CN115046928A - 一种基于光栅扫描识别的单分子检测方法 - Google Patents

一种基于光栅扫描识别的单分子检测方法 Download PDF

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Abstract

一种基于光栅扫描识别的单分子检测方法，将大量捕获珠相互散开布设在固珠板，其中至少部分捕获珠特异性结合有一个分析物，且每个分析物结合有发光标记物，利用光栅检测装置的光栅口从布设在一端处的捕获珠开始逐列扫描捕获珠、且光栅检测装置同步对结合有标记物的捕获珠的数量进行统计，通过光栅口与捕获珠之间横向的相对移动扫描整个固珠板上的捕获珠，扫描完成后即可得出分析物的总数。本发明采用对捕获珠边扫描边统计结合有标记物的捕获珠的数量，实时得出检测物的数量，大大提高了检测速度。

Description

一种基于光栅扫描识别的单分子检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种基于光栅扫描识别的单分子检测方法，属于分子检测技术领域。
背景技术
单分子检测（Single Molecule Detection, SMD）是近年快速发展起来的一种超灵敏的检测技术，其是指从单分子水平上对目标物进行测定与分析，是一种全新的检测方法，也开辟了一种全新的检测领域。如苏州宇测生物科技有限公司公开的“CN202080000774.8-一种单分子定量检测方法及检测系统”，通过在免疫识别过程中引入具有光学特效的原位信号增强纳米粒子对待测分子进行标记，对原发光材料产生的信号进行增强，提高辨识度，然后用光学成像设备获取有光斑的待测分子的数量。又如美国Quanterix公开的“CN201180019462.2-使用微珠或其他捕获物对分子或颗粒的超灵敏检测”，将捕获物划分到一定空间，然后对捕获物形成图像，统计出图像中发光分析物的数量以确定浓度。这些方式都能够极大地提高检测的灵敏度。然而，上述方式都是采用成像后在图片中数发光分析物的数量，对成像设备有较高的要求，且检测速度慢。
发明内容
本发明针对当前单分子检测方式中采用成像方式来计算分析物的浓度而对成像设备要求高且检测速度慢的问题，提出了一种基于光栅扫描识别的单分子检测方法，采用光栅扫描的方式实时得出被捕获的分析物数量，设备简单，且检测速度快。
本发明为解决上述问题所采用的技术手段为：一种基于光栅扫描识别的单分子检测方法，将大量捕获珠相互散开布设在固珠板（或检测芯片），其中至少部分捕获珠特异性结合有一个分析物，且每个分析物结合有发光标记物，利用光栅检测装置的光栅口从布设在一端处的捕获珠开始逐列扫描捕获珠、且光栅检测装置同步对结合有标记物的捕获珠的数量进行统计，通过光栅口与捕获珠之间横向的相对移动扫描整个固珠板上的捕获珠，扫描完成后即可得出分析物的总数。
进一步地，一套光栅检测装置包括光栅头、光感应器和信号处理器，其中光栅头包括成列设置的多个独立的光栅口，光感应器包括多个独立的感应元件，且扫描时，一个光栅口对准一个捕获珠或者不对准捕获珠，一个感应元件对应一个光栅口并能感应此光栅口处入射的光，当感应元件感应到入射光后反馈至信号处理器，信号处理器根据反馈结果统计分析物的数量。
进一步地，感应元件包括光敏管，其感应入射光后输出脉冲信号至信号处理器，信号处理器根据输出脉冲信号的光敏管的数量统计分析物数量。
进一步地，光栅检测装置的光栅口成一列设置，整列光栅口的数量大于或等于固珠板上布设的捕获珠的行数，且相邻两个光栅口之间的中心距离等于同列相邻两行捕获珠之间的中心距离。
进一步地，光栅检测装置的光栅口成交错设置的两列，两列光栅口的总数大于等于固珠板上捕获珠的行数，每列光栅口内相邻光栅口之间的中心距离等于同列中间隔一排的两排捕获珠之间的中心距离，两列光栅口配合对一列捕获珠进行扫描。
其中交错设置是指相邻光栅口间的位置呈V状，当一列光栅口与固珠板上某几排捕获珠对准时，另一列光栅口与前述捕获珠相邻排的捕获珠对准，也即同列布设的捕获珠内相邻两排的捕获珠不会同时与一列光栅口对准，而是在捕获珠与光栅口之间沿排运动的横向移动中依次分别与两列光栅口对准。
进一步地，相邻两个捕获珠之间的中心距离大于等于两倍捕获珠的外径。
进一步地，相邻两个捕获珠之间的中心距离大于等于三倍捕获珠的外径。
进一步地，光栅口与捕获珠表面之间的距离小于等于两倍捕获珠的外径。
进一步地，光栅口与捕获珠表面之间的距离等于1.5倍、1倍或0.5倍捕获珠的外径。从理论上来说，光栅口在不接触到捕获珠表面物质的前提下，距离捕获珠表面越小越好，使标记物发出的光能够尽量多地射入到光栅口内，避免距离过大时产生光的损失、导致检测结果不准确。
进一步地，单个光栅口内径为0.5倍捕获珠的外径至1.5倍捕获珠的外径之间。
进一步地，单个光栅口内径等于捕获珠的外径。较佳地，使单个光栅口处透光区域的面积接近于捕获珠发光区域在光栅口的投影面积，同时配合控制光栅口与捕获珠表面之间的距离，既保证捕获珠表面的发光物发出的光能够最大量地射入到光栅口内，同时，避免相邻位置处其他捕获珠表面的发光物发出的光射入此光栅口内而影响检测结果。
优选地，将捕获珠阵列布设在固珠板，以最大限度减小设备规格，且控制好能够进入光栅口的光的量，既能导通感应元件使其发出信号，又避免相邻捕获珠表面的光进入光栅口而使感应元件发出错误信号。
进一步地，发光标记物包括荧光或化学发光试剂。
进一步地，发光标记物为荧光时，在固珠板附近设置激发光源照射捕获珠。
本发明的有益效果是：
1. 本发明采用对捕获珠边扫描边统计结合有标记物的捕获珠的数量，实时得出检测物的数量，大大提高了检测速度。
2. 本发明在扫描时将发光标记物的光信号转换为电信号使得实时统计检测物数量的方式得以实现。
3. 本发明将光栅口设置成交错的两列的方式中，相当于增加了相邻光栅口之间的距离，避免同步检测时相邻捕获珠之间光的干涉，提高了检测结果的准确度。
附图说明
图1为实施例一将磁珠布设在微孔阵列板示意图；
图2为实施例一自动扫描识别示意图；
图3为实施例一光栅头的光栅口排列示意图；
图4为实施例二光栅头的光栅口排列示意图；
图5为俯视微孔阵列板和仰视光栅口时二者的对应关系示意图；
图6A-图6F为对不同位置关系布设的发光磁珠的检测所对应的信号示意图；
图7为实施例三中激发光源与捕获珠及光栅检测装置之间的位置关系示意图；
图中：10.微孔阵列板，11.微孔，12.磁珠，13.荧光标记物，20.光栅检测装置，21.光栅头，211.光栅口，22.光感应器，23.信号处理器，24.激发光源，25.反光镜。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。
实施例一
在本实施例中以发射荧光的物质作为标记物，以磁珠作为捕获珠，以带有微孔阵列的长条状微孔阵列板作为固珠板，且某些微孔中有一个磁珠，某些微孔中没有磁珠，每个磁珠表面最多特异性结合一个分析物，每个分析物均结合有荧光标记物。本文所描述的相邻行的磁珠（捕获珠）或相邻列的磁珠（捕获珠），都是指在阵列中相邻行的微孔或相邻列的微孔所在处的磁珠（捕获珠），即使是此相邻行或相邻列的微孔中没有磁珠，本文中相邻行的磁珠（捕获珠）或相邻列的磁珠（捕获珠）的描述依然是指阵列中相邻行的微孔或相邻列的微孔所在的位置。
一种基于光栅扫描识别的单分子检测方法，如图1所示，将数量确定的磁珠12布设在微孔阵列板10，且某些磁珠12表面没有结合分析物，某些磁珠12表面结合有分析物，也即结合有荧光标记物13；每个微孔11中最多布设一个磁珠12，某些微孔11中没有磁珠12。
然后进行光栅扫描识别检测，如图2所示，在微孔阵列板10的上方处设置激发光源24，发出的激发光经反光镜25反射后照射到待扫描的磁珠12表面，激发完成后关闭激发光。光栅检测装置20的光栅头21置于微孔阵列板10的上方处（当然也可以是设置在下方处），且光栅头21的光栅口211对准磁珠12，以使荧光标记物13被激发后发射的荧光能够最大限度地射入光栅口211。如图3所示，光栅口211的数量需大于或等于微孔阵列板10一列中微孔11的数量，且相邻两个光栅口211之间的中心距离需等于相邻两个微孔11之间的中心距离，以一次性对微孔阵列板10的整列磁珠12进行扫描识别。同时，为了正确统计射入荧光的光栅口211的数量，光栅检测装置20的光感应器22设在光栅头21与光栅口211相对的另一端处，光感应器22的感应元件如光敏管与光栅口211一一对应，当某个光栅口211处有荧光入射时，与其对应的感应元件接收入射光且发送信号到光栅检测装置20的信号处理器23，如光敏管感应光后能产生脉冲信号作为信号，信号处理器23接收此脉冲信号后进行后续处理，通过统计光感应器22发出的信号的数量可以对发荧光的磁珠12进行计数，进而得出具体的分析物的数量，当然，此将光信号转换成电信号并计数的方式采用现有技术是很容易实现的。
在扫描识别过程中，由于每次是对一列磁珠12进行检测，因此，要完成微孔阵列中全部磁珠12的检测，微孔阵列板10与光栅检测装置20之间需进行相对移动，以使光栅头21依次经过每列微孔12上方（或下方）进行检测。如图2所示，此相对运动可以采用微孔阵列板10向右的横向移动来实现，当然也可以通过光栅头21向左的横向移动来实现。
在此检测方式中，在布设磁珠12时确定好所有磁珠12的数量，然后扫描识别发光磁珠12的数量，也即分析物的数量，即可得知分析物的比例，与标准浓度曲线比较后可得知检测液中分析物的浓度。
实施例二
本实施例原理同实施例一，只是光栅头21的光栅口211排列有所不同，如图4所示，光栅口211交错成两列设置，也即相邻光栅口211之间的位置关系呈V形，以扩大相邻两个光栅口211之间的距离，此时，两列光栅口211的数量之和大于或等于一列中微孔11的数量，如图5所示，在扫描识别过程中，光栅头21从上方处对准微孔阵列板10后，标记为A’的光栅口211位于标记为A的磁珠12的正上方靠近磁珠12，标记为B’的的光栅口211位于标记为B的磁珠12的正上方靠近磁珠12。若检测过程中微孔阵列板10从左到右横向移动来实现微孔阵列板10和光栅检测装置20之间的相对运动，那么在开始扫描识别时，光栅头21位于微孔阵列板10最右端列的微孔12上方，标记为B’的光栅口211对准标记为B的磁珠12进行检测，而标记为A’的光栅口211不与微孔11相对，且标记为A的磁珠12此刻也不会被检测；当标记为B’的光栅口211将标记为B的磁珠12检测完成后，微孔阵列板10从左到右横向移动完成微孔阵列板10和光栅检测装置20之间的相对运动，此时标记为B’的光栅口211对准与标记为B同排的相邻下一列磁珠12，而标记为A’的光栅口211对准标记为A的磁珠12，同步完成相邻两列错位处磁珠12的检测。以此方式直至将微孔阵列板10上所有的磁珠12全部检测完成。这样，由于增加了相邻光栅口211之间的距离，可以减少相邻磁珠12之间光的干涉，使检测结果更准确。
检测结果
根据实验结果，对检测结果进行以下示意性说明，且为了简化实验操作和方便理解，仅用一个光栅口211和一个光敏管进行操作。
如图6A所示，当单个发光捕获珠从光栅口下方经过时，经信号处理器处理后发出一个正常的信号波。如图6B所示，当两个距离适中的发光捕获珠依次从光栅口下方经过时，经信号处理器处理后发出两个正常的信号波，其波峰波谷间隔明显且均匀。如图6C所示，当两个发光捕获珠距离太近甚至边缘处有部分重叠时，经信号处理器处理后发出的信号波中两个波的波峰相隔太近，且波谷不明显。如图6D所示，当三个发光捕获珠均距离太近依次从光栅口下方经过时，经信号处理器处理后发出的信号波波峰波谷间区别不明显。如图6E和6F所示，当三个发光捕获珠不在同一直线上、其中一个对准光栅口正下方、另外两个位于光栅口附近时，都会对检测产生影响，无法形成正常的信号波。
因此，为了保证检测结果的准确性以及实现检测体系的紧凑，尽量选取规格合适的捕获珠，如直径为2.7um的微珠，且在对捕获珠进行布设时，尽量控制相邻两个捕获珠之间的中心距，如为直径的2.5-3倍。同时，也需要尽量减小光栅口的大小，如将透光面积控制在捕获珠截面积的范围，只要保证透入的光足够导通感应元件以使信号处理过能够发出容易识别的信号即可。同时使光栅口与捕获珠表面之间的距离尽量靠近，尽量避免相邻发光捕获珠的光进入光栅口，也即减少相邻位置处光的干涉。
上述实施例虽然采用磁珠作为捕获珠，实际使用中还可以是带磁性或者不带磁性的其他形状的微粒，分析物既可以是蛋白质、也可以是核酸分子等，固珠板可以是带孔或者稍微凹陷的凹坑结构、甚至是平面均可。当固珠板带孔或者凹坑时，由于此孔或凹坑是提前加工出来的，因此可以加工成有规律的阵列格式，捕获珠可以有规律地放置入孔或凹坑，且列状排列的光栅口容易与其配合；当固珠板为平面时，既可以采用某些辅助结构将捕获珠有规律地阵列布设在固珠板表面，也可以将捕获珠随机散列在固珠板表面。而对于将捕获珠随机散开布置在平面上的方式中，为了避免捕获珠之间距离太近甚至成团，需要尽量增大捕获珠之间的距离，因此，对于同样数量的捕获珠，在平面上散开时，此时固珠板的表面积会比带孔或者凹坑的固珠板表面积大，且捕获珠之间的位置关系无序性较大，但是总的来说，依然可以将捕获珠看成是成多行多列的阵列布设，只是在此阵列中有很多位置没有捕获珠且同行或同列中的捕获珠并不是严格在一条直线上，因此依然可以采用上述实施例一或实施例二中逐列扫描检测的方式。
实施例三
本实施例中，如图7所示，固珠板与光栅检测装置之间上下设置，在固珠板的外周均匀设置两个或多个激发光源和反光镜，检测过程中，激发光源和反光镜保持不动，固珠板或光栅检测装置在激发光源之间的空间内移动。当然，激发光源还可以采用其他方式设置，只需保证每个捕获珠表面均能被照射到且能激发其表面标记物使其发出荧光。
以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化或变换，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的保护范围，本发明的保护范围应该由各权利要求限定。

Claims (10)

1.一种基于光栅扫描识别的单分子检测方法，其特征在于：将大量捕获珠相互散开布设在固珠板（或检测芯片），其中至少部分捕获珠特异性结合有一个分析物，且每个分析物结合有发光标记物，利用光栅检测装置的光栅口从布设在一端处的捕获珠开始逐列扫描捕获珠、且光栅检测装置同步对结合有标记物的捕获珠的数量进行统计，通过光栅口与捕获珠之间横向的相对移动扫描整个固珠板上的捕获珠，扫描完成后即可得出分析物的总数。
2.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子检测方法，其特征在于：一套光栅检测装置包括光栅头、光感应器和信号处理器，其中光栅头包括成列设置的多个独立的光栅口，光感应器包括多个独立的感应元件，且扫描时，一个光栅口对准一个捕获珠或者不对准捕获珠，一个感应元件对应一个光栅口并能感应此光栅口处入射的光，当感应元件感应到入射光后反馈至信号处理器，信号处理器根据反馈结果统计分析物的数量。
3.如权利要求2所述的基于光栅扫描识别的单分子检测方法，其特征在于：感应元件包括光敏管，其感应入射光后输出脉冲信号至信号处理器，信号处理器根据输出脉冲信号的光敏管的数量统计分析物数量。
4.如权利要求2所述的基于光栅扫描识别的单分子检测方法，其特征在于：光栅检测装置的光栅口成一列设置，整列光栅口的数量大于或等于固珠板上布设的捕获珠的行数，且相邻两个光栅口之间的中心距离等于同列相邻两行捕获珠之间的中心距离。
5.如权利要求2所述的基于光栅扫描识别的单分子检测方法，其特征在于：光栅检测装置的光栅口成交错设置的两列，两列光栅口的总数大于等于固珠板上捕获珠的行数，每列光栅口内相邻光栅口之间的中心距离等于同列中间隔一行的两行捕获珠之间的中心距离，两列光栅口配合对一列捕获珠进行扫描。
6.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子检测方法，其特征在于：相邻两个捕获珠之间的中心距离大于等于两倍捕获珠的外径。
7.如权利要求6所述的基于光栅扫描识别的单分子检测方法，其特征在于：相邻两个捕获珠之间的中心距离大于等于三倍捕获珠的外径。
8.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子检测方法，其特征在于：光栅口与捕获珠表面之间的距离小于等于两倍捕获珠的外径。
9.如权利要求8所述的基于光栅扫描识别的单分子检测方法，其特征在于：光栅口与捕获珠表面之间的距离小于等于一倍捕获珠的外径。
10.如权利要求1所述的基于光栅扫描识别的单分子检测方法，其特征在于：单个光栅口内径为0.5倍捕获珠的外径至1.5倍捕获珠的外径之间。
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