CN115094146A - 一种基于mira技术快速鉴别肉制品中猪源性成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于MIRA技术快速鉴别肉制品中猪源性成分的方法，属于食品安全生物技术领域。本发明首先提供了一种鉴别肉制品中猪源性成分的引物探针组合，它包括正向引物、反向引物和探针；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。本发明还提供了含该引物探针组合的试剂盒以及具体鉴别方法。本发明鉴别肉制品中猪源性成分的检测方法条件温和、操作简便、特异性强、灵敏度高、可靠性好，结果可视化，十分利于现场检测。本发明检测方法为现场快速、简捷、灵敏的检测肉制品猪源性成分提供一种新的选择，具有广阔的应用前景。

Description

一种基于MIRA技术快速鉴别肉制品中猪源性成分的方法

技术领域

本发明属于食品安全生物技术领域，具体涉及一种基于MIRA技术快速鉴别肉制品中猪源性成分的方法。

背景技术

随着市场全球化及贸易自由化的不断发展，消费者对肉制品产品质量和真实性越来越重视，肉制品安全提升到一个新的高度。近年来，国内外肉类掺假事件时有发生，引发社会广泛关注，对食品安全和食品贸易造成严重危害。肉类掺假的方式越来越多，形式越来越复杂。目前，肉制品的掺假主要表现为原料肉掺假、组织替换等，这些肉类真实性问题不但严重地侵害了消费者利益，更是给肉制品食用安全带来潜在危害，同时也可能带来宗教信仰和道德标准方面的风险。

因此，肉制品动物源性成分检测变得越来越重要，核酸检测可以从样品中检测出痕量目标分子，具有灵敏特异等诸多优势，已成为食品真实性研究中必要的技术手段，并在检测领域中得到广泛应用。但是，传统的核酸检测技术对实验室环境、仪器及人员要求较高，无法满足现场检测监管需求。

一些新型检测方法，如重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)、多酶恒温快速扩增技术(Multienzyme Isothermal RapidAmplification，MIRA)等，由于不需要高温变性、退火等步骤，对精密仪器依赖程度大大降低，是实现现场即时检测的有效技术手段。同时结合侧向流层析技术(Lateral FlowDipstick，LFD)，不仅可以达到简捷、灵敏、特异的检测目的，而且能更好地为现场动物源成分检测提供可视化应用服务。但是这些方法的关键在于寻找到合适的引物，引物的选择会影响检测速度和灵敏度。目前，寻找到合适的引物是肉制品动物源性成分检测的难点。

寻找到一种合适的引物，提供一种新的肉制品中猪源性成分检测方法，为现场快速、简捷、灵敏的检测肉制品中猪源性成分提供一种新的选择，对于食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于MIRA技术快速鉴别肉制品中猪源性成分的方法。

本发明提供了一种鉴别肉制品中猪源性成分的引物探针组合，它包括正向引物、反向引物和探针；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了前述的引物探针组合在鉴别肉制品中猪源性成分的用途。

进一步地，所述用途为在制备鉴别肉制品中猪源性成分的试剂盒中的用途。

进一步地，所述鉴别肉制品中猪源性成分的方法为多酶恒温快速扩增可视化技术。

进一步地，所述多酶恒温快速扩增可视化技术为多酶恒温快速扩增技术结合侧向流层析技术。

本发明还提供了一种鉴别肉制品中猪源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括前述的引物探针组合。

进一步地，所述鉴别肉制品中猪源性成分的方法为多酶恒温快速扩增可视化技术。

进一步地，所述多酶恒温快速扩增可视化技术为多酶恒温快速扩增技术结合侧向流层析技术。

本发明还提供了一种鉴别肉制品中猪源性成分的方法，它包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA作为模板；

(2)将前述的引物探针组合加入到含DNA模板的扩增体系中；

(3)使用多酶恒温快速扩增可视化技术进行检测；

(4)读取结果。

进一步地，步骤(2)中，所述扩增体系中正向引物、反向引物、探针和DNA模板的体积比为0.1～2：0.1～2：0.01～0.6：1；所述正向引物和反向引物的体积比为1：1；

和/或，步骤(2)中，所述扩增体系的反应温度为30～37℃；和/或，所述扩增时间为1～5min；

优选地，步骤(2)中，所述扩增体系的反应温度为37℃；和/或，所述扩增时间为5min；

和/或，步骤(2)中，所述扩增体系中引物的浓度为10μmol/L；和/或，所述扩增体系中探针的浓度为10μmol/L。

本发明成功筛选出肉制品中猪源性成分的多酶恒温快速扩增可视化技术检测体系的最优引物探针组合，提供了一种检测肉制品中猪源性成分的MIRA-LFD检测体系。本发明MIRA-LFD检测体系将MIRA技术和LFD技术相结合，不仅检测条件温和、操作简便、特异性强、灵敏度高、可靠性好，并且结果可视化，十分利于现场检测。本发明检测方法可靠性好，同时具有良好的时效性、操作性和安全性，为现场快速、简捷、灵敏的检测肉制品猪源性成分提供一种新的选择，具有广阔的应用前景。

本研究旨在提高肉制品猪源性成分检测方法的可操作性，建立健全肉制品动物源性的检测方法，项目组针对猪肉制品建立专属性多酶恒温快速扩增可视化技术——多酶恒温侧流式扩增技术(MIRA-LFD)检测方法，为监管部门提供猪源性成分现场检测技术手段。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为猪(X56295)源性目的序列比对。

图2为猪源性引物阳性对照筛选结果。

图3为猪源性引物探针空白对照筛选结果。

图4为猪源性引物探针阴性对照筛选结果。

图5为猪源性引物探针阴性对照筛选结果。

图6为MIRA-LFD检测体系引物探针体积筛选结果。

图7为不同温度条件下MIRA-LFD实验结果图。

图8为不同反应时间下MIRA-LFD实验结果图。

图9为猪源性成分荧光定量PCR检出限结果。

图10为猪源性成分MIRA-LFD检测方法检出限。

图11为猪源性成分灵敏度考察。

图12为猪源性成分特异性考察。

图13为猪源性成分假阳性和假阴性考察。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

本实验所用样品包括猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、狐狸、貂、猫、海狸鼠共10个物种。样品采自养殖厂、研究所、农贸市场、电商、超市等。所有样品通过合成引物进行线粒体基因测序验证，保证样品的真实性。

实施例1、本发明快速鉴别肉制品中猪源性成分的方法

1.1 DNA提取

按照DNA提取试剂盒说明书对猪源样品进行基因组提取，得到猪源性核酸模板(DNA模板)，用核酸蛋白定量仪确定DNA提取的效率与纯度，进行OD₂₆₀/OD₂₈₀值测定，测得值在1.7～2.0之间，表明可用于后续试验。

1.2 MIRA检测体系的建立

1.2.1 MIRA检测方法引物探针设计

本发明选取被广泛应用于物种鉴别的线粒体基因细胞色素氧化酶b(cytb)基因作为靶基团，在Genbank数据库中选择猪(X56295)的基因序列进行引物和探针的设计。

在引物设计时，选择碱基排布随机性高，GC含量在30％～70％之间的引物序列，并且在反向引物的5’端标记biotin修饰基团；对于MIRA法的探针序列，应避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基，长度一般在46nt～52nt，在5’端修饰一个FAM标记，在距5’端约30nt序列位置上标记一个dSpacer(四氢呋喃)，作为nfo(核酸内切酶)的识别位点，另外THF距离3’末端约15nt，并且3’末端标记一个C3-spacer修饰基团。猪源性特异性序列比对结果如图1所示。

根据序列比对结果，结合MIRA引物探针设计原则，对猪的引物和探针序列进行高级结构分析比对，以确保其高度的特异性，防止出现二聚体、茎环及发卡等影响检测效率的结构，共设计4条正向引物、4条反向引物、2条探针，引物探针名称及序列信息如表1所示。

表1.引物探针名称及序列信息

1.2.2阳性对照筛选研究

根据表1中引物的设计，对其进行组合，MIRA阳性对照引物组合共计16组，具体如表2所示。

表2.MIRA阳性对照引物组合表

MIRA电泳反应体系(50μL)包括29.4μL的A buffer，1.0μL猪源性核酸模板和2.5μL的B buffer，每对引物(10μmol/L)各0.25μL(表2所示)，并用去离子水补足50μL，设立以去离子水为DNA模板的空白对照组；同时以MIRA试剂盒提供的正对照模板单元作为实验质控对照。正对照体系配制(由试剂盒提供)：正对照模板加入1μL，引物加入4μL正对照引物Mix(包含上/下游引物)，其他组分如上体系配制。反应程序为37℃，5min。反应产物用3％琼脂糖凝胶做水平电泳，并用凝胶成像系统拍照记录结果。

结果如图2所示，图中M为DNA Marker；Z+数字为表2引物对中对应引物组合的阳性对照；Z+数字B为表2引物对中对应引物组合的空白对照；P为试剂盒的正对照；PB为试剂盒正对照对应的空白对照。如图2中的16对引物与试剂盒配套阳性对照结果所示，16对引物组合阳性对照均出现条带，将这些引物对均进行后续实验。

1.2.3空白对照筛选研究

根据1.2.2中实验结果，MIRA阳性对照引物探针组合共计32对，具体如表3所示。

表3.MIRA空白对照引物探针组合表

MIRA-LFD胶体金反应体系(50μL)包括29.4μL的A buffer，1.0μL去离子水和2.5μL的B buffer，每对引物(10μmol/L)各1.0μL(表3所示)，探针(10μmol/L)0.3μL(表3所示)，并用去离子水补足50μL。反应程序为37℃，5min。胶体金结果如图3所示，图中C线为控制线，T线为检测线；数字为表3中的图中编号；B为试剂盒正对照对应的空白对照。

如图3中的32对引物探针空白结果，12对引物探针组合空白对照未出现T线，表明未出现非特异结合；其余20对引物探针均出现T线，表明出现非特异结合。因此选择12对未出现T线的引物探针组合进行后续实验。

1.2.4阴性对照筛选研究

根据1.2.3实验结果，筛选空白对照中未出现检测线(T线)的引物探针组合，具体如表4所示。

表4.MIRA-LFD阴性对照筛选引物探针组合表

MIRA-LFD胶体金反应体系(50μL)包括29.4μL的A buffer，1.0μL核酸模板和2.5μL的B buffer，每对引物(10μmol/L)各2.0μL(表4所示)，探针(10μmol/L)0.6μL(表4所示)，并用去离子水补足50μL。核酸模板分为阴性对照核酸模板和阳性对照核酸模板，其中，阴性对照核酸模板分别为牛、羊、鸡和鸭样品提取的DNA模板，阳性对照核酸模板为猪源核酸模板，反应程序为37℃，5min。胶体金结果如图4所示，图中C线为控制线，T线为检测线；数字1～5分别对应为牛、羊、猪、鸡和鸭源性肉制品提取的DNA；B为空白对照。

如图4中的12对引物探针阴性对照结果，引物探针组合F3R4P2仅猪源性肉制品出现T线，阴性对照未出现T线，表明未出现非特异结合。而其余引物探针组合均出现非特异结合。

在此基础上，对引物探针组合F3R4P2增加阴性对照物种数，进一步考察引物探针组合F3R4P2的特异性，胶体金结果图如图5所示，图中C线为控制线，T线为检测线；数字1～10分别对应为牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅、狐狸、貂、猫和海狸鼠源性肉制品提取的DNA；B为空白对照。

如图5所示：上述实验筛选出的引物探针组合F3R4P2仅猪源性肉制品出现T线，在牛、羊、鸡、鸭、鹅、狐狸、貂、猫和海狸鼠为阴性，未出现明显的非特异性结合，说明该引物探针组合对猪源性体系表现出良好的特异性。因此将引物探针组合F3R4P2作为检测猪源性体系的引物探针组合。

1.2.5 MIRA-LFD检测体系引物探针体积筛选

表5.MIRA-LFD引物探针体积组合表

根据1.2.4实验结果，考察不同引物探针体积对MIRA反应体系的影响。MIRA-LFD胶体金反应体系(50μL)如表5四种组合所示。其中，样品为猪样品提取的DNA模板。反应程序为37℃，5min。

实验结果如图6所示，图中C线为控制线，T线为检测线；Z为猪源性成分检测，ZB为引物探针的空白对照。在图6中，各组合C线均出现条带，且各组合空白对照的检测线T线均未出现明显条带，说明组合物1～4均可以作为猪源性肉制品的引物探针添加量。

1.2.6 MIRA-LFD检测体系反应温度筛选

根据上述实验结果，考察不同反应温度对MIRA反应体系的影响，选择30℃、37℃、40℃、45℃、50℃五个温度点进行实验。MIRA-LFD胶体金反应体系(50μL)包括29.4μL的Abuffer，1.0μL阳性对照核酸模板和2.5μL Bbuffer，每对引物(10μmol/L)各0.25μL，探针(10μmol/L)0.075μL，并用去离子水补足50μL。反应程序为30℃、37℃、40℃、45℃、50℃，分别进行5min反应。其中，阳性对照核酸模板为猪样品提取的DNA模板，实验结果如图7所示，图中C线为控制线，T线为检测线；Z为猪源性成分检测，ZB为引物探针的空白对照。

如图7所示，30℃、37℃、40℃、45℃样品猪源性成分检测结果T线均出现明显条带，但是在40℃、45℃时猪源性样品空白对照T线出现明显条带，说明出现了非特异性扩增情况。因此37℃为最优检测结果。50℃条件下，T线条带不明显，说明50℃对酶产生了破坏，影响了MIRA反应。因此选择37℃作为本发明MIRA-LFD反应的温度。

1.2.7 MIRA-LFD检测体系反应时间筛选

根据上述实验结果，考察不同反应时间对MIRA反应体系的影响，选择1min、5min、10min、15min和25min五个反应时间进行实验。MIRA-LFD胶体金反应体系(50μL)包括29.4μL的A buffer，1.0μL阳性对照核酸模板和2.5μL B buffer，每对引物(10μmol/L)各0.25μL，探针(10μmol/L)0.075μL，并用去离子水补足50μL。反应温度为37℃，反应时间分别为1min、5min、10min、15min和25min。其中，阳性对照核酸模板为猪样品提取的DNA模板，实验结果如图8所示，图中C线为控制线，T线为检测线；Z为猪源性成分检测，ZB为引物探针的空白对照。

如图8所示：随着反应时间的延长，MIRA-LFD检测体系中的非特异结合更易出现(图中空白对照结果)，但是反应1min容易出现假阴性。因此选择5min作为MIRA-LFD检测体系的反应时间。

1.2.8检出限实验

称取200mg左右的猪肉组织，转移至2.0mL的离心管中。然后向离心管加入400μLACL Solution(由DNA提取试剂盒提供)和20μL的Proteinase K(由DNA提取试剂盒提供)。充分振荡混匀，置于55℃过夜裂解，直至样品裂解完全。

样品完全裂解后，按照如下公式计算1mg组织所对应的裂解液体积(x，μL)，以猪源性组织裂解液为样品，以鸡源性组织裂解液为本底，配制10％、1％、0.1％和0.01％(体积比)的模拟样本。分别进行DNA提取，依照荧光定量PCR法和MIRA-LFD法进行实验。

式中：x为1mg相应的动物源性所对应的裂解液体积；a为供试样品组织质量。

实验结果如图9所示：荧光定量PCR检出混合样品中的猪源性，并且不同稀释度之间呈良好的梯度，表明上述混样方法有效。在图10中，胶体金试纸条出现明显色差，证明可以通过胶体金颜色的深浅判断样品中是否含有猪源性成分。通过图9和图10，猪源性成分的检出限为0.1％。

1.2.9 MIRA-LFD检测体系的确立

本发明通过猪特异性引物探针的设计建立了猪源性成分MIRA-LFD检测方法，分别从阳性对照筛选、空白对照筛选、阴性对照筛选和检出限考察四个方面确立了本发明检测体系方案，如表6所示。

表6.MIRA-LFD检测体系方案

1.3实验室考察

1.3.1灵敏度考察

灵敏度是指方法在实验条件下达到实际检出限时，检出阳性结果的样品数占总阳性样品数的百分比。选择猪源检测体系进行10个检出限样品的灵敏度考察，确定方法的灵敏度，实验结果见图11和表7。图11中1-10编号即表7中样品的编号，B代表为空白对照，P代表阳性对照。实验结果说明本发明检测方法检测肉制品中猪源性成分时灵敏度好。

表7.灵敏度考察结果

1.3.2特异性考察

采用快检方法及其相关产品的交叉反应率反映产品的特异性，即目标源性成分检出限与非目标源性成分检出阳性的最小浓度的比值(以百分比计)。分别将目标成分与非目标成分按一定比例混合，评价方法的特异性，记录检测结果为阳性的最小浓度。当加入非目标源性成分浓度水平大于或等于检出限的1000倍时，特异性(交叉反应率)视为小于1％。实验结果见图12和表8，图12中编号含义如表8。

表8.特异性考察结果表

1.3.3假阳性率与假阴性率

按照本发明建立的反应参数、体系、反应条件，对方法进行假阳性率与假阴性率的考察。选择猪的检测体系进行物种的假阳性率与假阴性率的考察。样品均来源于“2021年成都市市级风险监测”样品，样品信息见表9，并与标准方法进行比对(标准方法见：中华人民共和国商务部.肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光PCR法:SB/T 10923-2012[S]北京：中国标准出版社，2012:1-5.)。

假阴性率与假阳性率计算公式如下：

假阴性率(％)＝阳性样品的阴性结果数×100/阳性样品总数。

假阳性率(％)＝阴性样品的阳性结果数×100/阴性样品总数。

表9.假阳性率与假阴性率考察样品信息表

考察结果见图13，结果见表10。

表10.假阳性率与假阴性率考察结果表

通过对“基于等温扩增技术的动物源性成分可视化检测方法及产品开发”所建立试剂盒灵敏度考察，特异性考察，假阳性率、假阴性率考察，该试剂盒灵敏度为100％，特异性为1.0％，假阳性率为20％、假阴性率为14％，均未超过20％，证明该试剂盒可靠有效。

1.5验证结果汇总

中国检验检疫科学研究院农产品安全研究中心、天津海关植物与食品检测中心、成都海关技术中心三家单位采用本发明研发的引物探针、胶体金试剂盒及操作说明，对提供的不同基质的样品进行了猪源性成分的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率验证。从三家单位的验证结果看，评价结果均为该试剂盒可靠有效。

综上，本发明成功筛选出肉制品中猪源性成分的多酶恒温快速扩增可视化技术检测体系的最优引物探针组合，提供了一种检测肉制品中猪源性成分的MIRA-LFD检测体系。本发明MIRA-LFD检测体系将MIRA技术和LFD技术相结合，不仅检测条件温和、操作简便、特异性强、灵敏度高、可靠性好，并且结果可视化，十分利于现场检测。本发明检测方法同时具有良好的可靠性、时效性、操作性和安全性，为现场快速、简捷、灵敏的检测肉制品猪源性成分提供一种新的选择，具有广阔的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都市食品检验研究院

<120> 一种基于MIRA技术快速鉴别肉制品中猪源性成分的方法

<130> GY392-2021P0114273CCZ

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctatttaccg ttatagcaac agccttcata gg 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtcctgccc tgaggacaaa tatcattctg ag 32

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacggtcatc acaaatctac tatcagctat c 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tatcggaaca gacctcgtag aatgaatctg ag 32

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgtgcaggaa tatgagatgt acggctgcga g 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgatgagatt ccggtagggt tgttggatcc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtctttaat agtgtagtat gggtgaaatg 30

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tggtgagaat agtacaagga ttagtaggat tag 33

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tccgtcgaca aagcaaccct cacacgattc tcgccttcca ctttatc 47

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caaccctcac acgattcttc gccttccact tatcctgcca ttcatc 46

Claims (10)

1.一种鉴别肉制品中猪源性成分的引物探针组合，其特征在于：它包括正向引物、反向引物和探针；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.权利要求1所述的引物探针组合在鉴别肉制品中猪源性成分的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述用途为在制备鉴别肉制品中猪源性成分的试剂盒中的用途。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于：所述鉴别肉制品中猪源性成分的方法为多酶恒温快速扩增可视化技术。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述多酶恒温快速扩增可视化技术为多酶恒温快速扩增技术结合侧向流层析技术。

6.一种鉴别肉制品中猪源性成分的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述鉴别肉制品中猪源性成分的方法为多酶恒温快速扩增可视化技术。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述多酶恒温快速扩增可视化技术为多酶恒温快速扩增技术结合侧向流层析技术。

9.一种鉴别肉制品中猪源性成分的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA作为模板；

(2)将权利要求1所述的引物探针组合加入到含DNA模板的扩增体系中；

(3)使用多酶恒温快速扩增可视化技术进行检测；

(4)读取结果。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述扩增体系中正向引物、反向引物、探针和DNA模板的体积比为0.1～2：0.1～2：0.01～0.6：1；所述正向引物和反向引物的体积比为1：1；

和/或，步骤(2)中，所述扩增体系的反应温度为30～37℃；和/或，所述扩增时间为1～5min；

优选地，步骤(2)中，所述扩增体系的反应温度为37℃；和/或，所述扩增时间为5min；

和/或，步骤(2)中，所述扩增体系中引物的浓度为10μmol/L；和/或，所述扩增体系中探针的浓度为10μmol/L。

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