CN115124888A - 一种喷墨打印光子晶体微阵列、生物检测芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

一种喷墨打印光子晶体微阵列、生物检测芯片及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于材料学与生物学领域，公开一种喷墨打印光子晶体微阵列、生物检测芯片及其制备方法和应用。本发明通过制备光子晶体得到的光子晶体墨水，可通过喷墨打印在基材上实现快速有序组装，得到光子晶体微阵列。并以其为基底载体，偶联抗体，搭建三明治荧光免疫夹心结构，利用光子晶体具有荧光增益作用，光子晶体微阵列通过简单的偶联反应固定生物材料，可放大生物材料的荧光信号，从而实现对低浓度待检测物的痕量检测。本发明不仅实现可视化检测，还作为生物材料的载体，为生物检测提供低成本、普适性平台。本发明的生物检测方法操作简单，可用于各类生物检测，应用范围广。

Description

一种喷墨打印光子晶体微阵列、生物检测芯片及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于材料学与生物学领域，特别是涉及一种喷墨打印光子晶体微阵列、生物检测芯片及其制备方法及和应用。
背景技术
随着全球新冠疫情防控常态化，开发新的诊断和检测技术愈发重要。多种分析物的识别在临床诊断和生物筛选领域引起了研究者们越来越多的关注。由于生物医学诊断的复杂性，基于单一分析物的检测结果所能提供的信息有限，相比之下，多通道生物传感器可增加检测通量并提高检测效率。因此，急需开发快速、高通量、小型化、低成本的生物医学诊断方案。
光子晶体因其具有大比表面积和有序通道，适合作为生物分子与功能纳米粒子的载体，可与微通道、酶标免疫检测、层析、细胞培养等生物化学方法有效结合；通过其特殊的光学性质，光子晶体显著增强生物光学检测色，提高生物分析检测的效率。因此，光子晶体的研究意义重大，前景广阔。而其与生物领域的交叉，相互促进相互提高，成为本领域重要的研究思路。这与光子晶体本身的依赖结构的光学功能特性密切相关，从而表现出的与众不同的交叉、拓展、衍生研究特点。
光子晶体因其独特的光学特性，在低浓度的离子、DNA、蛋白质和生物探针等生物材料的高灵敏检测领域有着重大研究意义。借助光子晶体固有的荧光增强放大荧光信号的性质，可实现光子晶体生物传感器检测灵敏度的大幅度提升，降低生物检测限。然而，实现低至飞摩尔量级甚至更低浓度的高灵敏检测仍然是一个巨大的挑战。
发明内容
本发明提供一种光子晶体墨水，所述光子晶体墨水包含光子晶体、保湿剂和润湿剂；其中，所述光子晶体为单分散乳胶球。
根据本发明的实施方案，所述单分散乳胶球的粒径为150-320nm，例如为180-280nm，示例性为180nm、190nm、200nm、205nm、215nm、220nm、230nm、250nm、260nm、280nm。
根据本发明的实施方案，所述单分散乳胶球可以选自聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球、二氧化硅微球、聚苯乙烯微球等中的至少一种，优选为聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球。
根据本发明的实施方案，所述单分散乳胶球的表面带有-COOH官能团。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中，光子晶体的质量浓度为5-30％，优选为10-25％、更优选为10-15％，例如10％、11％、12％、13％、14％、15％。
根据本发明的实施方案，所述保湿剂可以选自乙二醇、丙二醇、丙三醇、山梨糖醇等中的至少一种，例如为乙二醇。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中，保湿剂的质量浓度为5-10％，例如为6-9％，示例性为7％、8％。
根据本发明的实施方案，所述润湿剂可以选自BYK-3400、BYK-3455、BYK-151、BKY-154等中的至少一种，例如为BYK-3400。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中，润湿剂的质量浓度为0.5-5‰，例如1-3‰。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体墨水中含有溶剂。优选地，所述溶剂为水。
根据本发明示例性的方案，所述光子晶体墨水包含单分散聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球、乙二醇和BYK-3400；
所述单分散聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球的粒径为150-320nm，所述单分散聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球的质量浓度为5-30％；所述乙二醇的质量浓度为5-10％，所述BYK-3400的质量浓度为0.5-5‰。
本发明还提供上述光子晶体墨水的制备方法，包括如下步骤：将光子晶体、保湿剂和润湿剂混合，制备得到所述光子晶体墨水；所述光子晶体具有如上文所述含义。
优选地，所述光子晶体为单分散乳胶球。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体、保湿剂和润湿剂配比具有如上文所示的质量比。
根据本发明的实施方案，所述保湿剂和所述润湿剂具有如上文所示的选择。
本发明还提供上述光子晶体墨水在喷墨打印中的应用。优选地，所述光子晶体墨水在喷墨打印制备光子晶体微阵列中的应用。
本发明还提供了一种光子晶体微阵列，所述光子晶体微阵列由光子晶体在基材上自组装形成；优选地，所述光子晶体微阵列为由所述光子晶体在基材上自组装形成的周期性规则排列。优选地，所述光子晶体具有如上文所述的含义。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体由上述光子晶体墨水提供。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体微阵列由上述光子晶体墨水经喷墨打印，在基材上自组装形成。
根据本发明的实施方案，对所述光子晶体微阵列的图案无特别限定，例如图案可设计。作为示例，所述光子晶体微阵列可以为点阵列。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体微阵列为耐水性光子晶体微阵列。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体微阵列还可以包括基材。
根据本发明的实施方案，所述基材可以为玻璃(所述玻璃可以为普通玻璃、石英玻璃或有机玻璃等)、金属片/膜(铝箔或铜片等)、塑料片/膜(PET片/膜、聚苯乙烯片/膜、聚甲基丙烯酸片/膜、聚丙烯片/膜、或聚氯乙烯片/膜等)等。
根据本发明的实施方案，所述基材的接触角大于60°。
本发明还提供上述光子晶体微阵列的制备方法，包括如下步骤：由光子晶体在所述基材上自组装形成所述光子晶体微阵列。
优选地，所述光子晶体微阵列的制备方法包括如下步骤：由上述光子晶体墨水经喷墨打印，在所述基材上自组装形成所述光子晶体微阵列。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体具有如上文所述的含义。优选地，所述光子晶体由上述光子晶体墨水提供。
根据本发明的实施方案，所述基材具有如上文所示的选择。优选地，所述基材为PET膜；更优选地，所述PET膜的接触角为70°。
根据本发明的实施方案，所述光子晶体微阵列的制备方法还包括对得到的光子晶体微阵列进行热烧结。光子晶体经过热烧结能够更好地固化在PET基材上，达到耐水性能。
根据本发明的实施方案，所述热烧结的条件可以根据光子晶体的粒径进行调整。例如，所述热烧结的温度为100-150℃，优选为110-130℃，例如为120℃。例如，所述热烧结的时间为10-20min。
本发明还提供一种生物芯片，包含所述光子晶体微阵列和生物材料，所述生物材料固定在所述光子晶体微阵列上，所述光子晶体微阵列具有上述含义。优选地，所述生物材料通过偶联反应固定在所述光子晶体微阵列上。
根据本发明的实施方案，所述生物材料含有-NH2官能团。优选地，所述生物材料选自酶、核酸、抗原、抗体、适配体、结合蛋白质、植物凝血素、激素受体等中的至少一种。进一步优选地，所述生物材料为抗体或适配体。例如，所述抗体为山羊抗兔IgG、ST2纳米抗体；例如，所述适配体为C6 Amino FAM适配体。
根据本发明的实施方案，所述生物材料优选为由荧光分子标记的生物材料。例如，所述荧光分子可以为Cy-3、Cy-5等中的至少一种。示例性地，所述生物材料为Cy-3标记的山羊抗兔IgG、Cy-3标记的ST2纳米抗体一抗或Cy-5标记纳米抗体二抗。
根据本发明的实施方案，所述生物芯片具有三明治夹心结构。
根据本发明的实施方案，所述生物芯片能够特异性识别与所述生物材料相适配的目标分析物；例如，当所述生物材料为抗体时，所述目标分析物为与该抗体对应的抗原。
本发明还提供所述生物芯片的制备方法，包括：将生物材料固定在所述光子晶体微阵列上，形成所述生物芯片。
优选地，所述生物材料和光子晶体微阵列均具有如上所述的含义。优选地，所述生物材料通过偶联反应固定在所述光子晶体的微阵列上，形成所述生物芯片。
根据本发明的优选地实施方案，所述生物芯片的制备方法，包括如下步骤：活化所述光子晶体微阵列中的光子晶体，使所述光子晶体表面暴露出大量的-COOH官能团，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在下，发生交联反应，再与所述生物材料中的-NH2反应，形成酰胺键，得到所述生物芯片。
根据本发明的实施方案，所述生物材料为抗体或适配体。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含所述生物芯片。
本发明还提供一种生物检测平台，所述生物检测平台含有上述生物芯片。
本发明还提供所述光子晶体微阵列、所述生物芯片、所述试剂盒或所述生物检测平台在生物检测中的应用。
优选地，用于特异性识别所述目标分析物。
优选地，所述目标分析物具有如上文所述的含义。
本发明还提供所述生物芯片识别目标分析物的检测方法，所述检测方法包括：将所述生物芯片与所述目标分析物接触，通过荧光检测进行识别。优选地，所述荧光检测可识别的目标分析物最低浓度为0.01ng/mL。
根据本发明的实施方案，所述目标分析物的质量浓度为0.01ng/mL-100mg/mL。优选地，所述目标分析物的质量浓度为0.01ng/mL-1mg/mL。优选地，所述目标分析物由荧光分子标记。
本发明的有益效果：
1.本发明通过调控打印基材的浸润性，通过保湿剂和润湿剂调控光子晶体(如乳胶球)分散液的黏度和表面张力等，从而有效调控打印墨滴在基材表面的铺展、浸润行为；进而使得单分散光子晶体(如乳胶球)通过喷墨打印在基材上实现快速有序组装形成光子晶体微阵列。
2.本发明制备的光子晶体具有荧光增益作用，以其为载体，搭建三明治荧光免疫夹心生物检测体系，在原有荧光基础上，能够对检测抗体报告荧光增益10-1000倍，检测限降低一至三个数量级，实现对低浓度待检测物的痕量检测。
3.本发明搭建生物平台具有普适性，通过简单的偶联反应固定生物材料(抗体、适配体以及多肽等)实现可视化检测。
4.本发明制备方法简单，绿色环保，可以大规模制备，易于商用。
5.本发明的光子晶体不仅可以对荧光标记物具有荧光增强作用，还是可以偶联生物材料(抗体、适配体以及多肽等)的载体，既是一个生物检测探针，也是一个生物检测平台。
附图说明
图1为实施例1制备的喷墨打印制备光子晶体微阵列实物图以及光学显微镜图。
图2为实施例1制备的喷墨打印制备光子晶体(粒径为260nm)点阵列的扫描电镜SEM图。
图3为实施例2制备的耐水性光子晶体微阵列的扫描电镜SEM图。
图4为实施例3制备的生物芯片(光子晶体点阵列偶联Cy-3标记IgG抗体)示意图。
图5为实施例3制备的生物芯片微荧光显微镜图；左图代表光子晶体未偶联Cy-3标记IgG抗体，以直接滴加方式的荧光成像图；中图代表光子晶体偶联Cy-3标记IgG抗体的荧光成像图；右图代表光子晶体在同一参数下的荧光成像图。
图6为实施例4制备的生物芯片(绿色光子晶体微阵列偶联C6 Amino FAM适配体)示意图。
图7为实施例4制备的生物芯片荧光显微镜图。左图代表光子晶体未偶联C6 AminoFAM适配体，以直接滴加方式的荧光成像图；右图代表光子晶体偶联C6 Amino FAM适配体的荧光成像图。
图8为实施例5制备的生物芯片(光子晶体粒径为300nm)对Cy5标记的ST2纳米二抗的荧光增益荧光成像图。
图9为实施例6制备的生物芯片用于心肌标志物ST2三明治夹心免疫检测示意图。
图10为实施例6制备的生物芯片用于心肌标志物ST2三明治夹心免疫检测验证识别功能的Confocal图。
图11为实施例6制备的生物芯片识别纳米抗体实现ST2抗原的SEM图。
图12为实施例6光子晶体点阵烧结前后及搭建ST2三明治夹心免疫检测体系后的反射率变化谱图。
图13为实施例7制备的生物芯片识别不同浓度的目标检测物ST2抗原(目标检测物ST2抗原的初始质量浓度为100μg/ml，图中从左到右分别指目标检测物ST2抗原被稀释为初始浓度的10、102、103、104、105、106倍)的荧光显微镜图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
制备喷墨打印光子晶体微阵列，步骤如下：
(1)100mL水中加入10.00mmol甲基丙烯酸甲酯，13.89mmol丙烯酸和182.60mmol苯乙烯，随后溶入乳化剂十二烷基苯磺酸钠(不超过0.011mmol，其浓度低于临界胶束浓度)和缓冲剂碳酸氢铵6.30mmol。反应液保持70℃半小时，然后加入2.12mmol过硫酸铵的水溶液，连续搅拌下于80℃聚合10h，得到无需纯化可直接使用的单分散乳胶球。
通过调整苯乙烯的用量来调控乳胶球的粒径，制备得到粒径分别为300nm、280nm、260nm、220nm、215nm和180nm的乳胶球。
(2)本实施例以260nm乳胶球为例，将步骤(1)制备的光子晶体原液(即离心洗涤后的乳胶球的水溶液)稀释至10wt％浓度，以乙二醇作为保湿剂(质量分数占比8％)，BYK-3400作为润湿剂(质量分数占比为1‰)加入稀释后的光子晶体溶液中，配制成光子晶体墨水。
(3)选用PET膜(接触角θ＝70°)，根据设计的微阵列打印点阵列图案，将光子晶体墨水加入墨盒中，采用Epson Me 70普通带墨盒打印机进行打印，得到打印好的光子晶体阵列片。通过构建疏水基底上打印亲水光子晶体，可实现后期液滴的富集作用。
图1为喷墨打印制备光子晶体微阵列实物图以及光学显微镜图。从图1中可以看出，在PET膜上根据设计的图案打印出点阵列图案。通过在光子晶体溶液中加入保湿剂与润湿剂调控溶液的黏度和表面张力，配制成可用于喷墨打印的光子晶体墨水，液滴可在PET膜上规则排列。
图2为喷墨打印制备光子晶体(粒径为260nm)点阵的扫描电镜SEM图。从图2中可以看出，单分散聚苯乙烯乳胶微球自组装形成周期性整齐排列的光子晶体形貌。
实施例2
制备耐水性光子晶体微阵列，步骤如下：
将实施例1打印好的光子晶体微阵列置于110℃烘箱中加热烧结，一般加热时间控制在10-20min，得到耐水性光子晶体微阵列片。
图3为喷墨打印制备光子晶体微阵列经过110℃烧结10min固化后的耐水性光子晶体微阵列片扫描电镜SEM图。从图3中可以看出，光子晶体小球经过110℃烧结10min固化后，未破坏小球周期性排列的结构形貌以及尺寸变化，反而使小球之间排列更加紧密。同时，光子晶体微阵列在水中浸泡后，光子晶体图案仍然可以牢固在PET片上，具有很好的耐水性(即将光子晶体微阵列浸泡在水里，微阵列不会被浸泡冲散)。进一步地，通过下述在水系溶液中反应的各实施例也可以证明，光子晶体微阵列具有优异的耐水性。
实施例3
制备含抗体的生物芯片，选用Cy-3标记的山羊抗兔IgG(激发波长为554nm，发射波长为568nm)，以及实施例2制备的耐水性光子晶体微阵列(260nm光子晶体，禁带范围：550-650nm)构建含抗体的生物芯片。具体步骤如下：
(1)配置6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和30mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，交联反应使用体积比为1:1，现配现用。
(2)将耐水性光子晶体微阵列浸泡到4mL EDC/NHS混合溶液中，室温，2h进行活化。
(3)取出PET片放置培养皿中，待干燥后，向活化过的耐水性光子晶体微阵列上逐个点阵滴加1mg/mL Cy-3标记的山羊抗兔IgG，每个点阵的体积大约0.3μL，密封培养皿，置于4℃冰箱过夜。
(4)取出培养皿，因偶联发应在4℃条件下进行，可以保证抗体活性，对微阵列上多余抗体进行收集回收，重复使用。而后，用PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，Tween-20，万分之五)清洗耐水性光子晶体微阵列3～5次，洗去多余未偶联的Cy-3标记的山羊抗兔IgG，即得到本实施例制备的含抗体的生物芯片。
(5)将本实施例制备的含抗体的生物芯片置于荧光显微镜下，选择激发波段为512-552nm，发射波段为565-615nm的绿色滤波片进行观察并拍摄荧光图像。
(6)同时，另取一个实施例2制备的光子晶体微阵列不进行偶联反应处理，直接在该点阵上滴加Cy-3标记的山羊抗兔IgG，拍摄荧光图像；
(7)未偶联反应的光子晶体微阵列与本实施例制备的含抗体的生物芯片荧光图像进行荧光强度比较，计算出抗体固定的平均偶联率。
图4为上述步骤关于生物芯片(光子晶体微阵列偶联Cy-3标记IgG抗体)示意图。从图中可以看出，因光子晶体乳胶球表面暴露出大量-COOH官能团，通过EDC/NHS作为偶联剂，与抗体蛋白中的-NH2反应，形成酰胺键，实现在耐水性光子晶体微阵列上固定抗体。
为了对其固定效果进行表征，通过荧光显微镜图测得的荧光强度前后变化来计算抗体固定的偶联率。图5为生物芯片荧光显微镜图，左图代表光子晶体未偶联Cy-3标记IgG抗体，以直接滴加方式的荧光成像图；中图代表光子晶体偶联Cy-3标记IgG抗体的荧光成像图；右图代表光子晶体在同一参数下的荧光成像图。利用共聚焦显微镜拍摄出的荧光图，直接利用仪器自带软件计算每幅图出荧光强度值，左图平均荧光强度值为3620，中图平均荧光强度值为1230，右图荧光强度值为0(光子晶体本身无荧光，仅具有荧光增益的性能)。重复20次试验，通过偶联法/直接滴加法得到的荧光强度数值计算得到该Cy-3标记IgG抗体的偶联率范围为30％～40％，平均抗体偶联效率为34％。
实施例4
制备含适配体的生物芯片，选用C6 Amino FAM适配体(激发波长为480nm，发射波长为524nm)，以及耐水性光子晶体微阵列(参照实施例2方法制备得到，使用220nm光子晶体；禁带范围：460-540nm)。具体步骤如下：
(1)配置6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和30mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，交联反应使用体积比为1:1，现配现用。
(2)将实施例2制备的耐水性光子晶体微阵列浸泡到4mL EDC/NHS混合溶液中，室温、2h进行活化。
(3)取出光子晶体微阵列放置培养皿中，待干燥后，向活化过的光子晶体微阵列上逐个点阵滴加1mg/mL C6 Amino FAM适配体，每个点阵的体积大约0.3μL，密封培养皿，置于4℃冰箱过夜。
(4)取出培养皿，因偶联发应在4℃条件下进行，可以保证适配体活性，可对微阵列上多余适配体进行收集回收，重复使用。而后，用PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，Tween-20，万分之五)清洗耐水性光子晶体微阵列3-5次，洗去多余未偶联的C6 Amino FAM适配体，即得到本实施例制备的含适配体的生物芯片。
(5)将光晶微阵列置于荧光显微镜下，选择激发波段为465-495nm，发射波段为515-555nm的滤波片进行观察并拍摄荧光图像。
(6)同时，另取一个耐水性光子晶体微阵列不进行偶联反应，直接在点阵上滴加C6Amino FAM适配体，拍摄荧光图像；
(7)未偶联反应的耐水性光子晶体微阵列与本实施例制备的含适配体的生物芯片荧光图像进行荧光强度比较，计算出适配体固定的平均偶联率。重复20次试验后，计算出适配体固定的平均偶联率。
图6为本实施例制备的含适配体的生物芯片示意图。从图中可以看出，因光子晶体乳胶球表面暴露出大量-COOH官能团，通过EDC/NHS作为偶联剂，与适配体端头修饰的-NH2反应，形成酰胺键，实现在光子晶体微阵列上固定适配体。
为了对其固定效果进行表征，通过荧光强度前后变化来计算适配体固定的偶联率。图7为喷墨打印制备光子晶体微阵列偶联生物抗体荧光显微镜图。左图代表光子晶体C6Amino FAM适配体，以直接滴加方式的荧光成像图；中图代表光子晶体偶联C6 Amino FAM适配体的荧光成像图；右图代表光子晶体在同一参数下的荧光成像图。利用共聚焦显微镜拍摄出的荧光图，直接利用仪器自带软件计算每幅图出荧光强度值，左图平均荧光强度值为3536，右图平均荧光强度值为2581。重复20次试验，通过偶联法/直接滴加法得到的荧光强度数值计算得到该C6 Amino FAM适配体固定的偶联率范围为70～80％，平均偶联率为73％。
实施例5
含Cy-5标记纳米抗体二抗的生物芯片的荧光增益效果验证，方法如下：
以心衰标记物ST2抗原-抗体体系为例，选用ST2抗原以及Cy-3标记的ST2纳米抗体一抗和Cy-5标记纳米抗体二抗，实际上以Cy-5染料(激发波长：640nm；发射波长：680nm)荧光强度为检测标准，因此选择粒径为300nm的耐水性光子晶体微阵列(参照实施例2的制备方法，选用粒径为300nm的乳胶球PC300)作为固定载体(禁带范围：630-730nm)。具体步骤如下：
(1)Cy-5作为荧光标记物常被用于标记抗体或适配体，根据其激发波长640nm，发射波长为680nm作为光子晶体禁带范围参考，依据现有布拉格衍射公式推导计算出对应的光子晶体粒径300nm。
(2)选用PC300为光子晶体制备光子晶体微阵列，同时，另取一个空白PET板作为对比微阵列，在上分别滴加100ng/ml Cy-5标记纳米抗体二抗，每个点阵滴加体积为0.3μl，即得到本实施例制备的含Cy-5标记纳米抗体二抗的生物芯片。
(3)待液滴干燥完全，将上述对比微阵列和本实施例制备的生物芯片PC300放置共聚焦荧光显微镜下观察荧光，拍摄并统计荧光强度值。重复20次试验后，计算出平均荧光强度值。
图8为本实施例含Cy-5标记纳米抗体二抗的荧光增益效果成像图。右上角数字代表其平均荧光强度值。从图中很明显看出，PC300的平均荧光强度值为3025，对比微阵列的荧光强度值为30。由此可以看出，PC300对Cy5标记ST2纳米二抗具有很强的荧光增益作用，根据平均荧光强度值计算，平均增益值约为100倍。
实施例6
含Cy-5标记纳米抗体二抗的生物芯片快速生物检测方法，具体方法如下：
这里以心衰标记物ST2抗原-抗体体系为例，选用ST2抗原以及Cy-3标记的ST2纳米抗体一抗和Cy-5标记纳米抗体二抗，因目标检测物ST2抗原，本实施例使用Cy-3标记的ST2纳米抗体一抗是为了直观地验证抗体固定在光子晶体上并同时可以计算出固定效率。同时选择实施例5中所用的耐水性光子晶体微阵列作为固定载体(禁带范围在630-730nm)。实验具体步骤如下：
(1)配置6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和30mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，交联反应使用体积比为1:1，现配现用。
(2)将光子晶体微阵列浸泡到EDC/NHS混合溶液中，室温，2h。
(3)取出光子晶体微阵列放置培养皿中，待干燥后，向活化过的光子晶体微阵列上逐个点阵滴加10μg/mL Cy-3标记的ST2纳米抗体一抗，每点的体积大约0.3μL，密封培养皿，置于4℃冰箱过夜。
(4)取出培养皿，用PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，Tween-20，万分之五)清洗光子晶体微阵列3-5次，洗去多余未偶联的Cy-3标记的ST2纳米抗体一抗，即得到本实施例制备的含Cy-5标记纳米抗体二抗的生物芯片。
(5)对上述生物芯片进行封闭处理，配制质量分数为5％脱脂牛奶粉，采用完全浸泡方式对上述生物芯片进行封闭37℃，1h，占据生物芯片未偶联区域，降低非特异性吸附；封闭完后的生物芯片进行PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，Tween-20，万分之五)清洗3-5次，洗去多余脱脂牛奶粉溶液。
(6)将10μL ST2抗原(100μg/mL)与100μL Cy-5标记纳米抗体二抗(10μg/mL)混合孵育30min，37℃。
(7)取0.3μL步骤(6)中的混合溶液滴加到步骤(5)封闭处理后的生物芯片上，密封培养皿，置于4℃冰箱过夜。
(7)取出培养皿，用PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，Tween-20，万分之五)步骤(7)处理过的生物芯片3-5次，洗去生物芯片上多余未识别的ST2抗原与Cy-5标记纳米抗体二抗的混合溶液，即得到完成识别的生物芯片。
(8)将完成识别的生物芯片置于共聚焦显微镜下，选择561nm和640nm激发光进行激发，进行观察并拍摄荧光图像。
(9)对照组，分别设置不加目标检测物ST2抗原、加不能够互相识别的人IgG代替ST2抗原分别为本实施例的对照组1、对照组2，重复上述实验步骤(1)-(8)。
图9为本实施例制备的含Cy-5标记纳米抗体二抗的生物芯片识别心肌标志物ST2三明治夹心免疫检测示意图。
从图10中可以看出，通过光子晶体乳胶球表面暴露出大量-COOH官能团，以EDC/NHS作为偶联剂，与纳米抗体蛋白中的-NH2反应，形成酰胺键，实现在光子晶体微阵列上固定ST2纳米抗体一抗；而后对未被占据的活性位点进行封闭，降低非特异性吸附，排除假阳性；最终验证ST2抗原与纳米抗体二抗混合物与固定于光子晶体上的纳米一抗的识别功能。
图10为本实施例喷墨打印制备光子晶体微阵列搭建心肌标志物ST2三明治夹心免疫检测芯片验证识别功能的Confocal图，其中本实施例的完成识别的芯片(如图10中编号1、2、3)，不加目标检测物ST2抗原的对照组1(如图10中编号4、5、6)，加不能够互相识别的人IgG的对照组2(如图10中编号7、8、9)。从图10中可以看出，因纳米抗体一抗标记Cy-3荧光物质(激发波长：561nm)呈现绿色荧光图(如图编号3、6、9)，因其识别ST2抗原以及纳米二抗标记Cy-5荧光物质(激发波长：640nm)呈现红色荧光图(如图编号2、5、8)，二者叠加图(Merge图)呈现红绿色叠加的橙色荧光图(如图编号1、4、7)。从对照组荧光成像图可以看出，对照组1和2在640nm激发通道无红色荧光成像，即说明含有光子晶体的生物芯片不仅可以固定生物抗体，且不会破坏其原有的识别功能。
图11为生物芯片识别目标检测物ST2抗原的SEM图。从图11中可以看出，光子晶体表面被抗体包裹，其ST2抗原嵌入光子晶体小球间。从其构建荧光免疫三明治夹心检测结构中可以看出，虽然光子晶体一直处于水溶液体系浸泡，但光子晶体依然能够保持很好的周期性结排列，证明经过烧结，可以实现光子晶体固定在PET片上，且在反复清洗浸泡实验过程中不会被冲散，具有很好的耐水性能。
图12为光子晶体微阵列烧结前后及其制备的生物芯片的反射率变化谱图，其中，PC代表烧结之前的光子晶体微阵列(参照实施例1的制备方法，选用粒径为300nm的乳胶球)的反射率图谱，PCs代表光子晶体微阵列经过110℃烧结10min固化后的反射率图谱，PCS-ST2为光子晶体搭建心衰标志物ST2三明治免疫夹心体系后的反射率光谱。从图12中可以看出，光子晶体小球经过110℃烧结10min固化后，未破坏小球周期性排列的结构形貌以及尺寸变化，反而使小球之间排列更加紧密，导致其反射光谱发射蓝移；在生物芯片进行抗原二抗识别时，其反射光谱发生了红移是因为抗体抗原负载于小球表面，导致小球与小球间的折射率发生改变，产生反射峰的红移，进一步验证光子晶体搭建光子晶体微阵列不仅可以固定生物材料抗体，且不会破坏其原有的识别功能，可实现对目标检测物ST2抗原的检测。
实施例7
含Cy-5标记纳米抗体二抗的生物芯片的快速生物可视化检测的最低检测限
以心衰标记物ST2抗原-抗体体系为例，选用ST2抗原以及ST2纳米抗体一抗和Cy-5标记纳米抗体二抗，因目标检测物ST2抗原，实际上以Cy-5染料(激发波长：640nm；发射波长：680nm)荧光强度为检测标准，因此选择与Cy-5染料匹配的粒径为300nm光子晶体微阵列作为固定载体(禁带范围：630-730nm)，具体步骤如下：
(1)配置6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和30mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),交联反应使用体积比为1:1，现配现用。
(2)将实施例2制备的光子晶体微阵列浸泡到EDC/NHS混合溶液中，室温(25℃)、2h，对光子晶体微阵列进行活化。
(3)取出光子晶体微阵列放置培养皿中，待干燥后，向活化过的光子晶体点阵列上逐个点阵滴加10μg/mL ST2纳米抗体一抗，每个点阵的体积大约0.3μL，密封培养皿，置于4℃冰箱过夜。
(4)取出培养皿，用PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，Tween-20，万分之五，体积分数)清洗光子晶体微阵列3-5次，洗去多余未偶联的ST2纳米抗体一抗，即得到本实施例制备的含Cy-5标记纳米抗体一抗的生物芯片。
(5)对步骤(4)的生物芯片进行封闭处理，配制质量分数为5％脱脂牛奶粉，采用完全浸泡方式对生物芯片进行封闭37℃、1h，占据光子晶体微阵列上未偶联区域，降低非特异性吸附；封闭处理后的生物芯片进行PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，Tween-20，万分之五，体积分数)清洗3-5次，洗去多余脱脂牛奶粉溶液。
(6)将ST2抗原(原液浓度为100μg/mL)分别稀释10倍、100倍、…106倍后，得到ST2抗原系列溶液(浓度分别为10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、…10-4μg/mL)，前述ST2抗原系列溶液各取10μL与2μL Cy-5标记纳米抗体二抗(450ng/mL)混合孵育30min，37℃，得到混合溶液。
(7)取0.3μL步骤(6)中的混合溶液滴加到步骤(5)封闭处理后的生物芯片上，密封培养皿，置于4℃冰箱过夜。
(8)取出培养皿，用PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，Tween-20，万分之五)清洗生物芯片3-5次，洗去生物芯片上多余未识别的ST2抗原与Cy-5标记纳米抗体二抗的混合溶液。
(9)将步骤(8)完成识别的生物芯片置于共聚焦显微镜下，选择640nm激发光进行激发，进行观察并拍摄荧光图像。
阴性对照组：设置一组无目标检测物ST2抗原作为阴性对照组。因为实验中无法排除非特异性吸附的干扰，每次实验需增加无ST2抗原的对照组作为背景。对照组制备方法同上，区别在于步骤(6)中无ST2抗原。
图13为本实施例制备的生物芯片识别心衰标志物ST2三明治夹心免疫检测(从左到右分别为：识别的生物芯片对应的目标检测物ST2抗原稀释梯度10、102、103、104、105、106倍数及无ST2抗原，抗原初始浓度为100μg/ml)的荧光显微镜图。经计算，图13中从左到右荧光显微镜图对应的荧光强度值分别为：3101、1637、1281、1033、658、583、251。利用差减法计算出实际识别部分绝对荧光强度值(即识别ST2抗原的生物芯片的荧光强度值减去阴性对照组的荧光强度值)，即ST2抗原分别稀释10～106倍的对应的实际识别的生物芯片的荧光强度值为2850，1386，1030，782，407，332。在实际医学临床应用中，ST2心脏标志物以35ng/ml为阈值。当ST2心衰标志物>35ng/ml，超过此临界值的心衰患者被认为具有更高的再入院、心脏移植、死亡等风险。而本发明的生物芯片在目标检测物的浓度为0.1ng/ml时，仍具有明显的荧光现象。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种光子晶体墨水，其特征在于，所述光子晶体墨水包含光子晶体、保湿剂和润湿剂；其中，所述光子晶体为单分散乳胶球。
2.如权利要求1所述的光子晶体墨水，其特征在于，所述单分散乳胶球的粒径为150-320nm；
优选地，所述单分散乳胶球选自聚(甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸-苯乙烯)乳胶球、二氧化硅微球、聚苯乙烯微球中的至少一种；
优选地，所述单分散乳胶球的表面带有-COOH官能团；
优选地，所述光子晶体墨水中，所述光子晶体的质量浓度为5-30％；
优选地，所述保湿剂选自乙二醇、丙二醇、丙三醇、山梨糖醇中的至少一种；
优选地，所述光子晶体墨水中，所述保湿剂的质量浓度为5-10％；
优选地，所述润湿剂可以选自BYK-3400、BYK-3455、BYK-151、BKY-154中的至少一种；
优选地，所述光子晶体墨水中，所述润湿剂的质量浓度为0.5-5‰，例如1-3‰；
优选地，所述光子晶体墨水中含有溶剂。
3.权利要求1或2所述的光子晶体墨水的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述光子晶体、所述保湿剂和所述润湿剂混合，制备得到所述光子晶体墨水；
优选地，所述光子晶体为单分散乳胶球。
4.权利要求1所述的光子晶体墨水在喷墨打印中的应用；优选地，所述光子晶体墨水在喷墨打印制备光子晶体微阵列中的应用。
5.一种光子晶体微阵列，其特征在于，所述光子晶体微阵列由光子晶体在基材上自组装形成；
优选地，所述光子晶体微阵列为由光子晶体在基材上自组装形成的周期性规则排列；
所述光子晶体由权利要求1或2所述光子晶体墨水提供；
优选地，所述光子晶体微阵列由权利要求1或2所述光子晶体墨水经喷墨打印，在基材上自组装形成；
优选地，所述光子晶体微阵列为耐水性光子晶体微阵列；
优选地，所述光子晶体微阵列还包括基材；
优选地，所述基材的接触角大于60°。
优选地，所述光子晶体微阵列的制备方法，包括如下步骤：由光子晶体在基材上自组装形成所述光子晶体微阵列；
优选地，所述光子晶体微阵列的制备方法，包括如下步骤：由所述光子晶体墨水经喷墨打印，在所述基材上自组装形成所述光子晶体微阵列；
优选地，所述基材为PET膜；更优选地，所述PET膜的接触角为70°；
优选地，所述光子晶体微阵列的制备方法还包括对得到的光子晶体微阵列进行热烧结；
优选地，所述热烧结的温度为100-150℃；优选地，所述热烧结的时间为10-20min。
6.一种生物芯片，包含如权利要求5所述光子晶体微阵列和生物材料，所述生物材料固定在所述光子晶体微阵列上；优选地，所述生物材料通过偶联反应固定在所述光子晶体微阵列上；
优选地，所述生物材料含有-NH2官能团；所述生物材料优选选自酶、核酸、抗原、抗体、适配体、结合蛋白质、植物凝血素、激素受体中的至少一种；
优选地，所述生物材料为由荧光分子标记的生物材料；
优选地，所述生物芯片具有三明治夹心结构；
优选地，所述生物芯片能够特异性识别与所述生物材料相适配的目标分析物；
优选地，所述生物芯片的制备方法，包括：将所述生物材料固定在所述光子晶体微阵列上，形成所述生物芯片；
优选地，所述生物材料通过偶联反应固定在所述光子晶体的微阵列上，形成所述生物芯片；
优选地，所述生物芯片的制备方法，包括如下步骤：活化所述光子晶体微阵列中的所述光子晶体，使所述光子晶体表面暴露出大量的-COOH官能团，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在下，发生交联反应，再与所述生物材料中的-NH2反应，形成酰胺键，得到所述生物芯片。
7.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求6所述生物芯片。
8.一种生物检测平台，所述生物检测平台含有如权利要求6所述生物芯片或权利要求7所述的试剂盒。
9.如权利要求5所述的光子晶体微阵列、权利要求6所述的生物芯片、权利要求7所述的试剂盒或权利要求8所述的所述生物检测平台在生物检测中的应用；
优选用于特异性识别目标分析物，所述目标分析物与所述生物材料相适配。
10.权利要求6所述的生物芯片、权利要求7所述的试剂盒或权利要求8所述的所述生物检测平台识别目标分析物的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：将所述生物芯片与目标分析物接触，通过荧光检测进行识别；优选地，所述荧光检测可识别的目标分析物最低浓度为0.01ng/mL；
优选地，所述目标分析物的质量浓度为0.01ng/mL-100mg/mL；优选地，所述目标分析物的质量浓度为0.01ng/mL-1mg/mL；优选地，所述目标分析物由荧光分子标记。
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