CN115105598A - 靶向adrb1在免疫治疗中的用途 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于调节受试者调节性MAIT细胞数目和功能从而进行疾病治疗的药物组合物，所述药物组合物包含ADRB1拮抗剂或激动剂或调控ADRB1表达或功能的试剂，和药学上可接受的载体，其中所述调节性MAIT细胞为FOXP3+CXCR3+MAIT细胞。本申请还公开了包含所述药物组合物的药盒，以及其用途。
Description
技术领域
本申请涉及免疫治疗领域。具体而言，本申请涉及用于治疗调节性MAIT细胞亚群表达水平升高的疾病如肝癌的药物组合物和药盒，及其用途。
背景技术
免疫系统与多种疾病的发生发展密切相关，过度激活和失活均会导致疾病的发生。大量的临床证据也表明，调节性免疫细胞亚群在肿瘤、感染、自身免疫性疾病、炎症性疾病等重大疾病的发生发展过程中起着关键作用，在患者的临床诊断和治疗中都有很好的应用前景。靶向调节性免疫细胞是一种很有效的免疫治疗方案。除了已知的调节性B细胞,调节性T细胞,肿瘤相关巨噬,肿瘤相关中性粒,髓系来源抑制性细胞和调节性DC等一系列具有免疫调节功能的细胞外，在病理微环境中是否还存在一些未知的免疫调节细胞亚群尚不清楚。因此，发现新的免疫调节细胞亚群，探究其调控疾病进展的作用机制，将为各类疾病的免疫治疗提供新的策略和治疗靶点。
发明内容
MAIT细胞(Mucosal associated invariant T cells,粘膜相关的恒定T细胞)是一群特殊的固有样T淋巴细胞，可以识别MR1分子递呈的抗原，在多种疾病的发生发展中发挥重要的作用(见CN104884612A)。MAIT细胞在人类中，尤其是在人的肝脏中比例很高，可以高达占肝脏所有T细胞的50％。已知在小鼠和人体内都发现了两个主要的MAIT细胞亚群，MAIT1和MAIT17，但是是否存在新的具有免疫抑制功能的MAIT细胞亚群参与对疾病的调控尚未见报道。我们发现在肝癌患者中存在调节性的MAIT细胞亚群，并且与肝癌的发生密切相关，但是在健康人的外周血中并不存在。这些调节性MAIT细胞可以显著抑制T细胞活化。并且，我们还证实靶向β1肾上腺素受体(β1adrenergic receptor,ADRB1)可以促进或抑制调节性MAIT细胞的分化和功能。我们的研究表明，靶向ADRB1可以实现对调节性MAIT细胞分化和功能的调控，从而应用于免疫治疗。
具体而言，本申请通过以下项目所述的技术方案解决了本领域的技术问题。
1.一种用于调节受试者调节性MAIT细胞数目和功能从而进行疾病治疗的药物组合物，所述药物组合物包含ADRB1拮抗剂或激动剂或调控ADRB1表达或功能的试剂，和药学上可接受的载体，其中所述调节性MAIT细胞为FOXP3+CXCR3+MAIT细胞。
2.项目1所述的药物组合物，其中所述疾病为肝脏的疾病，如肝癌、肝炎，如甲肝、乙肝、丙肝、戊肝；自身免疫疾病，如多发性硬化；炎症性疾病；和癌症；优选地，所述疾病为肝癌。
3.项目1-2所述的药物组合物，其中所述ADRB1拮抗剂为洛尔类药物，如美托洛尔、比索洛尔、普萘洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、艾司洛尔、醋丁洛尔、噻吗洛尔、阿普洛尔，所述ADRB1激动剂选自多巴酚丁胺和异丙肾上腺素，或者所述ADRB1拮抗剂或激动剂为对ADRB1具有拮抗或激动功能的抗ADRB1抗体，优选单克隆抗体，反义核酸或适体；所述调控ADRB1表达或功能的试剂选自siRNA和基因编辑试剂及其组合。
4.一种用于调节受试者调节性MAIT细胞数目和功能从而进行疾病治疗的药盒，其包含项目1-3任一项所述的药物组合物。
5.ADRB1拮抗剂或激动剂或调控ADRB1表达或功能的试剂和药学上可接受的载体在制备调节受试者调节性MAIT细胞数目和功能从而进行疾病治疗的药物或药盒中的用途。
6.项目5所述的用途，其中所述疾病为肝脏的疾病，如肝癌、肝炎，如甲肝、乙肝、丙肝、戊肝；自身免疫疾病，如多发性硬化；炎症性疾病；和癌症；优选地，所述疾病为肝癌。
7.项目5-6所述的用途，其中所述ADRB1拮抗剂为洛尔类药物，如美托洛尔、比索洛尔、普萘洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、艾司洛尔、醋丁洛尔、噻吗洛尔、阿普洛尔，所述ADRB1激动剂选自多巴酚丁胺和异丙肾上腺素，或者所述ADRB1拮抗剂或激动剂为对ADRB1具有拮抗或激动功能的抗ADRB1抗体，优选单克隆抗体，反义核酸或适体；所述调控ADRB1表达或功能的试剂选自siRNA和基因编辑试剂及其组合。
8.项目1-3所述的药物组合物、项目4所述的药盒或项目5-7所述的用途，其中所述受试者是人。
本文所述的受试者包括哺乳动物，例如人、猴、马、牛、犬、猫、小鼠、大鼠和猪等，优选地，所述受试者是人。本文所述的药物组合物可以通过任何适当的方法使用，包括例如口服、静脉内、胃肠外、经皮、皮下、阴道内、腹膜内、鼻内、粘膜、舌下、局部或直肠给药以及它们的任何组合。
“药学上可接受的载体”是指药物组合物中除活性成分以外的成分，其对受试者是无毒性的。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在本文中，“调控ADRB1表达或功能的试剂”指能够在体外或体内调控调节性MAIT细胞的ADRB1表达水平(如蛋白质表达水平或mRNA表达水平)或功能(如调节ADRB1活性)的试剂。在一个实施方案中，调控ADRB1表达或功能的试剂选自siRNA和基因编辑试剂及其组合。
在一些实施方案中，给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、或其它不经肠道的施用途径，例如通过注射或输注。在一些实施方案中，注射途径包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、硬膜内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管的、皮下、表皮下、关节内、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内的注射和输注。在一些实施方案中，可以通过局部的、表皮的或粘膜的施用途径给药。
在一些实施方案中，本发明所述的治疗包括改变被治疗的受试者的天然临床进程，并且可以包括预防或临床病理水平的改善。治疗包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的直接或间接病理后果，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和改善的预后。在一些实施方案中，本发明的药物组合物或药盒用于治疗和/或预防相关疾病，和/或用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。
在一些实施方案中，为了预防或治疗疾病，本发明的药物组合物的合适剂量可以通过待治疗疾病的类型、疾病的严重性和进程、药物组合物以预防目的给药还是以治疗目的给药、以前的治疗、患者的临床病史和对所述药物组合物的应答等因素确定。药物组合物可以通过一次或多次分别给药，或通过连续输注。治疗的进展可以通过常规技术和测定来监测。
附图说明
图1至图3为实施例1的结果：肝癌患者中存在免疫抑制功能的调节性MAIT细胞。
图4为实施例2的结果：调节性MAIT细胞抑制肝癌患者CD8 T细胞的功能。
图5为实施例3的结果：肝癌患者中调节性MAIT细胞与肝癌的发生密切相关。
图6为实施例4的结果：肝癌患者中调节性MAIT细胞高表达ADRB1。
图7和8为实施例5的结果：ADRB1促进调节性MAIT细胞的诱导和抑制性功能。
图9为实施例6的结果：肝癌患者去甲肾上腺素含量随肝癌恶性程度的增加而增加，与MAITreg细胞比例呈正相关。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
以下的实例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
Purified抗人CD3抗体：Biolegend，300332
Purified抗人CD28抗体：Biolegend，302934
APC-CY7抗人CD3抗体：Biolegend，317342
PE-CY7抗人FOXP3抗体：eBioscience，25-4776-42
FITC抗人FOXP3抗体：eBioscience，11-4776-42
BV510抗人CXCR3抗体：Biolegend，353726
BV421抗人CD4抗体：Biolegend，357424
PE-CY7抗人CD8抗体：Biolegend，344712
PerCP5.5抗人CD25抗体：Biolegend,302626
PE-CY7抗人PD1抗体：Biolegend，621616
PE-CY7抗人CTLA4抗体：Biolegend，349914
PerCP5.5抗人Granzyme B抗体：Biolegend，372212
BV421抗人IL-10抗体：Biolegend，501422
FITC抗人TGF-β抗体：Biolegend，349606
PE抗人IL-17A抗体：Biolegend，512306
APC抗人ADRB1抗体：Bioss，0295P-APC
Purified抗cAMP抗体：Abcam，ab134901
FITC抗兔IgG：Biolegend，406403
抗人CD3磁珠：Miltenyibiotec，130-050-101
CFSE：eBioscience，65-0850-84
TGF-β：Peprotech，100-21C
IL2：Peprotech，20
TritonX-100:Sigma-Aldrich,V900502
Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA):MCE,HY-18739
Ionomycin:MCE,HY-13434A
PE-hMR1-5-OP-RU四聚体和APC-hMR1-5-OP-RU四聚体：由美国国家卫生研究院埃默里大学四聚体研发中心提供。
实施例1、肝癌患者中存在免疫抑制功能的调节性MAIT细胞亚群
1、肝癌患者中存在CXCR3+FOXP3+MAIT细胞
分别提取肝癌患者癌旁和肿瘤组织淋巴细胞，用APC-CY7抗人CD3抗体、BV510抗人CXCR3抗体、PE-hMR1-5-OP-RU四聚体冰上标记淋巴细胞30分钟，PBS洗两遍后，4％PFA冰上固定15分钟，PBS洗两遍后，在0.1％tritonX-100PBS溶液中冰上标记FITC抗人FOXP3抗体60分钟，流式检测发现肝癌患者癌旁和肿瘤组织中存在CXCR3+CD25+MAIT细胞。结果见图1a-c。
我们之前的工作对肝癌患者癌旁和肿瘤组织中MAIT细胞进行了单细胞测序技术的分析，发现CXCR3+MAIT细胞在肿瘤中的比例明显升高，并且高表达活化和耗竭相关的基因，表现出抑制性的表型。我们认为在肝癌患者中可能存在有免疫抑制功能的调节性MAIT细胞亚群。FOXP3是调节性T细胞主要的转录因子，于是我们首先用流式细胞仪检测了健康人外周血以及肝癌患者外周血、癌旁和肿瘤组织中MAIT细胞FOXP3的表达情况，结果见图1a。FOXP3主要表达在肝癌患者CXCR3+MAIT细胞中，但是健康人血液中并未发现CXCR3+MAIT细胞，结果见图1a-c。
2、肝癌患者中CXCR3+FOXP3+MAIT细胞表现Treg相关特征
(1)提取肝癌患者外周血癌旁和肿瘤组织淋巴细胞，用APC-CY7抗人CD3抗体、BV510抗人CXCR3抗体、PE-hMR1-5-OP-RU四聚体、PerCP5.5抗人CD25抗体、PE-CY7抗人PD1抗体或PE-CY7抗人CTLA4抗体冰上标记淋巴细胞30分钟，PBS洗两遍后，4％PFA冰上固定15分钟，PBS洗两遍后，在0.1％tritonX-100透膜液中冰上标记FITC抗人FOXP3抗体60分钟，流式检测FOXP3+CXCR3+MAIT细胞、FOXP3-CXCR3+MAIT细胞、FOXP3+CXCR3-MAIT细胞和FOXP3-CXCR3-MAIT细胞CD25、CTLA4和PD1的表达。结果见图2a,c。
(2)提取肝癌患者外周血癌旁和肿瘤组织淋巴细胞，用PMA(50ng ml-1)和伊屋诺霉素(Ionomycin)(1μM)活化4小时，用APC-CY7抗人CD3抗体、BV510抗人CXCR3抗体、APC-hMR1-5-OP-RU四聚体冰上标记淋巴细胞30分钟，PBS洗两遍后，4％PFA冰上固定15分钟，PBS洗两遍后，在0.1％tritonX-100透膜液中冰上标记PE-CY7抗人FOXP3抗体、PerCP5.5抗人Granzyme B抗体、BV421抗人IL-10抗体、FITC抗人TGF-β抗体、PE抗人IL-17A抗体60分钟，流式检测FOXP3+CXCR3+MAIT细胞、FOXP3-CXCR3+MAIT细胞、FOXP3+CXCR3-MAIT细胞、FOXP3-CXCR3-MAIT细胞和Tetramer-FOXP3+T细胞颗粒酶B、IL-10、TGF-β和IL-17A的表达。结果见图2b,d。
与患者癌旁和肿瘤组织中的FOXP3-CXCR3+MAIT细胞和FOXP3+CXCR3-MAIT细胞相比，FOXP3+CXCR3+MAIT细胞表面表达更高的CD25、CTLA4和PD1(图2a,c)，激活后产生更多颗粒酶B、IL-10、TGF-β和IL-17A(图2b,d)。同样，FOXP3-CXCR3-MAIT细胞并没有表现出Treg相关特征。此外，我们发现肝癌患者的FOXP3+CXCR3+MAIT细胞比传统的Treg细胞在活化之后能产生更多的颗粒酶B、IL-10、TGF-β和IL-17A(图2b,d)。
3、调节性MAIT细胞有免疫抑制性功能
模拟体外Treg的诱导条件，在有TGF-β(5nM)和IL2(100IU)存在的条件下，用αCD3(5μg ml-1)/αCD28(5μg ml-1)铺板激活健康人外周血单核细胞(PBMC)，培养6天诱导调节性MAIT细胞(CXCR3hi CD25hi MAIT细胞)。
进一步证明发现的FOXP3+CXCR3+MAIT细胞有免疫抑制功能，
(1)多聚赖氨酸处理96孔板，αCD3(5μg ml-1)/αCD28(5μg ml-1)在37℃铺板1小时。
(2)我们分选出体外诱导的CXCR3hi CD25hi MAIT细胞(MAITreg)和Tetramer-CD4+CD25hi T细胞(Treg)分别与CFSE标记的Tetramer-CD4+CD25-T细胞(Tresp)共培养，分成十组，每组三个复孔。
第一组，PBS铺板的孔，只加入4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞，阴性对照组。
第二组，αCD3/αCD28铺板的孔，只加入4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞，阳性对照组。
第三组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和4万个体外诱导的调节性MAIT细胞。
第四组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和2万个体外诱导的调节性MAIT细胞。
第五组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和1万个体外诱导的调节性MAIT细胞。
第六组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和0.5万个体外诱导的调节性MAIT细胞。
第七组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和4万个体外诱导的调节性T细胞。
第八组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和2万个体外诱导的调节性T细胞。
第九组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和1万个体外诱导的调节性T细胞。
第十组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和0.5万个体外诱导的调节性T细胞。
(3)培养3天后流式检测Tresp细胞CFSE的荧光值，观察调节性MAIT细胞和调节性T细胞分别对Tresp细胞增殖的影响。结果见图3。
发现调节性MAIT细胞可以在体外有效抑制T细胞的增殖，并且抑制能力比传统的调节性T细胞更强(图3a,b)。
实施例2、调节性MAIT细胞抑制肝癌患者CD8 T细胞的功能
为了探究调节性MAIT细胞在抗肿瘤免疫应答中的作用，我们研究了调节性MAIT细胞对CD8 T细胞的影响。模拟体外Treg的诱导条件，在有TGF-β(5nM)和IL2(100IU)存在的条件下，用αCD3(5μg ml-1)/αCD28(5μg ml-1)铺板激活健康人外周血单个核细胞，培养6天诱导调节性MAIT细胞(CXCR3hi CD25hi MAIT细胞)。
(1)多聚赖氨酸处理96孔板，αCD3(5μg ml-1)/αCD28(5μg ml-1)在37℃铺板1小时。
(2)我们分选出体外诱导的CXCR3hi CD25hi MAIT细胞(MAITreg)和CXCR3-CD25-MAIT细胞分别与CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞共培养，分成六组，每组三个复孔。
第一组，PBS铺板的孔，只加入4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞，阴性对照组。
第二组，αCD3/αCD28铺板的孔，只加入4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞，阳性对照组。
第三组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和4万个体外诱导的调节性MAIT细胞。
第四组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和4万个体外诱导的调节性MAIT细胞，加入终浓度为10μg/mL的TGF-β。
第五组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和4万个CXCR3-CD25-MAIT细胞。
第六组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔4万个CFSE标记的Tetramer-CD8+CD25-T细胞和4万个CXCR3-CD25-MAIT细胞，加入终浓度为10μg/mL的TGF-β。
(3)步骤(2)处理细胞3天后收集细胞，用APC-CY7抗人CD3抗体、PE-CY7抗人CD8抗体、PE-hMR1-5-OP-RU四聚体冰上标记细胞30分钟，PBS洗两遍后，4％PFA冰上固定15分钟，PBS洗两遍后，在0.1％tritonX-100透膜液中冰上标记PerCP5.5抗人Granzyme B抗体60分钟，流式检测Tetramer-CD8+CD25-T细胞增殖和颗粒酶B产生的情况。结果见图4a-e。
我们发现体外诱导的调节性MAIT细胞能有效抑制CD8 T细胞的增殖(图4a,b)和颗粒酶B的产生(图4c-e)，并部分通过TGF-β的产生实现这一作用(图4a-e)。作为阴性对照，CXCR3-CD25-MAIT细胞对CD8 T细胞增殖和颗粒酶B产生无抑制作用(图4a-e)。
提取肝癌患者癌旁和肿瘤组织淋巴细胞，用APC-CY7抗人CD3抗体、PE-CY7抗人CD8抗体、PE-hMR1-5-OP-RU四聚体冰上标记淋巴细胞30分钟，PBS洗两遍后，4％PFA冰上固定15分钟，PBS洗两遍后，在0.1％tritonX-100透膜液中冰上标记PerCP5.5抗人Granzyme B抗体60分钟，流式检测Tetramer-CD8+T细胞颗粒酶B产生的情况。并对肿瘤组织调节性MAIT细胞比例和颗粒酶B阳性CD8 T细胞的比例进行相关性分析。结果见图4f-h。
肝癌患者肿瘤中CD8 T细胞产生的颗粒酶B明显少于癌旁组织中的CD8 T细胞(图4f,g)。此外，肝癌患者肿瘤中产生颗粒酶B的CD8 T细胞比例与调节性MAIT比例呈负相关(图4h)。
实施例3、肝癌患者中调节性MAIT细胞与肝癌的发生密切相关
为了研究MAITreg与肝癌发生之间的关系，我们根据巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期对肿瘤的恶性程度进行分类(A,B,C恶性程度逐渐增加)，通过收集不同时期肝癌患者的样本，流式检测患者肿瘤组织中MAITreg的比例，耗竭CD8+T、Treg等细胞的比例，探究不同类型肝癌患者MAITreg比例与已知促进肿瘤生长免疫细胞比例之间的相关性，与肿瘤恶性程度的相关性，与患者血清中肿瘤标志物(包括CEA、CA125、AFP等)含量的相关性。结果见图5。
肝癌患者肿瘤中MAITreg的比例随肝癌恶性程度的增加而增加(图5a)，肿瘤中Treg细胞的比例(图5b)、PD1+CD8+T细胞(图5c)以及患者血清中肿瘤标志物CA125、CEA的含量(图5d,e)与MAITreg的比例呈正相关。通过一系列相关性的分析以及前期表型和功能的分析确定MAITreg在肿瘤发生过程中起到促进作用。
实施例4、肝癌患者中调节性MAIT细胞高表达ADRB1
我们之前对肝癌患者癌旁和肿瘤组织中MAIT细胞进行单细胞测序分析的结果显示，CXCR3+MAIT细胞会在mRNA水平上特异性的高表达ADRB1，是儿茶酚胺类神经递质受体，可以被去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺等神经递质激活。在蛋白水平上，我们提取肝癌患者外周血、癌旁和肿瘤组织淋巴细胞，用APC-CY7抗人CD3抗体、BV510抗人CXCR3抗体、PE-hMR1-5-OP-RU四聚体、APC抗人ADRB1抗体冰上标记淋巴细胞30分钟，PBS洗两遍后，4％PFA冰上固定15分钟，PBS洗两遍后，在0.1％tritonX-100透膜液中冰上标记FITC抗人FOXP3抗体60分钟，通过流式检测肝癌患者外周血、癌旁和肿瘤组织中，FOXP3+CXCR3+MAITreg细胞、FOXP3+CXCR3-MAIT细胞、FOXP3-CXCR3+MAIT细胞、FOXP3-CXCR3-MAIT细胞以及传统的Treg细胞ADRB1的表达情况。结果见图6。
在肝癌患者外周血、癌旁和肿瘤组织中，ADRB1特异性的高表达在FOXP3+CXCR3+MAITreg细胞上(图6a,b)。
实施例5、ADRB1促进调节性MAIT细胞的诱导和抑制性功能
ADRB1信号可能在FOXP3+CXCR3+MAITreg细胞的诱导分化以及维持抑制性功能过程中起到关键作用。为了证明这个推测，我们在体外诱导MAITreg的体系中分别加入ADRB1的激动剂(多巴酚丁胺(Dobutamine)或异丙肾上腺素(Isoproterenol))或ADRB1的拮抗剂(倍他洛尔(Betaxolol)或普萘洛尔(Propranolol))，检测诱导出MAITreg细胞的比例，以及MAITreg细胞产生抑制性细胞因子(包括IL-10、TGF-β和IL-17A等)的情况。
1、ADRB1激动剂促进调节性MAIT细胞的诱导和抑制性功能
(1)多聚赖氨酸处理12孔板，αCD3(5μg ml-1)/αCD28(5μg ml-1)在37℃铺板1小时。
(2)提取健康人外周血PBMC，用磁珠富集CD3+T淋巴细胞，分成四组，每组三个复孔，每孔加入100IU的IL2。
第一组，PBS铺板的孔，阴性对照组。
第二组，αCD3/αCD28铺板的孔，阳性对照组。
第三组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔加入终浓度为10μM多巴酚丁胺。
第四组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔加入终浓度为10μM异丙肾上腺素。
(3)步骤(2)处理细胞6天后收集细胞，用APC-CY7抗人CD3抗体、BV510抗人CXCR3抗体、APC-hMR1-5-OP-RU四聚体冰上标记淋巴细胞30分钟，PBS洗两遍后，4％PFA冰上固定15分钟，PBS洗两遍后，在0.1％tritonX-100透膜液中冰上标记PE-CY7抗人FOXP3抗体、BV421抗人IL-10抗体、FITC抗人TGF-β抗体、PE抗人IL-17A抗体60分钟，流式检测MAITreg细胞的比例，以及MAITreg细胞产生抑制性细胞因子(包括IL-10、TGF-β和IL-17A等)的情况。结果见图7，ADRB1激动剂促进调节性MAIT细胞的诱导(图7a,b)和抑制性细胞因子IL-10(图7c)、TGF-β(图7d)和IL-17A(图7e)的产生。
2、ADRB1拮抗剂抑制调节性MAIT细胞的诱导和抑制性功能
(1)多聚赖氨酸处理12孔板，αCD3(5μg ml-1)/αCD28(5μg ml-1)在37℃铺板1小时。
(2)提取健康人外周血PBMC，用磁珠富集CD3+T淋巴细胞，分成四组，每组三个复孔，每孔加入100IU的IL2。
第一组，PBS铺板的孔，阴性对照组。
第二组，αCD3/αCD28铺板的孔，阳性对照组。
第三组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔加入终浓度为10μM倍他洛尔。
第四组，αCD3/αCD28铺板的孔，每孔加入终浓度为10μM普萘洛尔。
(3)步骤(2)处理细胞6天后收集细胞，用APC-CY7抗人CD3抗体、BV510抗人CXCR3抗体、APC-hMR1-5-OP-RU四聚体冰上标记淋巴细胞30分钟，PBS洗两遍后，4％PFA冰上固定15分钟，PBS洗两遍后，在0.1％tritonX-100透膜液中冰上标记PE-CY7抗人FOXP3抗体、BV421抗人IL-10抗体、FITC抗人TGF-β抗体、PE抗人IL-17A抗体60分钟，流式检测MAITreg细胞的比例，以及MAITreg细胞产生抑制性细胞因子(包括IL-10、TGF-β和IL-17A等)的情况。结果见图8，ADRB1拮抗剂抑制调节性MAIT细胞的诱导(图8a,b)和抑制性细胞因子IL-10(图8c)、TGF-β(图8d)和IL-17A(图8e)的产生。
实施例6、肝癌患者去甲肾上腺素含量随肝癌恶性程度的增加而增加，与MAITreg细胞比例呈正相关
ELISA检测健康人外周血、肝癌患者外周血以及肿瘤组织匀浆中去甲肾上腺素的含量，与肿瘤恶性程度的相关性，与肿瘤组织MAITreg细胞比例的相关性。结果见图9。
肝癌患者外周血去甲肾上腺素含量明显高于健康人外周血(图9a)，并且去甲肾上腺素含量随肝癌恶性程度的增加而增加(图9b)；在肝癌患者外周血以及肿瘤组织中去甲肾上腺素含量都与MAITreg细胞比例呈正相关(图9c,d)。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于调节受试者调节性MAIT细胞数目和功能从而进行疾病治疗的药物组合物，所述药物组合物包含ADRB1拮抗剂或激动剂或调控ADRB1表达或功能的试剂，和药学上可接受的载体，其中所述调节性MAIT细胞为FOXP3+CXCR3+MAIT细胞。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述疾病为肝脏的疾病，如肝癌、肝炎，如甲肝、乙肝、丙肝、戊肝；自身免疫疾病，如多发性硬化；炎症性疾病；和癌症；优选地，所述疾病为肝癌。
3.权利要求1-2所述的药物组合物，其中所述ADRB1拮抗剂为洛尔类药物，如美托洛尔、比索洛尔、普萘洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、艾司洛尔、醋丁洛尔、噻吗洛尔、阿普洛尔，所述ADRB1激动剂选自多巴酚丁胺和异丙肾上腺素，或者所述ADRB1拮抗剂或激动剂为对ADRB1具有拮抗或激动功能的抗ADRB1抗体，优选单克隆抗体，反义核酸或适体；所述调控ADRB1表达或功能的试剂选自siRNA和基因编辑试剂及其组合。
4.一种用于调节受试者调节性MAIT细胞数目和功能从而进行疾病治疗的药盒，其包含权利要求1-3任一项所述的药物组合物。
5.ADRB1拮抗剂或激动剂或调控ADRB1表达或功能的试剂和药学上可接受的载体在制备调节受试者调节性MAIT细胞数目和功能从而进行疾病治疗的药物或药盒中的用途。
6.权利要求5所述的用途，其中所述疾病为肝脏的疾病，如肝癌、肝炎，如甲肝、乙肝、丙肝、戊肝；自身免疫疾病，如多发性硬化；炎症性疾病；和癌症；优选地，所述疾病为肝癌。
7.权利要求5-6所述的用途，其中所述ADRB1拮抗剂为洛尔类药物，如美托洛尔、比索洛尔、普萘洛尔、倍他洛尔、阿替洛尔、艾司洛尔、醋丁洛尔、噻吗洛尔、阿普洛尔，所述ADRB1激动剂选自多巴酚丁胺和异丙肾上腺素，或者所述ADRB1拮抗剂或激动剂为对ADRB1具有拮抗或激动功能的抗ADRB1抗体，优选单克隆抗体，反义核酸或适体；所述调控ADRB1表达或功能的试剂选自siRNA和基因编辑试剂及其组合。
8.权利要求1-3所述的药物组合物、权利要求4所述的药盒或权利要求5-7所述的用途，其中所述受试者是人。
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