CN115166115A - 一种鱼肉中多种汞形态含量检测的样品前处理方法以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鱼肉中多种汞形态含量检测的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制样：将疏水性吸附剂、鱼肉、缓冲溶液A、吡咯烷二硫代甲酸铵盐混合后研磨形成混合物，所述的疏水性吸附剂、鱼肉、pH为3～4的缓冲溶液、吡咯烷二硫代甲酸铵盐的添加量满足0.5～5mg：1mg：2～8μL：0.5～2μL；2)装样；3)洗脱：采用二氯甲烷洗脱。通过控制制样、洗脱中各物质的添加以及含量，满足多种汞形态采用HPLC联用的紫外可见光检测器检测，提供了一种集衍生化、萃取和净化于一体，且样品用量少，萃取效率高、分析速度快、成本低的样品前处理方法，提高了对海产品中汞形态分析效率。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种鱼肉中多种汞形态含量检测的样品前处理方法以及检测方法。
背景技术
汞是一种全球范围内广泛存在的污染物，自然界中的汞通过人类活动进入大气、水圈和生物圈，直接导致食物链污染，对人类健康构成了巨大威胁。汞按照其形态可分为无机汞(主要为Hg2+)和有机汞(主要为甲基汞、乙基汞和苯基汞等)，有机汞毒性大于无机汞，其中甲基汞毒性最强。海洋鱼类通过生物累积放大作用，可使体内甲基汞浓度达到自然环境水体中浓度的104～106倍，因此海产品成为一般人群甲基汞暴露的主要来源。长期食用汞污染的海产品对人体有很大的毒副作用，有机汞进入人体后与酶蛋白的巯基结合，抑制多种酶的活力，阻碍细胞的正常代谢，损坏中枢神经系统及肝肾功能。著名的日本水俣病事件就是由于当地人们食用甲基汞污染的鱼而造成的。因此，海产品中汞形态分析意义重大，是当前食品安全学科研究的重点内容之一。
目前，国家标准GB 5009.17-2014《食品中总汞及有机汞的测定》只涉及到总汞和甲基汞的检测，尚无Hg2+、乙基汞和苯基汞的相关限量标准和检测标准。该标准对甲基汞的测定采用液相色谱-原子荧光光谱联用方法，涉及到液相色谱仪、在线紫外消解系统及原子荧光光谱仪，仪器系统复杂。此外，样品前处理需盐酸浸泡过夜且超声提取1h，耗费时间长。因此，针对汞形态分析的需求，迫切需要发展样品前处理方法简单、快速，分析系统简单，多种汞形态同时分析的方法。
近年来，在汞形态分析中，色谱分离和不同检测器的联用技术得到越来越广泛的应用。气相色谱(GC)和液相色谱(HPLC)都是汞形态分析的常用手段。与GC相比，HPLC分析过程更具有优势，免去了将汞的化合物衍生为容易气化的稳定衍生物的步骤，确保不会因为汞化合物的分解而引起测定不确定性和溶剂挥发对人体产生毒害作用。此外，HPLC拥有可变的固定相和流动相，使其适合大多数金属有机物的分析。在汞形态分析中，与HPLC联用的检测器有紫外可见光检测器(UV/Vis)、原子荧光光谱、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等。除了UV/Vis是HPLC常规配置的检测器外，其他检测器价格昂贵，联用系统复杂，特别是ICP-MS，不仅设备昂贵，而且使用成本高。因此，不适应汞形态的日常检测要求。
由于海产品的基体和组成相当复杂，且被分析物含量低，需要浓缩才能被检出，测定时往往又存在基质干扰，这些都对分析测试造成了困难。因此，样品前处理方法成为汞形态分离检测的一个至关重要的步骤，是浓缩样品、提高方法灵敏度以及除去干扰物质的重要过程。在采用UV/Vis对汞形态进行检测时，需要加入螯合剂，形成螯合物，以便易于检测。一般液体样品，如水中汞形态的分析，常采用固相萃取方法(Solid-phase extraction,SPE)进行选择性萃取，衍生化步骤一般在上样之前完成。但是，针对固体样品，如海产品中，样品需进行超声辅助酸提取或者微波消化提取，随后将提取液和螯合剂反应，再进行选择性萃取和净化。超声辅助酸浸提是国家标准规定的提取汞形态化合物的基本方法，但是该方法不能从复杂的基体中将甲基汞全部分离出来，盐酸萃取率只有84％。微波消化提取则不能保证汞形态提取的完整性。此外，无论是酸提取还是微波消化提取，样品的需求量较大，通常为0.5g～5.0g，而且耗时长。因此，发展集衍生化、萃取和净化于一体，且样品用量少，萃取效率高、分析速度快、成本低的样品前处理方法对海产品中汞形态分析具有重大意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种适用于与HPLC联用的紫外可见光检测器检测且集衍生化、萃取和净化于一体的鱼肉中多种汞形态含量检测的样品前处理方法。
本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种鱼肉中多种汞形态含量检测的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制样：将疏水性吸附剂、鱼肉、缓冲溶液A、吡咯烷二硫代甲酸铵盐混合后研磨形成混合物，所述的疏水性吸附剂、鱼肉、pH为3～4的缓冲溶液、吡咯烷二硫代甲酸铵盐的添加量满足0.5～5mg：1mg：2～8μL：0.5～2μL；
2)装样：将所述混合物加入吸头中，所述吸头内设置有上筛板和下筛板，所述混合物位于上筛板和下筛板之间；
3)洗脱：采用二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，采用氮气将洗脱液吹干得到多种汞形态的混合物，所述二氯甲烷的添加量与鱼肉添加量的比值为：10～25μL：1mg。
吡咯烷二硫代甲酸铵盐(APDC)的作用是与汞、有机汞等发生螯合作用，形成疏水性的Hg-APDC、CH3Hg-APDC、CH3CH2Hg-APDC和C6H5Hg-APDC螯合物，最终被吸附剂吸附，经二氯甲烷洗脱之后，被HPLC-UV/Vis检测。
吸附剂、鱼肉、pH为3～4的缓冲溶液、吡咯烷二硫代甲酸铵盐的添加量满足0.5～5mg：1mg：2～8μL：0.5～2μL；吸附剂和鱼肉的比例为0.5～5mg：1mg，若吸附剂量小于这个比例，则螯合物不能全部吸附在吸附剂上，会有损失，降低回收率；若吸附剂量大于这个比例，则最终二氯甲烷的洗脱体积不能完全将螯合物洗脱下来，同样也导致回收率的下降。鱼肉和pH为3～4的缓冲溶液控制的比例为1mg：2～8μL，当缓冲溶液的添加体积小于这个比例时，不能使四种汞形态化合物与吡咯烷二硫代甲酸铵盐完全螯合，使回收率下降；当缓冲溶液的添加体积大于这个比例时，不容易在碾磨时挥发，不利于后续的转移和洗脱，也会导致回收率下降。鱼肉和吡咯烷二硫代甲酸铵盐的添加量控制1mg：0.5～2μL，当吡咯烷二硫代甲酸铵盐的添加量小于这个比例时，四种汞形态化合物不能与吡咯烷二硫代甲酸铵盐完全螯合，使回收率下降；当吡咯烷二硫代甲酸铵盐的添加量大于这个比例时，不容易在碾磨时挥发，不利于后续的转移和洗脱，也会导致回收率下降，而且过量的吡咯烷二硫代甲酸铵盐对后续的液相测定会产生干扰。
二氯甲烷是洗脱溶液，是强疏水性溶剂，适合于四种汞化合物与APDC螯合物的洗脱。洗脱体积太小，不能将螯合物完全洗脱下来，洗脱体积太大，增加后续氮气吹干的时间，且吹干时挥发出来，对人体造成危害，因此，二氯甲烷的添加量与鱼肉添加量的比值为：10～25μL：1mg。
作为优选，所述步骤1)中，疏水性吸附剂为经十六烷基三甲基溴化铵修饰后的凹凸棒土。
作为优选，所述步骤1)中，鱼肉为空白鱼肉，鱼肉中的含水量控制在80wt％以下，鱼肉中添加有多种汞形态的混合标准品溶液，混合标准品溶液、鱼肉的添加量满足1.0～5.0μL：1mg；混合标准品溶液的处理过程为：多种汞形态的标准品均配制在甲醇中，多种汞形态的标准品的浓度均在1～250μg/mL。
作为优选，所述步骤1)中，所述缓冲溶液A为先配置浓度为10～30mmol/L的乙酸铵水溶液，然后采用乙酸调pH至3～4。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种鱼肉中多种汞形态的检测方法。
本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案为：一种鱼肉中多种汞形态的检测方法，其特征在于：将上述得到的多种汞形态的混合物用80～90％v/v的乙腈水溶液溶解，然后采用联用有紫外可见光检测器的液相色谱分离和测定，其中，乙腈水溶液的添加量与鱼肉满足5～20μL：1mg；所述液相色谱的流动相分A、B两路，A路为甲醇，B路组成为乙腈、pH为3～4的缓冲溶液B以及吡咯烷二硫代甲酸铵盐，其中，乙腈的体积占比为3～7％，余量为pH为3～4的缓冲溶液B，吡咯烷二硫代甲酸铵盐的浓度为0.05g/L～0.2g/L；其中A路在流动相中的体积占比为80～90％，流动相的流速为0.2～0.4mL/min，检测波长为254～281nm，多种汞形态的混合物的进样量为5～20μL，在25～40℃下进行分离后测定。
A路比例越大洗脱能力越强，出峰时间越快，但会降低各个峰的分离度，不利于检测；A路比例越小洗脱能力越弱，出峰时间越慢，但会增加各个峰的分离度，耗费时间，因此，为了提高检测效率以及增加各个峰分离度之间的均衡，将A路在流动相中的体积占比控制在80～90％。
B路中乙腈浓度增加会增加B路的洗脱能力和APDC的溶解性，相反乙腈浓度减少会降低B路的洗脱能力，并且会使APDC析出，但需控制在7％以下，比例超过7％会影响A相和B相之间的比例，最终影响四个螯合物之间的分离效率。
B路中添加吡咯烷二硫代甲酸铵盐，是为了稳定各种汞的螯合物，若浓度太低，螯合物会解离，不能被紫外检测器检测，若浓度太高，会影响紫外检测器检测，增加背景噪声。
作为优选，所述缓冲溶液B为先配置浓度为10～30mmol/L的乙酸铵水溶液，然后采用乙酸调pH至3～4。
作为优选，所述鱼肉中多种汞形态的回收率均在80％以上。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过控制制样、洗脱中各物质的添加以及含量，满足多种汞形态采用HPLC联用的紫外可见光检测器检测，提供了一种集衍生化、萃取和净化于一体，且样品用量少，萃取效率高、分析速度快、成本低的样品前处理方法，提高了对海产品中汞形态分析效率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明提供3个实施例和6个对比例，采用本发明的检测方法检测鱼肉中多种汞形态含量。
实施例中鱼肉选用鱿鱼，取其肉，用打样机打碎，干燥碾磨后待用，鱼肉中的含水量控制在80wt％以下。
实施例的样品前处理方法步骤为：
1)制样：将疏水性吸附剂、鱼肉、缓冲溶液A、吡咯烷二硫代甲酸铵盐混合后研磨形成混合物，所述的疏水性吸附剂、鱼肉、pH为3～4的缓冲溶液、吡咯烷二硫代甲酸铵盐的添加量满足0.5～5mg：1mg：2～8μL：0.5～2μL；
2)装样：将所述混合物加入吸头中，所述吸头内设置有上筛板和下筛板，所述混合物位于上筛板和下筛板之间；
3)洗脱：采用二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，采用氮气将洗脱液吹干得到多种汞形态的混合物，所述二氯甲烷的添加量与鱼肉添加量的比值为：10～25μL：1mg。
其中，疏水性吸附剂为经十六烷基三甲基溴化铵修饰后的凹凸棒土。
其中，鱼肉为空白鱼肉，鱼肉中的含水量控制在80wt％以下，鱼肉中添加有多种汞形态的混合标准品溶液，混合标准品溶液、鱼肉的添加量满足1.0～5.0μL：1mg；混合标准品溶液的处理过程为：多种汞形态的标准品均配制在甲醇中，多种汞形态的标准品的浓度均在1～250μg/mL。
缓冲溶液A为先配置浓度为20mmol/L的乙酸铵水溶液，然后采用乙酸调pH至3～4。
实施例的样品前处理关键参数见表1。
实施例的检测方法为：将得到的多种汞形态的混合物用80～90％v/v的乙腈水溶液溶解，然后采用联用有紫外可见光检测器的液相色谱分离和测定，其中，乙腈水溶液的添加量与鱼肉满足5～20μL：1mg；液相色谱的色谱柱为C18色谱柱，尺寸为2.1×100mm，2.6μm；液相色谱的流动相分A、B两路，A路为甲醇，B路组成为乙腈、pH为3～4的缓冲溶液B以及吡咯烷二硫代甲酸铵盐，其中，乙腈的体积占比为3～7％，余量为pH为3～4的缓冲溶液B，吡咯烷二硫代甲酸铵盐的浓度为0.05g/L～0.2g/L；其中A路在流动相中的体积占比为80～90％，流动相的流速为0.2～0.4mL/min，检测波长为254～281nm，多种汞形态的混合物的进样量为5～20μL，在25～40℃下进行分离后测定。
其中，缓冲溶液B为先配置浓度为20mmol/L的乙酸铵水溶液，然后采用乙酸调pH至3～4，具体关键参数见表2。
对比例1与本发明的不同之处在于：吡咯烷二硫代甲酸铵盐的添加量不在本发明样品前处理方法的参数范围内。
对比例2与本发明的不同之处在于：吡咯烷二硫代甲酸铵盐的添加量不在本发明样品前处理方法的参数范围内。
对比例3与本发明的不同之处在于：洗脱液选用甲醇。
对比例4与本发明的不同之处在于：缓冲溶液B的pH值不在本发明样检测方法的参数范围内。
对比例5与本发明的不同之处在于：A路在流动相中的体积占比不在本发明样检测方法的参数范围内。
对比例6与本发明的不同之处在于：吡咯烷二硫代甲酸铵盐的浓度不在本发明样检测方法的参数范围内。
对得到的实施例、对比例的检测结果进行评价：当信噪比分别为3和10时，确定了本实施例中甲基汞、乙基汞、苯基汞和汞的最低检测限(LOD)为0.05～0.15mg kg-1和最低定量限(LOQ)为0.2～0.5mg kg-1。
同一天四种汞化合物的回收率为83.2～100.6％，RSD＜4.6％；不同天的四种汞化合物的回收率为82.6～101.5％，RSD(相对标准偏差)＜5.7％。结果表明，本发明的鱼肉中多种汞形态含量检测的样品前处理方法以及检测方法准确、可靠。
其中，回收率的计算公式为：回收率＝(A/B)×100％，其中，A为用该方法测定的汞形态的浓度值，B为加入的已知浓度值的汞形态。
RSD为回收率的标准偏差除以回收率的平均值。
同一天是指数据均在同一天测出，不同天是指连续不同的几天时间内测出数据，本实施例中，不同天为3天。
表1本发明实施例、对比例的样品前处理关键参数控制
表2本发明实施例、对比例检测方法中的关键参数控制
表3本发明实施、对比例鱼肉中多种汞形态的检测情况以及检测含量
表4本发明对比例鱼肉中多种汞形态的检测情况以及检测含量
Claims (7)
1.一种鱼肉中多种汞形态含量检测的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制样：将疏水性吸附剂、鱼肉、缓冲溶液A、吡咯烷二硫代甲酸铵盐混合后研磨形成混合物，所述的疏水性吸附剂、鱼肉、pH为3～4的缓冲溶液A、吡咯烷二硫代甲酸铵盐的添加量满足0.5～5mg：1mg：2～8μL：0.5～2μL；
2)装样：将所述混合物加入吸头中，所述吸头内设置有上筛板和下筛板，所述混合物位于上筛板和下筛板之间；
3)洗脱：采用二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，采用氮气将洗脱液吹干得到多种汞形态的混合物，所述二氯甲烷的添加量与鱼肉添加量的比值为：10～25μL：1mg。
2.根据权利要求1所述的鱼肉中多种汞形态含量检测的样品前处理方法，其特征在于：所述步骤1)中，疏水性吸附剂为经十六烷基三甲基溴化铵修饰后的凹凸棒土。
3.根据权利要求1所述的鱼肉中多种汞形态含量检测的样品前处理方法，其特征在于：所述步骤1)中，鱼肉为空白鱼肉，鱼肉中的含水量控制在80wt％以下，鱼肉中添加有多种汞形态的混合标准品溶液，混合标准品溶液、鱼肉的添加量满足1.0～5.0μL：1mg；混合标准品溶液的处理过程为：多种汞形态的标准品均配制在甲醇中，多种汞形态的标准品的浓度均在1～250μg/mL。
4.根据权利要求1或3所述的鱼肉中多种汞形态含量检测的样品前处理方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述缓冲溶液A为先配置浓度为10～30mmol/L的乙酸铵水溶液，然后采用乙酸调pH至3～4。
5.一种鱼肉中多种汞形态含量的检测方法，其特征在于：将权利要求1至5任一权利要求得到的多种汞形态的混合物用80～90％v/v的乙腈水溶液溶解，然后采用联用有紫外可见光检测器的液相色谱分离和测定，其中，乙腈水溶液的添加量与鱼肉满足5～20μL：1mg；所述液相色谱的流动相分A、B两路，A路为甲醇，B路组成为乙腈、pH为3～4的缓冲溶液B以及吡咯烷二硫代甲酸铵盐，其中，乙腈的体积占比为3～7％，余量为pH为3～4的缓冲溶液B，吡咯烷二硫代甲酸铵盐的浓度为0.05g/L～0.2g/L；其中A路在流动相中的体积占比为80～90％，流动相的流速为0.2～0.4mL/min，检测波长为254～281nm，多种汞形态的混合物的进样量为5～20μL，在25～40℃下进行分离后测定。
6.根据权利要求5所述的鱼肉中多种汞形态含量的检测方法，其特征在于：所述缓冲溶液B为先配置浓度为10～30mmol/L的乙酸铵水溶液，然后采用乙酸调pH至3～4。
7.根据权利要求5所述的鱼肉中多种汞形态含量的检测方法，其特征在于：所述鱼肉中多种汞形态的回收率均在80％以上。
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