CN115128283A - 一种重症急性胰腺炎疾病的标志物及其应用 - Google Patents

一种重症急性胰腺炎疾病的标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种标志物，特别是指一种重症急性胰腺炎疾病的标志物及其应用。本申请通过腺相关病毒介导的TXNIP过表达（AAV‑TXNIP）或敲低（shTXNIP）小鼠来进一步验证TXNIP在SAP中的作用以及相关的分子机制。总之，我们的体内实验和体外实验研究证明了TXNIP的缺失通过抑制炎症反应和氧化应激来减轻SAP。同时我们还发现，TXNIP的缺失对SAP的保护作用依赖于ASK1‑JNK/p38信号通路。AAV介导的TXNIP敲低减轻小鼠肺和肾脏组织学损伤及病例评分均减轻，从而证明了本申请的药物可实现改善重症急性胰腺炎的问题。

Description

一种重症急性胰腺炎疾病的标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种标志物，特别是指一种重症急性胰腺炎疾病的标志物及其应用。
背景技术
急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是一种临床常见的腹部急症，主要是由外分泌胰腺消化酶过度激活引起的可逆炎症过程。SAP的发病率约为33-74例/10万人，死亡率为1%，大多数AP患者经历轻度疾病过程，但10%-20%的患者出现严重的SAP（Severe acutepancreatitis, SAP），并发多脏器功能衰竭甚至危及生命。迄今为止，SAP的临床治疗也存在诸多困难，因此相关特效药物的研发成为目前的研究热点，筛选疗效果明确、不良反应较少的药物及其主要作用机制是科研工作的一项重要内容。虽然AP发病机理尚不明确，但其病理与腺泡细胞坏死、间质水肿、中性粒细胞与巨噬细胞浸润，进而导致炎性细胞因子和炎症介质的过度产生以及氧化应激有关。应激源的持续刺激会导致消化酶（例如胰蛋白酶）过早激活，损伤腺泡细胞，受损的腺泡细胞诱导促炎介质的转录及释放，如白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosis factor-α，TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattratctantprotein-1，MCP-1），并招募中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润胰腺组织，进一步释放各种细胞因子和趋化因子，放大炎症级联反应并加重胰腺损伤。此外，受损的胰腺腺泡细胞和活化的炎症细胞在SAP中产生大量的氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），这些ROS分子可以破坏胰腺腺泡细胞的脂膜，也可以损伤循环中的毛细血管内皮，导致脂质、蛋白质和DNA过氧化损伤，最终导致细胞死亡，加速SSAP的进展。
在胰腺炎的发展中，炎症反应和氧化应激扮演了重要的角色。炎症级联的主要成分是细胞因子，这些细胞因子主要由活化的白细胞产生。IL-1、TNF-α和IL-1β被认为是炎性细胞因子家族的主要成员，因为它们启动并传播了全身炎性反应综合征。同时氧化应激是重症急性胰腺炎炎症和并发症的活跃因素，氧化应激是指细胞和组织中ROS浓度的增加，导致脂质、蛋白质和DNA过氧化损伤，最终导致细胞死亡。受损的胰腺腺泡细胞和活化的炎症细胞在SAP中产生大量的氧自由基，这些ROS分子可以破坏胰腺腺泡细胞的脂膜，也可以损伤循环中的毛细血管内皮，加速SSAP的进展。因此，ROS和促炎细胞因子相互促进，在SAP中形成恶性循环。控制SAP过程中的氧化应激和炎症反应是治疗SAP的一种很有前途的策略。
硫氧还蛋白互作蛋白（Thioredoxin interacting protein, TXNIP）是硫氧还蛋白 (TRX) 系统的内源性抑制剂，是主要的细胞硫醇还原和抗氧化系统，可与硫氧还蛋白结合并抑制其清除 ROS 的能力。
ASK1是一种哺乳动物丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activatedprotein kinase kinase kinase，MAP3K），可激活下游MAPKs、JNKs和p38MAPKs以应对各种应激，例如ROS、肿瘤坏死因子、微管干扰剂和癌症化疗药物等。同时它与多种细胞功能相关，包括炎症反应、DNA损伤和细胞凋亡等。各种应激后，ASK1的激活形式会接着激活MAP2K，然后激活下游的JNK和p38，这些物质会从细胞质穿梭到细胞核中催化多种蛋白质和转录因子的磷酸化。从而导致一系列炎症和氧化应激的发生。ASK1依赖的JNK/p38信号通路与多种人类疾病相关，例如神经系统相关的侧索硬化性神经退行性疾病、帕金森病，以及循环系统疾病、内分泌系统、炎症性和免疫疾病等等。有研究表明神经酰胺通过上调TXNIP表达导致ASK1的激活。
发明内容
本发明提出一种重症急性胰腺炎疾病的标志物及其应用，提供了一种用于治疗重症急性胰腺炎的靶蛋白TXNIP的具体用途。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种重症急性胰腺炎疾病的标志物，所述标志物为硫氧还蛋白互作蛋白（Thioredoxin interacting protein, TXNIP）。
优选的，所述重症急性胰腺炎疾病为依赖于ASK1-JNK/p38信号通路的重症急性胰腺炎疾病。
利用上述的标志物制备的检测试剂或试剂盒。
一种预防、缓解和/或治疗重症急性胰腺炎疾病的药物，所述药物为降低硫氧还蛋白互作蛋白的表达量的药物。
优选的，所述药物为基于硫氧还蛋白互作蛋白的重组载体。
优选的，所述药物为硫氧还蛋白互作蛋白的干扰载体。
优选的，所述干扰载体是以腺病毒为载体介导的。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请提供了一种用于依赖于ASK1-JNK/p38信号通路的重症急性胰腺炎疾病的标志物及相关的药物，通过动物实验证实了TXNIP过表达会通过激活ASK1导致JNK和p38蛋白的磷酸化水平显著升高，而TXNIP敲除或下调后表现相反的趋势。
2、本申请通过腺相关病毒（Adenoad-related viruses，AAV）介导的TXNIP过表达（AAV-TXNIP）或敲低（shTXNIP）小鼠来进一步验证TXNIP在SAP中的作用以及相关的分子机制。总之，我们的体内实验和体外实验研究证明了TXNIP的缺失通过抑制炎症反应和氧化应激来减轻SAP。同时我们还发现，TXNIP的缺失对SAP的保护作用依赖于ASK1-JNK/p38信号通路。AAV介导的TXNIP敲低减轻小鼠肺和肾脏组织学损伤及病例评分均减轻，从而证明了本申请的药物可实现改善重症急性胰腺炎的问题。
3、本发明确定了TXNIP的表达与重症急性胰腺炎之间的相互关系，研究结果表明在发生重症急性胰腺炎的模型中，TXNIP的表达和正常组相比显著升高；抑制TXNIP表达显著抑制了了ASK1-MAPK信号通路的激活，抑制了胰腺组织炎症、坏死及远处脏器损伤；促进TXNIP过表达则显著促进了ASK1-MAPK信号通路的激活，加重了了胰腺组织炎症、坏死及远处脏器损伤。因此，TXNIP可作为靶基因，用于筛选或制备保护胰腺组织，抑制炎症反应的药物，为重症急性胰腺炎的治疗提供了一条有效的新途径；针对TXNIP的改善重症急性胰腺炎的功能，TXNIP可在制备用于预防、缓解和/或治疗重症急性胰腺炎的药物方面应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为WT小鼠诱导重症急性胰腺炎后TXNIP表达上调图。（A）Sham组和SAP组血清淀粉酶水平和脂肪酶活力（n=6/组）。（B）Sham组和SAP组小鼠的胰腺代表性组织学H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=100µm。（C）Sham组和SAP组小鼠胰腺中TXNIP的免疫组化染色（n=6/组）。比例尺=100µm。（D）Sham组和SAP组小鼠胰腺中TXNIP蛋白表达水平。（E）NC组和L-ARG组小鼠胰腺中TXNIP蛋白表达水平。（所有数据均以平均±标准差表示。差异具有统计学意义水平表示为*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001）。
图2为TXNIP缺失改善SAP。（A）采用鼠尾基因鉴定试剂盒进行基因鉴定，M为DNAMaker，T1为水，T2为WT小鼠，T3-T8为TXNIP-KO小鼠，T9为杂合子TXNIP+/-小鼠。（B）WT组和TXNIP-KO组小鼠胰腺中TXNIP的蛋白表达水平（代表三个独立实验）。（C）TXNIP-KO实验组小鼠血清淀粉酶水平和脂肪酶活力（n=6/组）。（D）AAV-TXNIP实验组小鼠血清淀粉酶水平和脂肪酶活力（n=6/组）。（E）TXNIP-KO实验组小鼠的胰腺中代表性组织学H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=100µm。（F）AAV-TXNIP实验组小鼠的胰腺中代表性组织学H&E染色图像（n=6/组）。G）统计分析显示TXNIP-KO实验组小鼠胰腺的病理评分（n=6/组）。（H）统计分析显示AAV-TXNIP实验组小鼠胰腺的病理评分（n=6/组）。比例尺=100µm。所有数据均以平均±标准差表示。ns，无显著性差异，差异具有统计学意义表示为*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001。
图3为TXNIP调节SAP过程中的炎症反应。（A）TXNIP-KO实验组小鼠血清促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1）的表达水平（n=6/组）。（B）AAV-TXNIP实验组小鼠血清促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1）的表达水平（n=6/组）。（C）TXNIP-KO实验组小鼠胰腺中CD11b、MPO和Ly6G的代表性免疫组化染色（n=6/组）。比例尺=100µm。（D）AAV-TXNIP实验组小鼠胰腺中CD11b、MPO和Ly6G的代表性免疫组化染色（n=6/组）。比例尺=100µm。所有数据均以平均±标准差表示。ns，无显著性差异，差异具有统计学意义表示为*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001。
图4为TXNIP介导SAP过程中的氧化应激。（A）ELISA检测TXNIP-KO实验组小鼠胰腺中氧化应激因子（GSH、H2O2、SOD、MDA）的水平（n=6/组）。（B）ELISA检测AAV-TXNIP实验组小鼠胰腺中氧化应激因子（GSH、H2O2、SOD、MDA）的水平（n=6/组）。（C）TXNIP-KO实验组小鼠胰腺中4-HNE的代表性免疫组化染色（n=6/组）。比例尺=100µm。（D）AAV-TXNIP实验组小鼠胰腺中4-HNE的代表性免疫组化染色（n=6/组）。比例尺=100µm。（E）TXNIP-KO实验组小鼠胰腺中HO-1和NQO-1蛋白的表达水平（代表三个独立实验）。（F）AAV-TXNIP实验组小鼠胰腺中HO-1和NQO-1蛋白的表达水平（代表三个独立实验）。E-F使用GAPDH作为对照。所有数据均以平均±标准差表示。ns，无显著性差异，差异具有统计学意义表示为*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001。
图5为TXNIP缺失减轻SAP相关的肺和肾损伤。（A）TXNIP-KO实验组小鼠肺的代表性组织学H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=100µm。（B）AAV-TXNIP实验组小鼠肺的代表性组织学H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=100µm。（C）统计分析TXNIP-KO实验组小鼠肺的病理评分（n=6/组）。（D）统计分析AAV-TXNIP实验组小鼠肺的病理评分（n=6/组）。（E）TXNIP-KO实验组小鼠肾脏的代表性组织学H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=50µm。（F）AAV-TXNIP实验组小鼠肾脏的代表性H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=50µm。（G）统计分析TXNIP-KO实验组小鼠肾脏的病理评分（n=6/组）。（H）统计分析AAV-TXNIP实验组小鼠肾脏的病理评分（n=6/组）。所有数据均以平均±标准差表示。ns，无显著性差异，差异具有统计学意义表示为*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001。
图6为TXNIP缺失抑制SAP期间ASK1激活和下游JNK/p38通路激活。（A）蛋白质印迹分析TXNIP-KO实验组小鼠胰腺中p38、JNK和ASK1总蛋白和磷酸化蛋白的表达水平（代表三个独立实验）。（B）蛋白质印迹分析AAV-TXNIP实验组小鼠胰腺中p38、JNK和ASK1总蛋白和磷酸化蛋白的表达水平（代表三个独立实验）。GAPDH作为对照。所有数据均以平均±标准差表示。ns，无显著性差异，差异具有统计学意义表示为*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001。
图7为ASK1介导了TXNIP对SAP期间炎症反应的影响。不同组小鼠血清淀粉酶水平及脂肪酶活力（n=6/组）。（B）不同组小鼠胰腺中代表性H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=100µm。（C）统计分析不同组小鼠胰腺的病理评分（n=6/组）。（D）不同组小鼠血清促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1）的表达水平（n=6/组）。（E）不同组小鼠胰腺中CD11b、MPO和Ly6G的代表性免疫组化染色（n=6/组）。比例尺=100µm。（F）不同组小鼠胰腺中p65和p-p65蛋白的表达水平（代表三个独立实验）。F以GAPDH作为对照。所有数据均以平均±标准差表示。ns，无显著性差异，差异具有统计学意义表示为*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001。
图8为ASK1介导了TXNIP对SAP期间氧化应激的影响。（A）ELISA检测不同组小鼠胰腺中氧化应激因子（GSH、H2O2、SOD、MDA）的水平（n=6/组）。（B）不同组小鼠胰腺中4-HNE的代表性免疫组化染色（n=6/组）。比例尺=100µm。（C）不同组小鼠肺的代表性组织学H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=100µm。（D）统计分析不同组小鼠肺的病理评分（n=6/组）。（E）不同组小鼠胰腺中HO-1和NQO-1蛋白的表达水平（代表三个独立实验）。（F）蛋白质印迹分析不同组小鼠胰腺中p38、JNK和ASK1总蛋白和磷酸化蛋白的表达水平（代表三个独立实验）。E-F使用GAPDH作为对照。（G）不同组小鼠肾脏具有代表性的H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=50µm。所有数据均以平均±标准差表示。ns，无显著性差异，差异具有统计学意义表示为*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001。
图9为AAV介导的TXNIP敲低减轻小鼠的SAP。（A）不同组小鼠血清淀粉酶水平和脂肪酶活力（n=6/组）。（B）不同组小鼠胰腺中代表性的H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=100µm。（C）不同组小鼠血清促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1）表达水平（n=6/组）。（D，E）不同组小鼠胰腺中CD11b、MPO、Ly6G和4-HNE的免疫组化染色（n=6/组）。比例尺=100µm。（F）ELISA检测不同组小鼠胰腺中氧化应激因子（GSH、H2O2、SOD、MDA）的表达水平（n=6/组）。所有数据均以平均±标准差表示。ns，无显著性差异，差异具有统计学意义表示为*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001。
图10为AAV介导的TXNIP敲低减轻小鼠的SAP。（A）统计分析不同组小鼠胰腺的病理评分（n=6/组）。（B）不同组小鼠肾脏的代表性H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=50µm。（C）统计分析不同组小鼠肾脏的病理评分（n=6/组）。（D）不同组小鼠肺组织中代表性的H&E染色图像（n=6/组）。比例尺=100µm。（E）统计分析不同组小鼠肺的病理评分（n=6/组）。所有数据均以平均±标准差表示。ns，差异无显著性差异，具有统计学意义表示为*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请采用以下生物材料和实验方法进行：
1、实验动物
雄性C57BL/6 WT小鼠，6-8周龄，体重18g到22g左右，购自华兴实验动物中心（郑州，中国）。小鼠被饲养在20℃-25℃，12小时的光/暗循环，喂食标准食物和无菌水，并在实验室条件下饲养。该研究通过了郑州大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理审查号2022-KY-0051-001）。雄性和雌性TXNIP杂合子TXNIP+/-小鼠（C57BL/6背景）购自赛业生物科技有限公司（江苏，中国）。小鼠在交配和繁殖前已在实验室条件下适应一周。从小鼠尾尖中提取基因组DNA对鉴定的小鼠进行基因分型，鉴定出的TXNIP-KO小鼠在相关实验前被喂养2-4周。为确定TXNIP对SAP的影响，对C57BL/6小鼠腹腔注射单剂量的AAV9-TXNIP、AAV9-shTXNIP或对照载体（2×1011vg/只，在无菌PBS溶液中稀释至200μl）。
2、SAP模型诱导
在SAP模型建立前，所有小鼠均禁食12小时。按照4g/kg称取适量L-Arg粉末溶解于生理盐水中，用10%的稀盐酸溶液调节L-Arg溶液PH值至7左右。实验组小鼠腹腔注射2次配制好的L-Arg溶液，间隔1小时。对照组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。注射完毕后，小鼠可以自由获得食物和无菌水，其生活条件与之前一样。最后一次注射后72小时处死小鼠，取胰腺组织、肺组织、肾组织和血液。为了进行组织学分析，三分之一的胰腺、肺和肾组织被固定在10%的中性福尔马林缓冲液中。剩余的组织在液氮中快速冷冻，并在-80℃下保存直到使用。在肝素锂管中采集血液，3000g，4℃离心10分钟，吸取的上清液在-80℃冷冻保存至使用。
3、淀粉酶和脂肪酶活性测定
使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定血清淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP1的表达水平，并比较每组各指标表达水平的差异。以武汉云克隆的ELISA试剂盒为例，其测定步骤如下（不同指标需根据试剂盒说明调整）：
①血浆样本：将储存在-80 ℃的待测血清提前半小时放入室温平衡至室温代用。
②组织样本：取适量肺组织块，PBS清洗后称量重量，将组织用剪刀剪碎，放置在冰上用RIPA裂解半个小时，将得到的匀浆液12,000×g 离心10分钟，弃沉淀，上清即可用于检测或置于-20℃下保存。
③稀释冻干标准品（冻干品）：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，其浓度为5,000pg/mL。稀释成2,500pg/mL，1,250pg/mL，625pg/mL，312pg/mL，156pg/mL，78pg/mL（具体稀释浓度根据试剂盒说明），标准品稀释液（0pg/mL）为空白孔。
④检测溶液A及检测溶液B：将检测溶液A、B按说明稀释并充分混匀。
⑤浓洗涤液：将洗涤液用去离子水稀释至1×，根据说明书洗板。
操作步骤：
①设置标准孔、空白孔、待测样品孔，每空100ul，在酶标板上覆盖覆膜，37 ℃温育1 h；
②弃去液体，每孔加入 100 μL检测溶液A，覆盖覆膜，37 ℃温育1 h；
③弃去孔中液体，每孔加满洗涤液洗涤，洗3次，每次3 min。
④加入检测溶液B覆盖覆膜，37 ℃温育30 min；
⑤弃去孔中液体，每孔加满洗涤液洗涤，洗3次，每次3 min。
⑥每孔加入90 μL 的TMB底物溶液，覆盖覆膜，37 ℃避光显色10-20 min；
⑦酶标仪（450 nm波长处）测量每孔的OD值。
⑧根据标准品浓度和OD值计算标准曲线，然后根据待测样品的OD值计算对应的浓度。
4、苏木精和伊红（H＆E）染色和免疫组织化学（IHC）
根据之前文献描述的方案，将石蜡包埋的胰腺组织、肺组织和肾组织用切片机切成4μm连续切片，接着按照实验室标准操作流程，对石蜡切片进行H＆E染色，观察不同组别处理后组织的水肿、炎症、坏死出血等病理学改变。同时用显微镜进行拍照和保存。用Schmidt评分标准（表1.3）对胰腺、肺和肾的病理照片进行病理评分，同时对胰腺组织的石蜡白片进行TXNIP、分化分子簇11b（Cluster of differentiation molecule 11b,CD11b）、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）、淋巴细胞抗原6复合位点G6D（Lymphocyteantigen 6 complex locus G6D, LY6G）、4-羟基-2-非烯醛（4-hydroxynoneral, 4-HNE）的免疫组织化学染色分析。
表1.3 Schmidt评分标准
Figure 726040DEST_PATH_IMAGE001
5、氧化应激及血清生化测定
取适量胰腺组织，加入生理盐水进行组织匀浆，4℃，12000g，离心10分钟，得到的上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度检测。然后用购买的特定试剂盒对过氧化氢（Hydrogen peroxide, H2O2）、GSH、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD），丙二醛（Malondialdehyde, MDA）等指标进行测定。用从官方网站购入的ELISA试剂盒测定血清中TNF-α、MCP-1、IL-1β以及IL-6的表达水平。
6、蛋白提取和蛋白质印迹分析
使用RIPA裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂从胰腺组织中提取蛋白，用BCA试剂盒检测浓度，最终使各组蛋白浓度保持恒定。将调好浓度的蛋白样品加入制好的凝胶孔中（凝胶配制表见表1.4和表1.5），先以80mV，30分钟电泳半小时，蛋白压缩完成后以120mV，1小时继续电泳。电泳结束后开始转膜，250mV，2小时转膜条件将凝胶内的蛋白转移到聚氟乙烯（Polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上。转膜结束后，将转好的PVDF膜先放入0.1%Tween20三缓冲盐水（0.1% Tween 20, three-buffered saline, TBST）溶液中洗5分钟，然后放入快速封闭液中封闭15分钟后，继续用TBST溶液洗膜，10分钟洗1次，共洗3次。然后按照比例配制抗GAPDH（1:1000）、p65（1:1000）、p-p65（1:1000）、HO-1（1:1000）、NQO-1（1:1000）、p38（1:1000）、p-p38（1:500）、JNK（1:1000）、p-JNK（1:500）、ASK1（1:500）、p-ASK1（1:500）、ACSL4（1:1000）、GPX4（1:500）等抗体，让PVDF膜与配好的抗体在4℃冷库的摇床上一起孵育一整晚。第二天回收一抗，再次用TBST溶液洗膜，共洗3次，每次10分钟。接着按照比例配制HRP偶联的兔二抗（1:5000）、鼠二抗（1:5000）（与一抗相对应）。配制好的二抗与洗好的膜在室温下的摇床上孵育1小时。最后倒掉二抗，膜继续用TBST溶液洗3次，每次10分钟。最后用增强化学发光法检测免疫复合物的含量，使用酶标仪来获取相应的蛋白条带图像。每次实验中测得的目的蛋白条带都需要重复三次（为了避免一次实验结果带来的误差），从而获取三条蛋白条带来评估蛋白质丰度，使用ImageJ软件对获取的蛋白条带进行半定量分析。在蛋白质印迹实验中都以GAPDH作为对照来验证相应目的蛋白的相对含量。
表1.4 浓缩胶体系配制表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表1.5 分离胶体系配制表
Figure 252967DEST_PATH_IMAGE003
7. 统计学分析
使用SPSS21.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。所有数据使用平均数±标准差表示。两组之间采用独立样本t检验进行比较，三组及以上使用单因素方差分析进行比较。P<0.05表示具有统计学意义。
实施例1
为了分析TXNIP和SAP之间的相关性，我们首先评估了TXNIP在SAP小鼠中的表达。我们发现与对照组相比，SAP小鼠的淀粉酶水平和脂肪酶活力增加（图1A）。胰腺组织切片的H&E染色和组织学分析显示与对照组相比，SAP组胰腺的水肿、炎细胞浸润和坏死程度显著增加（图1B）。免疫组化染色分析显示与对照组相比，SAP组小鼠的胰腺组织中TXNIP表达明显增加（图1C）。进一步的蛋白质印迹分析也显示，SAP小鼠胰腺组织中TXNIP的表达显著增加（图1D）。与体内结果相一致，L-Arg诱导的AR42J细胞中TXNIP的表达也高于未处理的对照组（图1E）。综上所述，TXNIP的表达上调提示TXNIP可能参与了SAP。
实施例2
基于TXNIP在SAP中显著上调的表达水平，我们使用TXNIP-KO小鼠进一步研究TXNIP在SAP中的作用。通过鼠尾基因鉴定盒和蛋白印迹鉴定出TXNIP的缺失（图2A，B）。与WT小鼠相比，SAP小鼠的血清淀粉酶水平和脂肪酶活性显著升高，而TXNIP-KO+SAP小鼠的淀粉酶水平和脂肪酶活力显著降低。此外与对照病毒组（AAV-GFP）小鼠相比，AAV-TXNIP+SAP小鼠的淀粉酶水平和脂肪酶活力显著提高（图2C，D）。H&E染色和病理评分显示，与对照组小鼠相比，TXNIP-KO+SAP小鼠胰腺组织的水肿，炎细胞浸润和坏死程度有显著改善（图2E，F，G），AAV-TXNIP+SAP小鼠与AAV-GFP+SAP小鼠相比，胰腺组织的水肿，炎症细胞浸润和坏死程度明显加重（图2，H）。综上所述，这些结果表明TXNIP的缺失改善了SAP，而TXNIP过表达加重了SAP的严重程度。
实施例3
炎症因子和趋化因子在SAP的发生发展中起着重要的作用。因此，我们研究了TXNIP缺失对SAP小鼠炎症反应的影响。与对照组相比，SAP组血清炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1）水平明显升高，TXNIP-KO+SAP组中IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的表达水平显著降低（图3A）。而AAV-TXNIP+SAP小鼠则表现出相反的趋势（图3B）。然后进行IHC染色，我们观察到与对照组小鼠相比，TXNIP-KO+SAP组小鼠胰腺中CD11b、MPO和Ly6G阳性炎细胞浸润显著减少（图3C），而AAV-TXNIP+SAP组小鼠胰腺中CD11b、MPO和Ly6G阳性炎细胞浸润程度显著升高（图3D）。总之，这些结果表明TXNIP可以调节SAP过程中的炎症反应。
实施例4
在SAP过程中，氧化应激不仅作为损伤因子，还会触发促炎细胞因子的产生。因此我们进一步探讨了TXNIP是否在SAP过程中调节氧化应激。ELISA结果显示，TXNIP-KO+SAP组小鼠胰腺中促氧化分子H2O2和MDA显著降低，AAV-TXNIP+SAP组小鼠胰腺的促氧化分子H2O2和MDA显著升高。而抗氧化分子GSH和SOD的表达水平则呈现相反的趋势（图4A，B）。然后我们对胰腺中4-HNE进行IHC染色，发现TXNIP-KO+SAP组小鼠胰腺中4-HNE的表达明显减少（图4C），而AAV-TXNIP+SAP组小鼠中4-HNE的表达明显增加（图4D）。此外与对照组相比，TXNIP-KO+SAP组小鼠的抗氧化蛋白HO-1和NQO-1水平升高（图4E），相比之下AAV-TXNIP+SAP组小鼠的HO-1和NQO-1蛋白表达水平降低（图4F）。综上所述，TXNIP在SAP过程中介导了氧化应激。
实施例5
SAP常导致多器官损伤，其中肺和肾是最常见的易感器官，因此我们验证了TXNIP在SAP期间对肺和肾损伤的影响。肺组织学分析显示，与对照组相比TXNIP-KO+SAP组小鼠肺水肿和炎细胞浸润程度较轻（图5A，C），而AAV-TXNIP+SAP组小鼠的肺水肿和炎细胞浸润程度明显增加（图5B，D）。肾脏组织学分析显示，与对照组相比TXNIP-KO+SAP组小鼠的肾小管坏死、肾小管扩张、刷状缘丧失和构型重塑减少（图5E，G），而在AAV-TXNIP+SAP组小鼠的肾组织中，肾小管坏死、肾小管扩张、刷状缘丧失和构型重塑明显增加（图5F，H）。这些结果表明，TXNIP缺失可以减轻SAP相关的肺和肾损伤。
实施例6
在证实了TXNIP促进SAP的炎症反应和氧化应激后，我们进一步探讨了TXNIP在SAP中的潜在机制。由前面讲述可知MAPK信号通路对SAP的发生和维持至关重要，抑制这一信号通路可减少炎症和纤维化。因此，我们需要进一步研究TXNIP是否在SAP过程中调控MAPK信号通路。有趣的是，我们发现SAP可以导致p38、JNK和ASK1的蛋白磷酸化水平被激活，而TXNIP-KO+SAP组小鼠的p38、JNK和ASK1蛋白磷酸化水平降低（图6A），但是我们在AAV-TXNIP+SAP组小鼠中发现了相反的趋势（图6B）。综上所述，这些结果表明在SAP过程中TXNIP的缺失抑制了ASK1的激活和下游的JNK/p38信号通路。
实施例7
作为其中的一个上游激酶激活MAPK信号通路，ASK1在该信号通路中占有重要作用。因此我们使用ASK1抑制剂（gs-4997）验证ASK1在TXNIP介导的SAP中的作用。与AAV-TXNIP+SAP组相比，gs-4997在很大程度上消除了血清中淀粉酶水平和脂肪酶活力的升高（图7A）。小鼠胰腺的组织学分析和病理评分显示与AAV-TXNIP+SAP组相比，gs-4997治疗明显降低了胰腺水肿、炎症和坏死的程度（图7B，C）。接下来我们检测了ASK1介导的TXNIP对SAP过程中炎症反应的作用。我们发现gs-4997处理显著抑制了AAV-TXNIP+SAP小鼠中IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的上调（图7D）。胰腺IHC染色也观察到gs-4997处理组胰腺的CD11b、MPO和Ly6G阳性炎细胞浸润减少（图7E）。综上所述，这些结果表明ASK1介导了TXNIP对SAP期间炎症反应的影响。
实施例8
我们进一步验证了ASK1在TXNIP介导的SAP期间氧化应激的作用。ELISA结果显示，gs-4997处理组胰腺中抗氧化分子GSH和SOD表达水平显著升高，而促氧化分子H2O2和MDA水平显著降低（图8A）。同时我们对胰腺4-HNE进行IHC染色，发现与AAV-TXNIP+SAP组相比，gs-4997治疗组胰腺4-HNE的表达明显降低（图8B）。gs-4997处理组抗氧化蛋白HO-1和NQO-1的表达水平升高（图8E），而gs-4997处理组p38、JNK和ASK1蛋白的磷酸化水平降低（图8F）。此外肺组织学分析显示与AAV-TXNIP+SAP组相比，gs-4997治疗组肺水肿和炎细胞浸润程度显著降低（图8C，D），以及肾脏组织学分析显示与AAV-TXNIP+SAP组相比，gs-4997治疗组的肾小管坏死、肾小管扩张、刷状缘丧失和构型重塑减少（图8G，）。综上所述，ASK1介导了TXNIP对SAP期间氧化应激的影响。
实施例9
以上结果表明TXNIP是SAP过程中炎症反应和氧化应激的关键介质。我们进一步评估了AAV介导的TXNIP敲低对SAP的治疗作用。与对照组相比，shTXNIP+SAP组小鼠的血清淀粉酶水平和脂肪酶活力显著降低（图9A）。H&E染色和病理评分显示，shTXNIP+SAP组小鼠胰腺组织水肿、炎细胞浸润和坏死程度明显改善（图9B）。然后我们发现与对照组相比，shTXNIP+SAP组小鼠血清中促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1）表达水平显著降低（图9C）。也观察到shTXNIP+SAP组小鼠胰腺IHC染色中CD11b、MPO和Ly6G阳性炎细胞浸润减少（图9D）和4-HNE表达下调（图9E）。此外ELISA结果显示，shTXNIP+SAP组小鼠胰腺中促氧化分子H2O2和MDA显著降低，而抗氧化分子GSH和SOD的表达显著增加（图9F）。此外，AAV介导的TXNIP敲低减轻小鼠肺和肾脏组织学损伤及病例评分减轻（图10A-E）综上所述，AAV介导的TXNIP敲低减轻小鼠的SAP。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种重症急性胰腺炎疾病的标志物，其特征在于：所述标志物为硫氧还蛋白互作蛋白。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于：所述重症急性胰腺炎疾病为依赖于ASK1-JNK/p38信号通路的重症急性胰腺炎疾病。
3.利用权利要求1或2所述的标志物制备的检测试剂或试剂盒。
4.一种预防、缓解和/或治疗重症急性胰腺炎疾病的药物，其特征在于：所述药物为降低硫氧还蛋白互作蛋白的表达量的药物。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：所述药物为基于硫氧还蛋白互作蛋白的重组载体。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述药物为硫氧还蛋白互作蛋白的干扰载体。
7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述干扰载体是以腺病毒为载体介导的。
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