CN115175999A - 多个转录物的高通量连接 - Google Patents
多个转录物的高通量连接 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115175999A CN115175999A CN202180017456.7A CN202180017456A CN115175999A CN 115175999 A CN115175999 A CN 115175999A CN 202180017456 A CN202180017456 A CN 202180017456A CN 115175999 A CN115175999 A CN 115175999A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cdna molecules
- container
- molecules
- cdna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
提供了用于物理连接来源于由同一细胞表达的mRNA分子的cDNA分子的高通量方法,以及通过所述方法产生的连接的cDNA分子文库。所述方法包括在第一容器中逆转录来自单细胞的mRNA以产生cDNA分子,以及在第二容器中连接所述cDNA分子。所述方法出人意料地产生了与来源于同一细胞的其他分子正确连接的分子数量增加的cDNA分子文库。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月22日提交的美国临时申请号62/964,319的优先权权益,所述临时申请出于所有目的以引用的方式并入本文。
背景技术
近年来开发了许多方法来实现对天然配对的免疫库序列(在B细胞的情况下为重-轻链对,并且在T细胞的情况下为α-β链对)的高通量捕获。例如,从所得数据集中收集的信息可为人免疫反应的内部运作提供独特的见解,并使得开发治疗剂和疫苗的方法能够更明智。
此类方法的一个类别涉及在微容器(例如液滴)中大规模并行分离单个免疫细胞,随后在这些容器内裂解细胞,以及通过mRNA链的poly-A尾将mRNA转录物捕获到poly-T捕获珠粒上。通常,然后从其容器中回收珠粒,并通过杂交附接mRNA。然后将这些珠粒洗涤,单个重新封装到二级微容器中,将所需转录物(重链和轻链或α和β链)逆转录成cDNA,并且最后将那些cDNA序列扩增并连接在一起形成单个扩增子,所述扩增子包含来自起源细胞的重链和轻链序列或α和β链序列。连接的扩增子的后续测序可从样品中生成1,00,000+个独特的连接的免疫细胞受体序列,而操作员只需最少的操作时间。此外,可将连接的扩增子片段进一步操纵成展示形式(例如噬菌体展示、酵母展示),以询问结合特定靶标(例如细胞、特定感兴趣的蛋白质)的序列的免疫库。
这些方法存在缺陷,即转录物错配和丢失的倾向,这是mRNA转录物非共价附接至捕获珠粒的结果。因为细胞转录物没有与珠粒共价连接,所以细胞转录物有多个机会最终出现在错误的珠粒上,并因此失去与单细胞的连接。此类丢失连接的一个实例发生在上面提到并在下面的描述中详细说明的两个封装步骤之间的中间时段。在微容器之间的这段时间内,必须非常小心地处理微珠样品:必须根据离子强度、pH以及表面活性剂和RNA酶的存在仔细调整洗涤溶液,样品必须始终保持低温,并且洗涤步骤必须尽可能快地进行,以最小化转录物丢失、混编(shuffling)或以其他方式与捕获珠粒随机杂交的程度以及相对脆弱的mRNA转录物的降解。
转录物的丢失可能由于mRNA从捕获珠粒的去杂交或mRNA转录物本身的降解而发生。去杂交可能是由于离子强度不足或洗涤溶液中存在某些表面活性剂或其他试剂、未能始终保持珠粒溶液低温、或者仅仅是从第一容器中提取珠粒与在第二容器中重新封装之间的时间间隔延长。mRNA转录物的降解可能是由于通过污染暴露于RNA酶或洗涤溶液的pH值不当造成的。降解或去杂交的后果是缺乏正确的免疫细胞序列配对的敏感度和准确度。
错配是由于mRNA转录物在其原始容器之外随机结合至捕获珠粒而发生的。这可能是由上述情况中的任一种引起的。此外,由于捕获率几乎总是低于100%或因为珠粒被转录物饱和,原始容器中几乎经常会有一些多余的转录物在溶液中保持游离。一旦从其原始容器中取出,这些多余的游离转录物就有机会随机结合至其他捕获珠粒,并且这种随机结合也会导致错配。
本公开描述了对当前方法的上述确定的问题的解决方案。
发明内容
本文描述了用于高通量连接多个转录物的方法,所述方法高度敏感并且几乎消除了上述转录物丢失和错配的来源。还描述了用于产生来源于同一单细胞的物理连接的扩增子文库的方法。所述方法提供了出乎意料的优点,即增加了正确连接至来自文库中同一细胞的扩增子的扩增子百分比。
在一个方面,提供了一种用于从单细胞产生两个或更多个连接的核酸分子的方法,所述方法包括:
(i)在第一容器中分离单细胞,并且裂解单细胞以释放mRNA分子;
(ii)在第一容器中将mRNA分子逆转录以产生cDNA分子;以及
(iii)在第二容器中连接来源于步骤(ii)中的单细胞的cDNA分子,
从而产生连接的核酸分子。
在一些实施方案中,第一容器包含附接至寡核苷酸的一个或多个固体载体,所述寡核苷酸包含与mRNA分子的一部分互补的序列。在一些实施方案中,mRNA分子通过与互补序列结合而附接至寡核苷酸。在一些实施方案中,逆转录包括用逆转录酶延伸寡核苷酸以产生cDNA分子。
在一些实施方案中,寡核苷酸通过接头附接至固体载体。在一些实施方案中,接头位于固体载体的表面和与mRNA分子的一部分互补的序列之间。
在一些实施方案中,接头是可光裂解的接头。在一些实施方案中,通过将可光裂解的接头暴露于光,从固体载体释放cDNA分子。在一些实施方案中,接头被紫外(UV)光裂解。在一些实施方案中,cDNA分子从第二容器中的固体载体释放。在一些实施方案中,通过在第二容器中将可光裂解的接头暴露于光,从固体载体释放cDNA分子。
在一些实施方案中,来自上述步骤(ii)的cDNA分子共价连接至固体载体。在某些实施方案中,在步骤(iii)之前将一个或多个固体载体中的每一个分离(或分散)到不同的第二容器中。
在一些实施方案中,第一容器中存在1至20个固体载体。在一些实施方案中,第一容器中存在平均3、4或5个固体载体。在一些实施方案中,第一容器中存在平均15个固体载体。
在一些实施方案中,固体载体是珠粒或粒子。在一些实施方案中,固体载体是直径为1至20微米的球形粒子。在一些实施方案中,固体载体的平均直径为5至10微米。
在一些实施方案中,在步骤(iii)中连接cDNA分子包括通过重叠延伸PCR扩增和连接cDNA分子。在一些实施方案中,重叠延伸PCR包括使用一个或多个包含生物素标签的内部引物扩增cDNA分子。在一些实施方案中,包含生物素标签的cDNA分子在连接步骤之后去除。在一些实施方案中,重叠延伸PCR包括使用一个或多个经化学修饰以抵抗核酸酶降解的外部引物扩增cDNA分子。在一些实施方案中,一个或多个外部引物经化学修饰以包括硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,在连接步骤之后使cDNA分子与5'-核酸外切酶接触。5'-核酸外切酶可消化和降解两端不含化学修饰的外部引物的任何分子。在一些实施方案中,cDNA分子在扩增和连接cDNA分子之前从固体载体释放。
在一些实施方案中,单细胞是免疫系统细胞,诸如B细胞、记忆B细胞、活化B细胞、前体(blasting)B细胞、浆细胞、浆母细胞、T细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。
在一些实施方案中,mRNA分子编码重链可变区和轻链可变区。
在某些实施方案中,cDNA分子编码重链可变区和轻链可变区的同源对。在一些实施方案中,cDNA分子编码T细胞受体α链和β链的同源对。
在一些实施方案中,第一容器和/或第二容器包括分隔物、乳液中的水性液滴、微泡、管或多孔板中的孔。
在一些实施方案中,液滴的直径为2至500微米。
在一些实施方案中,所述方法还包括在步骤(ii)之后消化mRNA。在一些实施方案中,在第一容器中或在步骤(ii)与(iii)之间消化mRNA。
在另一个方面,描述了一种用于产生连接的核酸分子文库的方法,所述方法包括:
a)在多个第一容器中分离多个单细胞,其中第一容器包含单细胞;
b)在第一容器中裂解单细胞以释放mRNA分子;
c)在第一容器中将mRNA分子逆转录以产生来源于单细胞的cDNA分子;
d)在第二容器中连接来自步骤(c)的cDNA分子;
e)合并来自步骤(d)的连接的cDNA分子以产生连接的核酸分子文库。
在一些实施方案中,步骤(d)包括通过重叠延伸PCR扩增和连接cDNA分子。在一些实施方案中,重叠延伸PCR包括使用一个或多个包含生物素标签的内部引物扩增cDNA分子。在一些实施方案中,包含生物素标签的cDNA分子在步骤(d)之后去除。在一些实施方案中,重叠延伸PCR包括使用一个或多个经化学修饰以抵抗核酸酶降解的外部引物扩增cDNA分子。在一些实施方案中,一个或多个外部引物经化学修饰以包括硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,在步骤(d)之后使cDNA分子与5'-核酸外切酶接触。
在一些实施方案中,单细胞是B细胞,并且与在同一容器中执行步骤(c)和(d)的方法相比,与文库中的同源轻链可变区正确配对的重链可变区的百分比增加。
在一些实施方案中,单细胞是T细胞,并且与在同一容器中执行步骤(c)和(d)的方法相比,与文库中的同源T细胞受体β链正确配对的T细胞受体α链的百分比增加。
在一些实施方案中,单细胞是NKT细胞,并且与在同一容器中执行步骤(c)和(d)的方法相比,与文库中的同源T细胞受体β链正确配对的T细胞受体α链的百分比增加。
在另一个方面,描述了一种用于从单细胞产生两个或更多个连接的核酸分子的方法,所述方法包括:
(i)在第一容器中分离单细胞,并且裂解单细胞以释放mRNA分子;
(ii)将mRNA分子与附接至固体载体的捕获寡核苷酸杂交,其中捕获寡核苷酸包含与mRNA序列的一部分互补的序列;
(iii)在第一容器中将mRNA分子逆转录以产生附接至固体载体的cDNA分子;
(iv)在第二容器中连接来源于步骤(iii)的cDNA分子,
从而产生连接的核酸分子。
在一些实施方案中,步骤(iv)包括通过重叠延伸PCR扩增和连接cDNA分子。在一些实施方案中,重叠延伸PCR包括使用一个或多个包含生物素标签的内部引物扩增cDNA分子。在一些实施方案中,包含生物素标签的cDNA分子在步骤(iv)之后去除。在一些实施方案中,重叠延伸PCR包括使用一个或多个经化学修饰以抵抗核酸酶降解的外部引物扩增cDNA分子。在一些实施方案中,一个或多个外部引物经化学修饰以包括硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,在步骤(iv)之后使cDNA分子与5'-核酸外切酶接触。
在一些实施方案中,捕获寡核苷酸还包含位于固体载体和与mRNA序列的一部分互补的序列之间的接头。因此,当捕获寡核苷酸被逆转录酶延伸以产生cDNA时,cDNA共价附接至捕获寡核苷酸,并且cDNA由此通过接头附接至固体载体的表面。
在本文所述实施方案中的任一项中,可裂解接头,从而在将cDNA分子扩增和连接成单个扩增子的步骤之前从固体载体释放cDNA分子。
在本文所述实施方案中的任一项中,连接cDNA分子可包括通过重叠延伸PCR扩增和连接cDNA分子。在一些实施方案中,重叠延伸PCR包括使用一个或多个包含生物素标签的内部引物扩增cDNA分子。在一些实施方案中,在重叠延伸PCR步骤之后去除包含生物素标签的分子。可通过例如以下步骤去除包含生物素标签的分子:使分子与连接至固体载体(诸如珠粒或磁珠粒)的链霉亲和素接触,以及将结合至链霉亲和素的包含生物素标签的分子与不包含生物素标签的未结合分子分离。在一些实施方案中,重叠延伸PCR包括使用一个或多个经化学修饰以抵抗核酸酶降解的外部引物扩增cDNA分子。在一些实施方案中,一个或多个外部引物经化学修饰以包括硫代磷酸酯键。在一些实施方案中,在重叠延伸PCR步骤之后使cDNA分子与5'-核酸外切酶接触,以消化和降解两端不含化学修饰的外部引物的分子。在进一步扩增之前去除包含生物素标签的分子和/或降解非连接的单链分子提供了增加最终连接的产物的产量和正确配对的优点。
附图说明
图1示出了当前最新技术(state of the art)方法和本公开的两个实施方案的示意图。在所有三种情况下,步骤1涉及在容器内裂解细胞,然后将mRNA模板与捕获珠粒杂交。在当前最新技术方法的情况下,mRNA模板在步骤2期间保持与捕获珠粒杂交。在步骤3中,破坏乳液并洗涤珠粒。在这个阶段,一些mRNA模板经常从珠粒中丢失,在珠粒之间混编,或者从另一个容器的内容物中被随机捕获。在步骤4中,将珠粒重新封装在第二容器中,然后逆转录成cDNA,并且可实现靶cDNA之间的扩增和连接。在本公开的一个实施方案中,步骤2涉及将mRNA靶标直接逆转录到捕获珠粒上,然后消化原始mRNA模板。在步骤3中,从其容器中提取珠粒并进行洗涤,没有丢失cDNA靶标的风险,因为它们与珠粒共价结合。在步骤4中,将珠粒重新封装到二级容器中,可在所述第二容器中扩增cDNA,并将所需产物以单个扩增子的形式连接在一起。在本公开的一个替代实施方案中,步骤2涉及直接在捕获珠粒上将mRNA靶标逆转录成cDNA。在步骤3中,从容器中提取珠粒,洗涤,并且消化掉mRNA模板。没有丢失cDNA靶标的风险,因为cDNA靶标与珠粒共价结合。在步骤4中,将珠粒重新封装到二级容器中,可在所述第二容器中扩增cDNA,并将所需产物以单个扩增子的形式连接在一起。
图2示出了具有呈用于液滴形成的流聚焦构造的油输入通道和以下水性输入通道的微流体液滴芯片的示意图:(1)在悬浮缓冲液中的细胞和(2)在裂解/逆转录(RT)混合物中的捕获珠粒。通过在不同的微流体通道中合并或拆分各种组分(细胞、珠粒、裂解混合物、RT混合物),多个不同的实施方案是可能的,所述微流体通道全部会聚以按比率合并它们的组分,以构成液滴中所需的最终混合物。如泊松分布(Poisson distribution)所述,将条形码化珠粒和细胞装载到水性液滴中。每个液滴的珠粒和每个液滴的细胞的平均值(λ)随着这些组分在其输入流中的浓度而变化。液滴是发生细胞裂解和逆转录反应的反应容器。
图3示出了将捕获DNA寡核苷酸与固体载体缀合的代表性连接策略。无铜点击化学方法使用叠氮化物修饰的寡核苷酸和DBCO官能化的固体载体。在羧基-胺偶联中,胺修饰的寡核苷酸与羧酸官能化的固体载体缀合。还可通过将生物素化的寡核苷酸与已用链霉亲和素分子修饰的固体载体偶联来实现非共价但牢固的键。
具体实施方式
术语
术语“来源于”是指直接或间接由另一种分子产生的化合物或分子。术语“来源于单细胞”是指直接从单细胞分离的分子,或由分离自单细胞的分子合成的分子。如果从单细胞分离的分子是核酸分子,则所述术语包括包含与分离的核酸分子互补或反向互补的序列的分子。例如,如果cDNA是由分离自单细胞的mRNA模板分子合成的,则cDNA分子来源于单细胞。
术语“固体载体”是指包含适于将核酸结合或附接至其上的固体表面的组合物。
术语“多核苷酸”和“核酸”是指DNA分子和RNA分子及其类似物(例如,使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA或RNA)。根据需要,可例如使用本领域公认的核酸化学合成制备多核苷酸,或者使用例如聚合酶酶促制备多核苷酸,并且如果需要,则可对多核苷酸进行修饰。典型的修饰包括甲基化、生物素化和其他的本领域已知的修饰。此外,多核苷酸可以是单链的或双链的,并且在需要时连接至可检测部分。在一些方面,多核苷酸可包括例如包含DNA和RNA的杂合分子。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而,应当理解,术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可指修饰的核苷酸或替代置换部分。本领域技术人员很清楚,鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可被其他部分置换而基本上不改变包含携带此种置换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如但不限于,包含肌苷作为其碱基的核苷酸可与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此,含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可在核苷酸序列中被含有例如肌苷的核苷酸置换。在另一个实例中,寡核苷酸中任何位置处的腺嘌呤和胞嘧啶可分别被鸟嘌呤和尿嘧啶置换以与靶mRNA形成G-U摆动碱基配对。含有此类置换部分的序列适用于本文所述的组合物和方法。
如本文所用,并且除非另有说明,否则如技术人员所理解,术语“互补”在用于描述与第二核苷酸序列有关的第一核苷酸序列时,是指包含第一核苷酸序列的多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力。此类条件例如可以是严格条件,其中严格条件可包括:400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA,50℃或70℃,12至16小时,然后洗涤。其他条件诸如生物体内可能遇到的生理学有关条件可适用。根据杂交核苷酸的最终应用,技术人员将能够确定最适合两个序列的互补性测试的一组条件。
互补序列包括包含第一核苷酸序列的多核苷酸的区域与包含第二核苷酸序列的多核苷酸的区域在一个或两个核苷酸序列的长度或所述长度的一部分上的碱基配对。此类序列在本文中可被称为彼此“互补”。然而,在第一序列被称为相对于本文中的第二序列“基本上互补”的情况下,这两个序列可以是互补的,或者它们可在碱基配对的区域内包括一个或多个,但通常不超过约5、4、3或2个错配碱基对。对于具有错配碱基对的两个序列,只要这两个核苷酸序列通过碱基配对彼此结合,就认为这两个序列“基本上互补”。
如本文所用,在满足关于其杂交能力的上述实施方案的范围内,“互补”序列还可包括非沃森-克里克(non-Watson-Crick)碱基对和/或由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对或完全由这些碱基对形成。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摆动或Hoogstein碱基配对。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中,术语“同一性”百分比是指,如使用下文所述的序列比对算法(例如,BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)之一或通过视觉检查所测量,在对于最大一致性进行比对和对齐时,具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。根据应用,“同一性”百分比可存在于被对比的序列的区域上,例如在功能结构域上,或可替代地,存在于待对比的两个序列的全长上。
对于序列比对,通常一个序列充当参考序列,与测试序列进行对比。当使用序列比对算法时,将测试序列和参考序列输入计算机中,必要时指定子序列坐标,并指定序列算法程序参数。序列比较算法随后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比对的序列的最佳对齐可例如通过以下方法进行:Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法;Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性对齐算法;Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的对于相似性方法的探索;通过这些算法的计算机化实现(在Wisconsin GeneticsSoftware Package,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过视觉检查(通常参见Ausubel等人,下文)进行。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法,其在Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述。用于执行BLAST分析的软件可通过美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站公开获得。
在一个或两个核苷酸序列的全长上,相同的序列包括包含第一核苷酸序列的多核苷酸与包含第二核苷酸序列的多核苷酸的100%同一性。此类序列在本文中可被称为相对于彼此“完全相同”。然而,在一些方面,在第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本上相同”的情况下,这两个序列可以是完全互补的,或者在比对时它们可以具有一个或多个错配的核苷酸。在一些方面,在第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本上相同”的情况下,这两个序列可以是完全互补的,或者它们可以与彼此至少约50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
本文中使用常规符号来描述核苷酸序列:单链核苷酸序列的左手端是5'-端;将双链核苷酸序列的左手方向称为5'-方向。将核苷酸的5'至3'添加至新生RNA转录物的方向称为转录方向。将具有与mRNA相同的序列的DNA链称为“编码链”;将具有与从所述DNA转录的mRNA相同的序列的DNA链上的并且位于RNA转录物5'端的5'的序列称为“上游序列”;将具有与RNA相同的序列的DNA链上的并且位于编码RNA转录物3'端的3'的序列称为“下游序列”。
术语“信使RNA”或“mRNA”是指不含内含子并且可翻译成多肽的RNA。
术语“cDNA”是指以单链或双链形式与mRNA互补或相同的DNA。
术语“扩增子”是指核酸扩增反应例如RT-PCR的扩增产物。
术语“杂交”是指与互补核酸的序列特异性非共价结合相互作用。杂交可发生在核酸序列的全部或一部分上。本领域技术人员将认识到,核酸双链体或杂合体的稳定性可由Tm确定。有关杂交条件的另外指导可参见:Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.,1989,6.3.1-6.3.6和Sambrook等人,Molecular Cloning,aLaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,第3卷。
如本文所用,“区域”是指多核苷酸的核苷酸序列的连续部分。本文描述的区域的实例包括鉴定区域和样品鉴定区域。在一些方面,多核苷酸可包括一个或多个区域。在一些方面,区域可偶联。在一些方面,区域可以可操作地偶联。在一些方面,区域可物理偶联。
如本文所用,“可变区”是指由重组事件产生的可变核苷酸序列,例如,它可包括从感兴趣的T细胞或B细胞(诸如活化T细胞或活化B细胞)分离的免疫球蛋白或T细胞受体序列的V、J和/或D区。
如本文所用,“B细胞可变免疫球蛋白区”是指从B细胞分离的可变免疫球蛋白核苷酸序列。例如,可变免疫球蛋白序列可包括从感兴趣的B细胞(诸如记忆B细胞、活化B细胞或浆母细胞)分离的免疫球蛋白序列的V、J和/或D区。
如本文所用,术语“天然对”或“同源对”是指编码由相同B细胞表达的重链和轻链可变区的免疫球蛋白基因,或编码由相同T细胞表达的α和β链的T细胞受体(TCR)基因。
如本文所用,“鉴定区域”是指可与第二相异核苷酸序列偶联以允许例如稍后鉴定所述第二核苷酸序列的第一核苷酸序列(例如,独特的条形码序列)。
如本文所用,“条形码”或“条形码序列”是指可与至少一个核苷酸序列偶联以允许例如稍后鉴定所述至少一个核苷酸序列的任何独特序列。
如本文所用,“免疫球蛋白区”是指来自抗体的一条或两条链(重链和轻链)的核苷酸序列的连续部分。
术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争以特异性结合靶抗原的片段,并且包括例如嵌合的、人源化的、完全人的和双特异性抗体。“抗体”是一种抗原结合蛋白。完整抗体通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链,但在一些情况下可包括更少的链,诸如骆驼中天然存在的抗体,其可仅包含重链。抗体可仅来源于单一来源,或者可以是“嵌合的”,即抗体的不同部分可来源于两种不同的抗体。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可在杂交瘤中通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解产生。除非另有说明,否则术语“抗体”除了包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外,还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白。此外,除非明确排除,否则抗体分别包括单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(有时在本文中称为“抗体缀合物”)及其片段。在一些实施方案中,所述术语还涵盖肽抗体。
术语“容器”是指适用于进行本文所述的分子生物学反应的封闭或部分封闭空间,并且包括分隔物、乳液中的水性液滴、微泡、管或多孔板中的孔。
术语“捕获寡核苷酸”是指包含与另一个核酸序列的至少一部分互补的核酸序列的寡核苷酸。例如,捕获寡核苷酸可包括与样品中存在的mRNA序列的至少一部分互补的序列。
术语“约”在本文中修饰数值时,涵盖本领域普通技术人员遇到的正常变化。因此,术语“约”包括所修饰数值的正负0.1%、0.5%、1.0%、2%、5%或10%的变化。本文所提供的所有范围包括端点以及端点到第一个有效数字之间的所有值。
用于连接转录物的方法
本文描述了用于连接来自细胞的转录物的方法,所述方法高度敏感并且几乎消除了使用本领域已知的当前方法发生的转录物丢失和错配的来源。这种高敏感度和增加的准确度是通过将mRNA模板逆转录成cDNA来实现的,所述cDNA共价附接至固体载体(例如捕获珠粒),而固体载体保留在其原始容器中。在一个方面,逆转录(RT)步骤在与扩增和连接步骤分开的容器中进行。在一些实施方案中,在固体载体离开第一容器之前通过消化破坏mRNA转录物。所述方法可出乎意料地增加后续PCR步骤的敏感度,并且因此只有存在于其原始容器中的序列被扩增并连接在一起。与现有方法相比,这一创新步骤的主要好处是显著提高了配对保真度和敏感度。例如,本发明人出乎意料地发现,与在从第一容器中取出固体载体之后且在将固体载体添加到第二容器之前进行RT步骤相比,或者与在将固体载体添加到第二容器之后执行RT步骤相比,在第一容器中执行逆转录步骤导致来源于同一细胞的连接的cDNA(例如,天然配对的cDNA)的百分比显著增加。所述方法还提供了第二种益处,即所述过程更稳健,并且可在从其原始容器中提取固体载体之后且在将它们添加到第二容器之前暂停。所述第二种益处提供了更大的工作流程灵活性的优点。
除非另有说明,否则本文所述的方法可包括本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。文献中充分解释了此类技术。参见例如,T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,当前添加);Green&Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版,2012);MethodsIn Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.);Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990);Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A和B卷(1992);Current Protocols in Molecular Biology(2002-;Wiley;Online ISBN:9780471142720;DOI:10.1002/04711142727);Current Protocols in Immunology(2001-;Wiley;Online ISBN:9780471142737;DOI:10.1002/0471142735)。
在一个方面,描述了用于产生两个或更多个连接的核酸分子的方法。本文所述的方法与本领域当前使用的方法的不同之处在于细胞裂解和逆转录反应是在第一容器(容器1)中使用与固体载体(诸如珠粒)缀合的oligo-dT引物执行的,从而产生与第一液滴中的固体载体共价连接的cDNA,而连接cDNA的PCR扩增反应在第二容器(容器2)中执行。本方法提供的优点包括(i)污染(例如,与来自其他容器的与固体载体结合的不同样品的转录物的交叉污染,导致连接的cDNA分子不再来源于同一样品)减少,因为cDNA与固体载体永久且共价地连接,和(ii)RT反应的敏感度增加。实施例提供了所述方法的代表性实施方案。在一个代表性实施方案中,所述方法的步骤包括将细胞单个包封到乳液液滴中,细胞的液滴内裂解,逆转录以产生cDNA,将cDNA掺入液滴2中,以及在液滴2中进行PCR以将cDNA分子连接在一起。在一些实施方案中,连接的cDNA分子编码来源于单细胞的免疫球蛋白重链和轻链。
在一些实施方案中,核酸分子最初存在于生物样品诸如细胞中。在一些实施方案中,核酸分子编码免疫系统蛋白,诸如IgG重链和轻链可变区或T细胞受体α和β链。在一些实施方案中,核酸分子编码IgG重链和轻链可变区或T细胞受体α和β链的天然对(也称为“同源对”)。
在一些实施方案中,所述方法包括(i)在第一容器中分离单细胞,并且裂解细胞以释放核酸分子,(ii)在第一容器中产生核酸分子的互补拷贝;以及(iii)在第二容器中连接核酸分子的互补拷贝,从而产生连接的核酸分子。在一些实施方案中,核酸分子是RNA分子。在一些实施方案中,核酸分子是信使RNA(mRNA)分子。
因此,在一些实施方案中,所述方法包括(i)在第一容器中分离单细胞,并且裂解细胞以释放mRNA分子,(ii)在第一容器中逆转录mRNA分子以产生cDNA分子;以及(iii)在第二容器中连接cDNA分子,从而产生连接的核酸分子。在一些实施方案中,所述方法的步骤按以下顺序发生:(i),然后是(ii),然后是(iii)。
在一些实施方案中,步骤(iii)中的cDNA分子来源于存在于单细胞中的mRNA分子。换句话说,当细胞被裂解时,存在于单细胞中的mRNA分子从单细胞中释放出来,并使用本领域已知的方法逆转录成cDNA。例如,可在促进寡核苷酸引物与mRNA中的互补序列杂交的条件下,使mRNA分子与包含与mRNA分子的一部分互补的核酸序列的寡核苷酸引物接触,并且可通过使mRNA/寡核苷酸异源双链体与具有逆转录酶活性的酶接触来延伸引物。
在一些实施方案中,第一容器包含一个或多个附接至寡核苷酸的固体载体,所述寡核苷酸包含与mRNA分子的一部分互补的序列。寡核苷酸可与mRNA分子的一部分的互补序列杂交,使得mRNA分子通过与互补序列结合而附接至寡核苷酸。在一些实施方案中,通过用逆转录酶延伸寡核苷酸来逆转录mRNA以产生cDNA分子,使得cDNA分子与固体载体共价连接。
在一些实施方案中,附接至固体载体的寡核苷酸起到与mRNA转录物杂交(即,“捕获”mRNA转录物,因此可替代地称为“捕获寡核苷酸”)的作用并用作初始逆转录反应的引物以将mRNA分子逆转录成cDNA分子(通过逆转录酶延伸寡核苷酸引物)。在一些实施方案中,接头位于固体载体表面与寡核苷酸之间,使得寡核苷酸通过接头间接附接至固体载体表面。在一些实施方案中,接头是可光裂解的接头。在一些实施方案中,接头可被紫外(UV)光裂解。
在第一容器中产生附接至cDNA分子的固体载体之后,将固体载体从第一容器中取出并转移到第二容器中。在一些实施方案中,可在从第一容器中取出固体载体之前用酶消化与cDNA杂交的mRNA模板。因此,在一些实施方案中,在从第一容器中取出固体载体之前破坏RNA模板。虽然不受理论的束缚,但在执行连接步骤之前破坏RNA模板可提供减少与来自其他容器的与固体载体结合的不同样品的转录物交叉污染,使得连接的cDNA分子不再来自同一样品的优点。在免疫球蛋白可变区的情况下,此种交叉污染会导致连接的cDNA不编码重链和轻链多肽的天然对(也称为同源对)。
在一些实施方案中,使用热稳定的RNA酶来消化RNA模板。在一些实施方案中,热稳定的RNA酶是RNA酶H。在一个实施方案中,热稳定的RNA酶在RT反应期间保持最低活性,然后升高温度以促进核糖核酸酶活性并广泛消化RNA模板。
在一些实施方案中,mRNA消化步骤在原始容器中执行。在一些实施方案中,mRNA消化步骤在从原始容器中提取固体载体之后且在将固体载体重新封装在第二容器中之前执行。在一些实施方案中,mRNA消化步骤在逆转录步骤之后执行。在一些实施方案中,mRNA消化步骤在逆转录步骤之后且在扩增和/或连接步骤之前进行。在一些实施方案中,mRNA转录物不是有意破坏的,而是在洗涤步骤期间持续存在并被封装在第二容器中。
在从第一容器中取出载体之后且在将它们添加到第二容器之前,可洗涤固体载体以去除细胞物质、RNA和酶。在将固体载体转移到第二容器之后,可物理连接cDNA分子。在一些实施方案中,在物理连接之前扩增cDNA分子。在一些实施方案中,例如通过使用重叠延伸聚合酶链式反应(PCR)(“oePCR”)在同一反应中扩增并物理连接cDNA分子。在一些实施方案中,通过将分子彼此接合,例如通过使分子与连接酶接触,物理连接cDNA分子。在一些实施方案中,通过使用吉布森反应(Gibson reaction)或一步PCR加连接反应的同源末端融合来物理连接cDNA分子。
在一些实施方案中,将来自第一容器的每个固体载体添加到不同的第二容器中,使得来自第一容器的一个或多个固体载体分散到一个或多个第二容器中,并且每个第二容器含有单个固体载体。因此,在一些实施方案中,将从第一容器中提取的一个或多个固体载体中的每一个在连接步骤之前添加到不同的(相异的)第二容器中,使得每个第二容器含有单个固体载体。
重叠PCR后去除单链片段以提高配对保真度
来自重叠-PCR步骤的单链片段的存在会干扰配对重链和轻链的后续扩增和克隆,从而导致重链和轻链的错配。在扩增前最小化单链片段可大大提高最终产物的产量和配对保真度。因此,在另一个方面,提供了一种方法,通过所述方法将非配对片段与正确配对的重叠产物区分开来,并从系统中去除。在一些实施方案中,所述方法包括在重叠-PCR反应期间引入差异引物。
在一些实施方案中,差异引物包括用于扩增单链的内部引物,但所述引物不存在于最终重叠-PCR产物中。在一些实施方案中,差异因子是可用于帮助去除重叠-PCR步骤留下的任何单链片段的标签。
例如,在一些实施方案中,内部引物可用5'分子标签诸如生物素标签进行修饰。链霉亲和素系统诸如磁性链霉亲和素珠粒可用于去除重叠-PCR反应后留下的任何含有生物素标签的DNA分子。因为正确配对的双重重链和轻链连接的重叠片段将不再含有生物素化的分子,因此所需的正确配对且连接的重链和轻链PCR片段将保留,而单链污染片段可用链霉亲和素珠粒去除。
可替代地,可修饰扩增最终重叠产物的外部引物以包括差异因子。在一些实施方案中,差异因子包括化学修饰。在一些实施方案中,例如当两个外部引物都存在于分子上时,可修饰外部引物以抵抗耗尽或降解。在一些实施方案中,外部引物可被化学修饰以抵抗核酸酶或5'-核酸外切酶降解。因此,在一些实施方案中,外部引物可通过包含锁碱基而被修饰以在主链中包括硫代磷酸酯键。连接的配对分子和单链分子的混合物可在进一步扩增之前用5'-核酸外切酶处理。因此,只有在两端都具有修饰的外部引物的分子(例如,连接的重链和轻链)才能抵抗核酸外切酶降解。在另一方面,仅含有一个修饰的外部引物的单链分子不会抵抗核酸外切酶降解,并且可在进一步扩增之前用5'-核酸外切酶消化,从而将它们从反应中去除以减少错配。
用于产生连接的核酸分子文库的方法
在另一个方面,所述方法产生连接的核酸分子文库。在一些实施方案中,所述方包括:
a)在多个第一容器中分离或分布多个单细胞,其中所述第一容器包含单细胞;
b)裂解单细胞以将mRNA分子释放到第一容器中;
c)在第一容器中将mRNA分子逆转录以产生cDNA分子;
d)在第二容器中连接cDNA分子;以及
e)合并连接的cDNA分子以产生连接的核酸分子文库。
在一些实施方案中,单细胞是B细胞,并且与在同一容器中执行逆转录和连接步骤的方法相比,与文库中的同源轻链可变区正确配对的重链可变区的百分比增加。
在一些实施方案中,单细胞是T细胞,并且与在同一容器中执行逆转录和连接步骤的方法相比,与文库中的同源T细胞受体β链正确配对的T细胞受体α链的百分比增加。
在一些实施方案中,单细胞是NKT细胞,并且与在同一容器中执行步骤(c)和(d)的方法相比,与文库中的同源T细胞受体β链正确配对的T细胞受体α链的百分比增加。
在一些实施方案中,在第二容器中的扩增(例如,PCR)步骤之前,附接至固体载体的cDNA分子从固体载体表面释放或裂解。本发明人出乎意料地发现,如果在执行将cDNA分子连接在一起形成单个扩增子的重叠延伸PCR之前从固体载体释放cDNA分子,则可提高产物的产量(例如,回收的重链和轻链对的数量)和产物纯度(例如,天然配对的重链与轻链的比例)。在一些实施方案中,与在不从固体载体表面释放cDNA分子的情况下执行扩增步骤的方法相比,产量增加至少5%、10%、15%或更多。在一些实施方案中,与在不从固体载体表面释放cDNA分子的情况下执行扩增步骤的方法相比,纯度增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%或更多。
在一些实施方案中,使用如本文所述的接头将封装在第二容器中的固体载体附接至cDNA分子。在一些实施方案中,在开始扩增(PCR)步骤之前裂解接头以释放cDNA分子。例如,在一些实施方案中,接头是可光裂解的接头,并且将接头暴露于包含能够裂解接头的波长的光,从而从固体载体表面释放cDNA分子。在一些实施方案中,将可光裂解的接头暴露于紫外(UV)光(365nM)一段适合裂解接头的时间段(例如,5-10分钟)。在裂解接头之后,可例如通过PCR扩增cDNA分子。
接头
可使用各种化学方法将寡核苷酸附接至固体载体。在一些实施方案中,使用与不同类型的珠粒相容的5'寡核苷酸修饰。5'寡核苷酸/珠粒修饰的代表性实例包括:生物素/链霉亲和素、巯基/NHS酯和叠氮化物/DBCO(点击化学)。在一些实施方案中,将伯胺添加到寡核苷酸,这允许与固体载体表面上的NHS酯反应。在一些实施方案中,氨基修饰的寡核苷酸可通过使用1-乙基=3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)的5'氨基修饰偶联至羧酸修饰的固体载体以形成酰胺键。用于将寡核苷酸偶联至固体载体的代表性方法在图3中示出。用于将寡核苷酸附接至固体载体的方法描述于“Strategies for AttachingOligonucleotides to Solid Supports”(Integrated DNA Technologi es,2014,v6)中。
条形码
在一些实施方案中,附接至固体载体的寡核苷酸包含鉴定序列,也称为核酸条形码,其可用于鉴定结合来自单细胞的mRNA的固体载体。合适的条形码的实例描述于PCT/US2012/000221(对应于US 2015/0133317)和PCT/US2014/072898(对应于US 2015/0329891)中,其以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中,附接至固体载体的寡核苷酸包含两个不同或两个相异的条形码序列。在一些实施方案中,一个(或第一)条形码序列鉴定从中分离出mRNA转录物的样品。在一些实施方案中,样品包含一个或多个细胞、或单细胞。因此,在一些实施方案中,第一条形码被称为“细胞条形码”。在一些实施方案中,另一个(或第二)条形码序列鉴定从样品诸如细胞中分离的转录物。因此,在一些实施方案中,第二条形码被称为“转录物条形码”。
在一些实施方案中,条形码序列包含8至32个核苷酸。在一些实施方案中,第一条形码序列和/或第二条形码序列包含8至16个核苷酸。在一些实施方案中,条形码序列包含16至32个核苷酸。
在一些实施方案中,固体载体通过接头或间隔子连接至寡核苷酸。在一些实施方案中,接头或间隔子包含5个或更多个核苷酸。
在一些实施方案中,附接至固体载体的寡核苷酸还包含poly-T序列。在一些实施方案中,poly-T序列包含10-25个核苷酸。
在一些实施方案中,附接至固体载体的寡核苷酸包含5个或更多个核苷酸的接头或间隔子、8至16个核苷酸的第一条形码序列或细胞条形码序列、8至16个核苷酸的第二条形码序列或转录物条形码序列和10-25个核苷酸的poly T序列。
文库
还提供了通过本文所述的方法产生的连接的扩增子文库。文库包含在第一容器中通过逆转录mRNA并在第二容器中扩增和连接扩增子而产生的物理连接的扩增子。在一些实施方案中,连接的扩增子来源于同一细胞,即它们是由通过在第一容器中逆转录来自同一细胞的mRNA而制备的cDNA所扩增的。
在一些实施方案中,文库包含编码来自B细胞的IgG重链和轻链序列的连接的扩增子。在一些实施方案中,文库包含编码来自单个或相同B细胞的IgG重链和轻链序列的连接的扩增子。在一些实施方案中,文库包含编码IgG重链和轻链序列的同源对的连接的扩增子。扩增子之间的接头可包括用于scFv抗体片段表达的接头或用于Fab抗体片段表达的恒定区序列。
在一些实施方案中,文库包含编码T细胞受体α和β链的连接的扩增子。在一些实施方案中,文库包含编码T细胞受体α和β链的同源对的连接的扩增子。在一些实施方案中,文库包含编码来自单个或相同T细胞的T细胞受体α和β链的连接的扩增子。
在一些实施方案中,不需要扩增的核酸序列的表达(例如,转录和/或翻译)。在这些实施方案中,接头可以是任何核苷酸链段,例如长度为15-30个核苷酸,而没有显著的二级结构。
容器
在一些实施方案中,第一容器和/或第二容器是管、多孔或微量滴定板中的孔、微孔或纳米孔板中的孔、分隔物、液滴或纳米液滴或微泡。在一些实施方案中,第一容器和/或第二容器是油乳液中的水性液滴。
在一些实施方案中,液滴的直径为约2微米至约500微米,或介于两者之间的任何值。例如,在一些实施方案中,液滴的直径为约2至约450微米、约2至约400微米、约2至约350微米、约2至约300微米、约2至约250微米、约2至约200微米、约2至约150微米、约2至约100微米、约2至约50微米;约2至约20微米;约5至约500微米、约5至约450微米、约5至约400微米、约5至约350微米、约5至约300微米、约5至约250微米、约5至约200微米、约5至约150微米、约5至约100微米、约5至约50微米、约5至约20微米;约10至约500微米、约10至约450微米、约10至约400微米、约10至约350微米、约10至约300微米、约10至约250微米、约10至约200微米、约10至约150微米、约10至约100微米、约10至约50微米;或约20至约500微米、约30至约500微米、约40至约500微米、约50至约500微米、约60至约500微米、约70至约500微米、约80至约500微米、约90至约500微米、约100至约500微米、约200至约500微米、约300至约500微米或约400至约500微米。在一些实施方案中,液滴的直径为约2微米至约10微米,例如约2微米至约5微米。
在一些实施方案中,第一容器和第二容器是水性液滴。在一些实施方案中,第一液滴的直径与第二液滴的直径相同或相似。在一些实施方案中,第一液滴的直径与第二液滴的直径不同。
固体载体
在一些实施方案中,第一容器包含一个或多个附接至寡核苷酸的固体载体,所述寡核苷酸包含与mRNA分子的一部分互补的序列。在一些实施方案中,mRNA分子通过与互补序列结合而附接至寡核苷酸。在一些实施方案中,固体载体是珠粒、磁珠粒、琼脂糖珠粒或粒子。附接至包含与mRNA分子的一部分互补的序列的寡核苷酸的珠粒或粒子在本文中有时称为“捕获珠粒”。虽然术语“珠粒”可用于描述本文的实施方案,但应理解术语固体载体可与术语珠粒互换使用。
在一些实施方案中,将附接至寡核苷酸的mRNA逆转录成cDNA。在一些实施方案中,CDNA共价连接至固体载体。
在一些实施方案中,第一容器中存在1至20个固体载体(例如,第一容器中存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个固体载体)。在一些实施方案中,第一容器中存在平均3、4、5或6个固体载体。
在一些实施方案中,固体载体是直径为1至20微米、或直径为5至10微米、或平均直径为5至10微米的球形粒子。在一些实施方案中,固体载体是直径为1至20微米、或直径为5至10微米、或平均直径为5至10微米的珠粒。
用于将核酸和寡核苷酸附接或缀合至固体载体的方法是本领域已知的,并且包括氨基寡核苷酸缀合至包含N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯配体的固体载体,其中用与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)官能团反应以形成稳定酰胺键联的伯氨基修饰寡核苷酸。常用策略的其他实例包括但不限于将生物素化的寡核苷酸缀合至链霉亲和素官能化的固体载体,以及将硫醇化的寡核苷酸缀合至金固体载体或马来酰亚胺官能化的载体。
微流体系统
在一些实施方案中,微流体系统用于产生油包水液滴,所述液滴用于用进行细胞裂解和逆转录反应所需的mRNA捕获珠粒和其他分子生物学组分来隔离细胞。图2示出了一个系统的代表性实例,即液滴装置,其先前描述于美国专利申请号14/586,857(US20150329891;现为美国专利号9,580,736)中,所述专利以引用的方式并入本文。所述装置将细胞悬浮液、珠粒悬浮液和细胞裂解混合物/RT混合物的水性流接合在与流聚焦油通道的连接处,所述流聚焦油通道以规则的间隔断开接近均匀体积的水性液滴。这种单分散的液滴组通过油相保持彼此分离,所述油相还包含稳定单个液滴并防止它们在任何显著程度上接合或交换其内容物的表面活性剂。因此,每个液滴都包含一个容器,可在所述容器中在不受周围液滴影响的情况下进行裂解和逆转录。对于给定的液滴大小,每个液滴的细胞和条形码化珠粒的平均数量可通过调整这些组分在其各自的水性输入流中的浓度来调整。用于在微流体装置上产生液滴的油和表面活性剂系统有多种选择。在一些实施方案中,油相包含在HFE-7500氟化油(3M,St.Paul,MN)中的2%含氟表面活性剂(RAN Biotechnologies,Beverly,MA)。
本领域普通技术人员将理解,本文所述的方法可与任何数量的不同油/表面活性剂系统一起使用,只要它们促进足够的液滴稳定性和与所涉及的分子生物学的相容性。典型的油系统包括氟化油、矿物油和硅油,并且其中任一种都可能用于乳化步骤中的任一种。
样品
本文所述的方法可应用于包含细胞的生物样品。本文所述的方法可用于涉及接合来自任何给定单细胞群的多个转录组靶标的任何应用。所述方法可用于来自不同生物组织的许多不同细胞类型。细胞可从哺乳动物分离,所述哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、伴侣动物(诸如猫和狗)、农场动物(诸如牛、猪和马)以及人。在一些实施方案中,将细胞分选成单个单细胞。例如,可使用流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS)或洗淘分离法(panning)对单个单细胞进行分选。在一些实施方案中,将单细胞添加到本文所述的容器诸如油包水液滴中。
在一些实施方案中,样品包含单个免疫细胞,诸如单个B细胞或单个T细胞(T淋巴细胞)。B细胞包括例如活化B细胞、前体B细胞、浆细胞、浆母细胞、记忆B细胞、B1细胞、B2细胞、边缘区B细胞和滤泡B细胞。T细胞(T淋巴细胞)包括例如表达T细胞受体的细胞。T细胞包括活化T细胞、前体T细胞、辅助T细胞(效应T细胞或Th细胞)、细胞毒性T细胞(CTL)、记忆T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞和调节性T细胞。在一些实施方案中,样品包括自然杀伤T(NKT)细胞。
在一些实施方案中,B细胞是直径为约8-20μm(例如,直径为约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20μm)的活化B细胞。在一些方面,活化B细胞的面积为约60、70、80、90、100、120、130、140、150、200、250、300、350或大于350μm2。在一些方面,活化B细胞的体积为约250、268、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或大于4000μm3。在一些方面,活化B细胞的直径大小比对照静息B细胞的中值直径大10%或更大、15%或更大、或20%或更大。在一些方面,活化B细胞能够分泌免疫球蛋白。在一些方面,通过流式细胞术,B细胞的前向散射(FSC)大于静息B淋巴细胞的FSC平均值的1.2倍。在一些方面,通过流式细胞术,B细胞的FSC平均值在人单核细胞的FSC平均值的0.7-1.15倍之间。在一些方面,B细胞是CD19阳性B细胞、CD38阳性B细胞、CD27阳性B细胞或CD20阴性B细胞。在一些方面,B细胞是CD19+CD20-CD27+CD38hi B细胞。
可通过流式细胞术从血液、大量外周血单核细胞(PBMC)、大量B细胞、浆母细胞、浆细胞、记忆B细胞或其他B细胞群中分选单个B细胞。
在US 2015/0133317中描述了用于将B细胞分选成单细胞的方法。简而言之,可将血液收集在肝素管(Beckton Dickinson and Company,目录号BD366664)或CPT管(BecktonDickinson and Company,目录BD362761)管中。在一种用于处理肝素管的代表性方法中,将一毫升血液转移到微量离心管中并以12,000rpm离心沉淀3分钟,收集血浆并在-80℃下冷冻(用于稍后测试抗体反应性),剩余的血液可在Ficoll上分层并在室温下在带有SX4750摆动桶转子的Beckman Coulter Allegra X-15R台式离心机中以800g(对于肝素管)离心20min,其中使用最小加速度且不使用制动器,并且收集外周血单核细胞(PBMC)层。可替代地,可在室温下以1,500g直接离心CPT管20min,其中使用最小加速度且不使用制动器,并且收集PMBC层。收集的PB MC在使用前可用PBS洗涤两次。
细胞和细胞亚群的分离和富集
浆母细胞。对于一些样品,可通过使用改良的浆细胞分离试剂盒II(Miltenyi130-093-628)富集PBMC以获得浆母细胞。
记忆B细胞。CD19+微珠(Miltenyi 130-050-301)和CD27+微珠(130-051-601)可用于在细胞分选之前富集记忆B细胞,以缩短分选时间。也可使用其他富集方法,诸如记忆B细胞分离试剂盒(Miltenyi 130-093-546),条件是它们富集CD19+CD27+细胞。
总B细胞。CD19+微珠(Miltenyi 130-050-301)可用于在细胞分选之前富集总B细胞,例如以缩短分选时间。也可使用其他富集方法来富集CD19+细胞。
其他细胞类型。所需细胞群的MACS富集可缩短分选时间。其他细胞群,包括浆细胞、其他B细胞群和非B细胞群也可使用MACS或其他使用适当试剂的系统进行富集。例如,可使用CD3+微珠富集总T细胞,并分别使用CD8+和CD4+微珠分离效应T细胞和辅助T细胞。CD45RO微珠可用于分离记忆T细胞,并与CD8+或CD4+珠粒结合使用,分别用于分离记忆效应T细胞或记忆辅助T细胞。
单细胞分选
分选不需要MACS富集,但可执行浆母细胞的MACS富集以缩短分选时间。如果对PBMC进行了MACS富集,则还可对未富集的PBMC(约100万个细胞)的等分试样进行串联分析,从而允许确定样品中的基线浆母细胞百分比。为了分选浆母细胞,可将细胞用在50μL FACS缓冲液(含有2%FBS的PBS或HBSS)中的制造商推荐体积的CD3-V450(BD 560365)、IgA-FITC(AbD Serotec STAR142F)、IgM-FITC(AbD Serotec STAR146F)或Ig M-PE(AbD SerotecSTAR146PE)、CD20-PerCP-Cy5.5(BD 340955)、CD38-PE-Cy7(BD 335808)、CD19-APC(BD340437)和CD27-APC-H7(BD 560222)在黑暗中在冰上染色20分钟。一些细胞也可用IgG-PE(BD 555787)、CD138-PE(eBioscience 12-1389-42)或HLA-DR-PE(BD 555812)与IgM-FITC一起染色。对于浆母细胞、记忆和初始B细胞的同时分选,可使用以下染色方案:IgD-FITC(Biolegend 348205)、IgG-PE(BD 555787)、CD20-PerCP-Cy5.5、CD38-PECy7、IgM-APC(BD551062)、CD27-APC-H7、IgA-生物素(AbD Serotec 205008),然后是链霉亲和素-eFluor710(eBioscience 49-4317-82)和CD19-BV421(Biolegend 302233)。记忆B细胞可分选为CD19+CD27+IgG+或CD19+CD20+IgG+,初始B细胞可分选为CD19+IgD+IgM+。IgA+浆母细胞定义为CD19+CD20-CD27+CD38++IgA+IgM-。也可使用其他细胞表面标志物,只要B细胞或其他细胞群可使用细胞表面标志物进行表型鉴定,就可对群进行单细胞分选。然后可将细胞用2mL的FACS缓冲液洗涤一次,并且以对于FACS的适当体积进行重悬。细胞可首先在BD Aria II上分选到5mL圆底管中。通常,从第一分选中获得>80%的纯度。对于IgG+浆母细胞,门控(细胞选择)策略可包括对标志物CD19+CD20-CD27+CD38++IgA-IgM-进行分选。可将分选的板用铝板密封剂(Axygen PCR-AS-600)密封,并立即在干冰上冷冻并储存在-80℃下。
单细胞分选门控策略。
B细胞。对于B细胞,门控方法可包括对以下标志物中的一种或多种进行分选:IgM、IgG、IgA、IgD、CD19或CD20。对于总IgG+B细胞,门控方法可包括对IgG+进行分选。对于总IgA+B细胞,门控方法可包括对IgA+进行分选。对于总IgM+B细胞,门控方法可包括对IgM+进行分选。
活化B细胞。活化B细胞包括已通过它们的膜抗原受体与其同源抗原的结合而受到刺激和/或已接受来自鉴定来源于相同大分子抗原的表位的T细胞的T细胞辅助的B细胞。活化B细胞可通过多种特性来鉴定,包括增加的细胞大小(例如“前体B细胞”;见下文),一个或多个细胞表面标志物的表达,一个或多个细胞内标志物的表达,一个或多个转录因子的表达,退出细胞周期的间隙0(G0)期,进展通过细胞周期,细胞因子或其他因子的产生,和/或某个或某些细胞表面标志物、某个或某些细胞内标志物、转录因子或其他因子的下调。一种鉴定活化B细胞的方法是将B细胞标志物(诸如CD19或免疫球蛋白)的检测与活化标志物(诸如增加的细胞大小或体积)、细胞表面活化标志物CD69或基于细胞渗透性吖啶橙DNA染色或另一种细胞周期分析的进展通过细胞周期进行组合。
前体B细胞。“前体B细胞”是相对于静息B细胞被激活且大小增加的B细胞。前体B细胞包括浆母细胞群以及其他活化B细胞群,并且前体B细胞在物理大小上比静息B细胞大。前体B细胞可使用几种不同的方法进行单细胞分选,所述方法包括对基于细胞直径、细胞体积、电阻抗、FSC、FSC脉冲的积分(面积)(FSC-A)、FSC高度(FSC-H)、前向散射脉冲宽度(FCS-W)、侧散射(SSC)、侧散射脉冲面积(SSC-A)、侧散射高度(SSC-H)、侧散射宽度(SSC-W)、自发荧光和/或细胞大小的其他量度在物理上更大的B细胞进行门控(分选)。
在流式细胞术中,前向散射(FSC)使用与细胞流一致的光束进行测量,并提供有关每个细胞的成比例的大小和直径的信息。使用FSC可选择FSC大于静息B细胞中值FSC的B细胞,例如FSC-A或FSC-H比静息B细胞大5%、比静息B细胞大10%、比静息B细胞大15%、比静息B细胞大20%、比静息B细胞大30%、比静息B细胞大40%、比静息B细胞大50%、比静息B细胞大60%。通过分析特定大小的校准珠粒,可使用FSC确定B细胞相对于校准珠粒的相对大小。通过这样做,可特异性地门通并由此选择直径为约8um、>8um、>9um、>10um、>11um、>12um、>13um、>14um、>15um、>16um、>17um、>18um、>19um或>20um的B细胞。
细胞大小的另一种测量是细胞体积。细胞体积的“黄金标准”使用基于电子测量的Coulter原理(Tzur等人,PLoS ONE,6(1):e16053.doi:10.1371/jour nal.pone.0016053,2011)。虽然通过液滴充电和偏转进行分选的方法首先用于通过阻抗测量细胞体积的装置中,但目前可用的流式细胞仪仅进行光学测量。FSC测量,特别是FSC-A(FSC积分面积)通常用于评估细胞大小,尽管FSC测量可能会受到粒子与流体之间折射率差异的影响(Tzur等人,PLoS ONE,6(1):e16053.doi:10.1371/journal.pone.0016053,2011)。一些人已经表明,可通过组合光学参数来改进体积估计,所述参数包括FSC-W、SSC和450/50-A自荧光(Tzur等人,PLoS ONE,6(1):e16053.doi:10.1371/journal.pon e.0016053,2011)。
例如,可通过使用诸如CD19的标志物鉴定B细胞并通过FSC或FSC-A评估大小来实现基于增加的大小选择活化B细胞。本文描述了用于评估大小的其他B细胞标志物和/或参数。
浆母细胞。对于浆母细胞的分离,门控方法可包括对CD19+CD38++B细胞进行分选。对于IgG+浆母细胞的分离,门控方法可包括对CD19+CD38++IgA-IgM-B细胞进行分选。对于IgA+浆母细胞的分离,门控方法可包括对CD19+CD38++IgA+B细胞进行分选。对于IgM+浆母细胞的分离,门控方法可包括对CD19+CD38++IgM+B细胞进行分选。此外,其他门控策略可用于分离足够数量的浆母细胞以进行本文所述的方法。浆母细胞也可使用以下标志物表达模式CD19低/+、CD20低/-、CD27+和CD38++进行分离。尽管使用所有这些标志物通常会从单细胞分选中得到最纯的浆母细胞群,但并不需要使用所有上述标志物用。例如,浆母细胞也可使用以下门控策略进行分离:大细胞的前向散射高(FSChi)、FSChiCD19lo细胞、FSChi和CD27+、CD38++或CD20-细胞。这些标志物中的任一种或其他被发现能够将浆母细胞与其他B细胞区分开来的标志物的组合通常会增加分选的浆母细胞的纯度,但是上述标志物中的任一种单独(包括FSChi)就可将浆母细胞与其他B细胞区分开来,尽管纯度较低。
记忆B细胞。对于IgG+记忆B细胞,门控方法可包括对CD19+CD27+IgG+或CD19+CD20+IgG+进行分选。对于IgA+记忆B细胞,门控策略可包括CD19+CD27+IgA+或CD19+CD20+IgA+。对于IgM+记忆B细胞,门控策略可包括CD19+CD27+IgM+或CD19+CD20+IgM+。
其他细胞类型。只要B细胞、T细胞或其他细胞群可使用细胞标志物进行表型鉴定,就可对所述群进行单细胞分选。例如,T细胞可被鉴定为CD3+或TCR+,初始T细胞被鉴定为CD3+CD45RA+,记忆T细胞被鉴定为CD3+CD45RO+。效应T细胞和辅助T细胞可分别被鉴定为CD3+CD8+和CD3+CD4+。可通过使用标志物的组合(诸如记忆辅助T细胞的CD3+CD4+CD45RO+)进一步细分细胞群。
实施例
提供的实施例仅用于说明目的,并不旨在以任何方式限制本发明的任何实施方案的范围。已经努力确保关于所使用的数值(例如用量、温度等)的准确度,但也应考虑一些实验误差和偏差。
实施例1
此实施例描述了本文所述方法的代表性实施方案。
在第一液滴(液滴1)中,细胞被单个封装,每个液滴一(1)个细胞,并且液滴通常含有大于10个mRNA捕获珠粒/液滴。液滴中的细胞被裂解,并且在液滴1中发生逆转录反应。RT反应包括将poly-A RNA与oligo-dT缀合的珠粒临时杂交。然后通过oligo dT引物的引物延伸进行cDNA合成,从而产生与液滴1中的捕获珠粒共价连接的cDNA。与cDNA杂交的RNA在液滴1中被酶促消化破坏,并且因此RNA没有从液滴1中分离出来。液滴1破裂,并洗涤珠粒。从液滴1中分离出来的洗涤的珠粒不含来自裂解细胞的大量细胞物质,包括RNA。
然后将包含共价连接的cDNA的分离的珠粒以1个或更少珠粒/液滴的浓度掺入第二液滴(液滴2)中。执行PCR反应以连接重链和轻链cDNA,并从珠粒中释放连接的重链和轻链cDNA。
实施例2
此实施例描述了本文所述方法的代表性实施方案。
液滴1中的逆转录(RT)
材料:
RT反应试剂:Invitrogen SuperScript IV RT(参考号18090050),dNTP,1M DTT,BSA,Ribolock,Tween-20,NEB RNA酶H(目录号M0523S);Oligo d(T)25珠粒(NEB,目录号S1419S);1x珠粒洗涤缓冲液(BWB):5mM Tris-HCl(pH 7.5),0.5mM EDTA,1M NaCl;PBS;Optiprep(Sigma,目录号D1556);FC40 5%Ran;塑料:联管(Striptube),1.5mL微量离心管;Mushroom磁铁;ZeroStat Milty抗静电枪。
RT反应混合物。
1.制造RT主混合物:
SSIV RT | 储备液浓度 | 最终浓度 | 300uL | ||
SSIV RT缓冲液 | 5 | x | 2 | x | 120.0 |
dNTP | 10 | mM | 1 | mM | 30.0 |
DTT | 1000 | mM | 10 | mM | 3.0 |
BSA | 20 | mg/mL | 1 | mg/mL | 15.0 |
Ribolock | 40 | U/uL | 0.5 | U/uL | 3.8 |
SSIV RT酶 | 200 | U/uL | 20 | U/uL | 30.0 |
RNA酶H | 5 | U/uL | 0.05 | U/uL | 3.0 |
Tween-20 | 20 | % | 1 | % | 15.0 |
水 | 80.3 |
2.将FACS分选细胞的小瓶解冻。
3.将细胞用20%optiprep在PBS中以1x10^6个细胞/mL(或1000个细胞/uL)重悬,浓缩并分成100uL等分试样。
4.取45uL(足够1mL中的1x106个细胞)的OdT珠粒放入1.5mL管中,并将管放置在磁铁上。吸出储存缓冲液并用500uL的BWB洗涤一次。再次放置在磁铁上并重悬于300uL的PBS中。计算运行所需的珠粒体积:例如对于300,000个细胞,300uL/1,000,000个细胞*300,000个细胞=90uL。
5.在正确体积的RT反应主混合物(“mmix”;与细胞体积相同)中重悬OdT珠粒并分成100uL等分试样。
6.继续运行样品通过液滴机。
液滴1形成:
功能性液滴装置的一个实例在图2中示出。除非另有说明,否则列出的所有零件编号均指IDEX Health&Science(Oak Harbor,WA)零件。A.01和B.01连接至压力泵,在所述压力泵中,A.01储液罐填充有含有2%RAN含氟表面活性剂的HFE-7500氟化油,并且B.01储液罐填充有水。B.11连接至注射泵。
7.使用注射泵将细胞悬浮液和RT/裂解/珠粒悬浮液分别加载到液滴装置的两个储液罐中,以将样品吸入样品环路。在B.15中推进液与样品之间保持1cm的气隙。
8.A.10和B.15连接至100um蚀刻深度的氟化2R芯片(Dolomite零件号3200510)
9.对于每条水线(B.15)以15uL/min的流速运行样品,并且对于油线(A.10)以180uL/min的流速运行样品。
10.将乳液收集在保持在冰上的15mL锥形管中。
液滴1清洗和RT/RNA酶H孵育:
11.设置两个1.5mL管,每个管中500uL的5%RanFC40。
12.使用宽口径尖端来处理乳液,并且在尖端上使用抗静电枪(ZeroStat Milty)来防止乳液剪切。
13.从15mL Falcon中收集乳液并用5%Ran吸入其中一个管中。从管底吸出一些5%Ran并用它轻轻洗涤乳液。重复。
14.将乳液从第一个洗涤管收集到另一个洗涤管并再次洗涤。
15.将洗涤的乳液收集到联管中,90uL/孔,并且放置在热循环仪上。
16.运行RT+RNA酶H热循环程序:55C 20min,65C 10min,80C 10min。
液滴2/PCR1:
所需材料:
锂裂解缓冲液:100mM Tris(pH 7.5),500mM LiCl,10mM EDTA,1%(重量/体积)十二烷基硫酸锂,5mM DTT。
洗涤缓冲液1:100mM Tris(pH 7.5),500mM LiCl,1mM EDTA。
洗涤缓冲液2:20mM Tris(pH 7.5),3mM MgCl,50mM KCl。
20mL油混合物:19010uL矿物油,900uL Span80,80uL Tween-80,10uL Triton X-100。
20%PFO。
KOD Xtreme热启动DNA聚合酶(Millipore,目录号71975)。
用于靶扩增子的正向和反向引物,诸如用于重链和轻链可变区的V和J基因引物。
IKA分散管+乳液分散设备
Zymo DNA清洁和浓缩试剂盒。
Dynabeads MyOne C1链霉亲和素珠粒(目录号65001,65002)。
2x珠粒洗涤缓冲液(BWB):10mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM EDTA,2MNaCl。
板/管:98孔板,1.5mL管。
RT产物洗涤和设置PCR1:
1.每天制备新鲜的锂裂解缓冲液。洗涤缓冲液1和2应每3-6个月新鲜制备。
2.制备新鲜的油混合物并放置在冰上。
3.制备PCR1反应混合物:
4.从联管中收集逆转录的乳液至新的1.5mL中并添加等体积的20%PFO(1:1比率)以打破乳液。
5.涡旋样品并以2000x g离心2min。
6.去除油层(底部)并测量水层(顶部),并将上清液转移到新管中。
7.将样品放置在磁铁上。
8.快速完成所有洗涤步骤并避免通过移液混合,以防止珠粒变粘并卡在移液器尖端内。
9.吸出上清液并添加100uL洗涤缓冲液1。通过移液混合(例外)并立即移至新管中。放置在磁铁上。
10.吸出上清液并添加100uL锂裂解缓冲液。不要将管从磁铁上取下。通过转动管进行混合:珠粒应当从管的一侧移到另一侧。如果珠粒看起来很粘,轻敲管侧面以帮助它们脱落。
11.吸出上清液并添加100uL洗涤缓冲液1并立即吸出。
12.再次添加100uL洗涤缓冲液1,并通过将管保持在磁铁上但转动它进行洗涤(如步骤10)。
13.吸出上清液并添加100uL洗涤缓冲液2,并通过将管保持在磁铁上但转动它进行洗涤(如步骤10)。
14.放置在磁铁上,吸出上清液,并且将200uL的PCR1 mmix添加到珠粒中。在冰上静置几分钟。通过上下移液重悬孔。
15.向样品中添加更多的PCR1 mmix,至多2.8mL
16.用9mL的冷油混合物填充IKA分散管,并将管附接至乳液分散设备。将装置设置为600rpm,并使用电子分散机将具有珠粒的PCR1 mmix逐滴分散到油中。每个样品需要5min来运行并制成乳液。
17.使用带有大口径或截止尖端的连续移液器,并将100uL乳液转移至96孔板的每个孔中。每个样品需要两个板。
18.将板放置在热循环仪上并运行名为“KOD xtreme phage PCR1”的KOD xtreme热循环程序:94℃2min;35个循环:94℃30s,60℃30s,68℃45s;68℃5min。
样品的PCR1后处理:
19.通过在通风橱中混合水和乙醚1:10(1mL水和9mL乙醚)来制备水合醚。将混合物涡旋并放置在冰上,并且静置约5min。只使用顶层。
20.将PCR1乳液从板中收集到1.5mL管中,不超过1mL/管。
21.以10,000x g离心管10min。
22.离心后,吸出顶部油层和底部的任何聚结物质。
23.估计管中乳液的体积并以1:1的比率添加水合醚(使用通风橱)。
24.继续在通风橱中工作,直到完成第一次Zymo清洗。
25.充分涡旋并以10,000x g再次离心10min。
26.将水层(底部)吸到新的1.5mL管中。测量体积。
27.用3x结合缓冲液Zymo清洁样品。按照Zymo SOP并在20uL(2x10uL)的10mM Tris中洗脱。
PCR2
材料:
Q5(NEB目录号M0493S/L)。
琼脂糖、SYBRSafe凝胶染料、TBE缓冲液
Qiagen MinElute凝胶回收试剂盒(目录号28006)
10mM Tris
塑料:1.5mL管、联管或96孔板
设置PCR2反应:
设置测试PCR2反应以确定每个样品的正确循环数:制备主混合物(总共25uL/循环),使用引物Fab-K/LF-R2-v1(池)和#1032,并使用1uL的PCR1产物作为模板。
运行13、17、21、25个循环。使用热循环程序:98℃30s;13/17/21/25个循环:98℃15s,62℃30s,72℃45s;72℃5min。
一旦完成PCR,在凝胶上运行5uL产物。
运行实际PCR2以使产物准备好用于测序的文库制备:制备主混合物,并使用2uLPCR1产物作为模板。
PCR完成后,将整个样品(50uL)加载到凝胶上。
通过使用Qiagen MinElute凝胶回收试剂盒凝胶回收样品。在20uL的10mM Tris中洗脱。
PCR2后:
可使用标准测序试剂盒和方法来连接用于NGS测序的衔接子。参见例如Rajan等人(2018),“Recombinant human B cell repertoires enable screeni ng for rare,specific,and natively paired antibodies.”Communications Biolo gy,1(1),5,和McDaniel等人(2016),“Ultra-high-throughput sequencing of the immune receptorrepertoire from millions of lymphocytes.”Nature Proto cols,11(3),429–442。
主混合物:
SSIV RT mmix | 储备液浓度 | 最终浓度 | 300uL | ||
SSIV RT缓冲液 | 5 | x | 2 | x | 120.0 |
dNTP | 10 | mM | 1 | mM | 30.0 |
DTT | 1000 | mM | 10 | mM | 3.0 |
BSA | 20 | mg/mL | 1 | mg/mL | 15.0 |
Ribolock | 40 | U/uL | 0.5 | U/uL | 3.8 |
SSIV RT酶 | 200 | U/uL | 20 | U/uL | 30.0 |
RNA酶H | 5 | U/uL | 0.05 | U/uL | 3.0 |
Tween-20 | 20 | % | 1 | % | 15.0 |
水 | 80.3 |
洗涤缓冲液2 | 储备液[浓度] | 最终[浓度] | 10mL |
Tris(pH 7.5) | 1M | 100mM | 1000.0 |
MgCl | 200mM | 3mM | 150.0 |
KCl | 3M | 50mM | 166.7 |
H2O | 8683.3 |
本领域普通技术人员将理解,可使用多种其他组分来提供相同的功能。替代组分可用作裂解剂、RT酶、RNA酶、引物序列和DNA聚合酶,以及其他组分。
实施例3
此实施例提供的实验数据表明,在与扩增和连接步骤分开的容器中执行逆转录步骤改进了扩增子的天然配对。
当在第一容器(液滴1)中、在第一容器与第二容器之间(在液滴1与2之间(B/w))或在第二容器(液滴2)中执行单细胞mRNA的逆转录(RT)时,进行实验以测试文库中正确配对的扩增子的百分比。
方法:
测试条件:
(i)液滴1中的RT:遵循标准程序(v2.1液滴噬菌体展示)。
(ii)液滴1和洗涤后的RT:遵循用于制备液滴1的标准程序,但不是随后进行RT温育,而是根据标准程序用20%PFO破坏乳液并洗涤珠粒(液滴1后洗涤步骤)。对洗涤的珠粒执行RT(标准条件)。孵育后,将样品放置在磁铁上并根据标准程序再次洗涤珠粒(液滴1后洗涤步骤)。在用于PCR1的KOD XtremeTM(EMD Millipore)反应混合物中重悬洗涤的珠粒,并继续在DT-20上进行液滴2步骤。PCR1后遵循标准程序。
(iii)液滴2(RT-PCR试剂盒,SSIV和Titan)中的RT:遵循用于制备液滴1的标准程序,但不是随后进行RT温育,而是根据标准程序用20%PFO破坏乳液并洗涤珠粒(液滴1后洗涤步骤)。在RT-PCR反应混合物(SuperScriptIV、Titan或Quanta)中重悬洗涤的珠粒,并使用DT-20制备用于RT孵育和PCR1循环的液滴(遵循每种反应混合物推荐的循环条件)。PCR1后遵循标准程序。
结果:如下表所示,液滴1中的逆转录增加了正确配对且连接至来自同一细胞的另一个扩增子的扩增子的百分比。%DNA天然是指与文库中的天然轻链扩增子正确配对的重链扩增子的分数。纯度是指文库中天然配对与非天然配对的分数。从表中可看出,当在液滴1中执行RT时,文库中65%-77%的扩增子正确配对,而在液滴1与2之间执行RT时,9%-32%的扩增子正确配对,并且在液滴2中执行RT时,23%-40%的扩增子正确配对。
独特的CDRH3用于确定文库中连接扩增子的总回收率。液滴1中的RT降低了总回收率。
以上提供的数据表明,在第一容器中执行RT步骤增加了由本文所述方法产生的文库中扩增子的天然配对。
实施例4
此实施例描述了在珠粒与捕获寡核苷酸之间使用可光裂解的接头增加扩增产物的产量和纯度。此实施例的方法与实施例1中描述的方法类似,其中变化在下文详述。
在此实施例中,通过将oligodT ssDNA缀合至珠粒来制备定制的mRNA捕获珠粒。可光裂解的接头,诸如IDT提供的硝基苄基接头(修饰代码'/iSpPC/')位于oligodT捕获/引发序列与珠粒表面之间。为了测试ssDNA从珠粒中的成功光裂解和释放,将珠粒的悬浮液暴露于365nm UV光六分钟。然后将悬浮液离心以沉淀珠粒,并通过Qubit(Thermo Fisher目录号Q10212)测定上清液以确定从珠粒中释放的ssDNA的量。
试剂:DBCO修饰的10μm直径聚苯乙烯珠粒(Creative Diagnostics目录号DNM-M006)。叠氮化物和可光裂解的接头修饰的mRNA捕获寡核苷酸(IDT):
5’-叠氮化物-iSpPC-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT–3’(SEQ ID NO:1)。用于EvaGreen的液滴生成油(BioRad目录号1864112)。
方法:
如下制备mRNA捕获珠粒的储备液:
1.在500uL的0.1X PBS+0.001%Tween-20中洗涤1000万个DBCO珠粒5次
2.将800万个珠粒转移到0.5mL PCR管中
3.离心,吸出上清液
4.在以下反应混合物中重悬珠粒:
5.将管涡旋,用铝箔包裹,放置在旋转器或振荡器上,在72C下孵育一小时
6.孵育后,从偶联管转移到单独的0.5mL PCR管中
7.离心,吸出上清液,重悬于0.5mL的0.1X PBS+0.001%Tween-20中
8.在0.5mL的0.1X TE+0.001%Tween-20中洗涤3次
9.执行如上所述的光裂解/Qubit测定以确定缀合产量并测试oligodT从珠粒表面的成功释放
遵循与实施例1中相同的程序,除了段落[0126]的步骤4('RT反应混合物')使用500万个定制珠粒而不是45uL珠粒储备液,并且段落[0144]的步骤15和16(“RT产物洗涤和设置PCR1”)被以下步骤代替:
1.向样品中添加更多的PCR1 mmix,至多500uL
2.使用与之前相同的液滴装置,其中A.01储液罐现在填充有用于EvaGreen的BioRad液滴生成油并且B.01储液罐填充有水。B.11连接至注射泵。
3.使用注射泵在液滴装置的两个储液罐中的每个中分别加载一半(250uL)的珠粒/PCR混合悬浮液,以将样品吸入样品环路。在B.15中推进液与样品之间保持1cm的气隙。
4.A.10和B.15连接至100um蚀刻深度的氟化2R芯片(Dolomite零件号3200510)
5.对于每条水线(B.15)以12uL/min的流速运行样品,并且对于油线(A.10)以180uL/min的流速运行样品。
6.将乳液收集在保持在冰上的15mL锥形管中。
7.在乳液生产之后且在将乳液等分到PCR板中之前,将乳液暴露于365nm UV光6分钟,旋转管使得乳液的所有部分均匀暴露。
通过结合UV裂解步骤,本发明人观察到与轻链可靠配对的独特重链序列的比例从71.1%增加到80.6%。
此实施例表明,使用上述方法可增加回收的重链和轻链对的数量以及天然配对的重链和轻链的比例。
非正式序列表:
SEQ ID NO:1:5’-叠氮化物-iSpPC-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT–3’。
应理解的是本文描述的实施例和实施方案是仅用于说明性目的,并且本领域普通技术人员仔细阅读本公开后可想到包括在所附权利要求书的范围内的各种改变。本文引用的所有公布、序列登录号、专利和专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
Claims (53)
1.一种从单细胞产生两个或更多个连接的核酸分子的方法,其包括:
(i)在第一容器中分离单细胞,并且裂解所述单细胞以释放mRNA分子;
(ii)在所述第一容器中将所述mRNA分子逆转录以产生cDNA分子;以及
(iii)在第二容器中连接来源于步骤(ii)中的所述单细胞的所述cDNA分子,
从而产生连接的核酸分子。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述第一容器包含一个或多个附接至寡核苷酸的固体载体,所述寡核苷酸包含与所述mRNA分子的一部分互补的序列。
3.如权利要求2所述的方法,其中所述mRNA分子通过与所述互补序列结合而附接至所述寡核苷酸。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述逆转录包括用逆转录酶延伸所述寡核苷酸以产生所述cDNA分子。
5.如权利要求4所述的方法,其中来自步骤(ii)的所述cDNA分子共价连接至所述固体载体。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述一个或多个固体载体中的每一个在步骤(iii)之前分离到不同的第二容器中。
7.如权利要求2所述的方法,其中所述寡核苷酸通过接头附接至所述固体载体。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述接头位于所述固体载体的表面和与所述mRNA分子的一部分互补的序列之间。
9.如权利要求7所述的方法,其中所述接头是可光裂解的接头。
10.如权利要求9所述的方法,其中所述cDNA分子通过在所述第二容器中将所述可光裂解的接头暴露于光而从所述固体载体释放。
11.如权利要求2所述的方法,其中所述第一容器中存在1至20个固体载体。
12.如权利要求2所述的方法,其中所述第一容器中存在平均3至5个固体载体。
13.如权利要求2所述的方法,其中所述第一容器中存在平均15个固体载体。
14.如权利要求2所述的方法,其中所述固体载体是珠粒或粒子。
15.如权利要求2所述的方法,其中所述固体载体是直径为1至20微米的球形粒子。
16.如权利要求2所述的方法,其中所述固体载体的平均直径为5至10微米。
17.如权利要求2所述的方法,其中在步骤(iii)中连接所述cDNA分子包括通过重叠延伸PCR扩增和连接所述cDNA分子。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述cDNA分子在步骤(iii)之前从所述第二容器中的所述固体载体释放。
19.如权利要求17所述的方法,其中所述重叠延伸PCR包括使用一个或多个包含生物素标签的内部引物扩增所述cDNA分子。
20.如权利要求19所述的方法,其中包含所述生物素标签的cDNA分子在步骤(iii)之后去除。
21.如权利要求17所述的方法,其中所述重叠延伸PCR包括使用一个或多个经化学修饰以抵抗核酸酶降解的外部引物扩增所述cDNA分子。
22.如权利要求21所述的方法,其中所述一个或多个外部引物经化学修饰以包括硫代磷酸酯键。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述cDNA分子在步骤(iii)之后与5'-核酸外切酶接触。
24.如权利要求1所述的方法,其中所述单细胞是免疫系统细胞。
25.如权利要求1所述的方法,其中所述单细胞是B细胞、记忆B细胞、活化B细胞、前体B细胞、浆细胞或浆母细胞。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述mRNA分子编码重链可变区和轻链可变区。
27.如权利要求25所述的方法,其中所述cDNA分子编码重链可变区和轻链可变区的同源对。
28.如权利要求1所述的方法,其中所述单细胞是T细胞。
29.如权利要求1所述的方法,其中所述单细胞是自然杀伤T(NKT)细胞。
30.如权利要求27所述的方法,其中所述cDNA分子编码T细胞受体α链和β链的同源对。
31.如权利要求1所述的方法,其中所述第一容器或第二容器包括分隔物、乳液中的水性液滴、微泡、管或多孔板。
32.如权利要求31所述的方法,其中所述液滴的直径为2至500微米。
33.如权利要求1所述的方法,其还包括在步骤(ii)之后消化所述mRNA。
34.如权利要求33所述的方法,其中所述mRNA在所述第一容器中或在步骤(ii)与(iii)之间进行消化。
35.一种用于产生连接的核酸分子文库的方法,其包括:
a)在多个第一容器中分离多个单细胞,其中所述第一容器包含单细胞;
b)在所述第一容器中裂解所述单细胞以释放mRNA分子;
c)在所述第一容器中将所述mRNA分子逆转录以产生来源于单细胞的cDNA分子;
d)在第二容器中连接来自步骤(c)的所述cDNA分子;
e)合并来自步骤(d)的所述连接的cDNA分子以产生连接的核酸分子文库。
36.如权利要求35所述的方法,其中所述单细胞是B细胞,并且与在同一容器中执行步骤(c)和(d)的方法相比,与所述文库中的同源轻链可变区正确配对的重链可变区的百分比增加。
37.如权利要求35所述的方法,其中所述单细胞是T细胞,并且与在同一容器中执行步骤(c)和(d)的方法相比,与所述文库中的同源T细胞受体β链正确配对的T细胞受体α链的百分比增加。
38.如权利要求35所述的方法,其中所述单细胞是NKT细胞,并且与在同一容器中执行步骤(c)和(d)的方法相比,与所述文库中的同源T细胞受体β链正确配对的T细胞受体α链的百分比增加。
39.如权利要求35所述的方法,其中步骤(d)包括通过重叠延伸PCR扩增和连接所述cDNA分子。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述重叠延伸PCR包括使用一个或多个包含生物素标签的内部引物扩增所述cDNA分子。
41.如权利要求40所述的方法,其中包含所述生物素标签的cDNA分子在步骤(d)之后去除。
42.如权利要求39所述的方法,其中所述重叠延伸PCR包括使用一个或多个经化学修饰以抵抗核酸酶降解的外部引物扩增所述cDNA分子。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述一个或多个外部引物经化学修饰以包括硫代磷酸酯键。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述cDNA分子在步骤(d)之后与5'-核酸外切酶接触。
45.一种用于从单细胞产生两个或更多个连接的核酸分子的方法,其包括:
(i)在第一容器中分离单细胞,并且裂解所述单细胞以释放mRNA分子;
(ii)将所述mRNA分子与附接至固体载体的捕获寡核苷酸杂交,其中所述捕获寡核苷酸包含与所述mRNA序列的一部分互补的序列;
(iii)在所述第一容器中将所述mRNA分子逆转录以产生附接至所述固体载体的cDNA分子;
(iv)在第二容器中连接来源于步骤(iii)的所述cDNA分子,
从而产生连接的核酸分子。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述捕获寡核苷酸还包含位于所述固体载体和与所述mRNA序列的一部分互补的序列之间的接头。
47.如权利要求46所述的方法,其中所述接头被裂解,从而在步骤(iv)之前从所述固体载体释放所述cDNA分子。
48.如权利要求45所述的方法,其中步骤(iv)包括通过重叠延伸PCR扩增和连接所述cDNA分子。
49.如权利要求48所述的方法,其中所述重叠延伸PCR包括使用一个或多个包含生物素标签的内部引物扩增所述cDNA分子。
50.如权利要求48所述的方法,其中包含所述生物素标签的cDNA分子在步骤(iv)之后去除。
51.如权利要求48所述的方法,其中所述重叠延伸PCR包括使用一个或多个经化学修饰以抵抗核酸酶降解的外部引物扩增所述cDNA分子。
52.如权利要求51所述的方法,其中所述一个或多个外部引物经化学修饰以包括硫代磷酸酯键。
53.如权利要求52所述的方法,其中所述cDNA分子在步骤(iv)之后与5'-核酸外切酶接触。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202062964319P | 2020-01-22 | 2020-01-22 | |
US62/964,319 | 2020-01-22 | ||
PCT/US2021/014631 WO2021150903A1 (en) | 2020-01-22 | 2021-01-22 | High throughput linking of multiple transcripts |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115175999A true CN115175999A (zh) | 2022-10-11 |
Family
ID=74672406
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202180017456.7A Pending CN115175999A (zh) | 2020-01-22 | 2021-01-22 | 多个转录物的高通量连接 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230220376A1 (zh) |
EP (1) | EP4093869A1 (zh) |
JP (1) | JP2023511440A (zh) |
CN (1) | CN115175999A (zh) |
WO (1) | WO2021150903A1 (zh) |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2702146B1 (en) | 2011-04-28 | 2018-11-28 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Identification of polynucleotides associated with a sample |
ES2774165T3 (es) * | 2012-06-15 | 2020-07-17 | Univ Texas | Secuenciación de alto rendimiento de múltiples transcritos de una única célula |
DK3089822T3 (da) | 2013-12-30 | 2022-05-02 | Atreca Inc | Analyse af nukleinsyrer associeret med enkelte celler under anvendelse af nukleinsyrestregkoder |
CA3021735A1 (en) * | 2016-04-19 | 2017-10-26 | President And Fellows Of Harvard College | Immobilization-based systems and methods for genetic analysis and other applications |
US10550429B2 (en) * | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
WO2019023627A1 (en) * | 2017-07-27 | 2019-01-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | AMPLIFICATION OF MRNA SEQUENCES ENCODING APPARIED PROTEINS |
AU2019227700A1 (en) * | 2018-03-01 | 2020-10-08 | University Of Kansas | Techniques for generating cell-based therapeutics using recombinant T cell receptor genes |
-
2021
- 2021-01-22 CN CN202180017456.7A patent/CN115175999A/zh active Pending
- 2021-01-22 WO PCT/US2021/014631 patent/WO2021150903A1/en unknown
- 2021-01-22 US US17/759,091 patent/US20230220376A1/en active Pending
- 2021-01-22 JP JP2022544751A patent/JP2023511440A/ja active Pending
- 2021-01-22 EP EP21707056.4A patent/EP4093869A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4093869A1 (en) | 2022-11-30 |
US20230220376A1 (en) | 2023-07-13 |
WO2021150903A1 (en) | 2021-07-29 |
JP2023511440A (ja) | 2023-03-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220389471A1 (en) | Analysis of nucleic acids associated with single cells using nucleic acid barcodes | |
US20210380974A1 (en) | Combinatorial sets of nucleic acid barcodes for analysis of nucleic acids associated with single cells | |
EP3268462B1 (en) | Genotype and phenotype coupling | |
CN110431233B (zh) | 用于单细胞的大量平行组合分析的系统和方法 | |
EP3375889B1 (en) | Single cell analysis | |
US20230069843A1 (en) | Pairing antigen specificity of a t cell with t cell receptor sequences | |
WO2020247685A2 (en) | Methods of barcoding nucleic acid for detection and sequencing | |
EP3963103A1 (en) | Methods and compositions for manipulating nucleic acids | |
CN115175999A (zh) | 多个转录物的高通量连接 | |
US20210032677A1 (en) | Methods to Improve the Sequencing of Polynucleotides with Barcodes Using Circularisation and Truncation of Template | |
US20230349901A1 (en) | Methods For Identification of Cognate Pairs of Ligands and Receptors | |
US20230151357A1 (en) | Methods and compositions for genotyping and phenotyping cells | |
WO2024015856A1 (en) | Compositions and methods for characterizing binding characteristics of antigen binding molecules from single cells | |
WO2024098076A1 (en) | Magnetic bead cell pelleting during in situ cell library preparation and/or barcoding |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |