CN115025247A

CN115025247A - 包载促血小板生成素mRNA的组合物及其用途

Info

Publication number: CN115025247A
Application number: CN202210426776.4A
Authority: CN
Inventors: 张宇; 徐颖洁
Original assignee: Shanghai Lanque Biomedical Co ltd; Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Lanque Biomedical Co ltd; Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2022-04-22
Publication date: 2022-09-09

Abstract

本申请涉及一种组合物，其包含(a)mRNA，所述mRNA包含编码促血小板生成素(TPO)的核酸分子，和(b)递送载体。本申请还涉及所述组合物在制备药物中的用途。

Description

包载促血小板生成素mRNA的组合物及其用途

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种包含促血小板生成素mRNA的脂质纳米颗粒。

背景技术

血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆脱落下来的小块胞质，在因血管创伤而失血时，可以帮助止血或形成血栓。但是多种因素(例如，白血病等原因导致的巨核细胞减少、免疫系统病变等)可能会引发血小板生成减少和/或血小板破坏增加，导致血液中血小板水平减少，进一步引起凝血功能障碍、出血甚至致死。

免疫性血小板减少症(ITP，Immune thrombocytopenia)是血小板减少引起的疾病之一，通常由自身免疫导致的血小板破坏增加引发。ITP患者通常表现为散在的皮肤出血点及其他较轻的出血症状，如鼻衄、牙龈出血等，不易治愈且严重时可因颅内出血致死。

目前血小板输注是治疗ITP最直接的手段，但是血小板寿命短且不易储存，比较稀缺，因此一般只在严重情况下使用，且存在费用昂贵和产生免疫排异等问题。除此之外，糖皮质激素是治疗ITP使用最多的一线药物，但是长期使用激素会带来较多的副作用。目前特异治疗ITP的临床药物的靶点主要为白介素受体和促血小板生成素(TPO)受体，其中巨核细胞上的TPO受体在体内可以被TPO激活并生长，从而促进血小板生成。针对TPO受体的药物有重组促血小板生成素和受体激动剂，但是存在安全性和/或有效性问题，例如重组促血小板生成素容易产生抗体而引发免疫排斥，而受体激动剂则特异性低、存在脱靶效应、持续的激活导致血栓和纤维化等。

因此针对血小板减少相关疾病，仍需要开发更多药物以实现更好的治疗。

发明内容

本申请提供了一种组合物，其包含(a)mRNA，所述mRNA包含编码促血小板生成素(TPO)的核酸分子，和(b)递送载体。本申请还提供了所述组合物在治疗血小板减少相关疾病(例如，血小板减少症)中的用途。使用本申请的组合物和方法，编码目的蛋白(例如，TPO)的mRNA包载在递送载体(例如，脂质递送载体，又例如，纳米脂质颗粒)中，被呈递到体内，目的蛋白(例如，TPO)由自身细胞表达产生，至少具有以下一种或多种性质：(1)副作用(例如，免疫排异、骨髓纤维化)低，(2)成本低，(3)特异性更高，(4)体内代谢受生理平衡体系控制，(5)起效时间短，因此具有良好的安全性、有效性和实用性。

一方面，本申请提供了一种组合物，其包含(a)mRNA，所述mRNA包含编码促血小板生成素(TPO)的核酸分子，和(b)递送载体。

在某些实施方式中，所述mRNA在选自下组的一个或多个位置处包含修饰：5’帽、5’非翻译区、开放阅读框、3’非翻译区和poly A尾。

在某些实施方式中，所述mRNA包含至少一种经修饰的核苷酸。

在某些实施方式中，所述mRNA包含选自下组中的一种或多种修饰的核苷酸：5-甲基胞苷/假尿苷(m5C/Ψ)、假尿苷(Ψ)、5-甲氧基尿苷(mo5U)和1-甲基假尿苷(m1Ψ)。

在某些实施方式中，所述TPO包含如SEQ ID NO:1和4中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述mRNA是密码子优化的。

在某些实施方式中，所述mRNA包含如SEQ ID NO:2、3和5中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述递送载体包括脂质体。

在某些实施方式中，所述递送载体包括脂质纳米颗粒(LNP)。

在某些实施方式中，所述递送载体包括阳离子脂质。

在某些实施方式中，所述阳离子脂质包括DLin-MC3-DMA。

在某些实施方式中，所述递送载体包括非阳离子脂质。

在某些实施方式中，所述非阳离子脂质包括磷脂和/或脂质缀合物。

在某些实施方式中，所述磷脂包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。

在某些实施方式中，所述脂质缀合物包括聚乙二醇(PEG)修饰的脂分子。

在某些实施方式中，所述递送载体包括PEG2000-DMG。

在某些实施方式中，所述递送载体包括胆固醇。

在某些实施方式中，所述mRNA包载在所述递送载体中。

另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含所述组合物以及药学上可接受的载体。

另一方面，本申请提供了预防和/或治疗与血小板减少引起的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的所述组合物，和/或所述药物组合物。

在某些实施方式中，所述与血小板减少引起的疾病或病症包括血小板减少症。

另一方面，本申请提供了所述组合物，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗与血小板减少引起的疾病或病症。

另一方面，本申请提供了所述组合物，和/或所述药物组合物，其用于预防和/或治疗与血小板减少引起的疾病或病症。

另一方面，本申请提供了一种促进血小板生成的方法，其包括使用所述的组合物，和/或所述的药物组合物。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：

图1显示的是体外转录制备mRNA的示例性流程。

图2显示的是本申请所述TPO mRNA在细胞中的表达结果(左：鼠；右：人)。

图3显示的是本申请所述TPO mRNA包载于纳米脂质颗粒的示例性流程。

图4显示的是本申请所述纳米脂质颗粒的粒径分布。

图5显示的是注射包载了TPO mRNA的纳米脂质颗粒后小鼠血浆中TPO的水平。

图6显示的是注射包载了TPO mRNA的纳米脂质颗粒后小鼠血液中的新生血小板比例。

图7显示的是注射包载了TPO mRNA的纳米脂质颗粒后的小鼠血小板计数结果(A：静脉注射；B：肌肉注射)

图8显示的是重复给药包载了TPO mRNA的纳米脂质颗粒后促进血小板增加。

图9显示的是包载了TPO mRNA的纳米脂质颗粒治疗R300引起的血小板减少症。

图10显示了慢性ITP模型建模过程中的血小板计数变化。

图11显示的是注射包载了TPO mRNA的纳米脂质颗粒，罗米司亭或TPO重组蛋白后小鼠血浆中TPO的水平对比。

图12至图13显示的是注射不同剂量的包载了TPO mRNA的纳米脂质颗粒，罗米司亭或TPO重组蛋白后未经造模的普通小鼠血小板计数结果对比。

图14至图15显示的是注射不同剂量的包载了TPO mRNA的纳米脂质颗粒，罗米司亭或TPO重组蛋白后慢性ITP模型小鼠血小板计数结果对比。

图16显示的是注射不同剂量的包载了TPO mRNA的纳米脂质颗粒未经造模的普通小鼠血浆中谷草/谷丙转氨酶的水平。

图17显示的是注射不同剂量的包载了TPO mRNA的纳米脂质颗粒，罗米司亭或PBS后未经造模的骨髓纤维化评价结果对比。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“促血小板生成素(TPO)”通常是指一种血小板生成调节因子，也可称为巨核细胞生成素、巨核细胞生长和发育因子(MGDF)和/或c-Mpl配体。TPO是一种糖蛋白，主要在肝脏细胞中产生，能刺激可以产生大量血小板的巨核细胞的形成和分化，进而促进血小板的生成。所述TPO涵盖全长的TPO或其功能性片段、截短体、剪接变体和/或物种同源物。示例性的人TPO的氨基酸序列可参见NCBI登录号:NP_000451.1，示例性的小鼠TPO的氨基酸序列可参见NCBI登录号:NP_001166976.1。

在本申请中，术语“mRNA”通常是指经过处理去除了内含子，且能够被翻译成多肽的RNA转录本。

在本申请中，术语“密码子优化”通常是指，通过用在细胞中具有不同的相对使用频率的编码相同氨基酸残基的密码子，替换亲代多肽编码核酸中的一个、至少一个、或一个以上密码子。

在本申请中，术语“递送载体”通常是指能够将试剂(例如，mRNA)递送至靶细胞的转移媒介物。递送载体可以将试剂(例如，mRNA)递送到特定的细胞亚类。例如，借助递送载体的固有特征或者通过与载体相偶联的部分、包含在其内的部分(或者与载体结合的部分，从而使得该部分和该递送载体维持在一起，进而使得该部分足以靶向递送载体)使递送载体靶向某些类型的细胞。递送载体还可提高要递送的试剂(例如，mRNA)的体内半衰期和/或要递送的试剂的生物利用度。递送载体可包括病毒载体、病毒样颗粒、聚阳离子载体、肽载体、脂质体和/或杂交载体。例如，如果靶细胞是肝细胞，所述递送载体的性质(例如，尺寸、电荷和/或pH)可以有效地将所述递送载体和/或其中包载的分子(例如，mRNA)递送至靶细胞、降低免疫清除和/或促进在该靶细胞中停留。

在本申请中，术语“脂质体”通常是指通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离的具有内部空间的囊泡。例如，所述双层的膜可以通过两性分子形成，如包含空间隔离的亲水性和疏水性结构域的合成或天然来源的脂质；又例如，所述双层的膜可以通过两亲性聚合物和表面活性剂形成。

在本申请中，术语“纳米脂质颗粒”通常是指包含通过分子间力彼此物理结合(例如，共价或非共价)的多个(即多于一个)脂质分子的颗粒。脂质纳米颗粒可以是例如微球(包括单层和多层囊泡，例如脂质体)、乳液中的分散相、胶团或悬浮液中的内相。纳米脂质颗粒可以包含一种或多种脂质(例如，阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG-修饰的脂质)。

在本申请中，术语“修饰”用于核酸(例如RNA或DNA)时通常是指，与相应的野生型相比，所述核酸具有不同的核苷酸分子，不同的核苷酸序列，由不同的键组成和/或在其结构中掺入非天然部分。例如，所述修饰可包括核苷酸的修饰，例如，所述核苷酸可包含经修饰的碱基、糖或磷酸基团。例如，所述修饰可包括不同的核苷酸序列但是编码相同氨基酸序列的多肽或蛋白质，或相同功能的多肽或蛋白质。所述修饰可以是化学修饰和/或生物修饰。“化学修饰”可包括引入不同于野生型或天然存在的核酸中所见到的那些化学物质的修饰，例如，共价修饰，例如，引入经修饰的核苷酸(例如，核苷酸类似物，或者引入在这些核酸分子中未天然发现的侧基)。

在本申请中，术语“受试者”通常是指本申请的组合物和方法待施用的任何动物(例如，不如动物)，包括但不限于人、非人灵长类、啮齿类等。

发明详述

mRNA

一方面，本申请提供一种分离的RNA，特别是一种mRNA，所述mRNA包含能够编码促血小板生成素(TPO)的核酸分子，所述mRNA的至少一部分能够编码TPO。

在本申请中，所述RNA可以是天然或非天然存在的RNA，例如mRNA。所述mRNA可以包括一个或多个核碱基、核苷或核苷酸。在本申请中，术语“核苷”通常是指包含糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物和有机碱(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文也称为“核碱基”)的组合的化合物。在本申请中，“核苷酸”通常是指包括磷酸基团的核苷。

在本申请中，所述mRNA可以包括5’非翻译区(5’UTR)、3’非翻译区(3’UTR)和/或编码区(例如开放阅读框)。

在本申请中，所述mRNA可包含编码TPO的核苷酸序列，所述TPO可以源自鼠。例如，所述TPO可包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。例如，所述mRNA编码的所述TPO也可包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，82％、85％、88％、90％、95％、98％、99％或以上)的序列同一性的氨基酸序列。

在本申请中，所述mRNA可包含编码TPO的核苷酸序列，所述TPO可以源自人。例如，所述TPO可包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。例如，所述mRNA编码的所述TPO也可包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，82％、85％、88％、90％、95％、98％、99％或以上)的序列同一性的氨基酸序列。

在本申请中，所述mRNA可包括5’帽结构、链终止核苷酸、Kozak序列(也称为Kozak共有序列)、茎环、polyA序列和/或聚腺苷酸化信号。在其他实施方案中，mRNA不包含poly A序列和/或聚腺苷酸化信号，而是包含用于稳定mRNA的替代结构。

5’帽结构通常是指包括两个通过接头连接的核苷部分的化合物，并且可以选自天然帽、非天然帽、帽类似物和抗加反帽子类似物(ARCA)。帽可以包括一个或多个修饰的核苷和/或接头部分。例如，天然mRNA帽可能包含在7位甲基化的鸟嘌呤核苷酸和鸟嘌呤(G)核苷酸，在其5’位通过三磷酸键连接，例如m G(5')ppp(5')G，通常写为mGpppG。所述帽可以包括但不限于m⁷GpppG、m⁷Gpppm⁷G、m⁷3'dGpppG、m₂ ^7，O3'GpppG、m₂ ^7，O3'GppppG、m₂ ^7，O2'GppppG、m⁷Gpppm⁷G、m⁷3'dGpppG、m₂ ^7,03'GpppG、m₂ ^7,03'GppppG和m₂ ^7,02'GppppG。在本申请中，所述mRNA可包含选自下组的的5'末端帽：Cap0、Cap1、Cap2、ARCA、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2’氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。例如，所述mRNA的5’帽可以是ARCA。

本申请的mRNA可以包括链终止核苷。例如，链终止核苷可包括在其糖基的2’和/或3’位置脱氧的那些核苷，例如可以包括3’-脱氧腺苷(cordycepin)、3’-脱氧尿苷、3’-脱氧胞嘧啶、3’-脱氧鸟苷、3’-脱氧胸腺嘧啶和2’,3’-脱氧核苷。例如在3’末端将链终止核苷酸掺入mRNA中可以使mRNA稳定。

本申请的mRNA可以包括茎环，例如组蛋白茎环。茎环可包含2、3、4、5、6、7、8或更多个核苷酸碱基对。例如，茎环可以包括4、5、6、7或8个核苷酸碱基对。茎环可以位于mRNA的任何区域。例如，茎环可位于非翻译区(5'非翻译区或3'非翻译区)、编码区或polyA序列或尾部之中、之前或之后。在一些实施方案中，茎环可以影响mRNA的一种或多种功能，例如翻译的起始、翻译效率和/或转录终止。

本申请的mRNA可以地包括polyA序列和/或聚腺苷酸化信号。polyA序列可以全部或大部分包含腺嘌呤核苷酸或其类似物或衍生物。polyA序列可以是位于mRNA的3'非翻译区附近的尾巴。在一些实施方案中，polyA序列可以影响mRNA的核输出、翻译和/或稳定性。

修饰的mRNA

在本申请中，所述mRNA可以是修饰的。所述修饰可以是化学修饰或生物修饰。在本申请中，所述mRNA可以包含一个或多个修饰的核碱基、核苷或核苷酸，此时，它可以被称为“化学修饰的mRNA”，在本文中也可被称为“修饰的mRNA”。与未经修饰的参考序列(例如，天然存在的或野生型的mRNA)相比，修饰的mRNA可具有有用的性质，例如，包括增强的稳定性、提高的细胞内保留、增强的翻译效果和/或降低的免疫原性。因此，使用修饰的mRNA可以提高蛋白质生产的效率、提高核酸在细胞内的保留以及降低免疫原性。

在本申请中，mRNA可以包括一个或多个(例如1、2、3或4)不同的修饰的核碱基，核苷或核苷酸。在某些实施方案中，mRNA包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100，或更多)不同的修饰核苷碱基，核苷或核苷酸。在某些实施方案中，相对于相应的未修饰的mRNA，修饰的mRNA在引入修饰的RNA的细胞中可具有降低的降解率、较高的蛋白质生产效率、较高的核酸在细胞内保留的时间以及较低免疫原性。在本申请中，所述修饰可以选自N6-甲基腺苷(m6A)、2'-O-甲基化(Nm)和假尿嘧啶修饰。

在本申请中，所述mRNA可以包括修饰的核碱基，所述修饰的核碱基可以是修饰的尿嘧啶。在本申请中，所述mRNA可以包括修饰的核碱基，所述修饰的核碱基可以是修饰的胞嘧啶。在本申请中，所述mRNA可以包括修饰的核碱基，所述修饰的核碱基可以是修饰的腺嘌呤。在本申请中，所述mRNA可以包括修饰的核碱基，所述修饰的核碱基可以是修饰的鸟嘌呤。在本申请中，所述mRNA可以包括一种或多种前述修饰的核碱基的组合(例如，前述修饰的核碱基的2、3或4种的组合)。在本申请中，

在本申请中，所述mRNA可以包括一种或多种修饰的尿苷和/或胞苷。

在本申请中，所述mRNA可以包括一种或多种修饰的核碱基，所述修饰的核碱基可以选自假尿苷(ψ)、5-甲基胞苷(m⁵C)、1-甲基-假尿苷(m¹ψ)、5-甲氧基尿苷(mo⁵U)和N6-甲基-腺苷(m6A)。在某些实施方案中，本申请的修饰的RNA包括一种或多种前述修饰的核碱基的组合(例如，前述修饰的核碱基的2、3或4的组合)。

在本申请中，所述mRNA可以包括一种或多种修饰的核碱基，所述修饰的核碱基可以选自5-甲基胞苷/假尿苷(m⁵C/Ψ)、假尿苷(Ψ)、5-甲氧基尿苷(mo⁵U)和1-甲基假尿苷(m¹Ψ)。在某些实施方案中，本申请的修饰的RNA包括一种或多种前述修饰的核碱基的组合(例如，前述修饰的核碱基的2、3或4的组合)。

在本申请中，修饰的核苷可以部分或完全替代所述mRNA的天然核苷酸。例如，天然核苷酸的核苷可以被替换为本申请所述的修饰的核苷。例如中，天然核苷酸的核苷可以被部分替换，例如，约0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45至少50％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％的天然核苷被替换为修饰的核苷)。

在本申请中，所述mRNA可以统一地含有某种特定修饰(即，100％的修饰，完全修饰，贯穿整个序列的修饰)。例如，所述mRNA可以用5-甲基胞苷/假尿苷(m⁵C/Ψ)统一地修饰，这意味着所述mRNA序列中的所有胞苷被替换为5-甲基胞苷(m⁵C)，且所有尿苷被替换为假尿苷(Ψ)。例如，所述mRNA可以用假尿苷(Ψ)统一地修饰，这意味着所述mRNA序列中的所有尿苷被替换为假尿苷(Ψ)。例如，所述mRNA可以用5-甲氧基尿苷(mo⁵U)统一地修饰，这意味着所述mRNA序列中的所有尿苷被替换为5-甲氧基尿苷(mo⁵U)。例如，所述mRNA可以用1-甲基假尿苷(m¹Ψ)统一地修饰，这意味着所述mRNA序列中的所有尿苷被替换为1-甲基假尿苷(m¹Ψ)。

例如，本申请的mRNA可以包含选自5-甲基胞苷/假尿苷(m⁵C/Ψ)、5-甲氧基尿苷(mo⁵U)和1-甲基假尿苷(m¹Ψ)的修饰。例如，本申请的mRNA可以包含1-甲基假尿苷(m¹Ψ)的修饰。

在本申请中，所述mRNA可以在编码区(例如，编码TPO的开放阅读框)中被修饰。在本申请中，所述mRNA可以在除编码区之外的区域中被修饰。例如，所述mRNA可以在5'-UTR和/或3'-UTR中包含一个或多个不同的核苷修饰。在本申请中，所述mRNA可以在编码区和非编码区(例如，5'-UTR和/或3'-UTR中)被修饰。在本申请中，所述mRNA可以包括对糖、核碱基和/或核苷间键的修饰，以及他们的组合。

在本申请中，所述mRNA可以被密码子优化，改变密码子的一种或多种核苷酸，仍使得密码子编码相同氨基酸。密码子优化方法是本领域已知的，可用于多种目的：匹配宿主生物中的密码子频率以确保正确折叠；偏置GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；最小化可能重复的串联重复密码子或可能损害基因的构建或表达的碱基序列；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；去除/添加编码蛋白中的翻译后修饰位点(例如糖基化位点)；添加，去除或改组蛋白结构域；插入或删除限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调节翻译速率以允许蛋白质的各个结构域正确折叠；或，减少或消除多核苷酸内有问题的二级结构。此外，合适的修饰可，但比在mRNA的野生型版本中的密码子更加稳定。

在本申请中，所述mRNA可包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。在本申请中，所述mRNA可包含与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，82％、85％、88％、90％、95％、98％、99％或以上)的序列同一性的核苷酸序列。

在本申请中，所述mRNA可包含如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。在本申请中，所述mRNA可包含与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，82％、85％、88％、90％、95％、98％、99％或以上)的序列同一性的核苷酸序列。

在本申请中，所述mRNA可包含如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。在本申请中，所述mRNA可包含与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有至少80％(例如，82％、85％、88％、90％、95％、98％、99％或以上)的序列同一性的核苷酸序列。

本申请的mRNA可以通过本领域任何可行的方法产生，包括但不限于体外转录(IVT)和合成方法。可以利用酶促(IVT)、固相、液相、组合合成方法、小区域合成和连接方法制备mRNA。在一个实施方案中，使用IVT酶促合成方法制备mRNA。因此，本申请还涉及还可用于体外转录本申请的mRNA的多核苷酸，例如DNA、构建体和载体。

纳米脂质颗粒

在本申请中，所述的组合物还可包含递送载体。本申请的mRNA可以配制在纳米颗粒或其他递送载体中，例如，以避免它们在递送至受试者时被降解。在本申请中，所述mRNA可以被包封在纳米颗粒内。在特定的实施方案中，纳米颗粒是具有至少一个尺寸(例如直径)小于或等于1000nM、小于或等于500nM或小于或等于100nM的颗粒。在特定的实施方案中，纳米颗粒包括脂质。脂质纳米颗粒可以包括但不限于脂质体和胶束。在本申请中，所述脂质纳米颗粒可以包括阳离子和/或可电离的脂质、阴离子脂质、中性脂质、两亲性脂质、聚乙二醇化的脂质和/或结构性脂质，或上述的组合在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种本申请所述的RNA，例如mRNA，又例如，编码目的多肽(例如，TPO)的mRNA。

本申请所述组合物中的递送载体可以是纳米脂质颗粒。所述纳米脂质颗粒可包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7或8)阳离子和/或可离子化的脂质。“阳离子脂质”通常指在一定pH(例如，生理pH)下携带任意数目的净正电荷的脂质。所述阳离子脂质可包括但不限于3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(二十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-二十三烷基-15,18,21,24-四氮杂八孔并烷(KL25)、DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、Octyl-CLinDMA、辛基-CLinDMA(2S)、DODAC、DOTMA、DDAB、DOTAP、DOTAP.C1、DC-Choi、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMRIE。另外，可以使用许多商业化的阳离子和/或可离子化脂质，例如，

(包括DOTMA和DOPE)和

(包括DOSPA和DOPE)。例如，阳离子脂质可以是DLin-MC3-DMA或DLin-KC2-DMA。

在某些实施方式中，所述阳离子脂质在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约40-70％，例如，约40-65％、约40-60％、约45-55％或约48-53％。在某些实施方式中，所述阳离子脂质在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约50％。

在本申请中，所述纳米脂质颗粒可包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7或8)非阳离子脂质。所述非阳离子脂质可以包括阴离子脂质。适用于本申请的脂质纳米颗粒的阴离子脂质可包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰磷酸乙醇基，以及其他连接了阴离子基团的中性脂质。

所述非阳离子脂质可以包括中性脂质。适用于本申请的脂质纳米颗粒的中性脂质可包括磷脂，例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，或其混合物。另外，可以使用具有饱和和不饱和脂肪酸链的混合物的脂质。例如，本申请所述的中性脂质可以选自DOPE、DSPC、DPPC、POPC或任何相关的磷脂酰胆碱。

在某些实施方式中，所述中性脂质在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约30-45％，例如，约33-42％、约35-40％或约38-39％。在某些实施方式中，所述中性脂质在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约38.5％。

在本申请中，所述纳米脂质颗粒可包含脂质缀合物，例如，聚乙二醇(PEG)修饰的脂质和衍生的脂质。PEG修饰的脂质可包括但不限于与具有C6-C20长度的烷基链的脂质共价连接的长度至多为5kDa的聚乙二醇链。这些组分的加入可防止脂质聚集，也可增加循环持续时间，易于脂质-核酸组合物递送至靶细胞，或快速释放出核酸。例如，所述聚乙二醇(PEG)修饰的脂分子可以是具有较短的酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。例如，所述纳米脂质颗粒可包含PEG2000-DMG。

在某些实施方式中，所述聚乙二醇(PEG)修饰的脂分子在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约0.5-2％，例如，约1-2％、约1.2-1.8％或约1.4-1.6％。在某些实施方式中，所述聚乙二醇(PEG)修饰的脂分子在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约1.5％。

在本申请中，所述纳米脂质颗粒还可包含胆固醇。在某些实施方式中，所述胆固醇在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约5-15％，例如，约6-14％、约7-13％、约8-12％或约9-11％。在某些实施方式中，所述胆固醇在脂质纳米颗粒中的摩尔比例为约10％。

在本申请中，所述纳米脂质颗粒可包括阳离子脂质、胆固醇、磷脂以及聚乙二醇修饰的脂分子。在某些实施方式中，所述阳离子脂质、胆固醇、磷脂以及聚乙二醇修饰的脂分子的摩尔比可以为45～55：5～15：35～45：0.5～2。在某些实施方式中，所述阳离子脂质、胆固醇、磷脂以及聚乙二醇修饰的脂分子的摩尔比可以为50:10:38.5:1.5。

制备方法

本申请提供了制备所述组合物中的递送载体的方法。例如，通过现有技术可制备多层囊泡(MLV)，例如，通过沉积选择的脂质在合适容器或器皿的内壁上；通过溶解脂质在合适溶剂中，以及然后蒸发溶剂以在器皿的内侧保留薄膜或者通过喷雾干燥。可将水相加入旋转运动着的器皿，其导致形成MLV。然后通过均质化、超声处理或挤压多层囊泡能够形成单层囊泡(ULV)。此外，通过洗涤剂去除技术能够形成单层囊泡。

在申请中，所述组合物包含递送载体(例如，纳米脂质颗粒)，其中mRNA可以与脂质的递送载体的表面缔合，并包封在其中。例如，在制备本申请的组合物时，所述阳离子脂质的递送载体可与mRNA通过静电作用缔合。

在某些实施方案中，所述组合物包含体内外可检测的诊断放射性核素、荧光物质或其他物质。

在本申请中，考虑靶细胞或者组织的尺寸以及待制备的脂质体应用程度选择所述脂质递送载体(例如，脂质纳米颗粒)的合适尺寸。在某些实施方案中，可以将mRNA递送至特定的细胞或者组织。例如，为了靶向肝细胞，可确定脂质递送载体(例如，脂质纳米颗粒)的尺寸，使得它的尺寸比在肝中内皮层衬里肝窦状隙的开窗缝要小，使得脂质递送载体(例如，脂质纳米颗粒)能够容易地渗透这些内皮开窗缝以到达靶肝细胞。脂质递送载体(例如，脂质纳米颗粒)可以具有足够大的直径以限制或者明显避免分布至某些细胞或组织内。在本申请中，所述脂质递送载体(例如，脂质纳米颗粒)的尺寸(例如，直径)可以在约25至250nm范围内，例如小于约250nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、25nm或10nm。例如，所述脂质递送载体(例如，脂质纳米颗粒)的尺寸(例如，直径)可以在约25至250nm范围内，例如，约50至200nm、约75至175nm、约75至150nm或约75至125nm内。

治疗方法

另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含所述组合物，以及药学上可接受的载体。

另一方面，本申请提供了预防和/或治疗与血小板减少引起的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的所述组合物，和/或所述药物组合物。所述方法包括体外方法或离体方法。

在本申请中，可以向受试者提供或施用包含所述mRNA的递送载体(例如脂质纳米颗粒)。在本申请中，可以向受试者提供或向受试者施用所述药物组合物。在本申请中，所述药物组合物可以包含编码目的多肽(例如，TPO)的mRNA，或者所述药物组合物可以包含包载mRNA的递送载体。在某些实施方案中，所述mRNA存在于递送载体(例如脂质纳米颗粒)中。在某些的实施方案中，所述mRNA或递送载体存在于药物组合物中。

在本申请中，所述组合物和/或药物组合物可以局部施用或全身施用。合适的施用途径可包括例如口服、直肠、阴道、经粘膜、经肺(包括气管内或吸入)，或者肠部施用；胃肠外递送，例如注射，包括肌肉内、皮下、髓内、椎管内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。在本申请中，所述组合物和/或药物组合物可以静脉注射施用。在本申请中，所述组合物和/或药物组合物可以肌肉注射施用。

在本申请中，所述组合物和/或药物组合物的施用剂量可以为约0.01μg至约100μg，例如，约0.01μg至约50μg、约0.01μg至约30μg、约0.01μg至约20μg、约0.01μg至约15μg、约0.01μg至约10μg、约0.01μg至约5μg、约0.01μg至约2μg、约0.1μg至约20μg、约0.1μg至约15μg、约0.1μg至约10μg、约0.2μg至约15μg、约0.2μg至约10μg、约0.2μg至约5μg或约0.2μg至约2μg。

本申请所述组合物和/或药物组合物能够增加血液中TPO的含量、促进血小板(例如，网状血小板)生长。与未施用本申请所述的组合物和/或药物组合物的对照组相比，本申请所述的组合物和/或药物组合物可以使TPO的含量增加30％以上，例如，增加40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、120％以上、150％以上或200％以上。与未施用本申请所述的组合物和/或药物组合物的对照组相比，本申请所述的组合物和/或药物组合物可以使血小板水平增加30％以上，例如，增加40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、120％以上、150％以上或200％以上。所述血小板的水平可以使用单位体积内的血小板数量表征，例如，使用血小板计数所检测的，例如，所述血小板可包括网状血小板。

在本申请中，所述组合物和/或药物组合物可以被单次施用、多次施用或连续施用，并且均具有安全性。在首次施用后，再次施用所述组合物和/或药物组合物可以缩短起效时间。在本申请中，所述组合物和/或药物组合物可以和其他活性物质或治疗/预防成分共同施用。在本申请中，所述组合物和/或药物组合物可以在其他活性物质或治疗/预防成分之前或之后施用。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1合成促血小板生成素mRNA

获取小鼠促血小板生成素(TPO，Thrombopoietin)基因的编码区序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，进行密码子优化，得到优化后的TPO编码区(核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示)。或者，获取人TPO基因的编码序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)。使用T7聚合酶进行体外转录得到上述编码区的DNA序列，在3’端添加HA tag并克隆到pSG5L载体上T7启动子的下游，利用载体上获取体外转录线性DNA模板的通用引物，PCR获取体外转录的DNA模板。使用T7 RNA聚合酶进行体外转录，同时利用抗加反帽子类似物ARCAs(anti-reversecap analogs)对合成的RNA进行5’端加帽，在转录时分别加入携带不同化学修饰的核苷酸，得到携带化学修饰的mRNA，化学修饰核苷酸的引入均为100％的替换。使用的化学修饰分别为5-甲基胞嘧啶/假尿苷(m⁵C/Ψ)、假尿苷(Ψ)、5-甲氧基尿苷(mo⁵U)和N1-5-甲基假尿苷(m¹Ψ)。

使用DNA酶消化模板后，使用大肠杆菌poly(A)聚合酶EPAP(E.coli Poly(A)Polymerase)进行poly(A)加尾，最后纯化回收获取mRNA。体外转录制备mRNA流程如图1所示。

实施例2表达促血小板生成素mRNA

将实施例1的鼠源TPO mRNA和人源TPO mRNA分别转入鼠源细胞系AML12和人源细胞系293T，使用western blot检测表达水平和分泌效率。m5C/Ψ、mo5U和m1Ψ修饰的mRNA均能在细胞中表达分泌，图2显示了m1Ψ修饰的mRNA在细胞中表达分泌。

实施例3使用脂质包载mRNA得到纳米脂质颗粒(LNPs)

为实现mRNA在体内的有效呈递，选择使用脂质包载得到LNP。使用四种脂质分子阳离子脂质(DLin-MC3-DMA)、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)以及聚乙二醇修饰的脂分子(PEG2000-DMG)，以50:10:38.5:1.5的摩尔比溶于乙醇，将溶于乙醇的脂质与体外转录的mRNA通过T管快速混匀，自包装得到纳米脂质颗粒，使用Malvern Zetasizer纳米粒度电位仪检测其直径约为100nm。纳米脂质颗粒的包载流程如图3所示，纳米脂质颗粒粒径分布如图4所示。

实施例4包载促血小板生成素mRNA的LNP促进血小板生成

将22只C57BL/6雌性小鼠分为六组，每组3/4只，分别使用尾静脉注射(i.v.)/肌肉注射(i.m.)两种方式注射不同剂量的包载TPO mRNA的LNP(2μg/只小鼠、5μg/只小鼠、10μg/只小鼠或15μg/只小鼠)、包载萤光素酶(luciferase，Luc)(15μg/只小鼠)的LNP和PBS，注射后6h取血进行血小板计数，并使用ELISA检测循环中的TPO表达水平，之后在注射后每24h取血进行血小板计数。

相比对空白对照PBS，以及阴性对照萤光素酶LNP，包载TPO mRNA的LNP在静脉给药和肌肉给药时均可以大量表达产生TPO，并在72-96小时后有效提高小鼠循环中的血小板水平，并持续约一周。

具体来说，图5显示的是给药后不同时间小鼠血浆中的TPO水平，通过静脉给药的TPO水平峰值比通过肌肉给药时的峰值高约2000倍。

图6显示的是流式细胞术检测的给药后不同时间新生血小板(网织血小板)的比例。图7显示的是给药后不同时间小鼠血小板计数的结果，图6、图7表明静脉给药和肌肉给药均可以促进新生血小板产生和促进循环中血小板增加，且在低至2μg的剂量下仍能起效，并且起效时间还稍微提前至72小时以内，这比已经报道的TPO受体激动剂的起效时间更短，且保持的时间依旧在一周左右。

TPO mRNA可以有效规避重组蛋白的免疫原性问题，本实施例测试了重复给药时TPO mRNA LNP促进血小板增加的能力，图8显示，第二次注射的作用类似于首次给药，起效时间从首次给药后的第二天提前至第二次给药后的第一天，说明提前了约24小时。

实施例5包载促血小板生成素mRNA的LNP治疗R300模拟的免疫性血小板减少症(ITP)

R300是一种抗血小板膜糖蛋白GPⅠb(CD42b)的单克隆抗体(购自德国Emfret公司)，可以结合并聚集血小板使得血小板被清除。给小鼠注射100ng/μl浓度的TPO mRNA的LNP，1天后或2天后，给小鼠静脉注射50ng/μl浓度的R300，建立ITP小鼠模型。然后于不同时间进行血细胞计数。

图9的结果显示，TPO mRNA LNP同样可以有效促进ITP小鼠的血小板增加。

实施例6包载TPO mRNA的LNP治疗慢性ITP

6.1慢性ITP模型

建立给小鼠皮下注射0.08mg/kg的R300，每三天注射一次，共注射三次，建立慢性ITP小鼠模型，小鼠的血小板计数降低趋势如图10所示。

6.2正常和ITP模型中包载TPO mRNA的LNP与重组蛋白和罗米斯亭的比较

在正常小鼠或6.1的上述R300皮下注射的慢性ITP模型上，注射重组小鼠TPO蛋白、罗米司亭，及TPO mRNA LNPs后进行相关检测。注射剂量上，TPO mRNA LNPs，重组小鼠TPO蛋白和罗米司亭的剂量均为0.1mg/kg或0.03mg/kg。将进行的检测包括：在注射后每天进行血常规检测，统计血小板计数，比较三者促进血小板生成的疗效；利用ELISA测定多次注射重组蛋白和TPO mRNA LNPs后循环中TPO抗体产生水平。

在未经造模的普通小鼠上，0.1mg/kg剂量下，由Elisa测定三种药物对血浆中TPO水平的影响，结果如图11所示，TPO mRNA LNPs组能够促进血小板生成，重组蛋白在第一天就检测不到可能是因为未经修饰的蛋白半衰期过短。

在未经造模的普通小鼠上，0.1mg/kg或0.03mg/kg的给药剂量下，检测循环中血小板计数，结果如图12-13所示，TPO mRNA LNPs组均能够显著增加血小板含量。

在慢性ITP模型上，比较3种药物在0.1mg/kg或0.03mg/kg的给药剂量下的治疗效果(循环中血小板计数)。造模如图10所示，在第0，3，6天皮下注射R300抗体消除血小板，第二天时血小板下降已经比较明显，在第二天进行各种药物的单次给药。结果如图14-15所示，其中Luc为LNPs的阴性对照，包载luciferase(荧光素酶)的mRNA，可以翻译出荧光素酶的蛋白产物，具有和TPO相同的翻译过程，但蛋白产物不对血小板产生影响。结果显示TPOmRNA LNPs组均能够显著增加血小板含量。

肝毒性评价：在未经造模的普通小鼠上，接受单针不同剂量的TPO LNPs，谷草/谷丙转氨酶的水平没有发生变化，图16显示注射TPO mRNA LNPs后未产生肝毒性。

骨髓纤维化评价：未经造模的小鼠，接受两种药物每周一次的给药，单次剂量0.1mg/kg，连续给药四周后处死小鼠，取股骨做骨髓切片，网状纤维染色中被染上黑色的即为生成的网状纤维，肺纤维化的切片在此处仅作为阳性对照，指征染色方法的可靠性。结果如图17所示，长期注射罗米司亭会导致骨髓产生可逆的纤维化，本申请的方法导致骨髓纤维化的程度较低。

综上所述，本申请的TPO mRNA LNP均能够促进血小板生成，也不会产生TPO抗体，见效快，副作用小、安全性更高。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学医学院

上海蓝鹊生物医药有限公司

<120> 包载促血小板生成素mRNA的组合物及其用途

<130> 0217-PA-010

<150> CN2021104423486

<151> 2021-04-23

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 356

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu

20 25 30

Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser Arg Leu Ser

35 40 45

Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala

50 55 60

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys

65 70 75 80

Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met

85 90 95

Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

100 105 110

Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu

115 120 125

Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp

130 135 140

Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val

145 150 155 160

Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro Thr Leu Cys Val Arg Arg Thr

165 170 175

Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu

180 185 190

Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser

195 200 205

Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly

210 215 220

Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly Gln Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser

225 230 235 240

Pro Val Gln Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly Pro Val Asn

245 250 255

Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr Leu Glu Ala

260 265 270

Ser Asp Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn

275 280 285

Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro Asp Gly His

290 295 300

Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His Gly Ser Pro

305 310 315 320

Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr Met Pro Asn

325 330 335

Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu

340 345 350

Ser Gln Glu Thr

355

<210> 2

<211> 1068

<212> RNA

<213> Mus musculus

<400> 2

auggagcuga cugauuugcu ccuggcggcc augcuucuug caguggcaag acuaacucug 60

uccagccccg uagcuccugc cugugacccc agacuccuaa auaaacugcu gcgugacucc 120

caccuccuuc acagccgacu gagucagugu cccgacgucg acccuuuguc uaucccuguu 180

cugcugccug cuguggacuu uagccuggga gaauggaaaa cccagacgga acagagcaag 240

gcacaggaca uucuaggggc agugucccuu cuacuggagg gagugauggc agcacgagga 300

caguuggaac ccuccugccu cucaucccuc cugggacagc uuucugggca gguucgccuc 360

cucuuggggg cccugcaggg ccuccuagga acccagcuuc cucuacaggg caggaccaca 420

gcucacaagg accccaaugc ccucuucuug agcuugcaac aacugcuucg gggaaaggug 480

cgcuuccugc uucugguaga aggucccacc cucuguguca gacggacccu gccaaccaca 540

gcugucccaa gcaguacuuc ucaacuccuc acacuaaaca aguucccaaa caggacuucu 600

ggauuguugg agacgaacuu cagugucaca gccagaacug cuggcccugg acuucugagc 660

aggcuucagg gauucagagu caagauuacu ccuggucagc uaaaucaaac cuccaggucc 720

ccaguccaaa ucucuggaua ccugaacagg acacacggac cugugaaugg aacucauggg 780

cucuuugcug gaaccucacu ucagacccug gaagccucag acaucucgcc cggagcuuuc 840

aacaaaggcu cccuggcauu caaccuccag gguggacuuc cuccuucucc aagccuugcu 900

ccugauggac acacacccuu cccuccuuca ccugccuugc ccaccaccca uggaucucca 960

ccccagcucc acccccuguu uccugacccu uccaccacca ugccuaacuc uaccgccccu 1020

cauccaguca caauguaccc ucaucccagg aauuugucuc aggaaaca 1068

<210> 3

<211> 1068

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 鼠源TPO编码区优化后的mRNA序列

<400> 3

auggagcuga cagaccugcu gcuggccgcc augcugcugg ccguggcuag gcugacacug 60

uccuccccug uggccccugc cugcgacccu agacugcuga acaagcugcu gagggacucc 120

caccugcugc acuccaggcu gagccagugc ccugaugugg acccccugag cauccccgug 180

cugcugccug ccguggauuu cagccugggc gaguggaaga cccagaccga gcaguccaag 240

gcccaggaca uccugggcgc cgugagccug cugcuggagg gagugauggc cgccagaggc 300

cagcuggagc cuuccugccu gagcagccug cugggccagc ugagcggcca ggugagacug 360

cugcugggcg cccugcaggg ccugcuggga acacagcugc cucugcaggg cagaaccacc 420

gcccacaagg acccuaacgc ccuguuccug agccugcagc agcugcugag aggcaaggug 480

agauuccugc ugcuggugga gggcccuacc cuguguguga gaagaacccu gccuaccacc 540

gccgugccua gcagcacauc ccagcugcug acccugaaca aguuccccaa caggaccucc 600

ggccugcugg agaccaacuu cagcgugaca gccaggacag ccggcccugg ccugcugucu 660

cggcugcaag gcuucagggu gaagaucacc cccggccagc ugaaccagac cagcagaucc 720

cccgugcaga ucagcggcua ccugaacaga acccacggcc cugugaacgg cacccacggc 780

cuguucgccg gcacaagccu gcagacccug gaggccagcg auaucagccc uggcgccuuc 840

aacaagggcu cccuggccuu caaccugcag ggcggccugc cucccagccc aucucuggcu 900

cccgauggcc acacaccuuu cccucccagc cccgcccugc ccacaaccca cgguagcccu 960

ccucagcugc acccucuguu ccccgacccu uccacaacca ugcccaacag caccgccccu 1020

cacccuguga caauguaccc ucaccccagg aaccugagcc aggagacc 1068

<210> 4

<211> 353

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

1 5 10 15

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

20 25 30

Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser

35 40 45

Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala

50 55 60

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys

65 70 75 80

Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met

85 90 95

Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

100 105 110

Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu

115 120 125

Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp

130 135 140

Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val

145 150 155 160

Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala

165 170 175

Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu

180 185 190

Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr

195 200 205

Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly

210 215 220

Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu

225 230 235 240

Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly

245 250 255

Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro

260 265 270

Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu

275 280 285

Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr

290 295 300

Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu

305 310 315 320

His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser

325 330 335

Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu

340 345 350

Gly

<210> 5

<211> 1062

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

auggagcuga cugaauugcu ccucgugguc augcuucucc uaacugcaag gcuaacgcug 60

uccagcccgg cuccuccugc uugugaccuc cgaguccuca guaaacugcu ucgugacucc 120

cauguccuuc acagcagacu gagccagugc ccagagguuc acccuuugcc uacaccuguc 180

cugcugccug cuguggacuu uagcuuggga gaauggaaaa cccagaugga ggagaccaag 240

gcacaggaca uucugggagc agugacccuu cugcuggagg gagugauggc agcacgggga 300

caacugggac ccacuugccu cucaucccuc cuggggcagc uuucuggaca gguccgucuc 360

cuccuugggg cccugcagag ccuccuugga acccagcuuc cuccacaggg caggaccaca 420

gcucacaagg aucccaaugc caucuuccug agcuuccaac accugcuccg aggaaaggug 480

cguuuccuga ugcuuguagg aggguccacc cucugcguca ggcgggcccc acccaccaca 540

gcugucccca gcagaaccuc ucuaguccuc acacugaacg agcucccaaa caggacuucu 600

ggauuguugg agacaaacuu cacugccuca gccagaacua cuggcucugg gcuucugaag 660

uggcagcagg gauucagagc caagauuccu ggucugcuga accaaaccuc caggucccug 720

gaccaaaucc ccggauaccu gaacaggaua cacgaacucu ugaauggaac ucguggacuc 780

uuuccuggac ccucacgcag gacccuagga gccccggaca uuuccucagg aacaucagac 840

acaggcuccc ugccacccaa ccuccagccu ggauauucuc cuuccccaac ccauccuccu 900

acuggacagu auacgcucuu cccucuucca cccaccuugc ccaccccugu gguccagcuc 960

cacccccugc uuccugaccc uucugcucca acgcccaccc cuaccagccc ucuucuaaac 1020

acauccuaca cccacuccca gaaucugucu caggaagggu aa 1062

Claims

1.一种组合物，其包含(a)mRNA，所述mRNA包含编码促血小板生成素(TPO)的核酸分子，和(b)递送载体。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述mRNA在选自下组的一个或多个位置处包含修饰：5’帽、5’非翻译区、开放阅读框、3’非翻译区和poly A尾。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含至少一种经修饰的核苷酸。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含选自下组中的一种或多种修饰的核苷酸：5-甲基胞苷/假尿苷(m⁵C/Ψ)、假尿苷(Ψ)、5-甲氧基尿苷(mo⁵U)和1-甲基假尿苷(m¹Ψ)。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述TPO包含如SEQ ID NO:1或4所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述mRNA是密码子优化的。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含如SEQ ID NO:2、3和5中任一项所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括脂质体。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括脂质纳米颗粒(LNP)。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括阳离子脂质。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述阳离子脂质包括DLin-MC3-DMA。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括非阳离子脂质。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述非阳离子脂质包括磷脂和/或脂质缀合物。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述磷脂包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。

15.根据权利要求13或14所述的组合物，其中所述脂质缀合物包括聚乙二醇修饰的脂分子。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括PEG2000-DMG。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述递送载体包括胆固醇。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包载在所述递送载体中。

19.药物组合物，其包含权利要求1-18中任一项所述的组合物，以及药学上可接受的载体。

20.权利要求1-18中任一项所述的组合物，和/或权利要求19所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗与血小板减少引起的疾病或病症。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述与血小板减少引起的疾病或病症包括血小板减少症。