CN115136885A - 一种牛至重离子束辐射诱变育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛至重离子束辐射诱变育种方法。本发明提供的牛至重离子束辐射诱变育种方法包括如下步骤：将牛至种子经重离子束辐射诱变，实现诱变育种。本发明通过利用重离子束辐射诱导牛至种子获得了高产、抗逆性强、抗病性强、百里香酚和香芹酚含量高的牛至新品种“伏牛山牛至4号”，与对照相比，“伏牛山牛至4号”不仅抗逆性和抗病性强，且精油含量及产量大幅提高，降低了牛至精油应用的成本，提高了产品的竞争力，对在畜牧养殖行业实现天然药物替代抗生素具有重要意义，为牛至优良种质资源的选育提供了新途径。
Description
技术领域
本发明涉及中草药生物技术育种领域，具体涉及一种牛至重离子束辐射诱变育种方法，特别涉及牛至种子经过重离子束辐射诱导后发生突变，经培育得到大量变异群体，结合产量、抗逆性、抗病性和精油含量等性状选育牛至优质新品系的方法。
背景技术
牛至(Origanum vulgare)是唇形科多年生草本，牛至精油主要成分为百里香酚(Thymol)和香芹酚(Carvacrol)，具有明显的抗菌、杀菌和抗氧化作用，并能增强动物免疫功能。牛至精油类预混剂是农业部(农牧发[2001]20号)批准使用的饲料药物添加剂，也是我国批准应用的唯一植物源的药物饲料添加剂，是目前理想的抗生素替代品，具有抗菌谱广、无残留、不易产生耐药性等特点。
牛至草在我国有较早的历史，但多利用它的野生资源而没有进行更多的引种和栽培研究。目前仍存在牛至精油成本较高的问题，如何科学提高牛至中香芹酚和/或百里香酚等精油成分的含量是要解决的问题。
牛至是多年生植物，生长速度慢，选育周期长。重离子束作为一种新兴的辐射诱变源，在植物种质诱变育种操作中，其单位剂量的诱变效率较X射线、γ射线、电子束等低LET诱变效率要高出10倍，其表现具体如下：损伤程度比较严重，突变率高而且损伤不易修复，突变体稳定。目前利用重离子辐射诱变育种技术，选育抗病、高产、有效成分含量高等农艺性状的牛至新品种还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛至重离子束辐射诱变育种方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种牛至诱变育种的方法。
本发明提供的牛至诱变育种的方法包括如下步骤：将牛至种子经重离子束辐射诱变，实现诱变育种。
上述方法中，所述重离子束可为12C6+离子束、20Ne10+离子束、16O8+离子束。在本发明的一个具体实施方式中，所述重离子束为12C6+离子束。
上述方法中，所述辐射诱变的辐射剂量可为10-20Gy或10-15Gy或15-20Gy，具体可为10Gy或15Gy或20Gy，优选15Gy。
上述方法中，所述辐射诱变的辐射能量可为50-100MeV/u，传能线密度LET可为10-30keV/μm，剂量率可为60-100Gy/min。在本发明的一个具体实施方式中，所述辐射诱变的辐射能量为80MeV/u，传能线密度LET为20keV/μm，剂量率为80Gy/min。
上述方法具体可包括如下步骤：
1)种植牛至种子，获得牛至单株，从所述牛至单株中选择优良单株，并采收所述优良单株种子；
2)对所述优良单株种子进行重离子束辐照，得到辐照后种子，种植所述辐照后种子，获得M1代植株，并采收所述M1代植株种子；同时以不进行重离子束辐照的优良单株种子作为对照；
3)种植所述M1代植株种子，获得M2代植株，从所述M2代植株中选择优异变异单株，作为初选突变体植株，并采收所述初选突变体植株种子；
4)种植所述初选突变体植株种子，获得M3代植株，从所述M3代植株中选择优异变异单株，即为目标突变体植株。
所述步骤1)中，所述牛至种子为野生优质牛至种子。在本发明的一个具体实施方式中，所述牛至种子为采集自河南伏牛山区的百里香酚和香芹酚含量高、叶片厚大、株型好的野生优质牛至种子。
所述步骤1)中，所述优良单株的选择方法如下：根据单株如下性状：产量、抗逆性、抗病性、百里香酚含量和香芹酚含量，淘汰不良单株，保留优良单株。
所述步骤3)和步骤4)中，所述优异变异单株的选择方法如下：选取如下性状均高于对照的植株：叶长、叶宽、茎粗、株高、抗逆性、抗病性、百里香酚含量和香芹酚含量。
所述步骤4)后还包括如下步骤：对目标突变体植株的抗性和品质性状进行鉴定；所述抗性和品质性状包括产量、抗逆性、抗病性、百里香酚含量和香芹酚含量。
所述步骤4)后还包括如下步骤：对目标突变体植株的遗传物质进行鉴定；所述鉴定的引物序列具体可为下文表1中所示的引物序列中的至少一种或几种或全部。
为了实现上述目的，本发明还提供了重离子束辐射诱变的新用途。
本发明提供了重离子束辐射诱变在制备牛至新种质中的应用。
为了实现上述目的，本发明最后提供了上述方法的新用途。
本发明提供了上述方法在如下a1)-a7)任一种中的应用：
a1)制备牛至新种质；
a2)提高牛至品质；
a3)提高牛至产量；
a4)提高牛至收油率；
a5)提高牛至精油含量；
a6)提高牛至抗逆性；
a7)提高牛至抗病性。
上述任一所述方法或应用中，所述精油含量具体可为百里香酚含量和/或香芹酚含量。
上述任一所述方法或应用中，所述抗病性具体可为茎腐病抗性和/或白粉病抗性。
上述任一所述方法或应用中，所述抗逆性具体可为抗旱性和/或抗寒性。
本发明提供了一种利用重离子束辐射诱导牛至种子的高效育种方法，运用本发明的育种方法可使牛至产生高频次、类型丰富的变异，改善牛至遗传结构单一的现状，为牛至选育提供技术支持，并筛选出适宜我国河南伏牛山地区种植的高产、优质牛至种质资源，同时，运用本发明的育种方法5-6年可实现高产、高品质、高抗性等多个性状的同步改良，可以培育高产、抗逆性强、抗病性强、百里香酚和香芹酚含量高的牛至新品种，品种选育周期比常规杂交选育缩短3-4年。本发明通过利用重离子束辐射诱导牛至种子获得了高产、抗逆性强、抗病性强、百里香酚和香芹酚含量高的牛至新品种“伏牛山牛至4号”，与对照相比，“伏牛山牛至4号”不仅抗逆性和抗病性强，且精油含量及产量大幅提高，降低了牛至精油应用的成本，提高了产品的竞争力，对在畜牧养殖行业实现天然药物替代抗生素具有重要意义，为牛至优良种质资源的选育提供了新途径。
附图说明
图1为本发明的牛至重离子束辐射诱变育种方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、牛至重离子束辐射诱变育种方法
以伏牛山牛至4号选育为例说明本发明利用重离子束辐射诱导牛至种子的高效育种方法的具体选育过程(图1)：
1、品种引进、择优留种
采集河南伏牛山区百里香酚和香芹酚含量高、叶片厚大、株型好的野生优质牛至种子，并将该引进的种子在田间按照常规方法进行种植，得到若干牛至单株。然后根据单株生物产量、抗逆性(抗寒性)、抗病性(茎腐病、白粉病)及百里香酚和香芹酚含量，淘汰不良单株，保留优良单株。采收并挑选籽粒饱满的牛至种子，并将其作为重离子束辐射育种材料。
2、辐照种子，确定适合辐射剂量(M1代)
M1代：第2年利用国家实验室兰州重离子加速器提供的重离子束(12C6+离子束)，对步骤1获得的重离子束辐射育种材料进行辐照处理，辐射能量为80MeV/u，传能线密度LET为20keV/μm，剂量率为80Gy/min，辐射剂量分别为5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、30Gy、40Gy，得到辐照后种子。将辐照后种子在田间按照常规方法进行种植，株距为30cm，行距为50cm，获得M1代植株。同时以步骤1中未辐照牛至种子作为对照。
以发芽率、存活率、叶长、叶宽、茎粗、株高、地上生物量、百里香酚和香芹酚含量为指标对M1代植株进行分析，确定15Gy为半致死剂量(半致矮量)，即最佳辐射剂量，并将经10Gy、15Gy、20Gy辐射剂量辐照后的种子获得的M1代植株作为第一代种子采收，每个剂量单独采收。
3、选择优异突变类型，筛选优良变异株系(M2代和M3代)
M2代：第3年春将从M1代中每个剂量收获的种子在田间按照常规方法进行株行种植，株距为30cm，行距为50cm，获得M2代植株。M2代是分离高峰世代，以如下优良目标性状为指标：叶长、叶宽、茎粗、株高(60cm以上)、抗逆性(抗旱性)、抗病性(茎腐病、白粉病)、百里香酚和香芹酚含量，选择上述性状均比对照植株(步骤1中未辐照牛至种子获得的植株)优异的变异单株，作为初选突变体植株。
M3代：将从M2代中选择的优异变异单株(初选突变体植株)收获的种子在田间按照常规方法进行株行种植，设置为8个小区，每个小区约20m2，重复三次，随机排列，获得M3代植株。以如下优良目标性状为指标：叶长、叶宽、茎粗、植高(60cm以上)、抗逆性(抗旱性)、抗病性(茎腐病、白粉病)、百里香酚和香芹酚含量，选择上述性状均比对照植株(步骤1中未辐照牛至种子获得的植株)优异的变异单株，即为目标突变体植株，获得优良变异株系(有益突变品系)。
最终依据目标性状选择获得伏牛山牛至1号、伏牛山牛至2号、伏牛山牛至3号和伏牛山牛至4号共4个优良变异株系，其中伏牛山牛至4号表现最为突出，在叶长、叶宽、茎粗、植高、抗逆性、抗病性、百里香酚和香芹酚含量等指标上均优于对照植株。
4、有益突变品系的重要性状与遗传稳定性鉴定(M4代和M5代)
M3代以后的各世代已经比较稳定，很少株系出现分离，对选择的有益突变品系(伏牛山牛至4号)进行多点种植(区域种植试验和生产试验)鉴定产量性状，同步进行多个重要性状及遗传稳定性的鉴定，对伏牛山牛至4号的产量、抗逆性、抗病性、百里香酚和香芹酚含量等性状进行分析。
5、有益突变品系的鉴定结果
本发明选育的牛至有益突变品系“伏牛山牛至4号”于2018-2019年连续两年进行区域种植试验，2020年进行生产试验，2021年通过河南省中药材品种鉴定专业委员会鉴定，命名为豫中药品鉴2021010。
本发明选育的牛至新品种“伏牛山牛至4号”具有以下特点：
1)遗传物质发生明显变异
采用表1中正交组合成的45对SRAP引物对伏牛山牛至4号与对照植株(步骤1中未辐照牛至种子获得的植株)的基因组DNA进行扩增，结果表明：7对引物(Me-1/Em-3、Me-1/Em-8、Me-2/Em-3、Me-4/Em-6、Me-4/Em-9、Me-5/Em-3和Me-5/Em-6)能扩增出差异DNA片段，表现出良好的多态性。因此“伏牛山牛至4号”与原始亲本(对照植株)在DNA水平上存在较大差异，从分子水平上证明重离子束辐射诱变是一种牛至育种的有效途径。
表1、SRAP引物序列
| 前引物 | 序列(5’-3’) | 后引物 | 序列(5’-3’) |
| Me-1 | TGAGTCCAAACCGGATA | Em-1 | GACTGCGTACGAATTAAT |
| Me-2 | TGAGTCCAAACCGGAGC | Em-2 | GACTGCGTACGAATTTGC |
| Me-3 | TGAGTCCAAACCGGAAT | Em-3 | GACTGCGTACGAATTGAC |
| Me-4 | TGAGTCCAAACCGGACC | Em-4 | GACTGCGTACGAATTTGA |
| Me-5 | TGAGTCCAAACCGGAAG | Em-5 | GACTGCGTACGAATTAAC |
| Em-6 | GACTGCGTACGAATTGCA | ||
| Em-7 | GACTGGGTACGAATTCGA | ||
| Em-8 | GACTGGGTACGAATTCTG | ||
| Em-9 | GACTGGGTACGAATTCGA |
2)高产、精油含量高、抗病
牛至新品系伏牛山牛至4号(干)平均亩产量为260-300Kg，较对照植株(步骤1中未辐照牛至种子获得的植株)增加20-35％；采用水蒸气蒸馏法提取牛至精油，收油率为0.50-0.65％，较对照植株增加40-60％；采用气相色谱法检测牛至精油中香芹酚和百里香酚含量分别为42.65％和8.68％，较对照植株分别提高12.03％和8.26％；连续3年多点抗病性鉴定显示田间未见任何病害，鉴定结果为高抗病性品种。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种牛至诱变育种的方法，包括如下步骤：将牛至种子经重离子束辐射诱变，实现诱变育种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重离子束为12C6+离子束。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述辐射诱变的辐射剂量为10-20Gy。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述辐射诱变的辐射剂量为15Gy。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述辐射诱变的辐射能量为50-100MeV/u，传能线密度LET为10-30keV/μm，剂量率为60-100Gy/min。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)种植牛至种子，获得牛至单株，从所述牛至单株中选择优良单株，并采收所述优良单株种子；
2)对所述优良单株种子进行重离子束辐照，得到辐照后种子，种植所述辐照后种子，获得M1代植株，并采收所述M1代植株种子；同时以不进行重离子束辐照的优良单株种子作为对照；
3)种植所述M1代植株种子，获得M2代植株，从所述M2代植株中选择优异变异单株，作为初选突变体植株，并采收所述初选突变体植株种子；
4)种植所述初选突变体植株种子，获得M3代植株，从所述M3代植株中选择优异变异单株，即为目标突变体植株。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：所述步骤3)和步骤4)中，所述优异变异单株的选择方法如下：选取如下性状均高于对照的植株：叶长、叶宽、茎粗、株高、抗逆性、抗病性、百里香酚含量和香芹酚含量。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于：所述步骤4)后还包括如下步骤：对目标突变体植株的抗性和品质性状进行鉴定；所述抗性和品质性状包括抗逆性、抗病性、产量、百里香酚含量和香芹酚含量。
9.重离子束辐射诱变在制备牛至新种质中的应用。
10.权利要求1-8任一所述的方法在如下a1)-a7)任一种中的应用：
a1)制备牛至新种质；
a2)提高牛至品质；
a3)提高牛至产量；
a4)提高牛至收油率；
a5)提高牛至精油含量；
a6)提高牛至抗逆性；
a7)提高牛至抗病性。
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- 2022-06-24 CN CN202210724691.4A patent/CN115136885A/zh active Pending
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| 陶蕾等: "碳离子束辐照处理对牛至精油微胶囊的缓释特性及抗鸡球虫病活性的影响", 《原子核物理评论》, vol. 35, no. 2, 20 June 2018 (2018-06-20), pages 179 - 187 * |
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