CN115141834A - 长链非编码rna在增生性瘢痕中抑制pi3k/akt信号通路中的应用 - Google Patents

长链非编码rna在增生性瘢痕中抑制pi3k/akt信号通路中的应用 Download PDF

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Abstract

长链非编码RNA在增生性瘢痕中抑制PI3K/AKT信号通路中的应用，包括以下步骤：检测增生性瘢痕和瘢痕旁正常皮肤组织以及其来源的原代成纤维细胞中AKT蛋白的磷酸化水平；不同浓度的PI3K磷酸化抑制剂LY294002处理来源于增生性瘢痕原代成纤维细胞，并检测抑制剂LY294002对成纤维细胞的抑制率；采用锁核苷酸（LNA）技术干扰lncRNA FPASL表达，采用慢病毒过表达lncRNA FPASL并转染至增生性瘢痕原代成纤维细胞，并检测lncRNA FPASL的表达；干扰和过表达lncRNA FPASL后检测改变lncRNA FPASL后成纤维细胞p‑AKT、AKT的蛋白表达水平；PI3K磷酸化抑制剂LY294002处理干扰lncRNA FPASL后的成纤维细胞后，CCK8细胞活力测定分析成纤维细胞的增殖能力。本发明为增生性瘢痕的形成机制提供了新的视角，也为其治疗提供了潜在靶点。

Description

长链非编码RNA在增生性瘢痕中抑制PI3K/AKT信号通路中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，是涉及一种长链非编码RNA在增生性瘢痕中抑制PI3K/AKT信号通路中的应用。
背景技术
增生性瘢痕是一个全球性的健康问题，是烧伤和外伤的常见并发症。增生性瘢痕是对皮肤损伤的生理反应，由此产生的纤维化瘢痕组织在形式和功能上都是异常的，并有可能导致破坏性毁容和永久性功能丧失，会给患者带来精神创伤、身体疼痛和沉重的经济负担。纤维化作为一个谱系存在，从哺乳动物胎儿皮肤的无疤痕愈合到健康产后皮肤的正常疤痕，再到增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的过度瘢痕。尽管增生性瘢痕很普遍，治疗上也有多种选择，如：广泛用于增生性瘢痕的疗法有手术切除、放射、冷冻疗法、病灶内皮质类固醇注射、激光和局部硅凝胶片等，但目前没有任何分子疗法能有效预防或逆转增生性瘢痕。众所周知，成纤维细胞的异常增殖和活化被认为是增生性瘢痕的主要特征，但成纤维细胞增殖在增生性瘢痕形成过程中的具体分子机制尚未完全了解。因此，仍然迫切需要阐明介导增生性瘢痕形成的关键机制并寻找新的治疗靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA在增生性瘢痕中抑制PI3K/AKT信号通路中的应用，即lncRNA FPASL在增生性瘢痕成纤维细胞中的应用，该发明中的原代成纤维细胞来源于临床手术过程中收集的增生性瘢痕和瘢痕旁正常皮肤组织，获取样本方式及途径相对简单快速，不会造成任何创伤，患者普遍容易接受，具有较强的可行性。
本申请的构思为：鉴于长链非编码RNA(lncRNA)因其在多种生物过程和疾病中的影响而成为越来越多的研究焦点。哺乳动物基因组通过RNA聚合酶II介导的转录表达两个主要基因类别：蛋白质编码转录单位和非编码RNA转录单位。非编码RNA进一步分为相对丰富的结构RNA，如小核RNA，以及大量低丰度和低稳定性的长链非编码RNA(lncRNA)。尽管至少某些lncRNA合成可能反映转录“噪音”，但最近的研究为特定lncRNA或lncRNA合成过程定义了独特的功能。值得注意的是，lncRNA的转录、加工和代谢与蛋白质编码基因的调控方式不同。尽管一些lncRNA已被确立为发育、疾病和调节多种生物过程的关键参与者，例如性染色体剂量补偿、细胞分化、增殖或凋亡，以及维持基因组稳定性，大多数lncRNA仍有待在细胞和分子水平上进行功能表征。与主要位于细胞质中的mRNA相比，lncRNA具有更多样化的分布。根据细胞丰度和细胞位置对lncRNA进行分类将有助于阐明它们在很大程度上未探索的作用。位于细胞质的lncRNA通过调节相关通路关键成分的表达从而参与疾病的进程。课题组前期发现lncRNA FPASL可以调控增生性瘢痕形成过程中的成纤维细胞增殖，但对于lncRNA FPASL是如何进行调控的尚不清楚，因此，探索lncRNA FPASL在增生性瘢痕中的具体机制为了解增生性瘢痕形成的机制提供了新的视角，也为lncRNA FPASL作为防治增生性瘢痕的新方法的应用提供了关键的科学数据。
PI3K/AKT通路通过3'-磷酸化磷酸肌醇的产生而被激活，AKT是PI3K信号的重要下游效应物，该通路的组成部分控制着细胞增殖、分化和存活所必需的基因和蛋白质的表达以及参与调节包括抑制细胞凋亡、刺激细胞生长和调节细胞代谢等多种途径，因此，PI3K/AKT通路的激活被认为是一个细胞增殖的标志。有研究报道，各种刺激，包括生长因子、细胞因子和激素都可以激活PI3K磷酸化，特别是EGF、PDGF和IGF。而EGF、PDGF和IGF可以调控成纤维细胞的增殖和ECM的合成，与增生性瘢痕的形成有关。这提示PI3K/AKT信号通路在增生性瘢痕中有重要机制。Xue Wu等人的研究证实可以通过抑制AKT的磷酸化从而抑制增生性瘢痕中成纤维细胞的增殖。这提示PI3K/AKT通路参与增生性瘢痕形成中成纤维细胞的增殖。LY294002是一种PI3K磷酸化抑制剂，其可靶向PI3K/AKT通路。因此，本发明通过研究PI3K磷酸化抑制剂在人增生性瘢痕成纤维细胞增殖过程中的作用，进一步阐述PI3K/AKT信号通路在促进成纤维细胞增殖从而参与增生性瘢痕发生发展的分子生物学机制对于预防和治疗提供了思路。
本发明的具体技术方案为：
长链非编码RNA在增生性瘢痕中抑制PI3K/AKT信号通路中的应用，包括以下步骤：
(1)检测增生性瘢痕和瘢痕旁正常皮肤组织以及其来源的原代成纤维细胞中AKT蛋白的磷酸化水平；
(2)不同浓度的PI3K磷酸化抑制剂LY294002处理来源于增生性瘢痕原代成纤维细胞，并检测抑制剂LY294002对成纤维细胞的抑制率；
(3)采用锁核苷酸(LNA)技术干扰lncRNA FPASL表达，采用慢病毒过表达lncRNAFPASL并转染至增生性瘢痕原代成纤维细胞，并检测lncRNA FPASL的表达；
(4)干扰和过表达lncRNA FPASL后检测改变lncRNA FPASL后成纤维细胞p-AKT、AKT的蛋白表达水平；
(5)PI3K磷酸化抑制剂LY294002处理干扰lncRNA FPASL后的成纤维细胞后，CCK8细胞活力测定分析成纤维细胞的增殖能力。
本发明发现了lncRNA FPASL在增生性瘢痕成纤维细胞中的作用，并发现lncRNAFPASL可通过PI3K/AKT信号通路抑制成纤维细胞的增殖，为增生性瘢痕的靶向治疗提供了应用价值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明明确lncRNA FPASL在增生性瘢痕形成过程中作用机制，为增生性瘢痕的形成机制提供了新的视角，也为其治疗提供了潜在靶点。
2、本发明的样本取材来自临床增生性患者手术过程中移除的组织，样本获取简单便捷，不会造成患者额外创伤，普遍能够能到患者的理解，具有较强的可行性。
附图说明
图1为检测增生性瘢痕组织和原代成纤维细胞中p-AKT和AKT的蛋白表达示意图。图中：A左，纵坐标：p-AKT表示磷酸化的蛋白激酶B、AKT表示蛋白激酶B、GAPDH表示甘油醛-3-磷酸脱氢酶；横坐标：分为两组，HS：增生性瘢痕组织，NS：瘢痕旁正常皮肤组织；A右(左图的统计图)，纵坐标：表示蛋白p-AKT与AKT的比值，横坐标：分为两组；HS：增生性瘢痕组织，NS：瘢痕旁正常皮肤组织，*代表与NS组相比，HS组FPASL的表达量降低，*p小于0.05为差异有统计学意义。B左，纵坐标：p-AKT表示磷酸化的蛋白激酶B、AKT表示蛋白激酶B、GAPDH表示甘油醛-3-磷酸脱氢酶；横坐标：分为两组，HSFBs：来源于增生性瘢痕组织的原代成纤维细胞，NSFBs：来源于瘢痕旁正常皮肤组织的原代成纤维细胞；B右(左图的统计图)，纵坐标：表示蛋白p-AKT与AKT的比值，横坐标：分为两组，HSFBs：来源于增生性瘢痕组织的原代成纤维细胞，NSFBs：来源于瘢痕旁正常皮肤组织的原代成纤维细胞，*代表与NSFBs组相比，HSFBs组FPASL的表达量降低，*p小于0.05为差异有统计学意义。
图2为CCK8法检测PI3K磷酸化抑制剂LY294002对成纤维细胞的抑制率示意图，纵坐标：抑制率，以百分比表示；横坐标：不同浓度的LY294002，分别为0μM，10μM，20μM，50μM。
图3为构建lncRNA FPASL过表达稳定细胞系示意图。纵坐标：FPASL的表达量，纵坐标：CTL表示空白组、OE-NC表示过表达对照组和OE-FPASL表示lncRNA FPASL过表达组；***代表与OE-NC组相比，OE-FPASL组FPASL的表达量明显增加，*p小于0.05为差异有统计学意义。
图4为干扰lncRNA FPASL后的自身验证示意图。纵坐标：FPASL的表达量，纵坐标：CTL表示空白组、LNA-NC表示干扰对照组和LNA-FPASL-1、LNA-FPASL-2、LNA-FPASL-3表示lncRNA FPASL不同干扰片段的三组；**与*分别代表与LNA-NC组相比，LNA-FPASL-2与LNA-FPASL-2组FPASL的表达量明显增加，*p小于0.05为差异有统计学意义。
图5为检测过表达/干扰lncRNA FPASL后p-AKT和AKT蛋白的表达示意图。左：纵坐标：p-AKT表示磷酸化的蛋白激酶B、AKT表示蛋白激酶B、GAPDH表示甘油醛-3-磷酸脱氢酶；横坐标：分为四组，CTL代表空白对照组，OE-NC+LNA-NC代表空载体组，OE-FPASL+LNA-NC代表过表达FPASL组，OE-NC+LNA-FPASL代表干扰FPASL组。右(左图的统计图)：纵坐标：表示蛋白p-AKT与AKT的比值，横坐标：分为四组，CTL代表空白对照组，OE-NC+LNA-NC代表空载体组，OE-FPASL+LNA-NC代表过表达FPASL组，OE-NC+LNA-FPASL代表干扰FPASL组，**代表与OE-NC+LNA-NC组相比，OE-FPASL+LNA-NC组p-AKT与AKT的比值下降，*代表与OE-NC+LNA-NC组相比，OE-NC+LNA-FPASL组p-AKT与AKT的比值增加，*p小于0.05为差异有统计学意义。
图6为CCK8法检测改变lncRNA FPASL后成纤维细胞的增殖示意图。纵坐标：CellViability(450nm)代表细胞活力，是在波长为450nm处，测量细胞的吸光度值；横坐标：分为四组，CTL代表空白对照组，LNA-NC代表空载体组，LNA-FPASL代表FPASL干扰组，LNA-FPASL+LY294002代表干扰FPASL的基础上加入LY294002抑制剂组。**代表与LNA-FPASL组相比，LNA-FPASL+LY294002组细胞活力明显下降，*p小于0.05为差异有统计学意义。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进行详细地说明。
1材料
1.1材料与试剂青链霉素(Solarbio，中国)；PBS(Hyclone，中国)；DPBS(Hyclone，中国)；庆大霉素(Biotopped，北京)；胶原I型蛋白(Solarbio，中国)；4％多聚甲醛(Biotopped，北京)；胎牛血清(FBS)(BI，以色列)；DMEM-F12培养基(Hyclone，中国)；TritonX-100(Biotopped，北京)；EdU试剂盒(锐博，广州)；CCK8试剂盒(APExBIO，美国)；TBST缓冲液(双螺旋，上海)；0.22μm PVDF膜(密理博，美国)；Rabbit Anti-GAPDH PolyclonalAntibody(BIOSS，北京)；Phospho-Akt(Thr308)Rabbit mAb(CST，美国)；Akt(pan)RabbitmAb(CST，美国)；山羊抗兔IgG/辣根酶标记(ABclonal，中国)；ECL化学发光底物试剂(Affinity，中国)；LY294002抑制剂(Abmole，美国)。
1.2仪器与设备负压吸引器(ROCKER 300，中国)；手持式涡旋振荡器(Kylin-bell，中国)；精密电子天平(Sartorius，德国)；微量移液器(Eppendorf，德国)；双温水浴摇床(HLD，江苏)；紫外超净工作台(安泰，中国)；台式离心机(Eppendorf，德国)；手持式便携离心机(SCILOGEX，美国)；生物安全柜(苏净安泰，中国)；制冰机(BILON，中国)匀浆仪(FLUKO，德国)；Biotek酶标仪(德泉兴业，北京)；6孔板、96孔板(康宁，美国)；水平摇床(Kylin-bell，中国)；梯度PCR仪(Eppendorf，德国)；荧光定量PCR仪(analytik jena，德国)；LUNA细胞计数仪(东胜，北京)；光学显微镜(Olympus，日本)；蔡司激光共聚焦显微镜(Carl ZeissMicroImaging GmbH，德国)；凝胶成像仪(BIO-RAD，美国)。
2方法
2.1免疫印迹法检测AKT、p-AKT表达改变
取原代成纤维细胞，PMSF与NP-40裂解液按1:100配制蛋白裂解液，依据细胞量加入裂解液，置于4℃摇床30min，12000rpm、4℃离心20min后，转移蛋白上清液至新的EP管中，按照蛋白与缓冲液4:1的比例，加入上样缓冲，并99℃煮沸变性5min。每孔30μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳，将胶转印至0.22μm PVDF膜上，5％BSA室温封闭2h，TBST洗膜10min，共3次，加入一抗4℃过夜，再TBST室温洗膜10min，重复3次，用辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000)室温孵育2h后，TBST室温洗膜10min，重复3次，曝光。
2.2慢病毒转染原代成纤维细胞
2.2.1原代成纤维细胞嘌呤霉素浓度的筛选
①细胞接种：将正常培养基制成单细胞悬液按照不同转染面积加入不同量到相应的培养板中；
②配制不同浓度的嘌呤霉素(0-10ug/μl)；
③当细胞密度达到80％左右时，加入不同浓度的PM培养48-72h后观察细胞的死亡情况(本实验在0-10ug/μl之间设置了21个浓度梯度)。
2.2.2 lncRNA LNCRNA FPASL过表达慢病毒转染成纤维细胞，构建稳定细胞系
①细胞接种：将正常培养基制成单细胞悬液按照不同转染面积加入不同量到相应的培养板中，以感染后的细胞3天培养至80％以上密度为宜(本实验涉及96孔板、24孔板、6孔板)；
②将50×的LV-Enhance用培养基稀释成1×；
③感染：根据原代成纤维细胞的MOI值及病毒滴度，加入相应的病毒体积，培养基为含有1×LV-Enhance的培养基。原代成纤维细胞的MOI值为20，病毒滴度为1×108TU/ml。病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度；
表一 1×108TU/ml病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考
Figure BDA0003783577570000081
Figure BDA0003783577570000091
④感染病毒后，8-12h后换液；
⑤观察细胞感染效率：感染72h后，用荧光显微镜观察感染效率，根据不同细胞生长状态和速度选择合适的时间；
⑤细胞筛选：当细胞密度达到80％左右时，加入4.5μg/ml的PM杀死未成功感染的细胞，保留感染成功的病毒细胞。
⑥qT-PCR和Western blot验证病毒感染效果后即可进行传代进行后续实验。
2.3 Antisense LNA GapmeRs转染原代成纤维细胞
2.3.1 Antisense LNA GapmeRs的稀释
①4000r离心30-60s，将贴盖或贴壁的LNA GapmeRs离心至管底；
②加250μl的TE-Buffer到含有5nmolLNA GapmeRs的管中；
③来回轻轻颠倒混匀，每回4-5下，5次；
④分装至200μl小管中，-20℃保存。
2.3.2 Antisense LNA GapmeRs转染原代成纤维细胞
①细胞接种：将正常培养基制成单细胞悬液按照不同转染面积加入不同量到相应的培养板中，以转染时60％左右为宜；
②计算转染Antisense LNA GapmeRs的量
表二 LNA GapmeRs转染参考表
Figure BDA0003783577570000101
以下步骤以6孔板为例
③将5μl Antisense LNA GapmeRs到250μl纯培养基，轻轻地吹吸3-5次以混匀；
④将6μl lipofectamine2000加入到250μl纯培养基，轻轻混匀，室温下放置5min；
⑤将Antisense LNA GapmeRs稀释液和助转染试剂充分混匀，室温下放置20min；
⑥将细胞拿出，纯培养基清洗2次，每孔加入1500μl纯培养基；
⑦每孔加入500μl混合液，轻轻摇动6孔板几次以充分混匀；
⑧培养4-6h后换液继续培养(提取RNA 24-48h即可，提取全蛋白则48h以上效果较佳)。
2.4 RT-qPCR(实时定量荧光PCR)检测表达
按Takara RNA试剂盒的说明书操作提取原代成纤维细胞的总RNA(核糖核酸)，依照逆转录试剂盒说明书步骤进行逆转录。RT-qPCR(实时定量荧光PCR)采用Takara Real-Time PCR Master Mix(绿色荧光染料标记的实时PCR混合物)试剂盒对lncRNA FPASL表达量用耶拿PCR仪进行检测分析。GAPDH被用作为对照。实验结果按照如下公式进行计算：检测目的基因的相对表达量＝2－△△Ct，其中，ΔΔCt＝[CtGI(检测样品)-CtGAPDH(检测样品)]-[CtGI(校正样本)–CtGAPDH(校正样本)]。GI是指所测目的基因，Ct是指检测到的反应体系中荧光信号强度，校正样本指的是所有被选做能够代表1倍所测目的基因表达量的样本。
2.5 CCK8细胞活力测定
在96孔板中每孔接种5000个左右的成纤维细胞，每组实验孔5孔，对照孔和空白孔至少3孔；铺板24h或转染48h后，每孔加入10μl的CCK8溶液，37℃下孵育2小时；取出96孔板后，避光在摇床上轻轻摇1min；使用酶标仪检测波长为450nm的OD值；求六个孔的OD值的平均值或通过公式计算细胞活力(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100(As＝实验孔吸光度；Ab＝空白孔吸光度；Ac＝对照孔吸光度)。
3.统计学处理
使用Prism5.0统计软件对上述结果进行分析学分析和处理，以均数±标准差(Mean±SD)表示，两样本均数间比较采用Student’s t检验，多个样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间比较采用Student-Newan-Keuls检验，以P≤0.05具有统计学意义。
4结果
4.1 Western blot检测增生性瘢痕中PI3K/AKT通路的激活
Western blot分别检测了增生性瘢痕组织和瘢痕旁邻近正常皮肤组织和来源于两组原代成纤维细胞中p-AKT和AKT的表达，结果显示：于瘢痕旁邻近正常皮肤组织相比，增生性瘢痕组织中p-AKT/AKT比值明显增高(P<0.05)，见图1A；另外，在原代成纤维细胞水平p-AKT/AKT比值也有明显的差异，HSFBs组的p-AKT/AKT比值比NSFBs组也显著增加(P<0.05)，见图1B，差异有统计学意义。以上结果说明在增生性瘢痕形成过程中AKT发生了磷酸化，可能参与了成纤维细胞的增殖。
4.2 CCK8法检测PI3K磷酸化抑制剂LY294002对成纤维细胞的抑制率
不同浓度(0、10、20、50umol/L)PI3K磷酸化抑制剂LY294002刺激成纤维细胞24h后，CCK8法检测成纤维细胞的活力，并计算抑制率。实验结果显示10、20、50umol/L PI3K磷酸化抑制剂LY294002对成纤维细胞活力有不同程度的抑制，其中50umol/L LY294002对成纤维细胞的抑制率接近于50％。见图2。
4.3原代成纤维细胞转染lncRNA FPASL过表达慢病毒，建立稳定细胞系
构建lncRNA FPASL过表达慢病毒，转染原代成纤维细胞72h后采用qRT-PCR进行过表达效率验证，结果显示与CTL组相比，OE-NC组的lncRNA FPASL表达量无明显改变，lncRNAFPASL过表达组(OE-FPASL组)的lncRNA FPASL表达量明显高于过表达对照组(OE-NC)(P<0.001)，见图3。以上结果表明构建lncRNA FPASL过表达稳定细胞系成功。
4.4采用锁核苷酸(LNA)技术干扰lncRNA FPASL的表达后的自身验证
根据lncRNA的序列,选取不同靶点设计构建了三条LNA GapmeRs，将细胞分为正常对照组(CTL)、干扰对照组(LNA-NC)和lncRNA干扰组(LNA-FPASL 1、LNA-FPASL 2、LNA-FPASL 3)，并通过qRT-PCR进行干扰效率验证，结果显示在原代成纤维细胞转染lncRNAFPASL的三条LNA GapmeRs后，LNA-NC与CTL无显著性差异，而与LNA-NC相比，LNA-FPASL1组lncRNA FPASL的表达无明显差异，LNA-FPASL 2组和LNA-FPASL 3组lncRNA FPASL的表达下降(P<0.01,P<0.05)，其中LNA-FPASL 2组的表达水平明显下降，见图4。因此，本文接下来使用LNA-FPASL 2干扰lncRNA FPASL的表达。
4.5 Western blot检测改变lncRNA FPASL后p-AKT、AKT蛋白的表达
为了更进一步的阐明在增生性瘢痕中lncRNA FPASL在成纤维细胞增殖的作用，研究了成纤维细胞中lncRNA对PI3K/AKT通路有调控作用。Western blot检测改变lncRNAFPASL后成纤维细胞p-AKT、AKT的蛋白表达水平，检测结果显示CTL组与OE-NC+LNA-NC组无显著性差异；与OE-NC+LNA-NC组相比，OE-FPASL+LNA-NC组p-AKT/AKT蛋白的比值降低(P<0.01)，LNA-FPASL+OE-NC组p-AKT/AKT蛋白的比值明显升高(P<0.05)，见图5。该结果说明在成纤维细胞中lncRNA FPASL的低表达可以激活AKT蛋白的磷酸化。
4.6 CCK8法分析成纤维细胞的增殖能力
在前面的研究中我们发现lncRNA FPASL可以调控成纤维细胞中AKT蛋白的磷酸化，那么lncRNA FPASL是否可以通过调控PI3K/AKT通路参与成纤维细胞的增殖呢？接下来我们用PI3K磷酸化抑制剂LY294002处理干扰lncRNA FPASL后的成纤维细胞。并采用CCK8法检测CTL组、LNA-NC组、LNA-FPASL组和LNA-FPASL+LY294002组的细胞增殖，CCK8结果显示与LNA-FPASL组相比，LNA-FPASL+LY294002组成纤维细胞的增殖能力减弱(P<0.01)，见图6。这说明LY294002很大程度的抑制了lncRNA FPASL低表达促进的成纤维细胞的增殖
5结论
本发明的目的在于发现lncRNA FPASL在增生性瘢痕成纤维细胞中的作用，并提出lncRNA FPASL可通过PI3K/AKT信号通路抑制成纤维细胞的增殖，对增生性瘢痕的靶向治疗提供了应用价值。
成纤维细胞的异常增殖和活化是增生性瘢痕主要的病理生理特征，由于目前对于增生性瘢痕没有特别有效的治疗手段。而lncRNA FPASL是一种非编码RNA分子，其可靶向PI3K/AKT通路，其可通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制增生性瘢痕中成纤维细胞增殖，为了解增生性瘢痕形成的机制提供了新的视角，也为非编码RNA分子FPASL作为防治增生性瘢痕的新方法的应用提供了关键的科学数据。

Claims (4)

1.长链非编码RNA在增生性瘢痕中抑制PI3K/AKT信号通路中的应用，其特征在于，该应用方法包括以下步骤：
(1)检测增生性瘢痕和瘢痕旁正常皮肤组织以及其来源的原代成纤维细胞中AKT蛋白的磷酸化水平；
(2)不同浓度的PI3K磷酸化抑制剂LY294002处理来源于增生性瘢痕原代成纤维细胞，并检测抑制剂LY294002对成纤维细胞的抑制率；
(3)采用锁核苷酸(LNA)技术干扰lncRNA FPASL表达，采用慢病毒过表达lncRNA FPASL并转染至增生性瘢痕原代成纤维细胞，并检测lncRNA FPASL的表达；
(4)干扰和过表达lncRNA FPASL后检测改变lncRNA FPASL后成纤维细胞p-AKT、AKT的蛋白表达水平；
(5)PI3K磷酸化抑制剂LY294002处理干扰lncRNA FPASL后的成纤维细胞后，CCK8细胞活力测定分析成纤维细胞的增殖能力。
2.根据权利要求1所述的长链非编码RNA在增生性瘢痕中抑制PI3K/AKT信号通路中的应用，其特征在于，所述检测AKT蛋白的磷酸化水平，是通过免疫印迹法检测AKT、p-AKT表达改变，具体方法为：取原代成纤维细胞，PMSF与NP-40裂解液按1:100配制蛋白裂解液，依据细胞量加入裂解液，置于4℃摇床30min，12000rpm、4℃离心20min后，转移蛋白上清液至新的EP管中，按照蛋白与缓冲液4:1的比例，加入上样缓冲，并99℃煮沸变性5min。每孔30μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳，将胶转印至0.22μm PVDF膜上，5％BSA室温封闭2h，TBST洗膜10min，共3次，加入一抗4℃过夜，再TBST室温洗膜10min，重复3次，用辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000)室温孵育2h后，TBST室温洗膜10min，重复3次，曝光。
3.根据权利要求1所述的长链非编码RNA在增生性瘢痕中抑制PI3K/AKT信号通路中的应用，其特征在于，所述采用慢病毒过表达lncRNA FPASL并转染至增生性瘢痕原代成纤维细胞，该原代成纤维细胞嘌呤霉素浓度的筛选具体方法为：
①细胞接种：将正常培养基制成单细胞悬液按照不同转染面积加入不同量到相应的培养板中；
②配制不同浓度的嘌呤霉素(0-10ug/μl)；
③当细胞密度达到80％左右时，加入不同浓度的PM培养48-72h后观察细胞的死亡情况(本实验在0-10ug/μl之间设置了21个浓度梯度)；
④感染病毒后，8-12h后换液；
⑤观察细胞感染效率：感染72h后，用荧光显微镜观察感染效率，根据不同细胞生长状态和速度选择合适的时间；
⑤细胞筛选：当细胞密度达到80％左右时，加入4.5μg/ml的PM杀死未成功感染的细胞，保留感染成功的病毒细胞；
⑥qT-PCR和Western blot验证病毒感染效果后即可进行传代进行后续实验。
4.根据权利要求1所述的长链非编码RNA在增生性瘢痕中抑制PI3K/AKT信号通路中的应用，其特征在于，所述的CCK8细胞活力测定为：
在96孔板中每孔接种5000个左右的成纤维细胞，每组实验孔5孔，对照孔和空白孔至少3孔；铺板24h或转染48h后，每孔加入10μl的CCK8溶液，37℃下孵育2小时；取出96孔板后，避光在摇床上轻轻摇1min；使用酶标仪检测波长为450nm的OD值；求六个孔的OD值的平均值或通过公式计算细胞活力(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100(As＝实验孔吸光度；Ab＝空白孔吸光度；Ac＝对照孔吸光度)。
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