CN115054688A - 一种乌贼墨螯合铁纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乌贼墨螯合铁纳米粒子及其制备方法和应用。所述制备方法包括乌贼墨的纯化、纯化乌贼墨与铁离子的螯合这两个主要步骤。本发明创新性地利用纯化后的乌贼墨纳米粒子作为载体,通过与Fe3+的螯合作用,形成了乌贼墨螯合铁纳米粒子。所述乌贼墨螯合铁纳米粒子在光热治疗中不仅有着增强光热转化效率的功效,还能将负载在纳米粒子上的Fe3+转运至肿瘤细胞内,诱导肿瘤细胞的铁死亡,从而实现光热疗法与肿瘤铁死亡的有机结合,达到协同增效的目的,在制备治疗肿瘤药物方面有着广阔的发展和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种乌贼墨螯合铁纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是全球女性中发病率最高的癌症,也是女性患癌症死亡的主要原因。2020年的癌症统计中,乳腺癌的发病人数、死亡人数仍然保持着持续增长的状态,其新发病例占全球癌症病例11.7%,首次高于占比11.4%的肺癌。乳腺癌具有多种复杂的机制,目前尚未清楚其发病机制。手术切除、放疗和化疗是临床上常用的乳腺癌治疗手段。但手术切除不彻底导致复发率高;放疗对正常组织也会造成危害;化疗毒副作用大,易产生耐药性。因此,急需探索一种新的乳腺癌治疗方法。
光热疗法因高效、微创、非侵入性、准确性,并可激活免疫系统、抑制肿瘤转移等优点,已应用于乳腺癌的研究和临床治疗。但实际应用中仍存在着诸多问题,如照射范围小、穿透深度有限、设备能耗高等;另外,尽管目前针对光热剂已开展了大量研究,但在稳定性、安全性及大规模制备上存在诸多问题;此外,在实际临床治疗中发现,单独的光热疗法无法根治肿瘤,常需要与其他疗法联合使用。因而开发具有较高的光热转化效率,具备联合疗法潜力,且安全性较高的热敏剂对光热疗法在临床应用方面有着举足轻重的作用。
近年来相关报道显示出了乌贼墨在光热疗法中的应用潜力,其光热转化效率达到40%。研究表明,乌贼墨以纳米颗粒形式存在,且表面负电性和丰富的基团,使其具备负载相关功能性物质的能力,因而展现出作为多功能热敏剂的潜力;同时乌贼墨应用历史及化学组成也显示了较高的安全性。
Fe3+作为一种正价金属离子,能够被乌贼墨纳米粒子负载,近年研究证明Fe3+能够通过诱导肿瘤细胞铁死亡而发挥抗肿瘤的功效。铁死亡,是一种铁依赖性调节型细胞死亡,具有独特的形态学特征,如线粒体皱缩、膜密度增加、嵴减少或消失,不具备细胞坏死中细胞膜破裂和细胞凋亡中染色质凝聚等特点。铁死亡的发生机制为Fe2+在细胞中的蓄积,可介导芬顿反应的发生,产生过量ROS,并与细胞膜上的不饱和脂肪酸发生过氧化反应,最终导致细胞膜解体,进而促进细胞铁死亡的发生。肿瘤细胞内铁离子的含量高于正常细胞水平,因此肿瘤细胞对于铁死亡更为敏感。相关研究显示,与Fe2+相比,Fe3+铁死亡诱导效果更强。Fe3+在谷胱甘肽的还原作用下,转变为Fe2+并触发芬顿反应。这一过程在增加细胞内Fe2+的蓄积的同时,也消耗了谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的水平,最终引起细胞的铁死亡。
此外,相关研究显示,光热疗法产生的光热效应可驱动芬顿反应的进程,进而增强铁死亡的肿瘤杀伤能力;同时肿瘤细胞内积累的脂质过氧化物能够抑制光热抵抗蛋白的表达,缓解其对肿瘤细胞的光热抵抗作用。因此,光热疗法与铁死亡可发挥联合治疗、协同增效抗肿瘤的效果。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足,本发明的目的在于提供一种乌贼墨螯合铁纳米粒子及其制备方法和应用。所述制备方法基于乌贼墨纳米粒子对Fe3+良好的螯合特性,制备了一种能够整合光热疗法与肿瘤铁死亡从而实现协同增效治疗的乌贼墨螯合铁纳米粒子。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,包括如下步骤:
(1)乌贼墨的纯化:将乌贼墨粗品加入去离子水中,然后依次进行机械搅拌、超声分散和离心处理,重复多次后,得下层沉淀物,即为纯化后的乌贼墨,将所得纯化乌贼墨冷冻干燥,备用;
(2)纯化乌贼墨与铁离子的螯合:将步骤(1)中所得纯化乌贼墨加水配制成乌贼墨纳米粒子溶液后与FeCl3溶液混合,得到混合溶液,将上述混合溶液在调节pH后进行磁力搅拌或超声处理,然后进行离心处理,将离心所得沉淀物洗涤,干燥,即得乌贼墨螯合铁纳米粒子。
优选的,步骤(1)中,乌贼墨粗品与去离子水的用量比为:1g:10~30mL。
优选的,步骤(1)中,机械搅拌的转速为4000~6000rpm,每次搅拌的时间为20~40min。
优选的,步骤(1)中,每次超声分散的时间为20~40min。
优选的,步骤(1)中,离心处理的转速为7000~13000rpm,每次离心的时间为10~20min,最后一次离心处理以1500~2500rpm的转速处理至上清液中无氯离子为止。
优选的,步骤(2)中,乌贼墨纳米粒子溶液的浓度为0.08~0.4mg/mL;
优选的,步骤(2)中,所述混合溶液中,乌贼墨纳米粒子与Fe3+的质量比为1:8~10。
优选的,步骤(2)中,pH值采用0.1M的盐酸调节至2~4,搅拌或超声处理的时间不小于1h。
优选的,步骤(2)中离心处理以1500~2500rpm的转速处理至上清液中无氯离子为止。同时,本发明要求保护由上述任一方法制备得到的乌贼墨螯合铁纳米粒子。
同时,本发明要求保护制备得到的所述乌贼墨螯合铁纳米粒子在制备治疗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明提供的乌贼墨螯合铁纳米粒子在光热治疗乳腺癌的应用中不仅有着增强光热转化效率的功效,还能将负载在纳米粒子上的Fe3+转运至肿瘤细胞内,诱导肿瘤细胞的铁死亡,从而实现光热疗法与肿瘤铁死亡的有机结合,达到协同增效的目的,治疗效果是单独进行光热治疗的6.15倍,所以对于光热治疗的增效有着广阔的发展和应用前景;
2、本发明提供的乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备工艺简单,成本低,便于工业化生产,发展前景好。
附图说明
图1为本发明乌贼墨螯合铁纳米粒子的透射电镜扫描示意图;
图2为本发明乌贼墨纳米粒子和乌贼墨螯合铁纳米粒子的(A)粒径、Zeta电位;(B)PDI值;
图3为本发明808nm激光照射(A)蒸馏水(B)乌贼墨纳米粒子的温度变化图以及(C)计算曲线;
图4为本发明乌贼墨螯合铁纳米粒子在(A)猪肝和(B)鸡肉中经808nm激光照射后温度变化曲线;
图5为本发明乌贼墨螯合铁纳米粒子中铁离子释放曲线;
图6为本发明铁死亡线粒体变化;
图7为本发明不同样品组组与光热治疗联用后不同浓度下的体外细胞毒性;
图8为本发明荷瘤小鼠的肿瘤体积生长曲线;
图9为本发明不同制剂组治疗后的肿瘤照片;
图10为本发明不同制剂组治疗后的肿瘤重量对比;
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚,以下结合实施例,对本发明作进一步的详细说明。当然,此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明中的步骤虽然用标号进行了排列,但并不用于限定步骤的先后次序,除非明确说明了步骤的次序或者某步骤的执行需要其他步骤作为基础,否则步骤的相对次序是可以调整的。可以理解,本文中所使用的术语“和/或”涉及且涵盖相关联的所列项目中的一者或一者以上的任何和所有可能的组合。
实施例1
一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,包括如下步骤:
(1)乌贼墨纳米粒子的纯化:从新鲜乌贼墨囊中取出乌贼墨粗品,用200mL去离子水将10g乌贼墨粗品分散于烧杯中,然后用高速搅拌机搅拌以5000rpm的转速搅拌30min,搅拌后将黑色悬浮液置于超声波分散仪中进行超声分散处理30min,接着将黑色悬浮液放入离心机中以10000rpm的转速进行为时15min的离心处理,重复处理三次,第三次离心处理的转速调整为2000rpm,直至上清液加入硝酸银溶液无氯离子反应为止,处理完成后,取得的下层黑色沉淀物即为纯化后的乌贼墨,将所得纯化乌贼墨冷冻干燥,备用。
(2)乌贼墨与铁离子的螯合:将(1)中纯化过的乌贼墨加水配制成14mL浓度为0.4mg/mL的乌贼墨纳米粒子悬浊液后与1mL浓度为2mol/L的FeCl3溶液混合,用0.1M的盐酸调节pH至4后,磁力搅拌2h,再以2000rpm的转速离心处理至上清液加入硝酸银溶液无氯离子反应为止,将离心所得沉淀物洗涤,干燥,得到乌贼墨螯合铁纳米粒子。
实施例2
一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,包括如下步骤:
(1)乌贼墨纳米粒子的纯化:从新鲜乌贼墨囊中取出乌贼墨粗品,用100mL去离子水将10g乌贼墨粗品分散于烧杯中,然后用高速搅拌机搅拌以4000rpm的转速搅拌20min,搅拌后将黑色悬浮液置于超声波分散仪中进行超声分散处理20min,接着将黑色悬浮液放入离心机中以7000rpm的转速进行为时10min的离心处理,重复处理三次,第三次离心处理的转速调整为1500rpm,直至上清液加入硝酸银溶液无氯离子反应为止,处理完成后,取得的下层黑色沉淀物即为纯化后的乌贼墨,将所得纯化乌贼墨冷冻干燥,备用。
(2)乌贼墨与铁离子的螯合:将(1)中纯化过的乌贼墨加水配制成26mL浓度为0.2mg/mL的乌贼墨纳米粒子悬浊液后与1mL浓度为2mol/L的FeCl3溶液混合,用0.1M的盐酸调节pH至3后,磁力搅拌1h,再以2500rpm的转速离心处理至上清液加入硝酸银溶液无氯离子反应为止,将离心所得沉淀物洗涤,干燥,得到乌贼墨螯合铁纳米粒子。
实施例3
一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,包括如下步骤:
(1)乌贼墨纳米粒子的纯化:从新鲜乌贼墨囊中取出乌贼墨粗品,用100mL去离子水将30g乌贼墨粗品分散于烧杯中,然后用高速搅拌机搅拌以6000rpm的转速搅拌40min,搅拌后将黑色悬浮液置于超声波分散仪中进行超声分散处理40min,接着将黑色悬浮液放入离心机中以13000rpm的转速进行为时20min的离心处理,重复处理三次,第三次离心处理的转速调整为2500rpm,直至上清液加入硝酸银溶液无氯离子反应为止,处理完成后,取得的下层黑色沉淀物即为纯化后的乌贼墨,将所得纯化乌贼墨冷冻干燥,备用。
(2)乌贼墨与铁离子的螯合:将(1)中纯化过的乌贼墨加水配制成60mL浓度为0.08mg/mL的乌贼墨纳米粒子悬浊液后与1mL浓度为2mol/L的FeCl3溶液混合,用0.1M的盐酸调节pH至2后,磁力搅拌5h,再以1500rpm的转速离心处理至上清液加入硝酸银溶液无氯离子反应为止,将离心所得沉淀物洗涤,干燥,得到乌贼墨螯合铁纳米粒子。
对比例1
一种乌贼墨纳米粒子的制备方法,包括如下步骤:
乌贼墨纳米粒子的纯化:从新鲜乌贼墨囊中取出乌贼墨粗品,用200mL去离子水将10g乌贼墨粗品分散于烧杯中,然后用高速搅拌机搅拌以5000rpm的转速搅拌30min,搅拌后将黑色悬浮液置于超声波分散仪中进行超声分散处理30min,接着将黑色悬浮液放入离心机中以10000rpm的转速进行为时15min的离心处理,重复处理三次,第三次离心处理的转速调整为2000rpm,直至上清液加入硝酸银溶液无氯离子反应为止,处理完成后,取得的下层黑色沉淀物即为纯化后的乌贼墨,将所得纯化乌贼墨冷冻干燥,备用。
本对比例与实施例1的区别是没有螯合Fe3+,得到的是乌贼墨纳米粒子。
试验例
1、对本申请实施例1~3和对比例1制备得到的产品进行形貌、粒径和电位进行测试,具体如下:
(1)形貌分析
乌贼墨纳米粒子的透射电镜扫描照片如图1所示。纳米粒子呈现圆球形,与乌贼墨原颗粒形貌相同,说明鳌合Fe3+后未破坏乌贼墨纳米粒子的纳米结构。
(2)粒径和电位分析
不同样品组的粒径、电位和PDI值如图2所示。未处理的乌贼墨表面具有多糖等粘附性物质,易聚集成团形成大粒径物质,经搅拌→超声→离心→纯化后,粒径相对更加均一,在210nm左右,当乌贼墨纳米粒子螯合铁离子后,乌贼墨螯合铁纳米粒子的粒径增加至220nm左右。
乌贼墨纳米粒子电位约为-30mV,铁离子含大量正电荷,当其螯合于乌贼墨粒子时,Zeta电位由约-30mV升至-15mV。PDI值为0.239,粒径分布较集中。最终,制备得到粒径均一,呈负电的乌贼墨螯合铁纳米粒子。
2、对本申请实施例1~3和对比例1制备得到的产品进行性能测试,具体如下:
(1)光热转化效率的测试
测试方法:将乌贼墨螯合铁纳米粒子,配置成3mg/mL乌贼墨螯合铁纳米粒子-蒸馏水悬浮液,测得其吸光度为1.05。根据乌贼墨螯合铁纳米粒子水溶液升温曲线得到ΔTmax=33.8℃,τ=336.3。带入方程和中,计算乌贼墨螯合铁纳米粒子的光转化效率为39.04%,如图3中C所示。
结果分析:文献报道中乌贼墨纳米粒子光热转化效率为40%,Liu等报道了一种尺寸可控的聚多巴胺纳米颗粒用于肿瘤光热治疗治疗,其光热转化效率为40%,说明乌贼墨纳米粒子本身具有良好的光热转化效率,与应用于光热治疗治疗的人工合成纳米材料接近,而鳌合铁后对于乌贼墨纳米粒子几乎无影响,乌贼墨螯合铁纳米粒子依然保持良好的光热转化效率。
(2)体外光热转化的测试
测试方法:将乌贼墨螯合铁纳米粒子注射于猪肝和鸡肉经在808nm激光照射后,记录温度变化。
结果分析:如图4所示。发现在猪肝上乌贼墨螯合铁纳米粒子和PBS组分别升高了38.3℃和27.9℃,PBS猪肝组升高大于20℃的可能原因是猪肝本底颜色深,具有一定的吸光能力。在鸡肉组织中乌贼墨纳米粒子和PBS组分别升高了26.9℃和14.1℃。可以看出,在猪肝和鸡肉组织中,乌贼墨螯合铁纳米粒子在激光照射下,可在短时间内使组织温度显著升高,展现出了良好的光热效应。
(3)体外铁离子释放量随时间变化的研究
测试方法:以铁标准溶液的浓度c(μg/mL)为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线,其标准曲线为:A=0.0415c+0.0026(R2=0.9974)。根据0.5h、1h、2h、4h、6h、12h和24h测定上清吸光度值带入标曲,得到乌贼墨螯合铁纳米粒子中铁离子随时间释放曲线。
结果分析:如图5所示。前1h释放约30%的铁离子,之后呈缓慢释放状态,2h后释放约35%,2h后进入平台期。证明乌贼墨螯合铁纳米粒子中Fe3+,可以在体外释放,发挥其功效。
(4)乌贼墨螯合铁纳米粒子对线粒体铁死亡的研究
测试方法:不同制剂组处理的细胞其线粒体透射电镜照片如图6所示。
结果分析:由图可以看出,对照组和乌贼墨纳米粒子组中线粒体大小正常,呈偏圆形饱满状态。相比之下,乌贼墨螯合铁纳米粒子组中线粒体皱缩、膜密度增高,符合铁死亡的独有生物学特点。证明了所制备的乌贼墨螯合铁纳米粒子成功引发了肿瘤细胞的铁死亡效应。
(5)乌贼墨纳米粒子和乌贼墨螯合铁纳米粒子对光热治疗增效作用的体外研究
测试方法:采用MTT细胞实验测试乌贼墨纳米粒子和乌贼墨螯合铁纳米粒子浓度对细胞活性的影响。
结果分析:在激光照射下(如图7所示),与空白对照组相比,乌贼墨纳米粒子和乌贼墨螯合铁纳米粒子组具有一定的细胞毒作用,细胞毒随纳米粒子浓度的增加而增强,且乌贼墨螯合铁纳米粒子+光热治疗细胞毒作用强于乌贼墨纳米粒子+光热治疗及乌贼墨螯合铁纳米粒子无光热治疗组。证明乌贼墨纳米粒子本身良好的光热效果,能够对光热治疗治疗起到增效作用;螯合铁之后,增效作用更强,且联合光热治疗治疗后,乌贼墨螯合铁纳米粒子细胞毒作用增强。
(6)在体功效评价
结果分析:不同样品组的肿瘤生长曲线,瘤重和肿瘤照片如图8至图9所示。在给药15天安乐处死解剖各组小鼠肿瘤,肿瘤照片如图9所示,将肿瘤组织剥离并称重,得到各组平均瘤重,结果如图10所示。结果显示空白对照组无抑制肿瘤生长作用。由于照射激光功率较低,短时间内无法产生明显的光热效应,所以光热治疗组几乎无肿瘤生长抑制效果;乌贼墨纳米粒子+光热治疗组与空白对照组相比,有较明显抑瘤效果,证明激光可以激发乌贼墨纳米粒子,发挥光热疗效,抑制肿瘤生长;乌贼墨螯合铁纳米粒子组有较明显肿瘤抑制效果,且强于乌贼墨纳米粒子+光热治疗组,说明乌贼墨螯合铁纳米粒子可诱导肿瘤铁死亡,发挥细胞毒作用;乌贼墨螯合铁纳米粒子+光热治疗组抑瘤效果最强,说明乌贼墨螯合铁纳米粒子既发挥了乌贼墨纳米粒子的光热效应;同时,乌贼墨纳米载体可以有效的将Fe3+运输至肿瘤细胞触发铁死亡机制,进一步发挥联合治疗的效果。动物实验结果与细胞实验结果一致。肿瘤体积测定结果中乌贼墨纳米粒子+光热治疗组,肿瘤体积缩小不明显,推测是由于肿瘤组织坏死产生水肿导致肿瘤体积增加但瘤重减小。
Claims (10)
1.一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)乌贼墨的纯化:将乌贼墨粗品加入去离子水中,然后依次进行机械搅拌、超声分散和离心处理,重复多次后,得下层沉淀物,即为纯化后的乌贼墨,将所得纯化乌贼墨冷冻干燥,备用;
(2)纯化乌贼墨与铁离子的螯合:将步骤(1)中所得纯化乌贼墨加水配制成乌贼墨纳米粒子溶液后与FeCl3溶液混合,得到混合溶液,将上述混合溶液在调节pH后进行磁力搅拌或超声处理,然后进行离心处理,将离心所得沉淀物洗涤,干燥,即得乌贼墨螯合铁纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,乌贼墨粗品与去离子水的用量比为:1g:10~30mL。
3.根据权利要求1所述的一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,机械搅拌的转速为4000~6000rpm,每次搅拌的时间为20~40min。
4.根据权利要求1所述的一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,每次超声分散的时间为20~40min。
5.根据权利要求1所述的一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,离心处理的转速为7000~13000rpm,每次离心的时间为10~20min,最后一次离心处理以1500~2500rpm的转速处理至上清液中无氯离子为止。
6.根据权利要求1所述的一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,乌贼墨纳米粒子溶液的浓度为0.08~0.4mg/mL;所述混合溶液中,乌贼墨纳米粒子与Fe3+的质量比为1:8~10。
7.根据权利要求1所述的一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,pH值采用0.1M的盐酸调节至2~4;磁力搅拌或超声处理的时间不小于1h。
8.根据权利要求1所述的一种乌贼墨螯合铁纳米粒子的制备方法,其特征在于,步骤(2)中离心处理以1500~2500rpm的转速处理至上清液中无氯离子为止。
9.权利要求1~8任一项所述方法制备得到的乌贼墨螯合铁纳米粒子。
10.权利要求9所述乌贼墨螯合铁纳米粒子在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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CN116832066A (zh) * | 2023-08-08 | 2023-10-03 | 青岛海洋生物医药研究院股份有限公司 | 乌贼墨提取物在制备抗多动症和抗抑郁症药物中的应用 |
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