和系统。因此，重要的是这些新的回路和系统以高重现性(reproducibility)、可靠性和稳健性(robustness)实施。然而，自然演化的生物体与合成生物学之间存在利益冲突。活的生物体的目标是生存，这是通过适应与繁殖来促进的。合成生物学的目的是工程化生物体以实施研究人员设计的功能或任务。由于细胞的繁琐复杂性和可变性、不可预测的基因表达和来自天然基因网络的不需要的干扰、以及大多数生物体中普遍存在的转座因子的潜在防御性破坏，此内在冲突将危害合成基因回路的性能。
合成生物学的一种激进的自下而上的尝试为从零开始构建细胞。一种策略是通过组装化学合成的脂质双层膜和必需的生物分子(例如，核酸和酶)以创建原始细胞。另一种策略为使用现有细胞创建无染色体底盘，然后引入设计的基因回路或人工染色体 8-11 。后一种策略能够对现存生物体重新编程并替换天然染色体，同时维持预先存在的细胞机制 8-11 。基因组移植涉及从无细胞壁山羊支原体(Mycoplasma capricolum)中小心地去除基因组，并使用聚乙二醇介导的转化重新引入设计的基因组 11 。实施基因组移植具有挑战性，因为在最有效的实验中，约150000个受体细胞中只有1个可以被移植，并且难以将基因组移植实施至其它细菌底盘上。SimCell(简单细胞)是无染色体细胞(由细菌生成)，其包含设计的基因回路或微型基因组。微型SimCell是从由于ΔminC/minD突变导致的异常细胞分裂的细菌生成的，能够在质粒上表达可诱导的基因回路 10 。然而，并不是所有细菌都可以被工程化来制备小细胞，并且在基因组上敲除细胞分裂基因的方法可能很麻烦。此外，微型SimCell只能在短时间内(几个小时)维持活性。
在本研究中，我们证明了能够通过可诱导的染色体降解从各种细菌(如大肠杆菌、恶臭假单胞菌和富养罗尔斯通氏菌)中生产一种新型的无染色体SimCell。这种方法可能将合成生物学中常用的几乎所有细菌转化为SimCell。天然染色体被I-CeuI核酸内切酶介导的双链断裂(DSB)和内源性核酸酶去除 13 。SimCell具有表达各种基因回路(例如，一组10个基因编码糖酵解途径、红霉素可诱导的mCherry和luxCDABE、以及水杨酸可诱导的salA-gfp-salR)的能力。这种新型的SimCell能够持续保持代谢功能性与转录和翻译装置约10天，并且能够在4℃或-80℃保存至少5个月。开发了数学模型以描述基因表达的成本效益经济，这可以作为建立ATP/NADH再生与制备负责该再生的蛋白质的成本的理想平衡的指导。此外，蛋白质组学分析表明，SimCell蛋白质组已经改变以适应其细胞机制的需要。最后，我们证明了SimCell能够用作生物催化剂，以将水杨酸(乙酰水杨酸(阿司匹林)的代谢物，其为一种安全且常用的药物)转化为邻苯二酚。邻苯二酚对几种具有低患者存活率的恶性癌细胞系具有有效的细胞毒性：A549腺癌(肺癌) 14 、Mo59K胶质母细胞瘤(脑癌) 15 以及RD横纹肌肉瘤(软组织癌) 16 。因此，SimCell用作最小细胞来研究关于“生命”的基础问题，也用作底盘细胞，用于医疗保健、生物制造、农业和环境中的应用。
材料与方法
用于SimCell的细菌菌株和培养条件
本研究中使用的菌株和质粒列于表S1中。染色体上具有GFP表达回路的大肠杆菌菌株为来自Barry Wanner(CGSC BW31003) 1a 的赠品。培养物在37℃的LB培养基中生长。适当时添加25μg/mL氯霉素、50μg/mL卡那霉素、50μg/mL羧苄青霉素、100μg/mL壮观霉素或12.5μg/mL四环素以维持选择压力。
为了生成SimCell，用100nM脱水四环素(ATc)诱导含有pJKR-H-TetR-ICeuI质粒(图S1b)的菌株。为了验证SimCell，用0.2％阿拉伯糖诱导GFP的染色体表达。为了产生蛋白质，用200μM红霉素诱导含有pJKR-O-mphR质粒(或变异)的菌株。原始的pJKR-O-mphR质粒(图S1d)来自George Church实验室(Addgene质粒#62570) 2a 。
用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导糖酵解途径并补充10mM葡萄糖。然而，在正文中显示的初步实验中没有这样做，因为糖酵解蛋白的过度产生对细胞性能有负面影响(图S10)。似乎糖酵解蛋白的泄漏表达是提供能量生成而不会给翻译和转录带来过度负担的理想平衡。对lac表达系统的泄漏行为进行验证(图S9)。
SimCell的纯化
来自Heinemann和Ankenbauer的最小细胞纯化方案适用于SimCell纯化 3a 。将SimCell和亲本细胞的混合培养物用D-环丝氨酸处理以杀死主动分裂的细胞。以200μg/mL的浓度添加D-环丝氨酸，并且将细胞在37℃孵育并振荡1.5小时，然后再次以相同浓度添加D-环丝氨酸。在用D-环丝氨酸处理24小时后，将细胞旋降(spin down)并用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤两次。当诱导纯SimCell培养物进行蛋白质表达时，每两天添加25μg/mL的D-环丝氨酸以阻止亲本细胞生长，但允许SimCell发挥功能。
有活力的(亲本)细胞群体的量化
将培养物标准化为具有相同的OD600。将培养物的稀释液点样到不含抗生素的LB琼脂平板上(10μL，3次平行测定)。将平板在37℃孵育过夜，并且在次日计算CFU/mL。
各种基因回路和质粒的构建
本研究中使用的引物列于表S2中。
核酸内切酶表达质粒的构建
I-CeuI核酸内切酶基因由ThermoFisher Ltd(GeneArt)合成以产生pGeneArt-ICeuI(图S1a)。在pGeneArt-ICeuI中，在pBAD启动子区域 4a 增加额外的15bp以与I-CeuI基因上对应的反向互补序列形成发夹环，有效阻断基因表达并允许合成。来自George Church(Addgene质粒#62561) 2a 的赠品，pJKR-H-TetR质粒被用作I-CeuI核酸内切酶的表达载体。使用引物对ICeuI Sacl.FOR和ICeuI_XbaI.REV通过PCR扩增I-CeuI核酸内切酶基因，而使用TetRXbal.FOR和TetRSacI.REV扩增pJKR-H-TetR的载体骨架(排除天然GFP)。将产物用SacI和XbaI消化并用T4 DNA连接酶(NEB)缝合在一起以构建染色体降解质粒pJKR-HTetR-ICeuI(图S1b)。
糖酵解质粒的构建
由Victor de Lorenzo 5a 慷慨提供的质粒pSEVA224-GBI和pSEVA224-GBII分别包含糖酵解的上部和下部分解代谢途径。来自pSEVA224-GBII的下部分解代谢块被移动到pSEVA224-GBI上的多克隆位点(BamHI和HindIII)，以产生pSEVA224-GB3(图S1c)和完整的糖酵解途径。
ilux质粒的构建
经典lux操纵子(亮度高7倍)的改进版本，称为ilux，取自来自Stefan Hell的赠品pQE-ilux 6a 。使用引物对ilux_KpnI.FOR和ilux_BamHI.REV扩增插入片段。用XcherryBamHI.FOR和Xcherry KpnI.REV扩增pJKR-O-mphR的载体骨架(图S1d)以排除mCherry。将ilux插入片段和pJKR-O-mphR载体用BamHI和KpnI消化并连接以产生pJKR-OmphR-ilux(图S1e)。
不稳定的mCherry的构建
将具有ASV变体 7a 的ssrA蛋白酶标签添加至pJKR-O-mphR质粒中mCherry序列的C端。用引物tag.FOR和ASV.REV扩增整个pJKR-O-mphR质粒，其引入了ASV ssrA标签。这种pJKR-OmphR-ASV质粒(图S1f)现在表达mCherry的不稳定版本。
广谱宿主范围SimCell生成质粒的构建和应用
为了证明更广泛范围的生物体中SimCell的形成，我们基于Victor de Lorenzo 5a 慷慨提供给我们的pSEVA231骨架，通过HiFi组装方法构建了质粒pRH121(图S2a)。用于扩增pRH121的各个部分的引物显示在表S2中。I-CeuI的严格转录控制被认为是强制性的，以避免可以使SimCell形成机制失活的各种细菌的细胞防御。丛林表达抑制子系统已显示可以在若干种不同物种(包括恶臭假单胞菌)中提供异常严格的转录控制 8a 。富养罗尔斯通氏菌中也见证了这种严格的控制水平(图S5)。因此，在pRH121中，来自pJC580(JBEI Part ID:JPUB_010723，图S2b)的EilR抑制子和PJEXD启动子控制了已针对富养罗尔斯通氏菌H16进行密码子优化的I-CeuI基因的转录(由集成DNA技术合成)。
对最终的pRH121质粒测序，并且通过S17-1大肠杆菌供体结合将其转移至富养罗尔斯通氏菌H16和恶臭假单胞菌UWC1。然后，在分别含有50μg/mL卡那霉素，以及50μg/mL庆大霉素或50μg/mL利福平的LB平板上选择含有pRH121的富养罗尔斯通氏菌和恶臭假单胞菌细胞。用1μM结晶紫在两种菌株中诱导I-CeuI表达。
SimCell群体的表征
使用S3e细胞分选仪(Bio-Rad)进行流式细胞术分析。FL1滤光器用于检测来自GFP的荧光，GFP在波长488nm/507nm处具有激发/发射。FL3滤光器用于检测来自mCherry的荧光，mCherry在587/610nm处具有激发/发射。
成像
用Nikon Ti Eclipse可视化细胞。为了直观地比较SimCell与亲本细胞的生长情况，将细胞固定在位于载玻片上的含有1.2％高贵级琼脂(Noble Agar)、10×稀释的LB培养基、100nM脱水四环素(ATc)、0.2％阿拉伯糖和200μM红霉素的琼脂中，该琼脂具有盖玻片的厚度。将该载玻片在室温下孵育过夜并在次日可视化。为了拍摄演示mCherry的SimCell合成的视频，将细胞用100μM的DAPI染色，并固定在具有相同成分的琼脂(除LB外，其它成分相同)中。如前所述对从含有pRH121的富养罗尔斯通氏菌和恶臭假单胞菌形成SimCell进行可视化，但使用1μM结晶紫以诱导I-CeuI表达。
SimCell的使用寿命
将表达发光(pJKR-OmphR-ilux)或不稳定的mCherry变体(pJKR-OmphR-ASV)的纯化的SimCell培养物保存在50mL Falcon管中，在37℃以100rpm振荡。每两天向培养物中添加25μg/mL D-环丝氨酸以维持SimCell纯度。在第1天、第3天、第5天、第10天、第14天和第28天，取出等分试样(200μL，n＝4)并测量24小时内的发光或荧光产生。记录此期间的最大读数。在t＝0和t＝24小时比较OD600，以查看是否有增加，并因此是否受到亲本细胞的污染。
用于蛋白质组学与LC-MS/MS分析的样品制备：
将具有pLO11和具有pLO11-ICeuI的野生型的大肠杆菌DH5a沉淀物在含有8mol/1尿素(Merck，Darmstadt，德国)和2mol/1硫脲(Merck，Darmstadt，德国)的溶液中重新溶解。通过在液氮中冷冻5个循环来使溶解的细胞破裂并随后在30℃孵育10分钟。然后，施加中等强度的超声波脉冲30秒。通过在室温以20000g离心1小时去除细胞碎片。收集得到的上清液。
最终蛋白质浓度通过Bradford测定法估算。将含有4μg蛋白质的蛋白质溶液与160ng测序级修饰胰蛋白酶(Sequencing Grade Modified Trypsin)(Promega,Madison,WI,USA)一起孵育过夜。16小时后通过施用乙酸(Carl Roth,Karlsruhe,德国)至1％的最终浓度来停止孵育。
使用具有20μL电动多道移液器(Mettler-Toledo,GieBen,德国)的C18 PureSpeedLTS吸头(Mettler-Toledo,GieBen,德国)纯化得到的肽。冷冻干燥后，将肽溶解在由2％乙腈(J.T.
Figure BDA0003712790080000201
Fisher Scientific的一部分,Waltham,MA,USA)、0.1％乙酸(Carl Roth,Karlsruhe,德国)的水(J.T.
Figure BDA0003712790080000202
Fisher Scientific的一部分,Waltham,MA,USA)溶液组成的缓冲液A中，并进行LC-MS/MS分析。为了实施数据独立采集(DIA)，添加了HRM肽标准品(Biognosys AG,Schlieren,瑞士)。
数据采集是在Q Exactive质谱仪(Thermo-Fisher Scientific,Idstein,德国)上结合UltiMate3000RSLC(Thermo-Fisher Scientific,Idstein,德国)和Nanospray Flex离子源(Thermo-Fisher Scientific,Idstein,德国)进行的。为了构建大肠杆菌离子库，每个样品都在数据依赖采集(DDA)和DIA模式下进行了分析。
原始数据分析与蛋白质鉴定
Spectronaut Pulsar X(v 12.0.20491.0.25470；Biognosys AG,Schlieren,瑞士)用于生成大肠杆菌DH5a离子库。数据库为FASTA文件，其包含大肠杆菌DH5α的4288个相同蛋白质(ISNDC；日期2018/11/09)。消化规则为胰蛋白酶/P，最多允许2个缺失的裂解。没有设置固定的修饰，而氧化(M)被认为是可变的修饰。仅预选了7-52个AA肽，并且最终考虑将具有6个以上转换的那些肽用于库。最终的大肠杆菌库包含24246种肽和2274种蛋白质，其中1228种在DIA数据集中被发现。
使用Spectronaut Pulsar X(v 12.0.20491.0.25470；Biognosys AG,Schlieren,瑞士)分析DIA原始数据。在R环境(v3.5.1)中进一步分析生成的原始数据(raw data)。MS2峰面积在重复水平上进行中值标准化，并使用重现性优化的肽变化平均法(ROPECA) 9a 在肽水平上比较条件。调节的P值(Benjamini和Hochberg)<0.05且倍数变化为+/-1.5的候选者被认为发生了显著变化。相关研究 10a 中列出了质谱设置、DIA分析的质量窗口以及用于分析的R包。
使用seaborn Python数据可视化库 11a 生成热图。对于树状图，相关性被用作具有单链接聚类的距离度量。对蛋白质丰度实施行缩放以显示倍数变化。
使用糖酵解途径对SimCell中的能量消耗进行建模
在含有糖酵解途径的SimCell中，用于驱动蛋白质产生的ATP和NADH形式的总能量E(摩尔量)可以描述为：
Figure BDA0003712790080000203
其中，k(t-1)为按照糖酵解的能量E产率，α(t-1)为蛋白质产生的能量消耗速率(其涉及转录和翻译)，β(t-1)为生物发光产生的能量消耗率，以及X(摩尔量)为糖酵解蛋白的总浓度。
等式(1)的解析解为：
Figure BDA0003712790080000204
设K0(t-1)为通过糖酵解产生的初始能量E产生速率，而γ为能量产生系统的整体老化/衰变常数，则能量E产生速率为：
k＝K0-γt (等式3)
因此，能量E产生的动力学可以描述为
Figure BDA0003712790080000211
这个等式在概念上可以拟合SimCell中的能量消耗动力学的模式。测量的生物发光为βE。
使用液相色谱(LC)进行邻苯二酚量化
使用液相色谱(Agilent 1120 Compact，California，US)分析样品。使用填有
Figure BDA0003712790080000212
孔径、5μm粒径并且尺寸为4.5×150mm柱的ZORBAZ Eclipse Plus C18(Agilent，US)实现代谢物分离。如先前由Sawyer和Kumar所述，使用水、甲醇和乙酸(690：280：30)的等度混合物以0.5ml min-1实施洗脱10分钟 12a 。烘箱温度为30℃。注射体积为5μl。紫外检测器设置为275nm的波长用于检测邻苯二酚。以5Hz的采集速率收集数据。对照、实验样品和邻苯二酚标准品依次运行以进行比较(n＝3)。将产生邻苯二酚的亲本细胞和纯化的SimCell以10000×g旋降，并分析上清液的邻苯二酚浓度。记录OD600以计算细胞数/mL，然后计算每个细胞产生的邻苯二酚的摩尔数。
细胞培养
在横纹肌肉瘤(RD)癌细胞系(ATCC no.CCL-136)、胶质母细胞瘤(Mo59K)癌细胞系(ATCC no.CRL-2365)和A549肺癌细胞系(来自英国牛津大学的Len Seymour的赠品)上测试了邻苯二酚的治疗效果。还使用了成纤维细胞对照细胞系(成纤维细胞)(来自英国牛津大学的Jo Poulton的赠品)。细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的高葡萄糖的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle培养基)中生长。将细胞保持在培养箱(37℃，5％CO2)中，并在汇合时(约每5天)传代。当SimCell应用于真核细胞时，还添加了25μg/mL D-环丝氨酸以保持SimCell纯度。
细胞活力测定
将细胞以1×104个细胞/孔的密度接种于96孔组织培养物处理的平板中并孵育24小时(n＝6)。然后，添加补充剂(邻苯二酚、水杨酸(SA)、25μg/mL D-环丝氨酸、105个SimCell)并将细胞再培养24小时。用PBS洗涤细胞两次，然后用1％戊二醛固定30分钟。然后，将细胞用0.5％结晶紫溶液染色1小时，洗涤，并用1％SDS(十二烷基硫酸钠)和10％乙酸重新溶解。在595nm处测量吸光度。
结果
通过降解天然染色体生成SimCell
通过在染色体上制造若干个双链断裂(DSB)来产生SimCell，该双链断裂导致RecBCD解旋酶-核酸酶与其它内源性核酸酶促进的染色体DNA降解 13，17，18 。DSB是通过I-CeuI核酸内切酶制备的，I-CeuI核酸内切酶识别特定的26个碱基对序列(5’-TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA-3’(SEQ ID NO：5)) 19 。该I-CeuI识别序列天然存在于大多数细菌基因组中，因为它是在23S rRNA的保守rrl基因中编码的 20 。因此，根据23S rRNA的拷贝数，I-CeuI核酸内切酶在细菌的基因组中具有多个识别位点(在大肠杆菌、恶臭假单胞菌和富养罗尔斯通氏菌中分别有7、6和3个位点)。因此，这种特定的核酸内切酶是一种策略性选择，因为这种方法能够将大多数细菌直接转化为SimCell。另外，该26bp的识别序列出现在设计的基因回路或微型基因组中的可能性非常低(在4.5×1015bp序列中出现1个)。
多个DSB的产生对细菌细胞是致命的，因此，除非I-CeuI的表达受到非常严格的控制，否则含有I-CeuI的菌株不能存活。为了选择最佳基因回路以表达用于染色体降解的I-CeuI核酸内切酶，我们筛选了多种严格调节的系统 21,22 。TetR家族抑制子TetR(pJKR-H-TetR)和EilR(pRH121)(表S1)在未诱导时表现出非常低的基础表达，但在诱导时表现出高水平的表达 21,22 。因此，I-CeuI基因被置于脱水四环素(ATc)和结晶紫可诱导的TetR和EilR基因回路的控制下(图S1b、S2a和表S1)。TetR系统用于大肠杆菌中，而EilR系统(图S2和S5)用于恶臭假单胞菌和富养罗尔斯通氏菌。当被诱导时，I-CeuI在这些生物体的染色体中产生了若干个DSB。DSB通常通过与RecBCD和RecA同源重组来修复。然而，由于I-CeuI同时在染色体中产生了若干个不可修复的DSB，因此其导致不稳定性以及随后DNA被RecBCD和其它核酸酶分解 17,24-27 。基于DAPI的逐渐丢失，视频显示，由于多个DSB的染色体切割活性和通过核酸酶的降解，染色体被去除(图S5和S7)。这些无染色体细胞现在已成为“简单细胞”或SimCell。缺乏I-CeuI表达的对照菌株保留了染色体并且没有失去DAPI的蓝色荧光(图S5)。据报道，用单个I-SceI DSB降解大肠杆菌染色体需要约180分钟。I-CeuI产生的多个DSB可能在较短的时间内导致染色体降解。另外，大肠杆菌、恶臭假单胞菌和富养罗尔斯通氏菌(图S5和S7)的染色体的成功降解验证了SimCell生成方法是从不同细菌属产生无染色体细胞的通用方法。
用于表征SimCell的功能性和使用寿命设计
构建的SimCell需要拥有并展示若干种属性以验证其身份与功能性。图1a为亲本大肠杆菌细胞在其变成SimCell之前含有的元件的概况，而图1b详细说明了每种质粒的属性。三种质粒的功能是可控的染色体切割(pJKR-HTetR-ICeuI)、ATP和NADH再生(pSEVA224-GB3)，以及货物表达(pJKR-OmphR-X)。为了确认细胞没有染色体，亲本菌株包含由阿拉伯糖启动子控制的染色体GFP标记物。用阿拉伯糖诱导时，仍具有它们的染色体的亲本细胞将产生GFP，而无染色体SimCell不能产生GFP。
试点研究表明，能量再生特征对于SimCell中的足够功能性是必要的。因此，将编码整个糖酵解途径的基因簇(gene cluster)引入到SimCell中，该糖酵解途径产生ATP和NADH。该基因簇包含10个受到质粒pSEVA224-GB3上的IPTG可诱导的启动子Ptrc 28 的控制的基因(图S1c)。SimCell内的货物表达质粒根据正在进行的概念验证(proof-of-concept)实验而有所不同，但它们都由pJKR-O-mphR编码的严格MphR调节系统控制，以产生一些响应于红霉素诱导的产物。pJKR-OmphR-X上携带的货物是mCherry(图S1d)，一种不稳定的mCherry的变体(图S1f)，或者是ilux操纵子(图S1e)。前者确定了功能性，后两者阐明了SimCell的使用寿命。
在诱导I-CeuI生成SimCell之前，将三种质粒(用于染色体降解的pJKR-HTetR-ICEuI，用于能量再生的pSEVA224-GB3，以及用于蛋白质产生的pJKR-OmphR-X)转移到亲本大肠杆菌菌株BW31003中。不具有I-CeuI和/或糖酵解途径且仅包含载体骨架(pSEVA224和pJKR-H-TetR)的菌株在本研究中作为对照组。
SimCell生成效率的量化
通过使用细胞活力与流式细胞术来表征I-CeuI核酸内切酶在生成SimCell中的效率和功效，以估算I-CeuI核酸内切酶活性之后的混合群体中SimCell的比例。由于SimCell不再包含染色体，所以无法复制，对培养物进行铺板，通过计数集落形成单位(CFU)来查看群体中剩余多少亲本大肠杆菌细胞(表2)。与其对应的对照菌株(无I-CeuI)相比，具有I-CeuI基因的菌株具有低约两个数量级的CFU/mL。这表明，I-CeuI核酸内切酶确实对细胞活力具有效果，因为染色体会已被降解(图S5和S7)。基于这些结果，诱导的I-CeuI培养物仍然分别含有约1.4％和3.8％的不含和含糖酵解质粒的亲本细胞。
流式细胞术用于使用亲本细胞的染色体上的阿拉伯糖可诱导的gfp回路量化无染色体SimCell。当没有不同的群体时，有和没有阿拉伯糖或红霉素诱导的对照细胞培养物(无I-CeuI)被混合以定义GFP或mCherry表达边界(图2b)。荧光显微术显示，AraC和MphR调节系统都很严格，并且没有观察到来自未诱导的大肠杆菌的泄漏表达。诱导时，GFP和mCherry有清晰明显的表达(图2a)。基于流式细胞术分析，大多数I-CeuI诱导的培养物为SimCell：菌株群体中的91.32％不具有糖酵解，菌株群体中的94.36％具有糖酵解(图3)。假设剩余的为亲本细胞(分别为8.68％和5.64％)，流式细胞术与细胞铺板实验相比，对留在I-CeuI诱导的培养物中的亲本细胞群体的估算略高。这种差异可能是由于流式细胞术确定的GFP表达的不明确性。
出乎意料地观察到，在诱导的I-CeuI群体中剩余的亲本细胞比例相对较小，因为在大肠杆菌染色体上产生的7个DSB应该是非常具有破坏性的。然而，细菌仍然能够部署它们的生存策略资源以使I-CeuI基因失活，从而恢复生长适应性并解释亲本细胞的存在，在另一项研究中进一步探索了这一现象 4 。这些结果提醒我们，细胞具有复杂的进化工具以对抗对其工程化的尝试。这也强化了这样的观念：合成生物学需要稳定且稳健的底盘细胞。通过缺少基因组，SimCell解决了此需求，因为它们避免了遗传漂变与可演化性的可能性。
由SimCell表达设计的基因回路
一旦确定可以产生无染色体SimCell，我们就试图证明我们的假设，即质粒DNA或微型基因组可以促使SimCell表达设计的基因回路。流式细胞术还用于确定表达mCherry(pJKR-O-mphR)的SimCell的群体。如前所完成的那样，当没有观察到不同的群体时，对照菌株(无I-CeuI)要么不被诱导，要么被诱导用于mCherry表达以定义表达边界(图2b)。使用先前建立的GFP表达门，分离SimCell群体(无GFP)。在SimCell群体中，估计只有13.18％的没有糖酵解的SimCell群体在产生mCherry，但随着糖酵解的重新引入(生成ATP和NADH)，该比例大幅上升至56.20％(图3)。SimCell性能的巨大改进表明，重要的是重新引入代谢途径，如糖酵解，以提供ATP和NADH以使细胞过程发挥功能。
图3还显示了具有I-CeuI诱导的GFP和mCherry表达的菌株的荧光显微图像。表达GFP的细胞仍然具有完整的染色体，因此不是SimCell。仅发出红色荧光的细胞是产生mCherry的SimCell。来自流式细胞术与荧光显微图像的结果是一致的，表明具有pSEVA224-GB3的SimCell(编码糖酵解途径介导的ATP和NADH的再生)增强了功能性(图3和4)。由于糖酵解能够再生ATP和NADH，所以存在更多的产生mCherry的SimCell。这些图像(图3)还显示流式细胞术可用于估算SimCell产生的比例并量化SimCell中可诱导基因回路的效率。为了确认这些仅红色的细胞是非复制的表达蛋白质的SimCell，将细胞固定在具有诱导物阿拉伯糖和红霉素的LB琼脂中，并使其生长过夜。对照菌株(无I-CeuI)(图S6a)生长出主导琼脂的集落，并且GFP和mCherry都有表达。与此相反，具有I-CeuI的菌株(图S6b)含有已经丧失复制能力的SimCell。虽然，有一些亲本细胞避免了染色体降解并复制以形成表达GFP和mCherry的集落，但还有更多仅表达mCherry的异常的(singular)SimCell。这表明，不表达GFP的细胞是无染色体的非复制细胞。图S7显示了SimCell生成与随后蛋白质产生的过程。将含有染色体DNA的细胞用DAPI染色并固定在含有I-CeuI核酸内切酶、GFP和mCherry诱导物的琼脂上。在生成SimCell时，随着染色体DNA降解为核苷酸，它会失去蓝色荧光。然后，新转化的SimCell将开始产生红色荧光(mCherry)(图S7)。这些观察结果表明，SimCell确实在产生mCherry，并且mCherry不是来自亲本细胞进行的合成的假象(artefact)。
总之，这些结果表明，当由基因回路指导时，无染色体SimCell仍然可以产生蛋白质；并且，这种活性可以通过重新引入糖酵解途径以再生ATP和NADH来增强。
SimCell的纯化
如流式细胞术和细胞铺板实验所示，在I-CeuI核酸内切酶活性之后，SimCell的生成效率并不是100％。为了阐明SimCell的不同特征与特性，需要从亲本细胞中纯化它们。D-环丝氨酸以前曾用于纯化最小细胞培养物，并且因此评估了它在杀死留在SimCell群体中的主动分裂的亲本细胞的功效。表3显示了在时间0和1.5小时施用D-环丝氨酸后菌株随时间变化的CFU/mL。在D-环丝氨酸的存在下，由于细胞壁生物合成被抑制，主动分裂的细胞将无法存活，这意味着细胞壁不能维持增加的细胞体积，从而导致渗透性裂解。虽然药物不能杀死对照菌株中的所有细胞，但在I-CeuI+菌株中，亲本细胞被有效消除，产生纯SimCell培养物。这也可以在图3中看到，其中没有细胞表达GFP，表明它们缺少染色体，因此是SimCell。因为SimCell首先被纯化，然后被诱导用于mCherry表达，这些结果也证明SimCell产生了蛋白质并且它不是来自亲本细胞的残留表达。这些图像还强调了糖酵解的益处，因为它允许更多SimCell生产mCherry(图4)。
D-环丝氨酸浓度的进一步优化确保了以下实验中的纯SimCell群体，并排除了SimCell群体中剩余亲本细胞作出的贡献。在筛选D-环丝氨酸浓度后，确定25μg/mL为培养物中亲本细胞被杀死的浓度点，这得到了OD几乎没有增加的证明(表S3)，但也允许SimCell中的蛋白质生产或其它活动。通过使用靶向活性亲本细胞的D-环丝氨酸，我们能够在更大的培养物水平范围内将活性与SimCell进行区分，用于进一步表征。
SimCell的保质期
为了确定SimCell的适用性，有必要表征它们可以存放多长时间。使用D-环丝氨酸从含有mCherry表达质粒和有或没有编码糖酵解途径的pSEVA224-GB3质粒的菌株中纯化SimCell。然后，将等分试样存放在4℃或-80℃。在存放后1周、1个月和5个月，诱导SimCell用于产生mCherry。图8的图像显示SimCell能够保存至少5个月。正如预期的那样，与不使用pSEVA224-GB3的SimCell相比，使用pSEVA224-GB3，更多的SimCell可以产生mCherry，尽管存储后可以产生mCherry的SimCell的数量减少。一般而言，就从pJKR-O-mphR可诱导mCherry表达而言，在4℃保存的SimCell似乎比在-80℃保存的SimCell表现更佳。存在一些证据表明，在零下温度储存并随后解冻可以对细胞造成“代谢损伤”并影响生长动力学。在SimCell的情况下，细胞过程可能在4℃处于休眠状态，而不是在-80℃关闭，因此，细胞更容易被重新激活并恢复。
SimCell的使用寿命
SimCell应用于如医药或环境产业的另一个要求为底盘细胞的使用寿命。潜在应用(如生物修复、生物传感器或药物递送)会需要SimCell保持活性持续数天、数周或数月。我们认为使用寿命是细胞可用的ATP和NAD(P)H形式的能量，以及细胞转录和翻译机制的功能性。为了表征能量储备的使用寿命，纯化的SimCell通过ilux操纵子产生的发光被用作指示信号。这是因为，需要ATP和/或NADH来促进荧光素酶(luxAB)将FMNH2和-CHO转化为FMN和-COOH以产生光 37 ，并且ATP和NAD(P)H的水平在濒死细胞中迅速下降 38 。因此，ilux操纵子被集成到pJKR-O-mphR质粒中(图S1e)并被引入SimCell。随着时间的推移，诱导发光并在SimCell中跟踪其产生(图5)。活性在第3天左右达到最高点，但此后下降。SimCell似乎在第10天左右失去了对能源的利用，并且到第14天仅检测到发光的背景水平。有趣的是，在第1、3和10天，具有糖酵解途径的SimCell的性能仅仅优于没有糖酵解途径的那些。可能是糖酵解所需的酶在生成SimCell之前维持在合适的浓度。
因此，即使没有糖酵解质粒，SimCell仍然可以产生相当水平的发光。可能的是，利用糖酵解质粒，高于酶的平均浓度允许增加活性的最初爆发(如从第1天到第3天看到的)，但是，由于在糖酵解途径中制备10个蛋白质的成本带来了显著的能量负担，这种对细胞的益处最终丧失了。我们的数学模型也描述了这种行为模式(图11)。
转录和翻译占据了细胞的能量预算的很大一部分，并且是细胞机制和蛋白质过程(合成、调节与降解)的重要指标，因此它对于评估SimCell能够维持这些过程多长时间非常重要。为了估算转录和翻译装置的使用寿命，以及SimCell中降解酶的功能，产生了不稳定版本的mCherry并将其用作指标。正常mCherry非常稳定，所以ssrA蛋白酶标签(VSAAYNEDNAAPR(SEQ ID NO：6)) 40 的ASV变体与mCherry基因融合，从而产生了靶向降解的mCherry，并且因此具有更短的半衰期。mCherry-asv报告基因作为蛋白质代谢的主要参与者(如RNA聚合酶、核糖体和蛋白酶)仍然有活性的指示。图6显示了通过具有或不具有糖酵解的纯化的SimCell随时间的mCherry-ASV表达。荧光水平在第5天左右达到最高，并在第14天左右开始下降，而28天后仅检测到荧光的背景水平。从这些结果来看，重新引入糖酵解的益处并不明显。合成和降解的同时活动使得很难辨别重新引入的糖酵解途径所作出的明确贡献。蛋白质代谢机制似乎比细胞中可用的ATP持续时间更长(图5)，但我们还必须考虑一个事实，即降解ssrA标记的mCherry的ClpXP和ClpAP蛋白酶需要ATP才能发挥功能。因此，荧光水平不再增加的点(第5-10天)可能是蛋白质机制开始丧失功能性的时候。
本质上，在用于表达这些过程所需的基因回路和能量的细胞机制方面，SimCell具有约10-14天的使用寿命。因此，SimCell可以足够稳健以在大多数预期应用中保持活性和功能。通过重新引入其它能量生成途径、DNA修复、核糖体再生以及营养补充，该时间有可能增加。
能量生成与基因表达的成本之间的权衡(trade-off)
糖酵解的代谢途径能够生成ATP和NADH，但糖酵解基因的表达成本高，并且消耗ATP和NADH。因此，能量生成与基因表达之间存在微妙的平衡。开发了数学模型来模拟此权衡(图S11)。编码糖酵解途径的10个基因由Ptrc启动子和LacI抑制子控制，由于LacI的结合动力学较差，Lad抑制子具有泄漏表达(图S12)。在SimCell中通过IPTG诱导过表达糖酵解是昂贵的且耗能的，使得SimCell不能分配资源来表达其它基因，如ilux操纵子或mCherry(图S11)。与此相反，亲本细胞中糖酵解基因的泄漏表达或IPTG诱导能够在前3天帮助SimCell中产生ilux和mCherry。然而，由于产生糖酵解蛋白的成本，这种益处在3天后消失，并且性能类似于不含糖酵解途径的SimCell(图4-6)。数学模拟在概念上也支持该观察结果(图S11)。
蛋白质组学揭示了SimCell中蛋白质的全局调节的改变
蛋白质调节负责确保某些蛋白质被产生以满足细胞内需求并适应不断改变的环境，同时下调不必要蛋白质的活性。在I-CeuI核酸内切酶导致DNA损伤的情况下，细胞内需求肯定会改变；并且，I-CeuI核酸内切酶活性的结果不仅限于染色体降解。因此，在一项相关研究 4 中进行了蛋白质组学分析，以研究I-CeuI核酸内切酶活性之后的蛋白质丰度的改变。没有载体的大肠杆菌菌株DH5a和具有空载体骨架的DH5a被用作对照组，并且具有I-CeuI基因的DH5a被指定为实验的SimCell条件。进行聚类分析以生成树状图及其对应的热图(图S13a)，以比较行缩放后不同条件下的蛋白质丰度。视觉上明显的是，I-CeuI+培养物的蛋白质表达谱不仅不同，而且几乎与对照组相反。
当我们剖析特定细胞过程的结果时，观察到不同I-CeuI蛋白质表达谱的相同趋势。在能量与代谢方面(图S13b)，SimCell诱导的群体上调或下调某些基因，以在能量匮乏状态的过程中最大限度地利用细胞资源来产生ATP(能量货币)。糖酵解和戊糖磷酸途径的生成ATP和NADH的部分被上调，而消耗ATP的部分被下调(图7)。TCA循环在很大程度上被关闭，因为当存在更简单的替代方案时，成本可能超过了运行大型途径的益处。富马酸酶的活性(富马酸盐和苹果酸盐的相互转化)是TCA循环中唯一上调的部分，并且其原因或潜在益处是未知的，因为SimCell中的苹果酸脱氢酶(苹果酸盐转化为丙酮酸盐)丰度较低。需要再生辅助因子NAD+以维持糖酵解途径，并且似乎SimCell有利于发酵和有氧呼吸(NADH脱氢酶)的一小部分来实现这一点。图7中显示的有氧和无氧呼吸部分是上调的仅有的复合物。这些复合物可能足以生成足够的质子梯度以运行ATP合酶并产生足够的ATP。在其它研究中也观察到了对能量匮乏的这种增强的碳代谢反应，其中细胞经历了DNA损伤并引发了应激反应 44 。随着染色体的缺失，我们减少了细胞代谢网络 45 的功能空间，这导致了不太复杂的相互作用组(整套分子相互作用)和SimCell中细胞过程的简化。
就属于“中心法则”的范畴的过程而言，即转录和翻译，SimCell再次显示出对这些过程和一般代谢的非常不同的调节(图S13c和8)。通过从头合成和补救途径优先处理脱氧核苷酸和核糖核苷酸的产生(和保存)。总体而言，促进了转录，因为与RNA聚合酶和σ因子(σ70和σ54)相关的蛋白质的丰度较高，但翻译似乎暂停。虽然，蛋白质组学表明，与核糖体亚基50S和30S相关的蛋白质丰富，但是70S复合物的组装被下调。细胞具有高转录率和低翻译率是异常的，因为前者在能量上是昂贵的 46 。然而，当细胞经历营养匮乏以及恶劣多变的条件时，核糖体能够进入休眠状态。一旦遇到更有利的条件，SimCell就可以为蛋白质合成和进一步的能量消耗做好准备。
由I-CeuI引起的最明显的表型效应(phenotypic effect)为较长的细胞的存在，表明细胞分裂的正常过程发生改变(图9和S13e)。典型的大肠杆菌的长度为约2μm，但是具有I-CeuI的菌株已经产生了可以是20μm或更长的细胞(图3、4、S6)。这些丝状细胞之前已经在由于DNA损伤而引发了SOS应答的细胞中被观察到(图S13d)，因为用于细胞分裂的必需基因通常被SOS基因关闭。然而，在尝试了DNA修复后，SOS应答随后被沉默。图5c假设了在经历I-CeuI核酸内切酶对DNA损伤的细胞中SOS应答的时间顺序行为，以及它如何影响细胞分裂的各个方面。当I-CeuI核酸内切酶进行DSB时，细胞启动SOS应答。SOS基因下调如FtsZ等蛋白质(由蛋白质组学观察到)，它是隔膜环(septal ring)形成与细胞分裂的主要参与者，导致细胞伸长。当尝试进行DNA修复时，某些细胞分裂基因会重新开启，我们有时可以观察到具有多个隔膜环的细胞(图4)。然而，由于缺少染色体，细胞不能完成分裂。其它研究观察到，当FtsZ在亲本细胞中下调或突变时，细胞可以达到高达750μM的长度，并且仍具有代谢能力并将合成DNA。我们的结果也支持功能的这种保留，因为更长的SimCell仍然可以产生mCherry(图3、4、S6)。支原体蛋白质组的比较研究表明，细胞分裂蛋白不是核心蛋白质组的一部分 52 。这表明细胞分裂机制比其它途径具有更大的可塑性，并且对细胞功能不是必需的。
由I-CeuI核酸内切酶进行的DSB导致的染色体降解启动了剧烈的细胞应答，该细胞应答影响了如细胞分裂、蛋白质代谢和ATP生成等过程。蛋白质组学分析表明了，哪些过程被优先处理、保持待命状态或关闭，以及SimCell中存在哪些细胞机制，为货物基因回路或微型基因组的设计提供必需的信息。
SimCell作为生物催化剂以从阿司匹林制备抗癌药物邻苯二酚
邻苯二酚(1,2-二羟基苯)是水果和蔬菜中的天然存在的化合物，并且是咖啡酸和儿茶素(茶)的一部分。先前已证明邻苯二酚通过在肺癌和脑癌细胞系中诱导细胞凋亡而具有细胞毒性效果。利用邻苯二酚的抗癌性质，SimCell用于将水杨酸(SA)转化为邻苯二酚并输出该产物以杀死癌细胞(图10和S14)。
质粒pSalAR-GFP含有正向的自动调节基因回路，当由SA诱导时其产生SalA(水杨酸羟化酶)和SalR(图10)。SalR是一种转录调节蛋白，其在SA存在下转换为其活性形式，并且作为其自身启动子Psal的激活物，有效形成正反馈回路(图10)。SalA通过消耗NADH催化SA转化为邻苯二酚(图10)。在具有和不具有糖酵解途径的情况下，该质粒(pSEVA224-GB3)被转移至大肠杆菌亲本细胞和SimCell(随后纯化的)中。LC分析(图11)显示，当用更高浓度的SA诱导时，亲本细胞和SimCell的邻苯二酚产量显著增加。这是由于基因回路的正反馈性质。当用500μM SA诱导时，SimCell能够通过糖酵解途径产生相当数量的邻苯二酚(图11)。糖酵解对邻苯二酚产量的显著改善可以归因于反应对NADH的依赖性。这表明糖酵解途径对SA转化为邻苯二酚作出了很大贡献。假定SimCell群体为1×107个细胞/ml，SimCell从500μM SA在12小时内每个细胞产生约4×10-14mol邻苯二酚。在小体积的细菌细胞(约1μm3)中产生的这种量的邻苯二酚会具有邻苯二酚的高局部浓度，随后从SimCell扩散到周围的介质中(图S14)。如果SimCell可以附着至癌细胞，那么局部浓度将充分高到足以抑制癌细胞。
筛选显示，浓度低至100μM的邻苯二酚显著降低了A549(肺)、Mo59K(脑)和RD(软组织)癌细胞系的活力，但对如成纤维细胞等正常细胞的不利影响较小(图12)。此外，SA(底物)和D-环丝氨酸(以维持SimCell纯度)并未导致细胞死亡(图S15)，这意味着细胞活力的降低将归因于邻苯二酚的细胞毒性效果。这些细胞系与含有糖酵解途径的SimCell和不同SA浓度中的pSalAR-GFP质粒一起孵育。用500μM SA诱导的用于产生邻苯二酚的SimCell显著降低了所有癌细胞系的细胞活力，但并不杀死成纤维细胞(非癌细胞)(图13和S16)。这些结果表明，SimCell能够作为生物催化剂以生产邻苯二酚，邻苯二酚对癌细胞具有细胞毒性，但不杀死非癌细胞。SimCell在医学上优于传统的细菌疗法，因为它们是可诱导的、功能性的和可控的(非复制的最小细胞)。未来的工作可以通过在SimCell的表面(表面显示)表达癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)来优化该系统。这将允许SimCell特异性靶向癌细胞 59 ，并在局部递送高浓度的邻苯二酚，这应当会导致增强的杀伤效果。
讨论
经典的最小细胞为只包含复制和代谢所必需的最少量成分的活细胞。在这项工作中，我们产生并表征了一种不同类型的最小细胞，称为SimCell或“简单细胞”，旨在将其用作用于重新编程微生物体的底盘。我们开发了一种潜在的通用技术，以从几乎所有细菌属中产生无染色体的且可重新编程的SimCell。这些SimCell能够作为宿主并表达设计的基因回路。SimCell可被看作是简化的细胞生物机器人：它的“硬件”包括完整的细胞膜和蛋白质以及分子工具包(例如电子链传输、转录、翻译)，其能够实现细胞机制的功能性；并且它的“软件”为工程化的DNA或实施指示的功能的微型基因组 10 。可以通过设计或选择具有所需表型属性的亲本细胞来优化硬件。天然基因组的缺失使SimCell能够将大部分能量和资源用于由质粒或微型基因组编程的指定任务，而不受不需要的途径和网络的干扰。SimCell为生化活性的、可设计的且简化的试剂，其可用于理解细胞的功能机制。它们也是底盘细胞，其能够容纳含有核心基因操作系统的微型基因组，该系统能够以预测方式进行操作并执行预定义的功能。此外，由于缺少染色体，SimCell不能复制，这可能有利于生物抑制并减轻无法控制的基因工程化的微生物体的担忧。
与使用自上而下的方法制备的最小细胞相比，本研究中的SimCell为抽象的甚至更简单的最小细胞，因为它仅含有功能基因回路而非完整的最小基因组。通过利用I-CeuI核酸内切酶介导的DSB和RecBCD介导的DNA降解的组合活性去除染色体，容易产生SimCell(图S5和S7)。SimCell的Zeta电位比亲本细胞略微带正电荷(图S17)，这是支持SimCell已经失去带负电荷的染色体的额外证据。这种SimCell生成方法是有利的，因为它能够适用于大肠杆菌以外的细菌(如本研究中的恶臭假单胞菌和富养罗尔斯通氏菌)，因为I-CeuI识别序列存在于23S rRNA中，因此在细菌基因组中出现若干次。研究通常观察到recA突变体的染色体降解，这是因为RecA在DSB修复中发挥重要作用。然而，当我们生成若干个DSB时，RecA蛋白质可能无法中断RecBCD对染色体的降解。RecBCD染色体降解的最终产物为4-6聚体的单链片段，其很可能被其它细胞核酸酶(如ExoI、ExoVII和RecJ)转化为单核苷酸。来自RecBCD反应的这些dNTP似乎并不干扰基因回路的表达。然后，我们展示了，在质粒DNA的指导下，SimCell能够产生蛋白质。在细胞中恢复了糖酵解基因后，改善了这种活性，约56％的SimCell具有代谢活性。SimCell能够维持约10天的恒定功能，直到它们耗尽它们的能量货币。SimCell还能够解决基因改造的生物体由于它们失去了复制能力而经常面临的一些生物抑制问题。
研究人员在基因操作过程中经常面临预料不到的困难，因为亲本细胞具有错综复杂的途径网络，其可能与工程化的系统不兼容。在SimCell中，基因演化不再能够干扰重组途径与蛋白质。因此，SimCell具有使其成为半人工细胞的有生命的和无生命的性质，并且使我们将其用作用于工程化的底盘，而且可以用作研究基本生命过程的模型平台。
与是脂质体或囊泡的原始细胞不同，SimCell保留了其原始的细菌细胞膜。这种膜具有许多重要功能：感知环境信号，通过电子传输链产生的质子梯度生成ATP，以及将营养物质输送至细胞中并从细胞中排出废物。SimCell也比原始细胞更稳健，因为即使基因网络被消除，细胞机制与蛋白质组仍然保持完整且活跃。因此，SimCell能够更有效地应答于细胞功能的挑战，因为它保留了适应性生物成分。例如，通过糖酵解、戊糖磷酸途径、发酵与呼吸的生产部分的上调优先处理ATP/NAD(H)的产生。这些途径也被鉴定为三种支原体物种的核心蛋白质组的一部分 52 。由于其较小的基因组大小，支原体通常被认为可以预测最小细胞需求。我们的结果支持某些代谢途径与机制(例如转录和翻译)被优先上调以确保细胞存活和功能。蛋白质组学分析为我们提供了指示，即在人工染色体上包括什么是明智的，以重新引入有益的过程以延长细胞的耐力(例如本研究中的糖酵解)，但排除较差效果的过程(例如TCA循环)。以这种方式，SimCell能够被模块化修饰以适合应用的需要。SimCell还能够作为生物催化剂，以从阿司匹林的代谢产物生产邻苯二酚，其对几种恶性癌细胞系具有治疗效果。这表明SimCell也能够通过利用其生物学(转录和翻译)和人工(非复制)性质来用作底盘细胞。SimCell能够取消工程化细菌的停滞进展(由于生物抑制问题)，以处理医学或环境修复方面的挑战。
SimCell的产生让我们洞察了“生命”的最低需求是什么，这是产生最小细胞的核心价值之一。它们的简单性(不存在的基因组)应当允许更多预测性操作，并且它们潜在的复杂性(剩余的蛋白质组)应当提供稳健性。此外，由于它们是功能性的(能够产生蛋白质)，因此能够设计和调整这种活性。无染色体SimCell将成为用于重新编程细菌细胞的通用平台，并将推动细胞设计与合成细胞的产生的进步。
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表2将具有或不具有I-CeuI核酸内切酶基因和具有或不具有糖酵解途径的菌株(pSEVA224-GB3)的过夜培养物铺板，以计算CFU/mL并量化群体中剩余的正常细胞的数量。将铺板的稀释液标准化为具有相同的OD600。具有I-CeuI的菌株的菌落比没有I-CeuI的菌株的菌落少约100倍，这表明由于染色体降解导致的I-CeuI对细胞活力的不利影响。
Figure BDA0003712790080000321
表3在时间0和1.5小时处用200μg/mL的D-环丝氨酸处理培养物以杀死正常细胞以产生纯SimCell培养物。随时间的平板计数估算了CFU/mL与药物疗效。D-环丝氨酸有效杀死具有I-CeuI的菌株中的正常细胞，表明它是有效的药物。
Figure BDA0003712790080000331
表S1：本研究中使用的菌株和质粒的列表。
Figure BDA0003712790080000332
Figure BDA0003712790080000341
Figure BDA0003712790080000351
表S2：本研究中使用的引物。
Figure BDA0003712790080000361
Figure BDA0003712790080000371
表S3：使用寿命实验中使用的SimCell群体随时间的OD变化。
Figure BDA0003712790080000372
在发光读数中，有记录以来的最高OD变化是第14天ilux糖酵解+的0.092，在200μL孔中估计增加了6.46×104个细胞(图S18b)。平行测定的平均OD为1.76，或每孔约1.70×108个细胞(图S18a)。这意味着细胞数量增加了3.80％，在总共39.5个发光单元中贡献了可以忽略不计的1.50个发光单元。
在mCherry读数中，有记录以来的最高OD变化是第21天mCherry糖酵解-的0.152，在200μL孔中估计增加了1.33×105个细胞(图S18b)。平行测定的平均OD为1.87，或每孔约1.81×108个细胞(图S18a)。这意味着细胞数量增加了7.37％，在总共7470个荧光单元中贡献了可以忽略不计的550个荧光单元。
表S3：大肠杆菌、恶臭假单胞菌和富养罗尔斯通氏菌的染色体降解率
Figure BDA0003712790080000373
序列：
I-CeuI(CAA78934.1)氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：
Figure BDA0003712790080000381
编码I-CeuI(CAA78934.1)的DNA序列(SEQ ID NO：2)：
Figure BDA0003712790080000382
pGeneArt-ICeuI序列(SEQ ID NO：3)(I-CeuI序列以粗体和下划线突出显示)：
Figure BDA0003712790080000383
Figure BDA0003712790080000391
Figure BDA0003712790080000401
Figure BDA0003712790080000411
Figure BDA0003712790080000421
pSEVA224-GB3序列(SEQ ID NO：4)(糖酵解途径序列以粗体和下划线突出显示)：
Figure BDA0003712790080000422
Figure BDA0003712790080000431
Figure BDA0003712790080000441
Figure BDA0003712790080000451
Figure BDA0003712790080000461
Figure BDA0003712790080000471
Figure BDA0003712790080000481
Figure BDA0003712790080000491
Figure BDA0003712790080000501
Figure BDA0003712790080000511

Claims (26)

1.一种产生无染色体细菌细胞的方法，包括：
i)通过在细菌细胞中表达能够识别并且双链切割天然染色体DNA的核酸内切酶降解所述细菌细胞中的天然染色体DNA，其中，所述核酸内切酶的表达受到诱导型或抑制型启动子的控制；并且
ii)用编码一种或多种生化能量途径或其部分的酶的重组核酸转化所述细菌细胞，所述生化能量途径或其部分为所述无染色体细菌细胞提供能量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，用于降解所述染色体DNA的所述核酸内切酶包括归巢核酸内切酶。
3.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，用于降解所述染色体DNA的所述核酸内切酶为I-CeuI，或其同源物，或其功能变体。
4.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，用于所述核酸内切酶，如I-CeuI的启动子受到TetR或EilR的控制。
5.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，在所述细菌细胞中表达所述核酸内切酶包括将所述细菌细胞暴露于诱导物分子，所述诱导物分子被布置为诱导或脱抑制所述核酸内切酶的启动子。
6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，在所述细菌细胞中表达核酸内切酶包括以下步骤：
i)提供编码核酸内切酶基因的供体核酸，其中，所述核酸内切酶基因是无启动子的；或者，其中，所述核酸内切酶基因可操作地连接至启动子，并且所述供体核酸还被布置以形成发夹环以阻止所述核酸内切酶的表达；
ii)使用所述供体核酸作为模板以形成编码所述核酸内切酶的PCR产物，并且将所述PCR产物插入用于转化所述细菌细胞的核酸中，其中，将所述核酸内切酶基因插入一位置中，使得其受到所述诱导型或抑制型启动子的控制；或者
或将所述供体核酸上编码的所述核酸内切酶基因与用于转化所述细菌细胞的核酸重组，其中，将所述核酸内切酶基因重组到一位置中，使得其受到所述诱导型或抑制型启动子的控制。
7.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，所述生化能量途径能够产生ATP和NAD(H)。
8.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，所述生化能量途径为糖酵解途径或其部分。
9.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，用编码所述糖酵解途径的一种或多种或所有酶的核酸转化所述细菌细胞。
10.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，用编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶和/或磷酸甘油酸激酶的核酸转化所述细菌细胞。
11.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，所述生化能量途径的表达在诱导型或抑制型启动子的控制下调节。
12.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，用编码表达产物的核酸转化所述细菌细胞或得到的无染色体细菌细胞(SimCell)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述产物包括肽、蛋白质或核酸中的任一种或多种。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述表达产物包括生物药品、疫苗、酶催化剂中的任一种或多种。
15.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，所述方法还包括：诱导步骤ii后其中的所述染色体DNA保持完整的任何细菌细胞和/或任何主动分裂的细菌细胞的死亡(杀死)。
16.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中，所述细菌细胞选自埃希氏菌属物种、假单胞菌属物种和罗尔斯通氏菌属物种中的细菌物种。
17.一种通过任一项前述权利要求所述的方法产生的无染色体细菌细胞。
18.一种无染色体细菌细胞，包含：
i)编码核酸内切酶的重组核酸，其中，所述核酸内切酶的表达受到诱导型或抑制型启动子的控制；和
ii)编码一种或多种生化能量途径或其部分的酶的核酸，所述生化能量途径或其部分为所述无染色体细菌细胞提供能量；
任选地，其中，所述无染色体细菌细胞还包含编码表达产物的核酸。
19.一种组合物，包含：根据权利要求17或18所述的无染色体细菌细胞的群体或根据权利要求1-16中任一项制备的无染色体细菌细胞的群体。
20.根据权利要求17或18所述的无染色体细菌细胞或根据权利要求19所述的组合物，用作药物或疫苗。
21.根据权利要求17或18所述的无染色体细菌细胞或根据权利要求19所述的组合物，用于治疗或预防受试者的疾病或病症。
22.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用根据权利要求17或18所述的无染色体细菌细胞，或根据权利要求19所述的组合物。
23.根据权利要求20或21使用的所述无染色体细菌细胞或组合物，或根据权利要求22所述的方法，其中，待治疗或预防的疾病包括病毒感染、糖尿病或癌症。
24.根据权利要求17或18所述的无染色体细菌细胞或根据权利要求19所述的组合物作为生物传感器和/或生物催化剂或用于生产生化产品的用途。
25.一种编码归巢核酸内切酶的核酸，其中
i)所述核酸内切酶的表达受到诱导型或抑制型启动子的控制；和/或
ii)所述核酸能够包含用于在所述核酸中形成二级结构的反向互补序列，所述二级结构如发夹环。
26.一种生产产品和/或生化物质的方法，所述方法包括：使用根据权利要求17或18所述的无染色体细菌细胞或根据权利要求19所述的组合物，对表达产物进行表达，并且任选地，还通过使用所述表达产物作为生物催化剂生产生化物质。
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