CN1150336C - 检测dna芯片的制造方法 - Google Patents

Abstract

检测DNA芯片的制造方法的步骤如下：①寡核苷酸的合成与修饰，②寡核苷酸片段氧化，③寡核苷酸片段的标记，④玻片表面的脂肪氨基化，⑤寡核苷酸片段的固定。这种方法基于核酸保护原理的DNA芯片检测技术，DNA芯片各个位点的DNA探针量已知而且待测样品无需预先用同位素或荧光基团标记，因其操作简单、结果可靠而易于在临床诊断中推广。

Description

检测DNA芯片的制造方法

本发明涉及的是一种芯片制造的方法，特别是一种检测DNA芯片的制造方法，属于生物技术中DNA类领域。

DNA芯片是将DNA片段共价固定于固相载体表面，经核酸杂交检测液相中为同位素或荧光基团标记的各种核酸及其含量，如文献Schena M，Shalon D，Davis RW，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementaryDNA microarray.Science，1995，270(5235)：467-470，该对比文献是将mRNA经反转录而得到的cDNA片段经PCR扩增后，点到玻璃基片上。样品与芯片杂交前，必须先制备mRNA，再经反转录得到cDNA，并标记荧光基团。这种cDNA芯片制造方法烦琐，特别对应用者来说，步骤繁多，很不方便，不适于发展成诊断用的DNA芯片，另一方面，这种cDNA芯片制造中虽然点样前的探针浓度可以确定，但并不能确定核酸与玻璃基片的交联效率，即点样后芯片上每一点的核酸量未知，这对定量检测很不利。

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种检测DNA芯片的制造方法。这种方法基于核酸保护原理的DNA芯片检测技术，DNA芯片各个位点的DNA探针量已知而且待测样品无需预先用同位素标记，因其操作简单、结果可靠而易于在临床诊断中推广。

本发明的技术方案和实施情况如下：芯片制造的关键是使寡核苷酸片段牢固地固定在玻片上，为此，必须对寡核苷酸片段和玻片都做一定的前期处理。本发明的方法步骤如下：①寡核苷酸的合成与修饰，②寡核苷酸片段氧化，③寡核苷酸片段的标记，④玻片表面的脂肪氨基化，⑤寡核苷酸片段的固定。

这些步骤的具体含义如下：

①寡核苷酸的合成与修饰：采用核糖核苷-CPG柱(核糖核苷与固相玻璃共价交联)起始寡核苷酸合成，合成的产物3′-末端是核糖核苷；

②寡核苷酸片段氧化：这种寡核苷酸用高碘酸氧化可以制备出3′-末端是醛基的寡核苷酸，具体方法如下：反应溶液含有3μmol/L寡核苷酸片段，0.1mol/L乙酸钠(pH5.0)，10mmol/L MgCl₂，10mmol/L NaIO₄，室温反应1小时，随后加入KCl至终浓度为0.2mol/L，于0℃保温10分钟，以中和过量的NaIO₄，回收上清液，用2-3倍体积冷乙醇(无水乙醇)沉淀氧化的OLIGO1-[rU]，并用70％乙醇清洗一次，最后溶于适量体积的TE缓冲液中；

说明：“OLIGO1-[rU]”，表示：这条寡聚脱氧核苷酸片段中，只有3’-末端的核苷酸是核糖核苷酸，其余核苷酸是脱氧核苷酸。LIGO1是oligodeoxy ribonudeotide的缩写形式，阿拉伯数字1是该聚合物的序列号，[rU]是Uridine ribonudeotide的缩写形式，表示尿嘧啶核糖核苷酸。

③寡核苷酸片段的标记：用同位素标记，反应溶液含有1x PNK buffer，0.8μci/μl [γ-³²P]ATP，6pmole/μl ATP，0.3u/μl T4-PNKinase，37℃温育1小时，然后聚丙烯酰胺电泳纯化标记好的寡核苷酸片段；

④玻片表面的脂肪氨基化：用10N NaOH溶液浸泡载玻片过夜，然后用蒸馏水冲洗干净，再将载玻片置于浓盐酸中浸泡过夜，用蒸馏水冲洗干净，最后将载玻片置于10％γ-氨丙基三乙氧基硅的甲苯溶液中100℃水浴回流过夜。用甲苯清洗载玻片，离心甩干备用；

⑤寡核苷酸片段的固定：将氧化的OLIGO1-[rU]点样于载玻片上，每点点样2μl，37℃反应1小时后，置室温过夜，再将玻片置于0.1mol/L Tris.HCl(pH8.0)，10mmol/L MgCl₂，0.05mol/L NaBH₄溶液中，室温反应2小时，最后用蒸馏水洗净。DNA芯片与液相中的待测核酸进行杂交，杂交后的DNA芯片用核酸酶S1酶切，反应后，用95℃水煮2分钟，反复3次，晾干后压X-光片，被保护核酸与液相中的待测核酸呈线性关系。

化学法合成了3′-末端是尿嘧啶核糖的寡聚脱氧核糖核苷酸片段，用³²P标记寡核苷酸的5′-末端，经过高碘酸氧化后与玻璃基片表面的脂肪氨基缩合，并用硼氢化钠还原，制造成寡核苷酸的3′-末端与玻片共价交联，5′-末端为同位素标记的DNA芯片，将这种芯片与液相中的核酸片段杂交，再用核酸酶S1酶切，结果显示如果液相中的核酸与玻片上共价交联的寡核苷酸片段能够特异性杂交酸对，核酸酶S1不能酶切玻片上的寡核苷酸片段；玻片上被保护的寡核苷酸量与液相中的与它配对的核酸量之间呈现线性关系。这种方法可以定性和定量地检测验液相中的核酸，由于此法制备的DNA芯片各个位点的DNA探针的含量可以预先确定，待测的核酸样品无需进行同位素或荧光标记，并且适于对DNA或RNA进行检测，更适于发展成临床诊断用的DNA芯片。

以下进一步说明本发明实施情况：

实施例1  在液相中做了利用核酸保护实验进行核酸定量的一个控制实验，先合成了三段寡核苷酸片段：OLIGO1，OLIGO2和OLIGO3，其中OLIGO1和OLIGO2是完全配对的，OLIGO1和OLIGO3是部分不配对的，实验证明，S1酶不能酶切完全配对的OLIGO1：OLIGO2双链，而能够降解部分不配对的OLIGO1：OLIGO3双链，当然，也能够酶切单链的寡核苷酸片段，当OLIGO1的量足够大时，被保护的OLIGO1的量与液相中OLIGO2的量呈线性关系。

液相核酸保护试验，杂交溶液含有1x S1 Buffer，3μM ³²P-OLIGO1，不同含量的OLIGO2或OLIGO3，100℃保温数秒，再自然冷却至室温，使其形成³²P-OLIGO1：OLIGO2双链或³²P-OLIGO1：OLIGO3双链，杂交双链用0.5U/μl核酸酶S1于23℃酶切15分钟，随后加EDTA至50mM终止反应，没有加入核酸酶S1的杂合双链³²P-OLIGO1：OLIGO2和³²P-OLIGO1：OLIGO3没有发生降解。完全配对的杂交双链³²P-OLIGO1：OLIGO2能够耐受核酸酶S1的酶切作用，而部分不配对的杂合双链³²P-OLIGO1：OLIGO3不能耐受核酸酶S1的酶切、被降解为小片段。当³²P-OLIGO1-rU化学量高于或等于OLIGO2的化学量时，在适当的范围内被保护的³²P-OLIGO1-rU与溶液中OLIGO2化学量呈较好的线性关系。

实验2：实施例1表明，可以利用核酸保护实验进行DNA或RNA的定量。为此，将OLIGO1照技术方案步骤2的方法进行氧化，生成带有醛基的寡核苷酸片段，并按技术方案步骤3的方法进行标记；同时，将玻片按技术方案步骤4的方法氨基化；最后，按技术方案步骤5的方法将标记好的OLIGO1共价交联到玻片上，即制造成能够用于核酸检测的DNA芯片。芯片上每点固定了5pmole的³²P-OLIGO1。将该芯片与待测样品杂交，并用S1酶酶切，如果待测样品中的核酸(如OLIGO2)与芯片上的寡核苷酸片段(OLIGO1)完全配对，则能够耐受S1酶的酶切，而且当固化在芯片上的OLIGO1的量大于待测样品中的OLIGO2的量时，经S1酶切后，芯片上被保护的OLIGO1的量与待测样品中的OLIGO2的量呈现线性关系。如果待测样品中的核酸(如OLIGO3)与芯片上的寡核苷酸片段部分不配对，则被S1酶酶切降解掉。当OLIGO1是某种疾病的特征DNA片段时，就可以利用该芯片检测疾病，将芯片与待检人员的DNA(或RNA)样品杂交，并经S1酶酶切，如果芯片有信号，说明待检人员的DNA(或RNA)样品中有与OLIGO1完全配对的片段，待检人员为该病患者，如果芯片无信号(即OLIGO1被完全降解掉)，说明该待检人员不患此病。利用芯片平行处理的优点，实际上可以在芯片上固化不止一种标记好的特征片段，因而可以同时进行多种疾病的检测，即使对同一种疾病，也可以设计多个特征片段，以增加诊断的准确率。在实际应用中，为了消除同位素的放射性危害，在标记待固化的寡核苷酸片段时，完全可以用荧光染料代替同位素。

本发明具有实质性特点和显著进步，获得的良好效果如下：1.探针与玻璃基片是共价连接，结合牢固；2.直接标记探针，这样就可以确定点样后芯片上每点的核酸量，便于定量测定核酸，并且简化了后续的检测步骤，即对应用者来说，不必再标记样品，极大地提高了工作效率；3.既能测定DNA，又能测定RNA，样品不必经反转录这一步；4.应用核酸保护原理定量测定核酸，简便、灵敏、可靠。

Claims (6)

1、一种检测DNA芯片的制造方法，其特征在于该方法步骤如下①寡核苷酸的合成与修饰，②寡核苷酸片段氧化，③寡核苷酸片段的标记，④玻片表面的脂肪氨基化，⑤寡核苷酸片段的固定。

2、根据权利要求1所述的这种检测DNA芯片的制造方法，其特征还在于①寡核苷酸的合成与修饰的具体方法为：采用核糖核苷-CPG柱起始寡核苷酸合成，合成的产物3′-末端是核糖核苷。

3、根据权利要求1所述的这种检测DNA芯片的制造方法，其特征还在于②寡核苷酸片段氧化的具体方法为：这种寡核苷酸用高碘酸氧化可以制备出3′-末端是醛基的寡核苷酸，具体方法如下：反应溶液含有3μmol/L寡核苷酸片段，0.1mol/L乙酸钠(pH5.0)，10mmol/L MgCl₂，10mmol/L NaIO₄，室温反应1小时，随后加入KCl至终浓度为0.2mol/L，于0℃保温10分钟，以中和过量的NaIO₄，回收上清液，用2-3倍体积冷乙醇沉淀氧化的OLIGO1-[rU]，并用70％乙醇清洗一次，最后溶于适量体积的TE缓冲液中。

4、根据权利要求1所述的这种检测DNA芯片的制造方法，其特征还在于③寡核苷酸片段的标记的具体方法为：用同位素标记，反应溶液含有1x PNK buffer，0.8μci/μl [γ-³²P]ATP，6pmole/μl ATP，0.3u/μl T4-PNKinase，37℃温育1小时，然后聚丙烯酰胺电泳纯化标记好的寡核苷酸片段。

5、根据权利要求1所述的这种检测DNA芯片的制造方法，其特征还在于④玻片表面的脂肪氨基化的具体方法为：用10N NaOH溶液浸泡载玻片过夜，然后用蒸馏水冲洗干净，再将载玻片置于浓盐酸中浸泡过夜，用蒸馏水冲洗干净，最后将载玻片置于10％γ-氨丙基三乙氧基硅的甲苯溶液中100℃水浴回流过夜，用甲苯清洗载玻片，离心甩干备用。

6、根据权利要求1所述的这种检测DNA芯片的制造方法，其特征还在于⑤寡核苷酸片段的固定的具体方法为：将氧化的OLIGO1-[rU]点样于载玻片上，每点点样2μl，37℃反应1小时后，置室温过夜，再将玻片置于0.1mol/L Tris.HCl(pH8.0)，10mmol/L MgCl₂，0.05mol/L NaBH₄溶液中，室温反应2小时，最后用蒸馏水洗净。