CN115141814A

CN115141814A - 一种4-羟基苯乙酮单加氧酶的应用

Info

Publication number: CN115141814A
Application number: CN202210741075.XA
Authority: CN
Inventors: 倪晔; 魏世誉; 许国超; 周婕妤
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-06-28
Filing date: 2022-06-28
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2042-06-28
Also published as: CN115141814B

Abstract

本发明公开了一种4‑羟基苯乙酮单加氧酶的应用，本发明针对已经报道的4‑羟基苯乙酮单加氧酶的对芳香酮、底物硫醚的低催化活性、产物ee值低等问题，提供了另外一种新的4‑羟基苯乙酮单加氧酶，该酶对芳香酮和硫醚底物表现出的高活性，并对硫醚有的高立体选择性，能够直接有效解决目前单加氧酶所存在的问题。在以不同取代基的硫醚衍生物为底物制备S‑亚砜时，大部分转化率可达95％以上，得率可达95％。为工业化生产光学活性亚砜提供了一种新的思路和方法。

Description

一种4-羟基苯乙酮单加氧酶的应用

技术领域

本发明涉及一种4-羟基苯乙酮单加氧酶的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

一些细菌通过酶介导的Baeyer-Villiger反应降解芳香化合物，如环苯乙酮和4-乙基苯酚，在芳香环和酮侧链之间插入一个氧原子。例如，荧光假单胞菌ACB利用4-羟基苯乙酮作为唯一的碳和能源来源。Baeyer-Villiger单加氧酶(Baeyer-Villigermonooxygenases,BVMOs)是一种黄酮类酶，利用氧气和NAD(P)H催化Baeyer-Villiger反应，将酮转化为相应的酯类。BVMOs还催化氮、硫、硒和硼等杂原子的氧化。BVMOs属于黄素依赖性单加氧酶，根据不同的蛋白质结构特征和辅助因子依赖性，可分为I、II和O三种类型。所有具有特征的BVMOs都是NAD(P)H依赖性的，需要黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黄素单核苷酸(FMN)作为辅基。先前的研究工作者从Pseudomonas fluorescens ACB中鉴定出一个4-羟基苯乙酮单加氧酶(HAPMO_{pf ACB})，用于催化NADPH依赖的4-羟基苯乙酮氧化为4-羟基苯乙酸酯。HAPMO_{pf ACB}是一个145kDa的同源二聚体，每个亚基包含一个紧密的非共价结合FAD作为辅因子，它是第一个报道的对芳香族化合物表现出主要活性的BVMO。Rehdorf和同事报道了来自Pseudomonas putida JD1(HAPMO_pp)的第二个HAPMO，它参与了4-乙基酚的代谢。基因组挖掘鉴定出的PAMO耐热BVMO，对芳酮类化合物具有广泛的活性，但对亚砜化反应的对映选择性较差。到目前为止，只有三种BVMOs,HAPMO_{pf ACB},HAPMO_pp和苯丙酮单加氧酶(PAMO)，能够转化脂肪族和芳香酮。然而，大多数已报道的BVMOs是专门转化环己酮和相关的环脂肪酮。人们越来越需要发现具有不同生物催化性能的新型BVMOs。

手性亚砜作为合成原料药香精和香料的合成前体和手性助剂在化学合成中受到了广泛的关注。手性亚砜可通过外消旋物的拆分、前手性硫化物的直接不对称氧化等具有对映选择性的化学和生物催化剂制备。吡唑硫化物的生物氧化已经有几个研究小组进行了探索。例如，甲基苯基硫化物的氧化由全细胞的Rhodococcus sp.ECU006，AbIMO和pmMsrA，其中(S)和(R)-苯基甲基亚砜产生高对体过量(≥94％ee)。值得注意的是，从P.fluorescens ACB中分离出的单分子半抗原(HAPMO)可生成光学纯的(S)-对映体(≥99％ee)，其方向为带有副电子给体基团的苯基甲基硫化物，被认为是一种合适的基因组挖掘模板。

虽然已经鉴定出P.fluorescens ACB和P.putida JD1中的两种HAPMOs，但具有多种底物特异性的HAPMOs工具箱还远远不够。并且现有报道的4-羟基苯乙酮单加氧酶还存在低催化活性、产物ee值低等问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明从P.fluorescens中鉴定了一种新的HAPMO，这一新发现的HAPMO_Pf丰富了BVMOs库，为手性亚砜的合成提供了一种潜在的生物催化剂。

本发明的第一个目的是提供一种4-羟基苯乙酮单加氧酶在制备酯类物质中的应用，所述的4-羟基苯乙酮单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的应用是以芳香酮为底物，以4-羟基苯乙酮单加氧酶为催化剂催化生成内酯。

进一步地，所述芳香酮为4-羟基苯乙酮、3-羟基苯乙酮、2-羟基苯乙酮、4-氟苯乙酮、4-氯苯乙酮、4-氨基苯乙酮、4-甲基苯乙酮、4-甲氧基苯乙酮、4-硝基苯乙酮、苯乙酮或苯丙酮。

进一步地，所述催化是在25-40℃下反应2-30h。

本发明的第二个目的是提供一种4-羟基苯乙酮单加氧酶在制备S-亚砜中的应用，所述的4-羟基苯乙酮单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的应用是以硫醚为底物，以4-羟基苯乙酮单加氧酶为催化剂催化生成S-亚砜。

进一步地，在催化反应过程中，所述硫醚在反应体系中的浓度为30mmol·L^-1。

进一步地，所述4-羟基苯乙酮单加氧酶的添加量为3-10g·L^-1。

进一步地，所述硫醚为苯甲硫醚、2-氯苯甲硫醚、3-氯苯甲硫醚、4-氯苯甲硫醚、2-溴苯甲硫醚、3-溴苯甲硫醚、4-溴苯甲硫醚、2-甲氧基苯甲硫醚、3-甲氧基苯甲硫醚、4-甲氧基苯甲硫醚、2-氨基苯甲硫醚、3-氨基苯甲硫醚或4-氨基苯甲硫醚。

进一步地，催化反应体系中还含有醇脱氢酶和甲醇。

进一步地，所述醇脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，添加量为1-10g·L^-1。

进一步地，所述甲醇在反应体系中的浓度为3-8％。

进一步地，所述催化是在pH 6-10、20-40℃下反应。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种4-羟基苯乙酮单加氧酶可作为催化剂应用于备光学纯S-亚砜，该酶可溶性好、适用的反应条件温和、环境友好。本发明的4-羟基苯乙酮单加氧酶催化效果佳，底物适用性广，能够催化芳香酮、硫醚，并且能够耐受高浓度的底物。可将高浓度硫醚转化成S-亚砜，转化率可达95％以上，立体选择性强(e.e.>95％)，为工业化大规模生产光学活性亚砜提供了一种新的方法，具有很好的应用开发前景。

附图说明

图1为pET28a-HAPMO_pf重组质粒物理图谱。

图2为重组4-羟基苯乙酮单加氧酶的蛋白电泳图；M，Marker；泳道1、2分别为重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-HAPMO_pf诱导后上清及纯酶。

图3为4-羟基苯乙酮单加氧酶的选择性分析液相检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：重组大肠杆菌的构建

化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的4-羟基苯乙酮单加氧酶编码基因序列，将其命名为HAPMO_pf，所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

用限制性内切酶NdeI和BamHI将质粒pET28a酶切后和HAPMO_pf的核苷酸片段，通过T4 DNA连接酶将基因HAPMO_pf与酶切过的质粒pET28进行连接，即得重组表达载体pET28a-HAPMO_pf(图1)。将构建好的重组表达载体pET28a-HAPMO_pf转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布含卡那霉素抗性LB固体平板，过夜培养后进行菌落PCR验证，阳性克隆子即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-HAPMO_pf。挑取阳性克隆子于LB培养基中过夜培养，次日按1mL/100mL转接量转接入新鲜LB培养中，培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.2mmol·L^-1IPTG，30℃诱导培养6小时后，4℃、8000r/min离心10min收集菌体。将收集好的菌体悬浮于磷酸钾缓冲液(100mmol·L^-1，pH 8.0)中，超声破碎，并通过SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(图2)。

由图2可知，目的蛋白有一半在上清中，说明重组酶在大肠杆菌中成功得到可溶表达。

实施例2：4-羟基苯乙酮单加氧酶的性质

(1)4-羟基苯乙酮单加氧酶的分离纯化

悬浮重组细胞于A液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1咪唑，pH7.4)中，超声波破碎离心后获得粗酶液。纯化所使用的柱子为亲和柱HisTrap FF crude(镍柱)，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和结合来完成。首先使用A液将镍柱平衡，粗酶液上样，继续使用A液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，1000mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组4-羟基苯乙酮单加氧酶。对纯化后的蛋白进行酶活测定(苯甲硫醚为底物)及SDS-PAGE分析(图2)。由图2可知，镍柱纯化后，在70kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。之后使用HiTrap Desalting脱盐柱(GE Healthcare)将纯化后的环己酮单加氧酶置换到Tris-HCl(100mmol·L^-1，pH 9.0)缓冲液中，进行下一步酶学性质分析。

(2)4-羟基苯乙酮单加氧酶的酶活力测定

测定4-羟基苯乙酮单加氧酶对底物4-羟基苯乙酮的酶活力。测定体系为：适量酶液、5mmol·L^-1 4-羟基苯乙酮。于30℃静置反应15min。反应结束后，取样进行液相检测。气相检测条件：120℃(2min),15℃/min,220℃(6min).Nitrogen:2ml/min.柱子:AT-SE-54(30m×0.25mm ID,0.33μm)。

酶活力单位定义(U)：

在30℃下，4-羟基苯乙酮单加氧酶催化底物生成1μmol的产物所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。

(3)酮类底物谱分析

测定4-羟基苯乙酮单加氧酶(HAPMO_pf)催化不同的酮类底物的酶活力，以4-羟基苯乙酮为底物测得的酶活为100％对照，其他底物测得的酶活力以二者的百分比计算。测定结果如表1所示。

表1HAPMO_pf的酮类底物谱

表1显示，HAPMO_pf底物谱很广泛，能够催化大部分芳香酮，分别生成相应的内酯。

表2HAPMO_pf的硫醚类底物谱

表2显示，HAPMO_pf底物谱很广泛，能够催化许多硫醚，活力受取代基及其在苯环上的位置影响，氨基尤为显著。

(4)立体选择性分析

测定HAPMO_pf催化底物硫醚的选择性。反应体系(0.5mL)为：适量纯化的酶液、5mmol·L^-1硫醚。于30℃静置反应15min。反应结束后，取样进行液相检测。检测条件：手性OD-H色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，检测波长为254nm，流动相为正己烷：异丙醇(95:5)，流速为0.2～1mL/min；OB-H色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，流动相为正己烷：异丙醇(80:20)流速为0.2～1mL·min^-1,检测波长为254nm。由图3可知，该酶具有非常好的立体选择性，根据底物不同生成相应有高立体选择性的S-亚砜。

表3HAPMO_pf催化氧化硫醚X-Ph-S-CH₃生成相应的亚砜

表3显示，HAPMO_pf底物谱很广泛，能够催化许多硫醚，并生成高选择性的亚砜，选择性基本不受取代基及其在苯环上的位置影响。

(5)酶的最适pH

配制100mmol·L^-1不同pH的缓冲液：磷酸缓冲液(pH 6.0～9.0)、Tris-HCl(8.0～9.0)、甘氨酸–NaOH缓冲液(pH 9.0～11.0)。然后以4-羟基苯乙酮为底物，测定HAPMO_pf在不同pH缓冲液的相对酶活力。HAPMO_pf的最适反应pH为Tris-HCl，8.0-9.0，酶活力为0.61-1.95U·mg^–1。在pH为1.0～11的甘氨酸–NaOH缓冲液中，酶活降至30％以下。

(6)酶的最适温度

以4-羟基苯乙酮为底物，测定HAPMO_pf在不同温度(20～50℃)下，反应15min的酶活，测得的最高酶活定为100％，其他温度下测得的酶活以相对于最高活力的百分比计算。结果显示HAPMO_pf的最适反应温度为30～40℃，酶活可保持在0.60～1.90U·mg^–1。

表4HAPMO_pf在不同温度下的酶活

反应温度(℃)	酶活(U·mg<sup>–1</sup>)	酶活百分比(％)
			20℃	0.5	26
25℃	0.88	46
			30℃	1.89	100
35℃	1.16	61
			40℃	1	52
45℃	0.78	41
			50℃	0.58	30

(7)酶的热稳定性

以4-羟基苯乙酮为底物，分别测定HAPMO_pf在30℃下的热稳定性，将0小时酶的初始活力定为100％，其他时间点测得的酶活以相对于0小时酶的初始活力的百分比计算。结果显示HAPMO_pf在30℃下8h后，酶活能保持在78％以上，在16h时能保持在66％，24h后活力降低为初始活力的50％以下。

表5HAPMO_pf的热稳定性

(8)动力学参数分析

测定HAPMO_pf对底物芳香酮和硫醚的动力学参数。酶活测定体系列举如下：Tris-HCl缓冲液(100mmol·L^-1，pH 9.0)，底物芳香酮和硫醚(0.1～10mmol·L^-1)。通过计算比酶活来表征反应速率，从而计算动力学参数。测定的HAPMO_pf对4-羟基苯乙酮的动力学参数为K_m为25.6μmol·L^-1，表现出高的亲和力。测定的HAPMO_pf对底物苯甲硫醚的动力学参数分别为K_m为2733μmol·L^-1。

表6HAPMO_pf动力学参数

表6显示，HAPMO_pf对4-羟基苯乙酮有很高的亲和力。

(9)金属离子对酶活的影响

将终浓度为1mmol·L^-1的氯化盐形式的金属离子加入到纯酶液中，于30℃下温育30min后，在PBS缓冲液(100mmol·L^-1，pH 8.0)中4-羟基苯乙酮为底物测定其残余酶活。同等条件下，不加任何金属离子测得的酶活力定为100％，加入金属离子测得的酶活力以对照的百分比计算。结果表7所示。

表7金属离子对HAPMO_pf单加氧酶酶活力的影响

由表7可知，当加入EDTA时4-羟基苯乙酮单加氧酶的活力没有受到抑制，因此该酶为非金属离子依赖的酶。

实施例3：4-羟基苯乙酮单加氧酶应用于S-亚砜的制备

取0.03～0.1g所得的重组4-羟基苯乙酮单加氧酶和0.1～1g的葡萄糖脱氢酶(GDH，购自诺唯赞公司)于Tris-HCl缓冲液(pH 9，100mmol·L^-1)中，加入5％甲醇，在反应体系中浓度为30mmol·L^-1的硫醚(表8)，反应液总体积为10mL。将反应置于30℃下，对反应过程实时取样检测，当检测到产物不再增加时，反应结束。

检测条件如下：手性OD-H色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，检测波长为254nm，流动相为正己烷：异丙醇(95：5)，流速为0.2～1mL/min；手性OB-H色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)，检测波长为254nm，流动相为正己烷：异丙醇(80：20)，流速为0.2～1mL/min。

结果如表8所示，4-羟基苯乙酮单加氧酶在高底物浓度下能够保持很好的催化性能，大部分底物的转化率能保持在90％以上，得率可达90％。

表8HAPMO_pf制备S-亚砜

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种4-羟基苯乙酮单加氧酶的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1923

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgaacacgt ataatcagac gctgagcgcc atggcgttcg atgaaccgac cctccgcacc 60

catctccgtg aagccgacat cccaacgctg ctgatgtgca tcgcgcatct gaccggtgat 120

ctgaagctgc tgaagccaga atggaagcca gttctggtga tgggcgatcc gaaaagcagt 180

atgaccgccg agcaagaaga gcaagtgcgt gagctgtgcg cggagaagct gatcgaattc 240

aagaacagtg gccgtccggt tccgggccgt ccgaccaagg acgaactgat cacctttacg 300

acgtggctga tgggtccggg cgttgatgcc tatctgccaa tcctcgcgga agaaatggtt 360

agtgccgatg atgacccacg tgcgccgcgt tggcacaaag aacacgtggc gccggagcgc 420

gattttaagg tggtgattat cggcgcgggt gaaagcggta tggttgcggg tctgcgtctc 480

aagcaagccg gcgtgccgtt cgtgatctac gagaagggta atgacgtggg tggtacgtgg 540

cgcgagaaca cgtacccggg ctgccgcgtg gacatcaata gctttagcta tagcttcagc 600

ttcgcgcgtg ccacgtggga tgaccattac agcaccgccc cgcaagtttt cagctatctc 660

caaaatgtgg cccgtcagaa tggcctctac gagcacatcg tgttcaatgc cgaagtgacg 720

gatgcgcact ggaacgaaaa cacccagcat tggaaggtga gcgtgaatca agccagtgcc 780

acccaagaca ttcatgccaa cgtggtggtg ttcgcggtgg gccagctcaa ccgcccactg 840

attccggcga ttccgggcat cgagagcttc caaggccaaa ccttccacag tgcgcagtgg 900

gaccatgatg ccgattgggc cggcaaacgc gttgcggtga tcggtaccgg tgccagtgcc 960

gtgcagttca ttccgcatct ggccaaaacg gccgccgatc tgaagatctt cgcccgcacc 1020

aacaactggc tgctgccgac cccgaatctc catgaccgtg ttgccgacag cgcgaagtgg 1080

ctgctcgaca atctgccgaa ctacagtctg tggtttcgcg ccaccgccgt gctgccacag 1140

accattggct ttgtgcatgc cgtgaccgtt gacccggcct atccaccaac cgaaaaagcg 1200

gtgagcgcca tcaacgaaca actgcgccaa gatctgggca gttggatgga agcgcaaatc 1260

gcggaccgtc cggatctgcg cgatgtggtt atcccggata gtccggtggg tggcaaacgc 1320

attatccgcg acaacggtac gtggatcagc acgctgaagc gcgacaacgt tcgtctggtt 1380

cgtgagccga tcgaaagcat caacccaaag ggcatctact gtgtggacgg tacgcaccat 1440

gagttcgacc tcatcgtgta cggtaccggt ttccaagcca gcaaattcct catgccgatc 1500

cgtgttaccg gccgcgatgg tctggatctg cacaccgagt ggaaaggcga tgatgcccgc 1560

gcgtatctgg gcaccaccgt tccgggcttc ccgaatatgt tctgcatgta tggcccgaat 1620

accggtctgg tggtgagcag taccatcatt cagttcagcg aattcaccgc cacctacatc 1680

acggatgcgg tgcgtctgct gctggaaggt ggccatacca gtatggaagt gaagccgcgc 1740

gtgtgcgaga cctacaacca gcgtgtggat gagggtaaca gtctgcgtgc gtggggcttt 1800

agcaaagtga acagctggta caagaacagc aaaggccgcg tgacccagaa tttcccgttt 1860

gacgccgccg agttctggcg tcgcacccat gaggtggagc caagcgatta ctttctgagt 1920

taa 1923

<210> 2

<211> 640

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Asn Thr Tyr Asn Gln Thr Leu Ser Ala Met Ala Phe Asp Glu Pro

1 5 10 15

Thr Leu Arg Thr His Leu Arg Glu Ala Asp Ile Pro Thr Leu Leu Met

20 25 30

Cys Ile Ala His Leu Thr Gly Asp Leu Lys Leu Leu Lys Pro Glu Trp

35 40 45

Lys Pro Val Leu Val Met Gly Asp Pro Lys Ser Ser Met Thr Ala Glu

50 55 60

Gln Glu Glu Gln Val Arg Glu Leu Cys Ala Glu Lys Leu Ile Glu Phe

65 70 75 80

Lys Asn Ser Gly Arg Pro Val Pro Gly Arg Pro Thr Lys Asp Glu Leu

85 90 95

Ile Thr Phe Thr Thr Trp Leu Met Gly Pro Gly Val Asp Ala Tyr Leu

100 105 110

Pro Ile Leu Ala Glu Glu Met Val Ser Ala Asp Asp Asp Pro Arg Ala

115 120 125

Pro Arg Trp His Lys Glu His Val Ala Pro Glu Arg Asp Phe Lys Val

130 135 140

Val Ile Ile Gly Ala Gly Glu Ser Gly Met Val Ala Gly Leu Arg Leu

145 150 155 160

Lys Gln Ala Gly Val Pro Phe Val Ile Tyr Glu Lys Gly Asn Asp Val

165 170 175

Gly Gly Thr Trp Arg Glu Asn Thr Tyr Pro Gly Cys Arg Val Asp Ile

180 185 190

Asn Ser Phe Ser Tyr Ser Phe Ser Phe Ala Arg Ala Thr Trp Asp Asp

195 200 205

His Tyr Ser Thr Ala Pro Gln Val Phe Ser Tyr Leu Gln Asn Val Ala

210 215 220

Arg Gln Asn Gly Leu Tyr Glu His Ile Val Phe Asn Ala Glu Val Thr

225 230 235 240

Asp Ala His Trp Asn Glu Asn Thr Gln His Trp Lys Val Ser Val Asn

245 250 255

Gln Ala Ser Ala Thr Gln Asp Ile His Ala Asn Val Val Val Phe Ala

260 265 270

Val Gly Gln Leu Asn Arg Pro Leu Ile Pro Ala Ile Pro Gly Ile Glu

275 280 285

Ser Phe Gln Gly Gln Thr Phe His Ser Ala Gln Trp Asp His Asp Ala

290 295 300

Asp Trp Ala Gly Lys Arg Val Ala Val Ile Gly Thr Gly Ala Ser Ala

305 310 315 320

Val Gln Phe Ile Pro His Leu Ala Lys Thr Ala Ala Asp Leu Lys Ile

325 330 335

Phe Ala Arg Thr Asn Asn Trp Leu Leu Pro Thr Pro Asn Leu His Asp

340 345 350

Arg Val Ala Asp Ser Ala Lys Trp Leu Leu Asp Asn Leu Pro Asn Tyr

355 360 365

Ser Leu Trp Phe Arg Ala Thr Ala Val Leu Pro Gln Thr Ile Gly Phe

370 375 380

Val His Ala Val Thr Val Asp Pro Ala Tyr Pro Pro Thr Glu Lys Ala

385 390 395 400

Val Ser Ala Ile Asn Glu Gln Leu Arg Gln Asp Leu Gly Ser Trp Met

405 410 415

Glu Ala Gln Ile Ala Asp Arg Pro Asp Leu Arg Asp Val Val Ile Pro

420 425 430

Asp Ser Pro Val Gly Gly Lys Arg Ile Ile Arg Asp Asn Gly Thr Trp

435 440 445

Ile Ser Thr Leu Lys Arg Asp Asn Val Arg Leu Val Arg Glu Pro Ile

450 455 460

Glu Ser Ile Asn Pro Lys Gly Ile Tyr Cys Val Asp Gly Thr His His

465 470 475 480

Glu Phe Asp Leu Ile Val Tyr Gly Thr Gly Phe Gln Ala Ser Lys Phe

485 490 495

Leu Met Pro Ile Arg Val Thr Gly Arg Asp Gly Leu Asp Leu His Thr

500 505 510

Glu Trp Lys Gly Asp Asp Ala Arg Ala Tyr Leu Gly Thr Thr Val Pro

515 520 525

Gly Phe Pro Asn Met Phe Cys Met Tyr Gly Pro Asn Thr Gly Leu Val

530 535 540

Val Ser Ser Thr Ile Ile Gln Phe Ser Glu Phe Thr Ala Thr Tyr Ile

545 550 555 560

Thr Asp Ala Val Arg Leu Leu Leu Glu Gly Gly His Thr Ser Met Glu

565 570 575

Val Lys Pro Arg Val Cys Glu Thr Tyr Asn Gln Arg Val Asp Glu Gly

580 585 590

Asn Ser Leu Arg Ala Trp Gly Phe Ser Lys Val Asn Ser Trp Tyr Lys

595 600 605

Asn Ser Lys Gly Arg Val Thr Gln Asn Phe Pro Phe Asp Ala Ala Glu

610 615 620

Phe Trp Arg Arg Thr His Glu Val Glu Pro Ser Asp Tyr Phe Leu Ser

625 630 635 640

Claims

1.一种4-羟基苯乙酮单加氧酶在制备酯类物质中的应用，其特征在于，所述的4-羟基苯乙酮单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是以芳香酮为底物，以4-羟基苯乙酮单加氧酶为催化剂催化生成内酯。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述芳香酮为4-羟基苯乙酮、3-羟基苯乙酮、2-羟基苯乙酮、4-氟苯乙酮、4-氯苯乙酮、4-氨基苯乙酮、4-甲基苯乙酮、4-甲氧基苯乙酮、4-硝基苯乙酮、苯乙酮或苯丙酮。

4.一种4-羟基苯乙酮单加氧酶在制备S-亚砜中的应用，其特征在于，所述的4-羟基苯乙酮单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用是以硫醚为底物，以4-羟基苯乙酮单加氧酶为催化剂催化生成S-亚砜。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在催化反应过程中，所述硫醚在反应体系中的浓度为30mmol·L^-1。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述4-羟基苯乙酮单加氧酶的添加量为3-10g·L^-1。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述硫醚为苯甲硫醚、2-氯苯甲硫醚、3-氯苯甲硫醚、4-氯苯甲硫醚、2-溴苯甲硫醚、3-溴苯甲硫醚、4-溴苯甲硫醚、2-甲氧基苯甲硫醚、3-甲氧基苯甲硫醚、4-甲氧基苯甲硫醚、2-氨基苯甲硫醚、3-氨基苯甲硫醚或4-氨基苯甲硫醚。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，催化反应体系中还含有醇脱氢酶和甲醇。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述醇脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，添加量为1-10g·L^-1；所述甲醇在反应体系中的浓度为3-8％。