CN115023499A

CN115023499A - 使用CRISPR/Cas13的靶向反式剪接

Info

Publication number: CN115023499A
Application number: CN202080058066.XA
Authority: CN
Inventors: 雅各布·博拉霍
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2022-09-06
Also published as: US20240035031A1; JP2022544688A; AU2020333667A1; US11767528B2; CA3150747A1; WO2021034717A1; EP4013873A1; US20210071178A1; KR20220044811A

Abstract

本公开内容提供了组合物和使用这些组合物介导细胞中前体mRNA上的靶向反式剪接事件的方法。

Description

使用CRISPR/Cas13的靶向反式剪接

相关申请

本申请要求于2019年8月16日提交的美国临时申请No.62/888,210和2020年3月5日提交的美国临时申请No.62/985,633的优先权，其每个均通过引用整体并入本文。

关于联邦政府资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)授予的资助号HL141005下的政府支持下完成的。政府对本发明具有一定的权利。

序列表

本申请包含已经以ASCII格式电子提交并且在此通过引用整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2020年8月14日，命名为706829_083474-007PC_ST25.txt，并且大小为475,491字节。

技术领域

本公开内容涉及用于治疗疾病的CRISPR/Cas介导的核酸反式剪接的领域。

背景技术

反式剪接是RNA加工的一种形式，其中来自两个不同的初级前体mRNA转录物的外显子端对端地接合并连接。该过程是使用剪接体核糖核蛋白复合体治疗多种疾病的有前景的策略。然而，需要改善当前系统的反式剪接的效率和特异性，以提供更有效的治疗策略。

CRISPR/Cas系统已被用于编辑基因组基因座以治疗疾病和病症。这导致对DNA的永久编辑。本发明提供了CRISPR/Cas系统以将反式剪接元件靶向至所期望的前体mRNA序列，并允许选择瞬时RNA修复同时改善反式剪接事件的特异性和效率二者。

发明内容

本公开内容提供了用于介导细胞中前体mRNA上的靶向反式剪接事件的方法和组合物。在一个方面中，靶向反式剪接系统包含：靶向核酸的CRISPR/Cas系统；指导核酸；特异性RNA结合结构域；以及修复模板，其包含剪接供体和/或受体以及在生理条件下与特异性RNA结合结构域杂交的RNA序列。

在多个实施方案中，指导核酸是指导RNA。在多个实施方案中，指导核酸是指导DNA。在多个实施方案中，反式剪接系统包含一个指导核酸。在多个实施方案中，反式剪接系统包含多于一个的指导核酸。在多个实施方案中，指导核酸识别多个靶标。在多个实施方案中，指导核酸靶向剪接受体(splice acceptor，SA)位点。在多个实施方案中，指导核酸靶向剪接供体(splice donor，SD)位点。在多个实施方案中，指导核酸靶向剪接位点附近的区域。在多个实施方案中，指导核酸靶向在剪接位点的200个核苷酸内的区域。在多个实施方案中，指导核酸靶向距离剪接位点小于或等于100个核苷酸的区域。在多个实施方案中，多于一个的指导核酸靶向一个目的核酸。在多个实施方案中，多于一个的指导核酸靶向多个目的核酸。

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含Cas13多肽。在多个实施方案中，Cas13是核酸酶失活的Cas13多肽(dCas13)。在多个实施方案中，Cas13是核酸酶活性Cas13多肽。在多个实施方案中，特异性RNA结合结构域包含病毒蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是MS2结合蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是λN蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是PP7衣壳蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是Qβ衣壳蛋白。

在多个实施方案中，病毒蛋白与CRISPR/Cas系统共价结合。在多个实施方案中，病毒蛋白不与CRISPR/Cas系统共价结合。在多个实施方案中，病毒蛋白和CRISPR/Cas系统是融合蛋白。

在一个实施方案中，反式剪接系统包含一个修复模板。在一个实施方案中，反式剪接系统包含多于一个的修复模板。在多个实施方案中，修复模板作为DNA引入。在多个实施方案中，修复模板作为RNA递送。

在多个实施方案中，修复模板作为RNA表达。在多个实施方案中，修复模板包含剪接受体。在多个实施方案中，修复模板包含剪接供体。在多个实施方案中，修复模板包含一个或更多个剪接位点。在多个实施方案中，修复模板包含外显子。在多个实施方案中，修复模板包含多于一个的外显子。在多个实施方案中，修复模板包含内含子。修复模板包含多于一个的内含子。在多个实施方案中，修复模板包含一个或多个与目的靶核酸杂交的序列。在多个实施方案中，修复模板的至少一部分包含与MS2结合蛋白特异性结合的ms2发夹。在多个实施方案中，修复模板包含与λN蛋白特异性结合的boxB发夹。在多个实施方案中，修复模板包含与PP7衣壳蛋白特异性结合的PP7发夹。在多个实施方案中，修复模板包含与Qβ衣壳蛋白特异性结合的Qβ发夹。

在多个实施方案中，靶向反式剪接系统还包含细胞。在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分被引入到细胞中。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的表达和/或活性是瞬时的。在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的活性由小分子调节。在多个实施方案中，小分子选自脱落酸(ABA)、雷帕霉素(或雷帕霉素类似物)、FK506、环孢素A、FK1012、赤霉素3-AM、FKCsA、AP1903/AP20187和生长素。在多个实施方案中，至少一部分是Cas13蛋白。在多个实施方案中，Cas13蛋白还包含小分子结合结构域。在多个实施方案中，Cas13蛋白和小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。在多个实施方案中，小分子结合结构域是ABA结合结构域。在多个实施方案中，ABA结合结构域包含ABI1多肽。

在多个实施方案中，靶向反式剪接系统还包含病毒蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白还包含小分子结合结构域。在多个实施方案中，病毒蛋白和小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。在多个实施方案中，小分子结合结构域是ABA结合结构域。在多个实施方案中，ABA结合结构域包含PYL1多肽。在多个实施方案中，ABA的添加诱导靶前体mRNA的靶向反式剪接。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分向细胞的递送是病毒的。在多个实施方案中，病毒是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、指环病毒(anellovirus)或杆状病毒。在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分向细胞的递送是非病毒的。在多个实施方案中，非病毒递送系统选自阳离子脂质载剂、电穿孔、磷酸钙转染、机械转染和纳米粒递送。

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统靶向核酸。在多个实施方案中，核酸是RNA。在多个实施方案中，核酸是DNA。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统与细胞中的RNA缔合。在多个实施方案中，RNA是前体mRNA。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统与细胞中的DNA缔合。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统不与细胞中的DNA缔合。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导细胞的核中前体mRNA的反式剪接。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导细胞的胞质中前体mRNA的反式剪接。

在多个实施方案中，反式剪接发生在分裂细胞中。在多个实施方案中，反式剪接发生在有丝分裂后细胞中。在多个实施方案中，有丝分裂后细胞是神经元、肌细胞或脂肪细胞。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的表达是诱导型的。在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的活性是诱导型的。

在另一个方面中，本文中提供了介导细胞中前体mRNA上的靶向反式剪接事件的方法，该方法包括将靶向反式剪接CRISPR/Cas系统的至少一部分引入到细胞中。在一个方面中，CRISPR/Cas系统包含：靶向核酸的CRISPR/Cas系统；与目的核酸基因座特异性杂交的指导核酸；特异性RNA结合结构域；以及修复模板，其包含剪接供体和/或剪接受体以及在生理条件下与特异性RNA结合结构域杂交的RNA序列。

在一个实施方案中，指导核酸包含RNA。在另一个实施方案中，指导核酸包含DNA。

在一个实施方案中，将单个指导核酸引入到细胞中。在另一个实施方案中，将多个指导核酸引入到细胞中。

在一个实施方案中，多个指导核酸靶向一个目的核酸。在另一个实施方案中，多个指导核酸靶向多于一个的目的核酸。

在多个实施方案中，指导核酸靶向剪接受体(SA)位点。在另一些实施方案中，指导核酸靶向剪接供体(SD)位点。

在多个实施方案中，指导核酸靶向剪接位点附近的区域。

在多个实施方案中，指导核酸靶向在剪接位点的200个核苷酸内的区域。在另一些实施方案中，指导核酸靶向在剪接位点的小于或等于100个核苷酸的区域。

在多个实施方案中，将多个指导核酸递送至多个细胞。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含Cas13多肽。

在多个实施方案中，Cas13多肽是Cas13b多肽。在多个实施方案中，Cas13b多肽是核酸酶失活的Cas13b(dCas13b)。在多个实施方案中，Cas13b多肽是核酸酶活性Cas13b。

在多个实施方案中，特异性RNA结合结构域包含病毒蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是MS2结合蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是λN蛋白。

在多个实施方案中，病毒蛋白是PP7衣壳蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是Qβ衣壳蛋白。

在多个实施方案中，反式剪接系统包含一个剪接受体修复模板。在多个实施方案中，反式剪接系统包含多于一个的剪接受体修复模板。在多个实施方案中，反式剪接系统包含一个剪接供体修复模板。

在多个实施方案中，反式剪接系统包含多于一个的剪接供体修复模板。

在多个实施方案中，修复模板包含与MS2结合蛋白特异性结合的ms2发夹。在多个实施方案中，修复模板包含与λN蛋白特异性结合的boxB发夹。

在多个实施方案中，修复模板包含与PP7衣壳蛋白特异性结合的PP7发夹。在多个实施方案中，修复模板包含与Qβ衣壳蛋白特异性结合的Qβ发夹。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的表达是瞬时的。在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的活性是瞬时的。在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的活性由小分子调节。在多个实施方案中，小分子选自脱落酸(ABA)、雷帕霉素(或雷帕霉素类似物)、FK506、环孢素A、FK1012、赤霉素3-AM、FKCsA、AP1903/AP20187和生长素。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分包含Cas13多肽。在多个实施方案中，Cas13多肽还包含小分子结合结构域。

在多个实施方案中，Cas13多肽和小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。在多个实施方案中，小分子结合结构域是ABA结合结构域。

在多个实施方案中，ABA结合结构域包含ABI1多肽。在多个实施方案中，该方法还包括病毒蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白还包含小分子结合结构域。在多个实施方案中，病毒蛋白和小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。

在多个实施方案中，小分子结合结构域是ABA结合结构域。

在多个实施方案中，ABA结合结构域包含PYL1多肽。

在多个实施方案中，ABA的添加诱导靶前体mRNA的靶向反式剪接。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分向细胞的递送是病毒的。

在多个实施方案中，病毒是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、指环病毒或杆状病毒。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分向细胞的递送是非病毒的。

在多个实施方案中，非病毒递送系统选自阳离子脂质载剂、电穿孔、磷酸钙转染、机械转染和纳米粒递送。

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统与细胞中的RNA缔合。

在多个实施方案中，RNA是前体mRNA。

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统与细胞中的DNA缔合。

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统不与细胞中的DNA缔合。

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导细胞的核中前体mRNA的反式剪接。

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导细胞的胞质中前体mRNA的反式剪接。

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在内含子-外显子连接处的反式剪接。

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在外显子-内含子连接处的反式剪接。

在多个实施方案中，剪接修复模板不包含剪接受体。

在多个实施方案中，剪接修复模板不包含剪接供体。

在多个实施方案中，剪接修复模板包含剪接受体和剪接供体二者。

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在该前体mRNA的5’端的反式剪接。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在该前体mRNA的3’端的反式剪接。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在前体mRNA中内部位点处的反式剪接。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在3’非翻译区(untranslated region，UTR)中的反式剪接。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在5’非翻译区(UTR)中的反式剪接。

在多个实施方案中，细胞是分裂细胞。在多个实施方案中，细胞是有丝分裂后细胞。

在多个实施方案中，有丝分裂后细胞选自神经元、肌细胞和脂肪细胞。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的表达是诱导型的。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的活性是诱导型的。

在多个实施方案中，细胞是患有疾病或病症的对象中的。

在多个实施方案中，疾病或病症是神经退行性的、神经性的或者神经肌肉的疾病或病症。

在多个实施方案中，神经退行性的、神经性的或者神经肌肉的疾病或病症选自脊髓性肌萎缩、雷特综合征(Rett Syndrome)、安格尔曼综合征(Angelman syndrome)、帕金森病(Parkinson’s disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、亨廷顿病(Huntington’s disease)、额颞痴呆、溶酶体贮积病、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)。

在又一个方面中，本文中公开了靶向反式剪接系统，其包含：核酸结合蛋白结构域；特异性RNA结合结构域；以及修复模板，其包含剪接供体和/或剪接受体以及在严格条件下与特异性RNA结合结构域杂交的RNA序列。

在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域靶向剪接受体(SA)位点。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域靶向剪接供体(SD)位点。在多个实施方案中，特异性RNA结合结构域包含病毒蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是MS2结合蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是λN蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是PP7衣壳蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白是Qβ衣壳蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白与核酸结合蛋白结构域共价结合。在多个实施方案中，病毒蛋白不与核酸结合蛋白结构域共价结合。在多个实施方案中，病毒蛋白和核酸结合蛋白结构域是融合蛋白。

在多个实施方案中，反式剪接系统包含一个剪接受体修复模板。在多个实施方案中，反式剪接系统包含多于一个的剪接受体修复模板。在多个实施方案中，反式剪接系统包含一个剪接供体修复模板。在多个实施方案中，反式剪接系统包含多于一个的剪接供体修复模板。在多个实施方案中，反式剪接系统包含含有剪接供体和/或剪接受体的修复模板。在多个实施方案中，修复模板的至少一部分包含与MS2结合蛋白特异性结合的ms2发夹。在多个实施方案中，剪接修复模板包含与λN蛋白特异性结合的boxB发夹。在多个实施方案中，剪接修复模板包含与PP7衣壳蛋白特异性结合的PP7发夹。在多个实施方案中，剪接修复模板包含与Qβ衣壳蛋白特异性结合的Qβ发夹。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的表达和/或活性是瞬时的。在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的活性由小分子调节。在多个实施方案中，小分子选自脱落酸(ABA)、雷帕霉素(或雷帕霉素类似物)、FK506、环孢素A、FK1012、赤霉素3-AM、FKCsA、AP1903/AP20187和生长素。在多个实施方案中，至少一部分是核酸结合蛋白结构域。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域还包含小分子结合结构域。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域和小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。在多个实施方案中，小分子结合结构域是ABA结合结构域。在多个实施方案中，ABA结合结构域包含ABI1多肽。在多个实施方案中，反式剪接系统还包含病毒蛋白。在多个实施方案中，病毒蛋白还包含小分子结合结构域。在多个实施方案中，病毒蛋白和小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。在多个实施方案中，小分子结合结构域是ABA结合结构域。在多个实施方案中，ABA结合结构域包含PYL1多肽。在多个实施方案中，ABA的添加诱导靶前体mRNA的靶向反式剪接。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分向细胞的递送是病毒的。在多个实施方案中，病毒是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、指环病毒或杆状病毒。在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分向细胞的递送是非病毒的。在多个实施方案中，非病毒递送系统选自阳离子脂质载剂、电穿孔、磷酸钙转染、机械转染和纳米粒递送。

在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域靶向DNA。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域靶向RNA。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域与细胞中的RNA缔合。在多个实施方案中，RNA是前体mRNA。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域与细胞中的DNA缔合。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域不与细胞中的DNA缔合。

在多个实施方案中，系统介导细胞的核中前体mRNA的反式剪接。在多个实施方案中，系统介导细胞的胞质中前体mRNA的反式剪接。在多个实施方案中，系统介导前体mRNA在内含子-外显子连接处的反式剪接。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域介导前体mRNA在外显子-内含子连接处的反式剪接。在多个实施方案中，剪接修复模板不包含剪接供体。在多个实施方案中，剪接修复模板不包含剪接受体。在多个实施方案中，剪接修复模板包含剪接受体和剪接供体二者。

在多个实施方案中，系统包含多个剪接模板。在多个实施方案中，多个剪接模板包含含有剪接受体的剪接修复模板和含有剪接供体的剪接修复模板。在多个实施方案中，多个剪接修复模板中的至少一些包含剪接受体和剪接供体。

在多个实施方案中，系统介导前体mRNA在该前体mRNA的5’端的反式剪接。在多个实施方案中，系统介导前体mRNA在该前体mRNA的3’端的反式剪接。在多个实施方案中，系统介导前体mRNA在前体mRNA中内部位点处的反式剪接。在多个实施方案中，系统替换靶mRNA的5’或3’端。

在多个实施方案中，靶mRNA是前体mRNA。在多个实施方案中，系统包括替换靶mRNA的一个或更多个外显子，不包括该靶mRNA的第一个和最后一个外显子。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域介导前体mRNA在3’非翻译区(UTR)中的反式剪接。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域介导前体mRNA在5’非翻译区(UTR)中的反式剪接。

在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的表达是诱导型的。在多个实施方案中，反式剪接系统的至少一部分的活性是诱导型的。在多个实施方案中，核酸结合蛋白结构域是来自锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)或Pumby模块的结构域，或者是RNA识别基序。

附图说明

图1A至1E示出了CRISPR/Cas系统的组分、可在前体mRNA中发生的顺式和反式剪接，以及CRISPR介导的反式剪接。

图2A示出了编码内切核糖核酸酶失活的Cas13(dCas13b)-MS2融合蛋白、gRNA构建体、剪接供体(SD)和剪接受体(SA)报道子、以及ms2内含子设计的DNA构建体。图2B示出了反式剪接报道子测定。

图3A示出了与阴性对照相比CRISPR/Cas系统在HEK193FT细胞中的反式剪接活性。柱1至5表示阴性对照中的活性。柱11是CRISPR/Cas系统的活性。图3B示出了CRISPR/Cas系统的反式剪接特异性。使用与SA报道子mRNA结合的引物创建RNAseq文库，并且计算和绘制读序的中靶反应。

图4A是RNAseq文库的RNAseq映射以表明反式剪接。图4B示出了存在SD报道子的顺式剪接的验证。

图5是gRNA靶位点的示意图。设计了数个gRNA以靶向SD报道子的不同区域。

图6A示出了如通过使用截短GFP反式剪接报道子测定测量的具有dCas13b-MS2的靶向反式剪接的倍数提高。图6B示出了无dCas13b-MS2的靶向反式剪接。

图7是示出在校正致病性外显子的背景下在反式剪接中的CRISPR/Cas系统的组分的示意图。

图8示出了用小分子的反式剪接复合体诱导。图8A示出了与脱落酸(ABA)结合蛋白ABI1融合的dCas13b多肽，以及与PYL1融合的MS2。图8B是显示在存在一系列ABA浓度的情况下诱导反式剪接之后GFP的表达的图，其在无指导对照作为阴性对照的情况下示出。图8C通过测量在ABA浓度(mM)递增的情况下GFP表达的倍数提高显示ABA可控制诱导的靶向反式剪接。

图9是剪接点处反式剪接的测量。图9A示出了横跨可能的连接点的RNAseq读序数。图9B是针对所有转染条件进行反式剪接的剪接读序的图。图9C是针对所有转染条件进行顺式剪接的剪接读序的图。

图10是用于靶向反式剪接的策略的说明。图10A示出了用于反式剪接的5’靶向的策略。图10B示出了内部靶向反式剪接策略。图10C示出了用于反式剪接的3’靶向的策略。

图11示出了用于内部外显子修复的策略。图11A示出了测试CRISPR介导的内部外显子修复是否可行的dPspCas13b-MS2、gRNA、靶标和内部修复模板构建体。图11B示出了通过蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein，BFP)的表达的靶转录物的表达的监测，以及通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表达的内部外显子修复的监测。图11C测量了在内部外显子修复之后的GFP表达，表明了GFP表达仅在存在CRISPR系统以及靶向剪接位点的gRNA的情况下是可行的。

图12是示出反式剪接可使用其他Cas13直向同源物例如Cas13d介导的荧光测量。

图13示出了用使用基于AAV的多载体方法递送的构建体完成的CRISPR介导的反式剪接。

具体实施方式

本公开内容提供了组合物和使用这些组合物来介导细胞中前体mRNA上的靶向反式剪接事件的方法。在多个实施方案中，靶向反式剪接事件由CRISPR/Cas系统介导。在多个实施方案中，介导靶向反式剪接事件的CRISPR/Cas系统用于治疗神经退行性疾病或病症。这些组合物和方法包括由包含核酸酶失活的Cas13的CRISPR/Cas系统介导的反式剪接事件。

如本文权利要求书、发明内容和具体实施方式中使用的没有数量词修饰的术语是指一个/种或更多个/种；例如，“细胞”被理解为代表一个/种或更多个/种细胞。

此外，本文中使用的“和/或”应被视为具体公开了要素的两个指出特征中的每一个，有或没有另一个。因此，在例如本文的“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。

应当理解，在本文用语言“包括/包含”来描述一些方面时，也提供了以“由...组成”来描述的其他类似方面。

术语“剪接位点附近”意指在剪接位点的500bp以内。

术语“治疗”是指用于改善疾病的一种或更多种具体操作的应用。在某些实施方案中，具体操作是施用一种或更多种药剂。对个体(例如哺乳动物，例如人)或细胞的“治疗”是用于试图改变个体或细胞的自然过程的任何类型的干预。治疗包括但不限于施用药物组合物，并且可以预防性地或在病理事件开始或与病原体接触之后进行。治疗包括对疾病或病症的症状或病理学的任何期望的作用，并且可以包括例如疾病或病症的一种或更多种可测量标志物的微小变化或改善，并且可以包括例如正在治疗的疾病或病症的一种或更多种可测量标志物的微小改变或改善。

术语“患者”、“对象”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适于本文所述的方法的任何动物或其细胞，无论是体外的还是原位的。在某些非限制性实施方案中，患者、对象或个体是人。

在本发明的一些方面中，术语“指导核酸”、“指导RNA”、“指导DNA”和“单指导核酸”可互换使用，并且指包含指导序列和tracr序列的多核苷酸序列。在某些实施方案中，指导核酸仅包含crispr RNA(crRNA)。术语“指导序列”是指指导RNA或DNA中指定靶位点的10至80bp序列。在本发明的一些方面中，术语“指导序列”和“间隔子”可互换使用。在本发明的一些方面中，术语“同向重复”和“支架”可以互换使用。

本文中使用的用于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的核酸主要与靶序列杂交并且基本上不与非靶序列杂交的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于许多因素。一般来说，序列越长，序列与其靶序列特异性杂交的温度越高。在一些实施方案中，严格条件包括在约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50至65℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或更多次。严格条件的其他实例是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，eds.，JohnWiley&Sons，Inc.(1995)，第2、4和6节中找到，其教导在此通过引用并入本文。另外的严格条件可以在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，章节7、9和11中找到，其教导在此通过引用并入本文。

本文中使用的术语“生理条件”通常是指对动物，特别是哺乳动物，更特别是人有效的生物学参数。所述术语可涉及哺乳动物，尤其是人体(尤其是体液)中常见的生物化学和生物物理参数。“生理条件”可以涉及在患病哺乳动物或人患者中存在的参数，以及在健康身体中存在的相应参数。例如，当哺乳动物或人发烧时，患病哺乳动物或人患者可具有高但“生理”温度条件。关于“生理条件”，最重要的参数是温度(人体为37℃)、pH(人血液为7.35至7.45)、渗透压(280至300mmol/Kg H2O)以及必要时的蛋白质含量(66至85g/l血清)。然而，本领域技术人员将理解这些参数可以变化。例如，这样的温度、pH、渗透压和蛋白质含量在给定的身体或组织、例如血液或脑脊液中可能不同(Klinke(2005)Physiologie，5thed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart)。“生理条件”还可以指模拟动物中条件的缓冲系统、溶剂和/或赋形剂的条件。

“杂交”及其变形是指其中一个或更多个多核苷酸反应形成复合体的反应，所述复合体通过核苷酸残基的碱基之间的氢键合而稳定。氢键合可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性的方式发生。复合体可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合体的三条或更多条链、单个自杂交链或这些的任何组合。

本文中使用的“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(例如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。

术语“多肽”、“肽”、“蛋白质”和“酶”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸打断。所述术语还涵盖已修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，例如与标记组分缀合。本文中使用的术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光异构体二者，以及氨基酸类似物和肽模拟物。

术语“核酸”或“核酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸。所述术语还涵盖具有合成骨架的核酸样结构，参见例如Eckstein，Biomed Biochim Acta.1991；50(10-11)：S114-7；Baserga et al.Genes Dev.1992 Jun；6(6)：1120-30；Milligan et al.，NucleicAcids Res.1993 Jan 25；21(2)：327-33；WO 97/03211；WO 96/39154；Mata，Toxicol ApplPharmacol.1997 May；144(1)：189-97；Strauss-Soukup，Biochemistry.1997 Aug 19；36(33)：10026-32；和Samstag，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.1996 Fall；6(3)：153-6。

本文中使用的“诱导型的”是指诱导蛋白质或系统，例如本申请的反式剪接系统的表达或活性。已知的诱导型基因表达系统已被设计成允许插入的核酸序列的化学诱导激活，导致基因过表达或阻遏。诱导蛋白质或系统的活性可以包括释放分子以允许蛋白质或系统的活性或添加效应分子以诱导蛋白质或系统的活性。

术语“核酸酶失活”用于描述不再具有核酸酶活性的Cas酶。在一些实施方案中，不再具有核酸酶活性的Cas酶可以具有少量残留活性。在一些实施方案中，该少量残留活性小于Cas酶的野生型核酸酶活性的5％、1％、0.1％、0.05％、0.01％或0.005％。核酸酶失活的Cas蛋白可以互换地称为“dCas”蛋白，例如dCas13b。在一些实施方案中，dCas蛋白可以是dCas13b蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1、62、71、74、77、80、83、86或89所示的多核苷酸序列编码dCas13b蛋白。在一些实施方案中，dCas13b对应于或部分或完全地包含如SEQID NO：2、63、72、75、78、81、84、87或90所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，dCas蛋白可以是dCas13a蛋白。在一些实施方案中，dCas13a蛋白由SEQ ID NO：17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56或59中任一个中所示的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，dCas13a对应于或部分或完全地包含如SEQ ID NO：18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57或60所示的氨基酸序列中的任一个。在一些实施方案中，dCas蛋白可以是dCas13d蛋白。在一些实施方案中，dCas13d蛋白由SEQ ID NO：65所示的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，dCas13d蛋白对应于或部分或完全地包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列。核酸酶失活的Cas蛋白可以是具有导致核酸酶活性失活的突变的变体。

“靶向的”用于描述包含靶向部分的分子、蛋白质或复合体，所述靶向部分特异性结合与特定目的前体mRNA相关的一个或更多个靶标。

本文中使用的术语“RNA结合”用于描述与RNA特异性结合的分子、蛋白质、核酸、或复合体。

“前体mRNA”是指前体mRNA并且是含有外显子和内含子二者的RNA。前体mRNA是一种类型的初级转录物，其在加工之后变成信使RNA。它是由细胞核中的DNA模板通过转录合成的。在一些实施方案中，RNA来自哺乳动物细胞。在另一些实施方案中，RNA来自哺乳动物细胞的线粒体。

短语“与DNA缔合”是指可结合DNA或与DNA共处一地的核酸、系统、蛋白质和分子。

术语“有丝分裂后”是指非复制细胞，例如神经系统细胞、骨髓细胞、肌肉细胞、肝细胞等。神经系统的细胞包括不再能够进行有丝分裂的神经元、胶质细胞等。

术语“非分裂细胞”是指不经常经历有丝分裂的细胞。许多非分裂细胞可以在细胞周期的任何点(例如，G0/G1、G1/S、G2/M)被阻断，只要大多数细胞没有活跃地分裂。在一些实施方案中，非分裂细胞来自不频繁分裂的组织类型。体内非分裂细胞的实例包括但不限于神经元细胞、肌肉细胞(肌细胞)、肝细胞、皮肤细胞、心脏细胞、肺细胞、脂肪细胞和骨髓细胞，以及它们的衍生物。“分裂细胞”将是经常活跃地经历有丝分裂的细胞。在一些实施方案中，分裂细胞来自不经常分裂的组织类型。体内分裂细胞的实例包括但不限于上皮细胞和造血细胞。

“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持体内平衡，以及其中如果疾病没有得到改善，那么动物的健康继续恶化。相比之下，动物的“病症”是动物能够维持体内平衡的健康状态，但其中动物的健康状况不如没有病症的情况。不经治疗，病症不一定导致动物的健康状况进一步下降。疾病和病症包括脊髓性肌萎缩、雷特综合征、安格尔曼综合征、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、额颞痴呆、溶酶体贮积病、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化(ALS)。

“载体”是物质组合物，其包含分离的核酸并且其可用于将分离的核酸递送至细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。所述术语还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非病毒和非质粒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒、指环病毒、杆状病毒、逆转录病毒载体等。

术语“特异性结合”等意指给定分子与另一分子形成在生理条件下相对稳定的复合体。用于确定给定分子是否与另一分子特异性结合的方法是本领域公知的并且包括例如平衡透析法、表面等离子体共振等。例如，本文中使用的“特异性结合”病毒蛋白的RNA发夹包括以以下KD结合病毒蛋白或其部分的RNA发夹：小于约1000nM、小于约500nM、小于约300nM、小于约200nM、小于约100nM、小于约90nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、小于约50nM、小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM或约0.5nM，如在表面等离子体共振测定中测量的。

本文中使用的“变体”意指通过氨基酸或核苷酸的添加(例如，插入)、缺失或保守替换而与给定多肽或核苷酸序列在氨基酸或核酸序列中不同但保留给定多肽的生物活性(例如，变体核酸仍可编码相同或相似的氨基酸序列)的多肽或核苷酸序列。氨基酸的保守替换(即用相似特性(例如，亲水性和带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸)在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化如本领域所理解的，可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定(参见，例如，Kyte et al.，J.Mol.Biol.，157：105-132(1982))。氨基酸的亲水指数基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知具有相似亲水指数的氨基酸可以进行替换并且仍然保留蛋白质功能。在一方面中，具有±2的亲水指数的氨基酸进行替换。氨基酸的亲水性也可用于揭示会导致蛋白质保留生物学功能的替换。在肽的背景下考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是据报道与抗原性和免疫原性密切相关的有用量度(参见，例如美国专利No.4,554,101)。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的替换可导致肽保留生物活性(例如免疫原性)。在一方面中，用具有彼此相差±2以内的亲水性值的氨基酸进行替换。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察结果一致，与生物学功能相容的氨基酸替换被理解为取决于氨基酸的相对相似性，并且特别是这些氨基酸的侧链的相对相似性，如由疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的。“变体”也可用于描述已被不同地加工(例如通过蛋白水解、磷酸化或其他翻译后修饰不同地加工)但仍保留其生物活性或抗原反应性的多肽或其片段。本文使用“变体”旨在涵盖变体的片段，除非上下文相矛盾。

替代地或另外地，“变体”应理解为与其衍生于的多核苷酸或蛋白质相比不同之处在于其长度或序列的一个或更多个变化的多核苷酸或蛋白质。蛋白质或核酸变体衍生于的多肽或多核苷酸也称为亲本多肽或多核苷酸。术语“变体”包括亲本分子的“片段”或“衍生物”。通常，“片段”在长度或尺寸上小于亲本分子，而“衍生物”与亲本分子相比在它们的序列上表现出一处或更多处不同。还涵盖经修饰的分子，例如但不限于经翻译后修饰的蛋白质(例如糖基化、生物素化、磷酸化、泛素化、棕榈酰化或经蛋白水解切割的蛋白质)和经修饰的核酸(例如甲基化DNA)。术语“变体”也涵盖不同分子的混合物，例如但不限于RNA-DNA杂合体。通常，变体是人工构建的，优选地是通过基因技术方法人工构建的，而亲本多肽或多核苷酸是野生型蛋白质或多核苷酸。然而，天然存在的变体也应理解为涵盖在本文使用的术语“变体”中。此外，可用于本公开内容的变体还可以来源于亲本分子的同源物、直向同源物或横向同源物或来自人工构建的变体，条件是所述变体表现出亲本分子的至少一种生物活性，即是功能活性的。

替代地或另外地，本文使用的“变体”可以通过与其衍生自的亲本多肽或亲本多核苷酸的一定程度的序列同一性来表征。更准确地，本公开内容的上下文中的蛋白质变体表现出与其亲本多肽至少80％的序列同一性。本公开内容的上下文中的多核苷酸变体表现出与其亲本多肽至少70％的序列同一性。关于多肽和多核苷酸序列比较，在整个说明书中使用术语“至少70％的序列同一性”。该表述优选地指与相应参考多肽或相应的参考多核苷酸至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。

核苷酸和氨基酸序列的相似性(即序列同一性的百分比)可以通过序列比对来确定。这样的比对可以用数种本领域已知的算法进行，优选地使用Karlin和Altschul的数学算法(Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)，用hmmalign(HMMER包，http：//hmmer.wustl.edu/)或用CLUSTAL算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.&Gibson，T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22，4673-80)，可获得自例如http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html或http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_clustalw.html。使用的优选参数是如其在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/或http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html上设置的默认参数。序列同一性的等级(序列匹配)可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)计算。Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTP程序中并入了类似的算法。为了获得用于比较目的的空位比对，空位BLAST(Gapped BLAST)如Altschul et al.(1997)NucleicAcids Res.25：3389-3402中所述使用。当使用BLAST和空位BLAST程序，使用各自程序的默认参数。序列匹配分析可以通过已建立的同源映射技术如Shuffle-LAGAN(Brudno M.，Bioinformatics 2003b，19 Suppl 1：I54-I62)或马尔可夫随机场(Markov random field)来补充。当在本申请中提及序列同一性的百分比时，如果没有另外特别指出，这些百分比是相对于较长序列的全长计算的。

反式剪接

已经设计了许多基因治疗技术来解决特定的病理。这些不同的方法从使用病毒载体的基因补充到使用CRISPR/Cas9技术的基因组编辑。然而，有时这些方法并不适用或并不有效以达到显著治疗作用。目前，人们正在努力通过利用剪接体催化治疗性反式剪接事件来修复突变转录物以在不改变基因表达水平的情况下产生净转录物来解决这个问题。(参见，例如图7)。

剪接是存在于真核细胞的细胞核中的由剪接体(大型核糖核蛋白复合体)催化的反应。剪接导致前体mRNA中内含子的消除。该反应被认为是顺式剪接，因为它涉及位于同一RNA分子上的供体位点、分支点和受体位点。

剪接体还可以催化反式剪接事件。与顺式剪接不同，反式剪接发生在两个不同的RNA分子之间。分子过程是相同的，除了最终的mRNA由第一前体mRNA的第一外显子和另一前体mRNA的外显子构成，因此创建嵌合分子。随着自然发生的反式剪接的发现，它被证明可用于生物工程目的。1999年，Puttaraju等(Nature Biotech.，17：246-52)证明了使用由能够在细胞培养物中诱导反式剪接的人工RNA介导的外显子互换来转向反式剪接以诱导修复内源性mRNA的能力。随后的研究表明在体内使用它的可行性，导致在人支气管异种移植模型系统中的突变囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cystic fibrosis transmembraneconductance regulator，CFTR)的功能性恢复。这导致了剪接体介导的RNA反式剪接或SMaRT系统作为基因治疗策略的研究和使用。虽然该技术已被用于介导与疾病相关的多种mRNA序列的修复，但SMaRT技术存在缺陷和限制。

当前的SMaRT技术存在一些人们必须加以考虑的重要缺陷。SMaRT技术的一个缺点是分子的特异性。理论上，有随机mRNA的脱靶反式剪接应该通过无义介导的衰变或无终止衰变处理，必须验证前体mRNA反式剪接分子对靶序列的特异性并限制非特异性事件。已经发现，将结合结构域序列的长度增加到153个碱基会显著降低在人基因组中找到完整且精确对应序列的概率，并提高效率。另一个缺点是系统的效率。对于某些疾病，即使突变蛋白的低表达水平也会导致患病表型。

CRISPR/Cas

本公开内容包括组合物和方法，其包含含有核酸酶失活的CRISPR/Cas系统、指导核酸、特异性RNA结合结构域和修复模板的靶向反式剪接系统，所述修复模板包含在严格条件下与特异性RNA结合结构域杂交的RNA序列。成簇的规则间隔的短回文重复(更广泛地称为CRISPR)以及称为Cas(CRISPR相关)蛋白的酶家族是一种原核生物免疫系统，其赋予针对外来遗传元件(例如存在于提供获得性免疫形式的质粒和噬菌体中的那些)的抗性。最近，CRISPR/Cas系统已被开发为用于基础分子生物学研究、生物技术产品开发和疾病治疗的工具。这些系统已被广泛采用于介导靶向DNA切割，其进而通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或经由模板依赖性同源定向修复(homology-directedrepair，HDR)的精确基因编辑驱动靶向基因破坏。

在某些实施方案中，本文所述的CRISPR/Cas系统包含由SEQ ID NO：1、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、71、74、77、80、83、86或89中任一个的多核苷酸序列或其变体编码的Cas13酶。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统包含含有SEQ IDNO：2、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、72、75、78、81、84、87或90中任一个的氨基酸序列或其变体的Cas13酶。Cas13酶被归类为VI型CRISPR-Cas系统，并且具有两个高等真核生物和原核生物核苷酸结合(HEPN)内切核糖核酸酶结构域，其介导精确的RNA切割，优选在生化和细菌中观察到的具有原间隔子侧翼位点基序的靶标。迄今已确定三个Cas13蛋白家族。Cas13a(以前称为C2c2)可改造为核酸检测工具。Cas13b已用于RNA编辑和核酸检测，并且在其线性结构域结构和CRISPR RNA(crRNA)结构方面在VI型CRISPR效应物中是特有的。Cas13酶本质上是可编程的，并且使其成为开发用于RNA结合和干扰应用的工具的有吸引力的起点(Cox et al.(2017)Science.358：1019-1027，通过引用将其全部并入本文)。

术语“核酸结合蛋白结构域”是指能够靶向特定核酸序列的蛋白质结构域。在一些实施方案中，核酸序列是DNA。在另一些实施方案中，核酸序列是RNA。在一些实施方案中，核酸结合蛋白结构域特异性与剪接受体或剪接供体位点结合。核酸结合蛋白结构域的一些实例包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)和Pumby模块(Adamala et al.(2016)Proc Natl AcadSci.113(19)：E2579-E2588，其全文通过引用并入本文)或人源化CRISPR，例如CRISPR-Cas启发的RNA靶向系统(CRISPR-Cas-Inspired RNA Targeting System，CIRTS)(Rauch etal.(2019)Cell.178(1)：P122-134，其全文通过引用并入本文)或RNA识别基序(Maris etal.(2005)The FEBS journal 272：2118-2131)。

本文所述的RNA靶向系统、载体系统、载体和组合物可用于多种RNA靶向应用，改变或修饰基因产物例如蛋白质的合成、RNA切割、RNA编辑、RNA剪接；靶RNA的运输、靶RNA的追踪、靶RNA的分离、靶RNA的可视化等。

术语“剪接供体”是指内含子的5’端。

术语“剪接受体”是指内含子的3’端。

术语“修复模板”是指包含要剪接至目的核酸基因座的所期望序列的核酸分子。在一些实施方案中，要剪接的所期望序列是外显子。在一些实施方案中，修复模板还包含一个或更多个内含子。

在某些实施方案中，指导核酸是指导RNA。在某些实施方案中，指导核酸是指导DNA。在一些实施方案中，指导核酸(例如指导RNA或gRNA)是识别目的靶前体mRNA并将Cas蛋白引导至所述前体mRNA的特异性序列。在一些实施方案中，指导核酸靶向发生转录的DNA基因座。通常，指导核酸由两个组分-crispr RNA(crRNA)(其是与靶序列互补的17至20个核苷酸序列)和tracr RNA(其作为Cas核酸酶的结合支架)构成。最近，crRNA和tracr RNA组分已融合到一个分子中，以产生单指导RNA(single guide RNA，sgRNA)。在某些实施方案中，反式剪接系统包含一个指导核酸。对于目前表征的CRISPR/Cas13系统，crispr RNA(crRNA)由间隔子和同向重复构成。对于Cas13b，间隔子是5′，并且同向重复是crRNA的3′。对于Cas13b，crRNA和指导RNA可以互换使用。对于Cas13a和Cas13d，间隔子是3′，并且同向重复是crRNA的5′(Zhang F(2019).Development of CRISPR-Cas systems for genomeediting and beyond.Quarterly Reviews of Biophysics 52，e6，1-31.https：//doi.org/10.1017/S0033583519000052，其全文通过引用并入本文)。在某些实施方案中，反式剪接系统包含多于一个指导核酸。在某些实施方案中，多于一个指导核酸以阵列与一个启动子可操作地连接，其然后被Cas13切割和加工。在一些实施方案中，阵列在多个间隔子之间具有同向重复，其中每个间隔子靶向不同的核酸。在某些实施方案中，多于一个指导核酸由单独的启动子，例如U6启动子表达。在某些实施方案中，指导RNA在5’端具有同向重复(例如，SEQ ID NO：10、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、73、76、79、82、85、88和91)，并且在3’端具有间隔子。在另一些实施方案中，指导RNA在3’端具有同向重复(例如，SEQ ID NO：10、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、73、76、79、82、85、88和91)，并且在5’端具有间隔子。在另一些实施方案中，间隔子的侧翼为同向重复(例如，SEQ ID NO：10、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、73、76、79、82、85、88和91)。在某些实施方案中，同向重复与SEQ ID NO：10、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、73、76、79、82、85、88或91的同向重复核酸序列具有至少70％(例如，至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。在某些实施方案中，指导核酸识别多个靶标。在某些实施方案中，本公开内容提供了与SEQ ID NO：11或12的核酸序列具有至少70％(例如，至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的指导核酸序列。

本发明使用核酸结合靶RNA序列。这是有利的，因为与蛋白质相比产生核酸更容易且更便宜，并且特异性可以根据寻求同源性的延伸段的长度而变化。多个指的复杂3-D定位例如是不需要的。术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任意长度的核苷酸，不管是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸还是其类似物的聚合物形式。多核苷酸可以具有任意三维结构，并且可以进行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、从连锁分析定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。所述术语还涵盖具有合成骨架的核酸样结构，参见，例如Eckstein，1991；Baserga et al.，1992；Milligan，1993；WO 97/03211；WO 96/39154；Mata，1997；Strauss-Soukup，1997；和Samstag，1996。多核苷酸可以包含一种或更多种经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可在聚合之后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。

在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统的特异性RNA结合结构域包含与Cas蛋白融合的病毒蛋白。术语“病毒蛋白”可用于描述与剪接受体模板的发夹结合的结合至Cas蛋白的病毒来源蛋白。单链RNA噬菌体的衣壳蛋白是病毒复制酶的翻译阻遏物。他们通过特异性结合涵盖复制酶起始密码子的RNA发夹来实现这一点。一些实例是RNA噬菌体MS2、γN、Qβ和PP7的衣壳蛋白(例如SEQ ID NO：5至9)。在某些实施方案中，特异性RNA结合结构域包含SEQID NO：6、7、8或9中任一个的氨基酸序列或其变体。术语“结合”等意指病毒蛋白与相应发夹形成在生理条件下相对稳定的复合体。在某些实施方案中，本公开内容提供了与SEQ IDNO：13至16的核酸序列中任一个具有至少70％(例如，至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的发夹序列。

在某些实施方案中，病毒蛋白与CRISPR/Cas系统共价结合。在某些实施方案中，病毒蛋白不与CRISPR/Cas系统共价结合。在某些实施方案中，病毒蛋白和CRISPR/Cas系统是融合蛋白。本文中使用的术语“共价结合”是指涉及原子之间共享电子的化学键。术语“融合蛋白”是指通过将最初编码单独蛋白质的两个或更多个基因连接产生的蛋白质。

在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统的特异性RNA结合结构域包含不是病毒来源的RNA结合蛋白。

在某些实施方案中，反式剪接系统包含一个修复模板。在某些实施方案中，反式剪接系统包含多于一个修复模板。

在某些实施方案中，反式剪接系统包含含有核酸酶失活的CRISPR/Cas系统的指导核酸结合蛋白结构域。

在某些实施方案中，反式剪接系统的表达和/或活性是瞬时的。“瞬时表达”是指在核酸引入真核细胞之后表达一段时间的基因的短暂表达。在一些实施方案中，反式剪接系统的瞬时表达可以用小分子控制。本文中使用的术语“小分子”是指非核酸/非氨基酸分子。本文中使用的术语“小分子结合结构域”是指与给定小分子特异性结合的分子(通常是蛋白质)的部分。这些可以包括tet-ON或tet-OFF系统或使用合成转录因子和蛋白酶抑制剂的化学(chemogetic)控制。例如，在BILN-2061的存在下，dCas13-NLS-NS3-MS2仍然有活性且未切割。(Tague et al.，Nature Methods，第15卷，第519-522页(2018)和Wagner etal.Nature Chemical Biology，第14卷，第1043-1050页(2018)，其全文通过引用并入本文)。在一些实施例方案，反式剪接系统的瞬时表达可以通过递送颗粒的降解来控制。在一些实施方案中，反式剪接系统的表达可以用光激活转录因子控制(Konermann et al.，Nature，第500卷，第472-476页(22August 2013)，其全文通过引用并入本文)。在一些实施方案中，反式剪接系统的组装可以用小分子控制，例如经化学诱导二聚化。实例包括由FK1012组装的dCas13-NLS-FKBP和FKBP-NLS-MS2；由FK506组装的dCas13-NLS-FKBP和CNA-NLS-MS2；和由雷帕霉素瞬时组装并由FK506快速分解的dCas13-NLS-FRB和MS2-FKBP。((Braun et al.，Nature Communications，DOI：10.1038/s41467-017-00644-y，其全文通过引用并入本文)。另外的实例包括由脱落酸组装的dCas13-NLS-ABI1和PYL1-MS2，(Gao etal.，Nature Methods，DOI：https：//doi.org/10.1038/nmeth.4042，其全文通过引用并入本文)。小分子及其化学诱导系统的另一些实例包括在Stanton et al.中(Science，DOI：http：//dx.doi.org/10.1126/science.aao5902，其全文通过引用并入本文)。在一些实施方案中，反式剪接系统的活性可以使用小分子控制以降解系统。在一些实施方案中，小分子结合域可以通过自切割肽与CRISPR系统连接。在一些实施方案中，自切割肽是2A自切割肽。一些实例包括但不限于T2A、P2A、E2A和F2A序列。

在一些实施方案中，反式剪接系统的组装由SunTag介导(Tanenbaum et al.，Cell，2014，DOI：https：//doi.org/10.1016/j.cell.2014.09.039)。在一些实施方案中，反式剪接系统的组装由天然或经修饰的指导RNA上的发夹介导，例如SAM系统(Konermann etal.，Nature，2015，DOI：10.1038/nature14136)。

在一些实施方案中，瞬时表达通过将反式剪接系统作为RNA递送来进行，如Hewittet al.，Science Translational Medicine 30 Jan 2019：第11卷，第477期，eaat9143中所示，其全文通过引用并入本文。在一些实施方案中，反式剪接系统组装可以通过光来控制。例如，dCas13-NLS-CRY2和CIB1-NSL-MS2通过466nm光组装。(Konermann et al.(2013))。在一些实施方案中，瞬时表达通过将反式剪接系统与游离型或非整合病毒一起递送来进行。这些病毒包括Ad5、AAV、HSV-1或杆状病毒。在一些实施方案中，反式剪接系统的活性由条件活性内含肽介导，例如在4-羟基他莫昔芬(4-HT)或其他小分子存在下进行蛋白质剪接的内含肽。在一些实施方案中，反式剪接系统的活性由4-HT控制，通过将4-HT敏感内含肽包含在Cas13中破坏Cas13活性的位置直到4-HT介导的蛋白质剪接已经发生来实现控制，类似于Davis et al.(Nature Chemical Biology，2015，DOI：https：//doi.org/10.1038/ nchembio.1793)。

递送

在一些实施方案中，引入真核细胞中的核酸是质粒DNA或病毒载体。

优选地，递送以载体的形式进行，载体可以是病毒载体，例如慢病毒或杆状病毒或腺病毒/腺相关病毒载体，但是已知并提供其他递送方式(例如酵母系统、微囊泡、基因枪/将载体附接到金纳米粒的方式)。病毒载体可选自多种病毒科/属，包括但不限于肌病毒科(Myoviridae)、长尾病毒科(Siphoviridae)、短尾病毒科(Podoviridae)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、拟菌病毒科(Mimiviridae)、潘多拉病毒属(Pandoravirusa)、盐末端蛋白噬菌体属(Salterprovirusa)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、囊病毒科(Cystoviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、整体病毒科(Totiviridae)、双分病毒科(Partitiviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、δ病毒属(Deltavirusa)、光滑病毒科(Leviviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、海洋RNA病毒科(Marnaviridae)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、肝炎病毒科(Hepeviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、野田村病毒科(Nodaviridae)、四病毒科(Tetraviridae)、黄症病毒科(Luteoviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、帚状病毒科(Virgaviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、芜菁发黄镶嵌病毒科(Tymoviridae)、甲型线形病毒科(Alphaflexiviridae)、南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirusa)或悬钩子病毒属(Idaeovirusa)。

载体可以不仅意指病毒或酵母系统(例如，其中目标核酸可与启动子可操作地连接并受其控制(就表达而言，例如以最终提供经加工的RNA))，而且还指直接将核酸递送到宿主细胞中。虽然在本文的方法中，载体可以是病毒载体，并且这有利地是AAV，但也可以采用如本文所讨论的其他病毒载体，例如慢病毒。例如，杆状病毒可用于在昆虫细胞中表达。这些昆虫细胞反过来可用于产生大量另外的载体，例如适于递送本发明的AAV或慢病毒。还设想了递送本发明CRISPR酶的方法，其包括将编码CRISPR酶的mRNA递送到细胞。应了解，在某些实施方案中，CRISPR酶被截短和/或由少于1000个氨基酸或少于4000个氨基酸构成，和/或是核酸酶或切口酶，和/或是经密码子优化的，和/或包含一个或更多个突变，和/或包含嵌合CRISPR酶，和/或如本文所讨论的其他选项。

在一些实施方案中，编码CRISPR酶的核酸序列的表达可由启动子驱动。在一些实施方案中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的核酸序列和一个或更多个指导序列的表达。在一些实施方案中，CRISPR酶和一个或更多个指导序列与同一启动子可操作地连接并由其表达。在一些实施方案中，CRISPR酶和一个或更多个指导序列由不同的启动子表达。例如，启动子可以是但不限于UBC启动子、PGK启动子、EF1A启动子、CMV启动子、EFS启动子、SV40启动子和TRE启动子。启动子可以是弱启动子或强启动子。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子还可以是AAV ITR，并且可以有利于消除对可占据载体空间的另外的启动子元件的需要。通过使用AAV ITR释放的另外的空间可用于驱动另外的元件，例如指导序列的表达。在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子。

在一些实施方案中，对编码CRISPR酶的酶编码序列进行密码子优化以在特定细胞，例如真核细胞中表达。真核细胞可以是特定生物体的那些或者来源于特定生物体，所述生物体例如哺乳动物，其包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类。一般而言，密码子优化是指在维持天然氨基酸序列的同时通过用在目的宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子(例如，约或大于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多密码子)来修饰核酸序列以在该宿主细胞中增强表达的过程。多种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(messenger RNA，mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率继而被认为尤其取决于所翻译密码子的特性和特定转移RNA(transfer RNA，tRNA)分子的可用性。所选择tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最频繁使用的密码子。因此，可基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中进行最佳基因表达。密码子使用表容易获得，例如，在“密码子使用数据库”中，并且这些表可以以多种方式进行调整。参见Nakamura，Y.，et al.“codon usage tabulated from the international DNA sequence databases：statusfor the year 2000”Nucl.Acids Res.28：292(2000)。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可用的，例如Gene Forge(Aptagen；Jacobus，Pa.)也是可用的。在一些实施方案中，编码Cas蛋白的序列中的一个或更多个密码子(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多，或所有密码子)对应于特定氨基酸的最频繁使用的密码子。

在一些实施方案中，载体编码包含一个或更多个核定位序列(NLS)，例如约或大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个NLS的Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白在氨基端或其附近包含约或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个NLS，在羧基端或其附近包含约或大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个NLS，或这些的组合(例如，在氨基端的一个或更多个NLS和在羧基端的一个或更多个NLS)。当存在多于一个NLS时，各自可以彼此独立选择，使得单一NLS可以以多于一个拷贝存在和/或与一个或更多个拷贝存在的一种或更多种其他NLS组合存在。在一些实施方案中，当NLS的最近氨基酸沿着多肽链在从N或C端的约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或更多个氨基酸内时，NLS被认为在N或C端附近。通常，NLS由暴露在蛋白质表面的带正电赖氨酸或精氨酸的一个或更多个短序列组成，但其他类型的NLS也是已知的。在一些实施方案中，NLS在两个结构域之间，例如在Cas13蛋白和病毒蛋白之间。NLS也可在由甘氨酸-丝氨酸接头分隔或侧接的两个功能结构域之间。

总的来说，一个或更多个NLS具有足够的强度以在真核细胞的细胞核中驱动Cas蛋白以可检出量积聚。一般来说，核定位活性的强度可源自Cas蛋白中NLS的数目、使用的特定NLS或这些因素的组合。核内积聚的检测可通过任何合适的技术进行。例如，可检测标志物可与Cas蛋白融合，从而可可视化细胞内的位置，例如与用于检测细胞核位置的方式(例如，对细胞核特异的染色剂，例如DAPI)结合。可检测标志物的实例包括荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白，或GFP；RFP；CFP)和表位标签(HA标签、FLAG标签、SNAP标签)。细胞核也可从细胞中分离出来，然后可以通过任何用于检测蛋白质的合适的方法，例如免疫组织化学、Western印迹或酶活性测定来分析其内容物。也可以间接确定细胞核中的积聚，例如通过与未暴露于CRISPR复合物或暴露于缺乏该一个或更多个NLS的Cas蛋白的对照相比测定CRISPR复合物形成的效应(例如，测定靶序列处的DNA切割或突变，或测定受CRISPR复合物形成和/或CRISPR复合物活性影响的基因表达活性的改变)。

一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且引导CRISPR复合物与靶序列序列特异性地结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其对应的靶序列之间的互补性程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。最佳比对可通过使用用于比对序列的任何合适的算法来确定，所述算法的一些非限制性实例包括史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)；内德勒曼-温施算法(Needleman-Wunschalgorithm)；基于伯劳斯-惠勒变换(Burrows-Wheeler Transform)的算法(例如，伯劳斯-惠勒比对器(Burrows Wheeler Aligner))；Clustal W；Clustal X；BLAT；Novoalign(Novocraft Technologies，ELAND(Illumina，San Diego，Calif.))；SOAP(可在soap.genomics.org.cn上获得)以及Maq(可在maq.sourceforge.net上获得)。在一些实施方案中，指导序列的长度为约或大于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列的长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少核苷酸。指导序列引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可通过任何合适的测定进行评估。

在一些方面中，本发明提供了方法，其包括将一种或更多种多核苷酸例如如本文所述的一种或更多种载体、其一种或更多种转录物和/或由其转录的一种或更多种蛋白质递送到宿主细胞。在一些方面中，本发明进一步提供了通过这样的方法产生的细胞，以及包含这样的细胞或由这样的细胞产生的生物体(例如动物、植物或真菌)。在一些实施方案中，将与指导序列组合(且任选地复合)的Cas蛋白递送至细胞。可使用常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。可使用这样的方法以向培养物中或宿主生物体中的细胞施用编码CRISPR系统的组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，本文中所述载体的转录物)、裸核酸以及与递送载剂、例如脂质体复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，它们在递送至细胞之后具有游离基因组或整合的基因组。对于基因治疗程序的综述，参见Anderson，Science 256：808-8313(1992)；Navel和Felgner，TIBTECH 11：211-217(1993)；Mitani和Caskey，TIBTECH 11：162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11：167-175(1993)；Miller，Nature 357：455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology 6(10)：1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology andNeuroscience 8：35-36(1995)；Kremer和Perricaudet，British Medical Bulletin 51(1)：31-44(1995)；Haddada et al.，Current Topics in Microbiology and Immunology，Doerfler和Bohm(eds)(1995)；以及Yu et al.，Gene Therapy 1：13-26(1994)。

如本文所述的CRISPR/Cas系统可使用腺相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒或其他病毒载体类型或其组合来递送。Cas蛋白和一个或更多个指导RNA可被包装到一个或更多个病毒载体中。在一些实施方案中，靶向反式剪接系统通过AAV作为分离型内含肽系统递送，与Levyet al.(Nature Biomedical Engineering，2020，DOI：https：//doi.org/10.1038/s41551-019-0501-5)类似。在另一些实施方案中，靶向反式剪接系统可通过AAV作为反式剪接系统递送，与Lai et al.(Nature Biotechnology，2005，DOI：10.1038/nbt1153)类似。在一些实施方案中，通过例如肌内注射将病毒载体递送至目标组织，而有时候，病毒递送是通过静脉内、经皮、鼻内、经口、黏膜、鞘内、颅内或其他递送方法进行。这样的递送可以是通过单剂量或多剂量。本领域技术人员理解，本文中待递送的实际剂量可根据多种因素而极大变化，所述因素例如所选择的载体、靶细胞、生物体或组织、待治疗对象的一般状况、寻求的转化/修饰程度、施用途径、施用模式，寻求的转化/修饰类型等。

使用RNA或DNA病毒类系统递送核酸利用高度进化的过程将病毒靶向至体内的特定细胞，并将病毒有效载荷输送到细胞核。病毒载体可直接施用于患者(体内)，或其可用于体外处理细胞，并且经修饰的细胞可任选地施用于患者(离体)。常规的基于病毒的系统可包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。使用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法使整合到宿主基因组中成为可能，其经常导致插入的转基因长期表达。此外，在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到了高转导效率。病毒介导的Cas13和指导RNA的体内递送提供了在细胞中、尤其是在有丝分裂后细胞和组织中实现精确mRNA扰动的快速而强大的技术。

在某些实施方案中，反式剪接系统向细胞的递送是病毒的。在某些实施方案中，病毒为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、指环病毒或杆状病毒。

在某些实施方案中，反式剪接系统向细胞的递送是非病毒的。在某些实施方案中，非病毒递送系统选自阳离子脂质载剂、电穿孔、磷酸钙转染、使用机械剪切力通过膜破裂进行的转染、机械转染和纳米粒递送。

优选地，所述载体是病毒载体，例如慢病毒、杆状病毒或腺病毒/腺相关病毒载体，但已知并提供了其他递送方式(例如酵母系统、微囊泡、基因枪/将载体附接到金纳米粒的方式)。在一些实施方案中，一种或更多种病毒或质粒载体可通过脂质体、纳米粒、外泌体、微囊泡或基因枪递送。

慢病毒是复杂的逆转录病毒，其具有在有丝分裂和有丝分裂后细胞二者中感染和表达其基因的能力。最常见的已知慢病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)，它利用其他病毒的包膜糖蛋白靶向广泛多种细胞类型。

在另一个实施方案中，还考虑了基于马传染性贫血病毒(equine infectiousanemia virus，EIAV)的最小非灵长类慢病毒载体，尤其是用于眼部基因治疗(参见例如Balagaan，J gene Med 2006：8：275-285，2005年11月21日在线发表于Wiley InterScience(www.interscience.wiley.com).DOI：10.1002/jgm.845)。在另一个实施方案中，还考虑了基于马传染性贫血病毒的慢病毒基因治疗载体RetinoStat，该载体表达通过视网膜下注射递送的血管抑制蛋白内皮抑素和血管抑素，用于治疗年龄相关性黄斑变性的网状形式(参见例如Binley et al.，HUMAN GENE THERAPY 23：980-991(2012年9月))可以针对本发明的CRISPR-Cas系统进行修饰。

慢病毒载体已被公开作为用于帕金森病的治疗，参见例如美国专利公开No.20120295960和美国专利No.7,303,910和7,351,585。慢病毒载体也已被公开用于递送到脑，参见例如美国专利公开No.US20110293571、US20040013648；US20070025970、US20090111106和美国专利No.7,259,015。

核酸的非病毒递送的方法包括脂质转染、核转染、微注射、生物弹道术、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子以及DNA的试剂增强摄取。脂质转染描述于例如美国专利No.5,049,386、4,946,787和4,897,355中；并且脂质转染试剂是商业销售的(例如，Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适合于多核苷酸的高效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质包括Felgner，WO 91/17424；WO 91/16024的那些。可递送至细胞(例如，体外或离体施用)或者靶组织(例如，体内施用)。

脂质：核酸复合物(包括靶向脂质体，例如免疫脂质复合物)的制备为本领域技术人员所公知(参见例如Crystal，Science 270：404-410(1995)；Blaese et al.，CancerGene Ther.2：291-297(1995)；Behr et al.，Bioconjugate Chem.5：382-289(1994)；Remyet al.，Bioconjugate Chem.5：647-654(1994)；Gao et al.，Gene Therapy 2：710-722(1995)；Ahmad et al.，Cancer Res.52：4817-4820(1992)；美国专利No.4,186,183；4,217,344；4,235,871；4,261,975；4,485,054；4,501,728；4,774,085；4,837,028；和4,946,787)。

在一些实施方案中，用本文所述的一种或更多种载体瞬时或非瞬时转染宿主细胞。在一些实施方案中，细胞如其在对象中天然存在那样转染。在一些实施方案中，被转染的细胞取自对象。在一些实施方案中，细胞源于取自对象的细胞，例如细胞系。细胞系可从本领域技术人员已知的多种来源获得(参见例如美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)(Manassas，VA))。在一些实施方案中，用本文所述的一种或更多种载体转染的细胞用于建立包含一种或更多种载体来源序列的新细胞系。在一些实施方案中，用如本文所述的CRISPR系统的组分瞬时转染(例如通过瞬时转染一种或更多种载体，或用RNA转染)并通过CRISPR复合物的活性进行修饰的细胞用于建立新的细胞系，该新的细胞系包含含有该修饰但缺少任何其他外源序列的细胞。在一些实施方案中，用本文所述的一种或更多种载体瞬时或非瞬时转染的细胞或来源于这样的细胞的细胞系用于评估一种或更多种测试化合物。

在一些实施方案中，本文所述的一种或更多种载体用于产生非人转基因动物或转基因植物。在一些实施方案中，转基因动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠或兔。在某些实施方案中，生物体或对象是植物。在某些实施方案中，生物体或对象或植物为藻类。本领域已知用于产生转基因植物和动物的方法，并且通常从细胞转染方法开始，例如本文所述。

在一个方面中，本发明提供了在真核细胞中修饰靶多核苷酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括允许CRISPR复合物与靶多核苷酸结合以实现所述靶多核苷酸的切割，从而修饰所述靶多核苷酸，其中CRISPR复合物包含与与所述靶多核苷酸中靶序列杂交的指导序列复合的CRISPR酶，其中，所述指导序列与tracr配对序列连接，该配对序列又与tracr序列杂交。

随着作物基因组学的最新进展，利用CRISPR/Cas系统进行高效且具有成本效益的基因编辑和操纵的能力将允许快速选择和比较单一和多重化遗传操纵，以转化这样的基因组用于改善产量和增强性状。在这方面，参考美国专利和公开：美国专利No.6,603,061-Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method；美国专利No.7,868,149-PlantGenome Sequences and Uses Thereof和US 2009/0100536-Transgenic Plants withEnhanced Agronomic Traits，每篇的全部内容和公开内容均通过引用整体并入本文。在本发明的实践中，Morell et al“Crop genomics：advances and application”Nat RevGenet.2011 Dec 29；13(2)：85-96的内容和公开内容也通过引用整体并入本文。

即时CRISPR/Cas系统的任何组分都可以以RNA的形式递送。Cas和/或病毒蛋白mRNA可以使用体外转录产生。例如，可以使用包含以下元件的PCR盒合成Cas mRNA：T7启动子-Kozak序列(GCCACC)-Cas13-来自β珠蛋白的3’UTR-polyA尾(120个或更多腺嘌呤的串)。该盒可用于通过T7聚合酶的转录。还可以使用从含有T7启动子-GG-指导RNA序列的盒体外转录来转录指导RNA。

即时CRISPR/Cas系统的组分可使用纳米粒或脂质包膜同时递送。例如，Su X，Fricke J，Kavanaugh DG，Irvine DJ(“In vitro and in vivo mRNA delivery usinglipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles”Mole Phar.2011 Jun 6；8(3)：774-87.doi：10.1021/mp100390w.Epub 2011 Apr 1)描述了生物可降解的具有被磷脂双层壳包膜的聚(β-氨基酯)(PBAE)核的核-壳结构化纳米粒。这些是为体内mRNA递送而开发的。选择pH响应性PBAE组分以促进内体破坏，而选择脂质表面层以最小化聚阳离子核的毒性。因此，此类优选用于递送本发明的RNA。

在一个实施方案中，考虑了基于自组装生物黏附聚合物的纳米粒，其可应用于肽的经口递送、肽的静脉内递送和肽的经鼻递送，所有这些都递送到脑。还考虑了另一些实施方案，例如疏水性药物的经口吸收和眼部递送。分子包膜技术涉及经改造的聚合物包膜，其被保护并递送到患病位点(参见，例如，Mazza，M.et al.ACSNano，2013.7(2)：1016-1026；Siew，A.，et al.Mol Pharm，2012.9(1)：14-28；Lalatsa，A.，et al.J Contr Rel，2012.161(2)：523-36；Lalatsa，A.，et al.，Mol Pharm，2012.9(6)：1665-80；Lalatsa，A.，et al.MolPhar，2012.9(6)：1764-74；Garrett，N.L.，et al.J.Biophotonics，2012.5(56)：458-68；Garrett，N.L.，et al.J Raman Spect，2012.43(5)：681-688；Ahmad，S.，et al.J RoyalSoc Interface 2010.7：S423-33；Uchegbu，I.F.Expert Opin Drug Deliv，2006.3(5)：629-40；Qu，X.，et al.Biomacromolecules，2006.7(12)：3452-9和Uchegbu，I.F.，etal.Int J Pharm，2001.224：185-199)。考虑了约5mg/kg的剂量，单剂量或多剂量，这取决于靶组织。

美国专利申请20110293703涉及类脂化合物在多核苷酸的施用中也特别有用，其可应用于递送本发明的CRISPR/Cas系统。在一个方面中，将氨基醇类脂化合物与待递送到细胞或对象的药剂组合以形成微粒、纳米粒、脂质体或胶束。待由颗粒、脂质体或胶束递送的药剂可以是气体、液体或固体的形式，并且药剂可以是多核苷酸、蛋白质、肽或小分子。氨基醇类脂化合物可与其他氨基醇类脂化合物、聚合物(合成的或天然的)、表面活性剂、胆固醇、糖类、蛋白质、脂质等组合而形成颗粒。然后，这些颗粒可任选地与药物赋形剂组合以形成药物组合物。

美国专利申请20130302401涉及使用组合聚合制备的一类聚(β-氨基醇)(PBAA)。发明PBAA可在生物技术和生物医学应用中用作涂层(例如用于医疗设备或植入物的膜或多层膜的涂层)、添加剂、材料、赋形剂、非生物燃料剂、微图案剂和细胞封装剂。当用作表面涂层时，这些PBAA在体外和体内均引起不同程度的炎症，这取决于它们的化学结构。这类材料的巨大化学多样性使我们能够鉴定在体外抑制巨噬细胞活化的聚合物涂层。此外，在皮下植入羧化聚苯乙烯微粒之后，这些涂层降低炎性细胞的募集，并降低纤维化。这些聚合物可用于形成用于细胞封装的聚电解质复合胶囊。本发明还可以具有许多其他生物应用，例如抗微生物涂层、DNA或siRNA递送以及干细胞组织工程。美国专利申请No.20130302401的教导可应用于本发明的CRISPR/Cas系统。

在另一个实施方案中，考虑了脂质纳米粒(LNP)。具体而言，封装在脂质纳米粒中的抗转甲状腺素蛋白小干扰RNA(参见，例如，Coelho et al.，N Engl J Med 2013；369：819-29)可应用于本发明的CRISPR/Cas系统。

必须考虑LNP的电荷。阳离子脂质与带负电荷的脂质组合诱导促进细胞内递送的非双层结构。由于静脉内注射之后带电荷的LNP迅速从循环中清除，因此开发了pKa值低于7的可电离阳离子脂质(参见例如Rosin et al，Molecular therapy，第19卷，第12期，第1286至2200页，Dec.2011)。带负电荷的聚合物，例如siRNA寡核苷酸，可在低pH值(例如pH 4)下负载到LNP中，在此pH下可电离脂质展示正电荷。然而，在生理pH值下，LNP表现出与更长循环时间相适应的低表面电荷。四种可电离阳离子脂质已被关注，即1，2-二亚油酰基-3-二甲基铵-丙烷(1，2-dilineoyl-3-dimethylammonium-propane)(DLinDAP)、1，2-二亚油烯基氧基-3-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亚油烯基氧基-酮-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinKDMA)和1，2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧戊环(DLinKC2-DMA)。

带有siRNA的自组装纳米粒可以用聚乙烯亚胺(PEI)构建，其与附接在聚乙二醇(PEG)远端的Arg-Gly-Asp(RGD)肽配体聚乙二醇化，例如，作为靶向表达整合素的肿瘤新生血管的方式，并用于递送抑制血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)表达并从而抑制肿瘤血管生成的siRNA(参见例如，Schiffelers et al.，Nucleic Acids Research，2004，Vol.32，No.19)。纳米复合物可通过混合等体积的阳离子聚合物和核酸的水溶液来制备，以产生在2至6的范围内的可电离氮(聚合物)与磷酸(核酸)的净摩尔过量。阳离子聚合物和核酸之间的静电相互作用导致形成平均颗粒尺寸分布为约100nm的聚合复合物，因此称其为纳米复合物。

外泌体是运输RNA和蛋白质的内源性纳米囊泡，其可将短干扰(si)RNA递送到小鼠的脑。为了降低免疫原性，Alvarez-Erviti等(2011，Nat Biotechnol 29：341)使用自身来源的树突细胞产生外泌体。

在某些实施方案中，本发明提供了治疗或抑制有此需要的对象(例如哺乳动物或人)或非人对象(例如哺乳动物)中由目标mRNA中靶序列缺陷引起的病症的方法，其包括通过操纵靶序列来修饰对象或非人对象，并且其中所述病症可通过操纵靶序列进行治疗或抑制，其包括提供治疗，所述治疗包括：递送包含AAV或慢病毒载体系统的非天然存在或经改造的组合物，所述AAV或慢病毒载体系统包含一种或更多种可操作地编码组合物用于其表达的AAV或慢病毒载体，其中所述靶序列在表达时由所述组合物操纵，其中所述组合物包含：(A)包含载体系统的非天然存在或经改造的组合物，所述载体系统包含一种或更多种载体，所述载体包含包含非天然指导核酸结合蛋白结构域、指导核酸、特异性RNA结合结构域和修复模板的靶向反式剪接系统，该修复模板包含剪接供体和/或剪接受体以及在严格条件下与特异性RNA结合结构域杂交的RNA序列。

细胞靶向

本文的工作支持使用CRISPR/Cas系统通过将CRISPR/Cas系统递送到适当位置(即，递送到目标器官或组织内的细胞)来靶向有丝分裂后细胞中的前体mRNA，以介导对前体mRNA的反式剪接事件。

在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统还包含细胞。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统靶向RNA。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统与细胞中的RNA缔合。在某些实施方案中，RNA是前体mRNA。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在内含子-外显子连接处的反式剪接。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在外显子-内含子连接处的反式剪接。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在该前体mRNA 3’端处的反式剪接。靶向前体mRNA 3’端的序列的实例可包括但不限于如本文所公开的SEQ ID NO：70。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在3’非翻译区(UTR)中的反式剪接。3’UTR中的反式剪接可导致产生的mRNA的更强翻译。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在前体mRNA中na内部位点的反式剪接。靶向前体mRNA中内部位点的序列的实例可包括但不限于如本文所公开的SEQ ID NO：92。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在5’非翻译区(UTR)中的反式剪接。已知mRNA的3’和5’UTR包含多种调节元件，并且对mRNA的稳定性和翻译成蛋白质至关重要。Warren等(Cell Stem Cell，第7卷，第618至630页(2010)，通过引用将其整体并入本文)使用含有强Kozak翻译信号的人工5’UTR和α珠蛋白3’UTR，以在将成纤维细胞重新编程为诱导性多能干细胞的过程中改善蛋白质产量。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统可介导反式剪接以提供3’UTR序列以改变翻译强度，在某些情况下，导致更强的翻译和蛋白质产量的显著提高。例如，来自包括但不限于AGXT、ALB、APOA2、ASL、C3、CYP2E1、FBA、HPX和/或ORM的基因的3’UTR可用于改变翻译强度。此外，例如，来自包括但不限于AGXT、ALB、APOA2、ASL、C3、CYP2E1、FBA、HPX和/或ORM的基因的5’UTR可用于改变翻译强度。

在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统与细胞中的DNA缔合。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统不与细胞中的DNA缔合。

在某些实施方案中，将反式剪接系统引入细胞中。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统介导细胞的核中前体mRNA的反式剪接。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统介导细胞的胞质中前体mRNA的反式剪接。在本发明的另一个方面中，本文提供了介导细胞中前体mRNA上靶向反式剪接事件的方法，该方法包括将靶向反式剪接CRISPR/Cas系统引入细胞中，其中该系统包含核酸酶失活的核酸靶向CRISPR/Cas系统、与目标核酸基因座特异性杂交的指导核酸、特异性RNA结合结构域以及包含在严格条件下与特异性RNA结合结构域杂交的RNA序列的修复模板。

使用II型和最近的V型CRISPR系统进行基因编辑可通过两种途径之一完成：非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。NHEJ不要求细胞活跃地分裂，然而HDR仅在分裂细胞中有活性。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统介导细胞的核中前体mRNA的反式剪接。在某些实施方案中，CRISPR/Cas系统介导细胞的胞质中前体mRNA的反式剪接。细胞可以是分裂细胞或有丝分裂后细胞。在某些实施方案中，有丝分裂后细胞可以简单地是一种或更多种有丝分裂后细胞，或器官本身或其中的组织。在某些实施方案中，有丝分裂后细胞可选自神经元、肌细胞和脂肪细胞。有丝分裂后细胞可包含在患者(在需要反式剪接介导的治疗的动物的意义上)或模型生物体的脊椎动物中，或者可以在细胞培养物、类器官或其他离体组织例如“芯片上肝”中，例如其中肝细胞接种在支架上并生长。随着3-D打印技术应用于生物学的发展，打印的组织已在掌握之中，并且完全可行的是以这种方式打印以创建类器官或在芯片上的肝细胞或组织也可以被靶向。还设想了非肝替代品，尤其是对于其他有丝分裂后细胞/组织。

因此，提供了包含有丝分裂后细胞(例如神经元或肾细胞)的模型生物体，本发明CRISPR-Cas系统已被递送到该模型生物体。这样的集合可包括有丝分裂后器官、类器官或驻存于支架的细胞(“芯片上肾”)。

特别地，这样的有丝分裂后细胞可表达或包含能够表达Cas酶的多核苷酸。如本文所讨论的，这具有提供用于通过前体mRNA的靶向反式剪接来查询基因产物功能的现成模型的优点。这在研究有丝分裂后细胞(例如肾或脑，例如本文所列出的那些)的病症以及更广泛的病症(例如肥胖)时特别有用。

还提供了在一种或更多种有丝分裂后细胞中诱导转录物扰动的方法，其包括使用根据本发明的CRISPR/Cas系统转导细胞群，从而改变细胞群的转录物。该方法可以是离体或体外的，例如在细胞培养物中或者在离体或体外模型(例如类器官)中。或者，该方法可以是体内的，在这种情况下，其还可以包括从对象分离细胞群，并将细胞群移植(回)到对象中。转录物扰动可针对一个或更多个、或者两个或更多个、或者三个或更多个、或者四个或更多个基因。然而，如果细胞已经包含Cas，无论是作为蛋白质表达还是由细胞中已经包含的多核苷酸编码，那么只需要递送CRISPR多核苷酸。该方法可包括从有丝分裂后细胞中提取并任选地重新插入回有丝分裂后细胞中。递送实际上意味着多核苷酸物理递送到细胞核，但也指转染。因此，除非另有明显说明，否则递送也应理解为包括转染。

基因治疗

由于所述发明可用于介导非分裂细胞中的反式剪接，因此在某些实施方案中，细胞在患有疾病或病症的对象中。在某些实施方案中，疾病或病症是神经退行性的、神经性的或者神经肌肉的疾病或病症。在某些实施方案中，疾病或病症选自脊髓性肌萎缩、雷特综合征、安格尔曼综合征、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、额颞痴呆、溶酶体贮积病、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化(ALS)。

本文采用的方法表明本发明可应用于基因治疗。例如，通过在本文讨论的有丝分裂后细胞中使用本发明CRISPR-Cas系统，可实现一个或更多个缺陷基因型(例如单点突变)的校正。特别优选与有丝分裂后相关的单基因病症，并在本文举例说明。

虽然可使用一个指导物，但所谓的用两个、三个、四个或更多指导物的多重化在待校正多个缺陷基因型(单个基因中的多个错误或横跨数个基因的多个错误)的基因治疗中特别有用。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了通过操纵目标基因组基因座中的靶序列来修饰生物体(例如，哺乳动物，包括人或非人哺乳动物或生物体)的有丝分裂后细胞的方法，其包括递送非天然存在或经改造的组合物，所述组合物包含病毒或质粒载体系统，所述病毒或质粒载体系统包含一种或更多种可操作地编码组合物用于其表达的病毒或质粒载体，其中所述组合物包含：(A)包含载体系统的非天然存在或经改造的组合物，所述载体系统包含一种或更多种载体，所述载体包含包含非天然指导核酸结合蛋白结构域、指导核酸、特异性RNA结合结构域和修复模板的靶向反式剪接系统，该修复模板包含剪接供体和/或剪接受体以及在严格条件下与特异性RNA结合结构域杂交的RNA序列。

如本文所述的反式剪接系统可用于查询有丝分裂后细胞中一种或更多种基因的功能。这可以通过将CRISPR/Cas系统递送到有丝分裂后细胞并表达来实现，其中CRISPR/Cas系统的一个或更多个指导物被设计为将CRISPR/Cas系统募集到前体mRNA靶标或目标靶标。同样，如果CRISPR/Cas已经包含在有丝分裂后细胞中，蛋白质(转录)形式，那么向有丝分裂后细胞递送指导物就足够了。在这里，由小分子诱导CRISPR/Cas系统可以是有利的。如果CRISPR/Cas已经在有丝分裂后细胞中，以多核苷酸(尚未转录)，则需要向有丝分裂后细胞递送指导物以及诱导Cas9多核苷酸的转录。使CRISPR/Cas系统在诱导型或阻遏型启动子的控制下，例如tet(四环素)开-关系统在此可以是有利的。

特别有前景的一个方面是将CRISPR技术与表型测定相结合，以确定基因扰动(尤其是敲低)引起的表型变化(如果有的话)。CRISPR/Cas系统的使用可与生化、测序、电生理和行为分析相结合，以研究所靶向的基因组元件的功能。

这在一个方面提供了查询有丝分裂后细胞中一种或更多种基因的功能的方法，其包括诱导经调节的mRNA的表达和确定病症中由一种或更多种基因而引起的表型变化，从而查询从经调节的前体mRNA翻译的一种或更多种蛋白质的功能。

以下广泛应用于本发明的适当方面。细胞可在对象(例如人、动物或模型生物体)中，使得在体内询问蛋白质功能。然而，也设想了细胞可以是离体的，例如在细胞培养物中或在模型器官或类器官中。在一些实施方案中，方法可包括从对象分离第一细胞群，任选地培养细胞并用一种或更多种CRISPR/Cas系统转导细胞。随后可进行进一步的任选培养。然后可将经转导的细胞移植回对象中。

细胞可来自本文所述的任何组织或生物体。脑是一个优选实例，提供了查询一种或更多种基因产物(例如前体mRNA)的功能的所述方法，其中有丝分裂后细胞是脑细胞，例如神经元。特别是在体内，这允许在动物行为方面查询突变或经修饰的蛋白质功能。动物优选是哺乳动物，例如啮齿动物。考虑到由异质细胞类型的复杂网络组成的神经系统的复杂性，能够在体内有效地编辑神经元的前体mRNA使得能够直接测试包埋在原生环境中的相关细胞类型中的基因功能。

试剂盒

本公开内容提供了用于实施方法的试剂盒。一方面，本发明提供了包含上述方法和组合物中公开的任意一种或更多种元件的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含载体系统和使用该试剂盒的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含载体系统，该载体系统包含调控元件和编码CRISPR/Cas反式剪接系统的多核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包含CRISPR/Cas反式剪接系统的病毒递送系统。在一些实施方案中，该试剂盒包含CRISPR/Cas反式剪接系统的非病毒递送系统。元件可以单独提供或组合提供，并且可以在任何合适的容器中，例如小瓶、瓶或管中提供。在一些实施方案中，该试剂盒包括一种或更多种语言，例如多于一种语言的说明。

在一些实施方案中，试剂盒包含一种或更多种试剂，其用于利用本文中所述的一种或更多种元件的方法中。试剂可以在任何合适的容器中提供。例如，试剂盒可以提供一种或更多种反应或储存缓冲液。试剂可以以可用于特定测定的形式提供，或以需要在使用之前添加一种或更多种其他组分的形式(例如以浓缩物或冻干形式)提供。缓冲液可以是任何缓冲液，其包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。在一些实施方案中，缓冲液是碱性的。在一些实施方案中，缓冲液的pH为约7至约10。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或更多种对应于指导序列的寡核苷酸用于插入到载体中以将指导序列和调控元件可操作地连接。

通过参考以下实验例对本发明进一步详细说明。这些实施例包括在内仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的，并不旨在限制本发明。因此，本发明绝不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文中提供的教导而显而易见的任何和所有变化方案。

实施例

实施例1-基于CRISPR的反式剪接系统的改造

基于CRISPR的反式剪接系统被设计成包含：指导RNA，例如指导RNA(gRNA)；与带有ms2发夹的改造内含子缀合的一个或一组目的外显子；以及与MS2结合蛋白连接的无催化活性Cas13b(dCas13b)(图1A)。反式剪接系统的组装依赖于dCas13b识别gRNA支架以及MS2结合蛋白识别改造内含子的ms2发夹(图1B)。作为诱导顺式剪接反应(图1C)的替代，CRISPR-dCas13b系统诱导类似于图1D所示的基于内源剪接体的反应的反式剪接事件。在基于CRISPR/Cas的系统中，当上述CRISPR-dCas13b组装体与前体mRNA结合时，就会发生反式剪接事件。当与MS2结合蛋白连接的dCas13b与前体mRNA结合时，顺式剪接受体被阻断。MS2结合蛋白系连目的反式剪接RNA分子，并且在dCas13b与靶前体mRNA结合的情况下，将反式剪接RNA引导至前体mRNA。这使得高效的反式剪接成为可能(图1E)。

数种DNA构建体用于使CRISPR介导的反式剪接实现(图2A)。首先，U6启动子驱动的具有普氏菌(Prevotella sp.)Cas13b(PspCas13b)RNA支架的gRNA构建体用于驱动细胞中gRNA的表达。dCas13b通过SV40核定位信号(SV40nuclear localization signal，SV40NLS)和甘氨酸-丝氨酸接头与MS2结合蛋白连接。牛生长激素多腺苷酸化信号(bovinegrowth hormone polyadenylation signal，bGHpA)用于允许构建体的稳定表达。剪接供体用于产生可测定反式剪接的前体mRNA的表达。使用蓝色荧光蛋白(BFP)作为标志物来验证剪接供体的表达，并在截短GFP(5′GFP)上使用自切割p2A接头。为确保剪接受体进行反式剪接，将基质金属肽酶9(Matrix Metallopeptidase 9，MMP9)内含子1和外显子2置于下游，随后是bGHpA以确保稳定表达。设计了剪接受体报道子，使得反式剪接可产生完整的GFP，其可以通过流式细胞术观察到。设计的ms2内含子由以下组成：i)与剪接供体报道子中的MMP9内含子1杂交的结合域(binding domain，BD)、ii)两个ms2环、iii)分支点(branch point，BP)和iv)多嘧啶束(polypyrimidine tract，PPT)，随后是v)剪接受体序列。截断GFP的第二半放置在ms2内含子之后，在其之后是逆转录引物结合位点(RT)，这允许生成下一代测序文库(NGS)以通过RNAseq验证反式剪接。为了确认剪接受体报道子的表达，使用内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)来驱动mCherry的翻译，从而允许独立于反式剪接通过流式细胞术测量mCherry。最后，使用ms2null(A2x ms2)剪接受体报道子来测量ms2环对CRISPR介导的反式剪接的效率的影响。

在成功反式剪接之后，通过剪接供体和受体报道子引入的截短GFP外显子(5’GFP，3’GFP)被剪接在一起，生成包含完整GFP mRNA序列的转录物，该序列能够产生功能性GFP蛋白产物(图2B)。使用流式细胞术针对BFP+和mCherry+对细胞进行设门以分别验证剪接供体(SD)和剪接受体(SA)报道子的表达。从设门双阳性BFP+mCherry+群体中，通过GFP+的细胞的分数测量反式剪接活性。

实施例2-测量CRISPR介导的反式剪接

HEK293FT细胞以12孔板形式转染，每种条件总共用1250ng DNA和4μLLipofectamine 2000。每种构建体是总DNA转染量的四分之一，但pUC19除外，pUC19用作递送少于四种组分的情况的非编码对照DNA。总共递送了1250ng DNA。转染之后6小时更换培养基，转染之后48小时通过流式细胞术分析细胞。阴性对照(图3A的第1至5列)示出了通过GFP报道子测定未检测出反式剪接。第6列，其表示用于反式剪接的现有技术，导致检出0.69％±0.08％(平均值±SD，n＝4)的BFP+mCherry+细胞的反式剪接。CRISPR介导的反式剪接(第11列)导致检测到19.58％±1.01％(平均值±SD，n＝4)的BFP+mCherry+细胞的反式剪接，其提高28.03±1.45倍。正如预期的那样，当使用ms2 null(A2x ms2)SA报道子时，CRISPR介导的反式剪接的效率显著下降(第12列)。令人感兴趣的是，与不表达dCas13b-MS2和gRNA的情况(第6列)相比，反式剪接显著提高2.45±0.45倍(p＝0.00074)，表明将dCas13b与SA结合防止顺式-剪接，从而在没有其他外显子进行顺式剪接的情况下促进反式剪接。

RNAseq文库是通过使用与SA报道子mRNA上的RT位点结合的逆转录引物对SA报道子进行逆转录而创建的。RT位点被设计成还携带TruSeq接头序列，使得最终文库的读序1将是GFP的3’端。通过标记随机插入读序2测序衔接子。通过读序1匹配GFP的3’端来过滤读序。然后使用BWA将读序2和与SD和SA报道子连结的整个转录组参考比对。通过将映射到SD报道子的读序的数目除以与转录组(包括SD报道子)比对但不与SA报道子比对的总读序数来计算中靶分数(绘制)(图3B)。

实施例3-测量中靶反式剪接的RNAsea文库的生成

分析由SA报道子的RT生成的RNAseq文库的读序2的映射位置。正如预期的那样，读序2显示与SD报道子的外显子区域的高度映射，证明了反式剪接。相反，只有1个读序映射到MMP9内含子和MMP9外显子2，其可能来自索引跳跃或嵌合事件(图4A)。

为了验证SD报道子的顺式剪接，通过poly(A)尾的逆转录生成RNAseq文库。正如预期的那样，观察到顺式剪接，因为内含子区域(MMP内含子1)的读序数较低，而外显子区域(BFP-2A-5′GFP和MMP9外显子2)的读序数较高(图4B)。

为了更好地理解CRISPR介导的反式剪接的gRNA设计限制，设计了数种gRNA以靶向SD报道子的不同区域。gRNAS-1至4靶向SA位点，而gRNA 5和6靶向内含子。gRNA 7和8靶向MMP9外显子2，而gRNA 9和10靶向bGHpA。gRNA 11和12靶向第一个外显子中的BFP(图5)。

通过使用截断GFP反式剪接报道子测定来测量靶向反式剪接。对转染的细胞进行流式细胞术，每种条件有3个生物学重复。当使用靶向剪接受体位点的gRNA时，CRISPR介导的反式剪接用设计以靶向剪接受体位点的gRNA将反式剪接效率提高约50倍。在这种情况下，最有效的gRNA(gRNA 4)具有映射到剪接受体位点的3’指导。正如预期的那样，将CRISPR系统靶向SD报道子的替代区域导致反式剪接效率的边际收益(图6A)。

当排除dCas13b-MS2时，靶向反式剪接的倍数提高是微不足道的，如通过截断GFP反式剪接报道子测定测量的(图6B)。对转染细胞进行流式细胞术，每种条件有三个生物学重复。

实施例4-通过小分子诱导的反式剪接

为了测试反式剪接dCas13b复合体是否可以被修饰以用小分子诱导反式剪接，dCas13b与ABI1融合并且MS2与PYL1融合，二者都通过甘氨酸-丝氨酸接头进行(图8A)。假设在这种结构下反式剪接可通过引入脱落酸(ABA)瞬时诱导，因为该机制在ABA存在下组装。由单表达盒递送的构建体是CMV-dPspCas13b-ABI1-2A-PYL1-MS2。利用分裂GFP报道子通过流式细胞术经由GFP测量测定反式剪接活性。

使用如上所述的构建体，分裂GFP报道子在1.5mM ABA存在下进行反式剪接，其导致＞40％的细胞为GFP+(图8B)。使用Lipofectamine 2000按照制造商的说明转染HEK293FT细胞，在转染之后72小时进行流式细胞术。横跨多个样品滴定ABA，并通过流式细胞术测量每个ABA浓度的3个生物学重复。为了证明ABA可以控制诱导的靶向反式剪接，在ABA存在下分裂GFP报道子进行反式剪接，并且GFP翻译的倍数变化受ABA浓度严格控制(图8C)。

实施例5-测量在剪接点处的反式剪接

为了测量外显子连接点，对用dCas13b-MS2、gRNA和分裂GFP报道子系统(SD报道子、具有2x ms2的SA报道子)转染的293FT细胞进行全长RNAseq。通过流式细胞术针对BFP+和mCherry+对细胞进行设门，以分别验证剪接供体(SD)和剪接受体(SA)报道子二者的表达，然后分选到TCL缓冲液中以在构建RNAseq文库之前裂解细胞。使用正则表达式过滤横跨所有可能连接点的RNAseq读序，随后映射到所有可能的连接序列，即反式剪接连接点(TS)、顺式剪接连接点(CS)和非剪接连接点(NS)。绘制映射位置以示出横跨可能连接点的读序(图9A)。

使用正则表达式过滤横跨所有可能连接点的全长RNAseq读序，并随后映射到所有可能的连接序列，即反式剪接连接点(TS)、顺式剪接连接点(CS)和非剪接连接点(NS)。对于所有转染条件，计算并绘制了被反式剪接的剪接读序的分数(图9B)。使用正则表达式过滤横跨所有可能连接点的全长RNAseq读序，并随后映射到所有可能的连接序列，即TS、CS和NS，如上。对于所有转染条件，计算并绘制顺式剪接的剪接读序的分数(图9C)。结果显示报道子进行有效剪接以及dCas13在靶向gRNA存在下抑制顺式剪接。

实施例6-用于靶向反式剪接的策略

图10A示出了用于反式剪接的5’靶向的策略。对于这种策略，dCas13b-MS2或类似物可以靶向剪接供体(SD)，同时为RNA的5’校正或修饰提供5’修复模板。这种策略当校正或修饰接近mRNA的5′端时可以是有利的。图10B示出了内部靶向反式剪接策略。dCas13b-MS2或类似物可以靶向剪接受体和剪接供体二者，同时提供具有外显子或一组外显子、具有剪接受体和剪接供体二者的修复模板。图10C示出了反式剪接的3’靶向的策略。对于这种策略，可以提供3’修复模板用于RNA的3’校正或修饰，以及dCas13b-MS2或类似物靶向剪接受体(SA)。这种策略当校正或修饰接近mRNA的3’端时可以是有利的。

实施例7-内部外显子修复

图11A示出了用于内部外显子修复的构建体。使用标准gRNA构建体以及CMV-dPspCas13b-MS2来测试用CRISPR介导的反式剪接是否可进行内部外显子修复。GFP被分成三个外显子，并且GFP外显子1和3用于靶RNA分子设计。为了模拟致病性外显子，将MMP9外显子2放置在靶分子上的GFP外显子1和3以及相应的侧翼内含子：MMP9内含子1和MMP9内含子2之间。内部修复模板设计为使GFP外显子2侧翼有两个合成内含子，每个都有ms2发夹。

图11B示出了用于监测内部外显子修复的测定。通过蓝色荧光蛋白(BFP)的表达监测靶转录物。表达靶转录物的细胞是GFP阴性，因为GFP的中间外显子(GFP外显子2)从转录物中缺失。在内部外显子修复之后，来自修复模板的GFP外显子2被反式剪接以产生完整的GFP mRNA，而BFP部分通过T2A自切割肽丢失。GFP mRNA的存在导致GFP蛋白的翻译和表达，其可以通过流式细胞术进行测量。

图11C是内部外显子修复之后GFP表达的读出。使用lipofectamine 2000按照制造商的说明转染293FT细胞，并以96孔格式(每孔100ng)转染细胞，每种条件下进行4次生物学重复。在转染之后48小时进行流式细胞术。设计了数种靶向剪接供体(SD)的gRNA(SD靶向gRNA 1至5)，并与靶向剪接受体(SA)的gRNA一起递送。在没有gRNA的情况下，没有检测到GFP+细胞。然而，在引入gRNA之后，检测到GFP+细胞，并且GFP+细胞的分数根据gRNA相对于剪接供体的位置而变化。

实施例8-Cas13直向同源物的使用

为了测试Cas13d是否也能导致CRISPR介导的反式剪接，dRfxCas13d以dPspCas13b为基准。为RfxCas13d设计了四种指导物，其全部都靶向靶报道子中的剪接受体位点。MS2在两种不同的Cas13d架构中融合到N端和C端。使用lipofectamine 2000按照制造商的说明转染293FT细胞，并以96孔格式(每孔100ng)转染细胞，每种条件下进行3次生物重复。在转染之后48小时进行流式细胞术，并在BFP和mCherry上对细胞进行设门，以仅考虑具有靶标和修复模板报道子二者的细胞。BFP+mCherry+细胞在GFP上设门以确定反式剪接频率。在RfxCas13d系统中观察到轻微的反式剪接，其性能远远优于PspCas13b系统(图12)。

实施例9-CRISPR反式剪接系统的基于AAV的递送

为了测试是否可以使用基于AAV的多载体方法递送CRISPR系统，将单个组分克隆到具有AAV2 ITR的构建体中以能够进行AAV包装。通过PEI将每个转移载体与Rep2/Cap8(pAAV2/8)和AAV辅助质粒(pAdDeltaF6)以3∶5∶6的比率以每150mm皿30μg DNA共转染，在293FT细胞中产生AAV2/8。在转染之后24小时更换培养基，在转染之后72小时收集上清液。然后用0.45μm醋酸纤维素过滤器过滤上清液，并通过使用100kDa MWCO amicon过滤器在4C以4000rcf浓缩AAV 30分钟。然后在96孔板中使用每孔3μL AAV以悬液转导293FT细胞，每种条件有四个生物学重复。在AAV转导之后72小时进行流式细胞术以测量CRISPR介导的反式剪接。细胞在BFP和mCherry上进行设门，以仅考虑具有靶标和修复模板报道子二者的细胞。BFP+mCherry+细胞在GFP上设门以确定反式剪接频率。如通过流式细胞术中GFP+荧光测量的，通过多载体AAV方法递送CRISPR系统显示反式剪接显著提高(图13)。

Claims

1.靶向反式剪接系统，其包含：

靶向核酸的CRISPR/Cas系统；

指导核酸；

特异性RNA结合结构域；以及

修复模板，其包含剪接供体和/或剪接受体以及在生理条件下与所述特异性RNA结合结构域杂交的RNA序列。

2.权利要求1所述的靶向反式剪接系统，其中所述指导核酸是指导RNA。

3.权利要求1所述的靶向反式剪接系统，其中所述指导核酸是指导DNA。

4.权利要求1至3中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统包含一个指导核酸。

5.权利要求1至3中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统包含多于一个的指导核酸。

6.权利要求5所述的靶向反式剪接系统，其中所述指导核酸识别多个靶标。

7.权利要求1至6中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述指导核酸靶向剪接受体(SA)位点。

8.权利要求1至6中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述指导核酸靶向剪接供体(SD)位点。

9.权利要求1至8中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述指导核酸靶向剪接位点附近的区域。

10.权利要求1至9中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述指导核酸靶向在剪接位点的200个核苷酸内的区域。

11.权利要求1至10中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述指导核酸靶向距离剪接位点小于或等于100个核苷酸的区域。

12.权利要求1至11中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述多于一个的指导核酸靶向一个目的核酸。

13.权利要求1至11中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述多于一个的指导核酸靶向多个目的核酸。

14.权利要求1所述的靶向反式剪接系统，其中所述CRISPR/Cas系统包含Cas13多肽。

15.权利要求14所述的靶向反式剪接系统，其中所述Cas13是核酸酶失活的Cas13多肽(dCas13)。

16.权利要求14所述的靶向反式剪接系统，其中所述Cas13是核酸酶活性Cas13多肽。

17.权利要求1至16中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述特异性RNA结合结构域包含病毒蛋白。

18.权利要求17所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白是MS2结合蛋白。

19.权利要求17所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白是λN蛋白。

20.权利要求17所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白是PP7衣壳蛋白。

21.权利要求17所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白是Qβ衣壳蛋白。

22.权利要求17至21中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白与所述CRISPR/Cas系统共价结合。

23.权利要求17至21中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白不与所述CRISPR/Cas系统共价结合。

24.权利要求17至21中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白和所述CRISPR/Cas系统是融合蛋白。

25.权利要求1至24中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统包含一个修复模板。

26.权利要求1至24中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统包含多于一个的修复模板。

27.权利要求25或26所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板作为DNA引入。

28.权利要求25或26所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板作为RNA递送。

29.权利要求25至28中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板作为RNA表达。

30.权利要求25至29中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含剪接受体。

31.权利要求25至29中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含剪接供体。

32.权利要求25至31中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含一个或更多个剪接位点。

33.权利要求25至32中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含外显子。

34.权利要求25至33中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含多于一个的外显子。

35.权利要求25至34中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含内含子。

36.权利要求25至35中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含多于一个的内含子。

37.权利要求25至36中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含一个或多个与目的靶核酸杂交的序列。

38.权利要求25至37中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板的至少一部分包含与MS2结合蛋白特异性结合的ms2发夹。

39.权利要求25至37中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含与λN蛋白特异性结合的boxB发夹。

40.权利要求25至37中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含与PP7衣壳蛋白特异性结合的PP7发夹。

41.权利要求25至37中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板包含与Qβ衣壳蛋白特异性结合的Qβ发夹。

42.权利要求1至41中任一项所述的靶向反式剪接系统，其还包含细胞。

43.权利要求42所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分被引入到所述细胞中。

44.权利要求42或43中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分的表达和/或活性是瞬时的。

45.权利要求44所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分的活性由小分子调节。

46.权利要求45所述的靶向反式剪接系统，其中所述小分子选自脱落酸(ABA)、雷帕霉素(或雷帕霉素类似物)、FK506、环孢素A、FK1012、赤霉素3-AM、FKCsA、AP1903/AP和生长素。

47.权利要求43至46中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述至少一部分是Cas13蛋白。

48.权利要求47所述的靶向反式剪接系统，其中所述Cas13蛋白还包含小分子结合结构域。

49.权利要求48所述的靶向反式剪接系统，其中所述Cas13蛋白和所述小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。

50.权利要求45至49所述的靶向反式剪接系统，其中所述小分子结合结构域是ABA结合结构域。

51.权利要求50所述的靶向反式剪接系统，其中所述ABA结合结构域包含ABI1多肽。

52.权利要求45所述的靶向反式剪接系统，其还包含病毒蛋白。

53.权利要求52所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白还包含小分子结合结构域。

54.权利要求52或53所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白和所述小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。

55.权利要求53或54所述的靶向反式剪接系统，其中所述小分子结合结构域是ABA结合结构域。

56.权利要求55所述的靶向反式剪接系统，其中所述ABA结合结构域包含PYL1多肽。

57.权利要求56所述的靶向反式剪接系统，其中ABA的添加诱导靶前体mRNA的靶向反式剪接。

58.权利要求42至57中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分向所述细胞的递送是病毒的。

59.权利要求58所述的靶向反式剪接系统，其中病毒是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、指环病毒或杆状病毒。

60.权利要求42至57所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分向细胞的递送是非病毒的。

61.权利要求60所述的靶向反式剪接系统，其中非病毒递送系统选自阳离子脂质载剂、电穿孔、磷酸钙转染、机械转染和纳米粒递送。

62.权利要求1至61中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述CRISPR/Cas系统靶向核酸。

63.权利要求62所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸是RNA。

64.权利要求62所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸是DNA。

65.权利要求1至64中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述CRISPR/Cas系统与细胞中RNA缔合。

66.权利要求65所述的靶向反式剪接系统，其中所述RNA是前体mRNA。

67.权利要求1至64中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述CRISPR/Cas系统与细胞中DNA缔合。

68.权利要求1至64中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述CRISPR/Cas系统不与细胞中DNA缔合。

69.权利要求1至68中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述CRISPR/Cas系统介导细胞的核中前体mRNA的反式剪接。

70.权利要求1至69中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述CRISPR/Cas系统介导细胞的胞质中前体mRNA的反式剪接。

71.权利要求1至70中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接发生在分裂细胞中。

72.权利要求1至70中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接发生在有丝分裂后细胞中。

73.权利要求72所述的靶向反式剪接系统，其中有丝分裂后细胞是神经元、肌细胞或脂肪细胞。

74.权利要求1至73中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分的表达是诱导型的。

75.权利要求1至73中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分的活性是诱导型的。

76.介导细胞中前体mRNA上的靶向反式剪接事件的方法，所述方法包括将靶向反式剪接CRISPR/Cas系统的至少一部分引入到所述细胞中，其中所述CRISPR/Cas系统包含：

靶向核酸的CRISPR/Cas系统；

与目的核酸基因座特异性杂交的指导核酸；

特异性RNA结合结构域；以及

77.权利要求76所述的方法，其中所述指导核酸包含RNA。

78.权利要求76所述的方法，其中所述指导核酸包含DNA。

79.权利要求76所述的方法，其中将单个指导核酸引入到所述细胞中。

80.权利要求76所述的方法，其中将多个指导核酸引入到所述细胞中。

81.权利要求80所述的方法，其中所述多个指导核酸靶向一个目的核酸。

82.权利要求81所述的方法，其中所述多个指导核酸靶向多于一个的目的核酸。

83.权利要求76至82中任一项所述的方法，其中所述指导核酸靶向剪接受体(SA)位点。

84.权利要求76至82中任一项所述的方法，其中所述指导核酸靶向剪接供体(SD)位点。

85.权利要求76至84中任一项所述的方法，其中所述指导核酸靶向剪接位点附近的区域。

86.权利要求76至85中任一项所述的方法，其中所述指导核酸靶向在剪接位点的200个核苷酸内的区域。

87.权利要求76至86中任一项所述的方法，其中所述指导核酸靶向在剪接位点的小于或等于100个核苷酸的区域。

88.权利要求76所述的方法，其中将多个指导核酸递送至多个细胞。

89.权利要求76所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统包含Cas13多肽。

90.权利要求89所述的方法，其中所述Cas13多肽是Cas13b多肽。

91.权利要求90所述的方法，其中所述Cas13b多肽是核酸酶失活的Cas13b(dCas13b)。

92.权利要求90所述的方法，其中所述Cas13b多肽是核酸酶活性Cas13b。

93.权利要求76至92所述的方法，其中所述特异性RNA结合结构域包含病毒蛋白。

94.权利要求93所述的方法，其中所述病毒蛋白是MS2结合蛋白。

95.权利要求93所述的方法，其中所述病毒蛋白是λN蛋白。

96.权利要求93所述的方法，其中所述病毒蛋白是PP7衣壳蛋白。

97.权利要求93所述的方法，其中所述病毒蛋白是Qβ衣壳蛋白。

98.权利要求93至97中任一项所述的方法，其中所述病毒蛋白与所述CRISPR/Cas系统共价结合。

99.权利要求93至97中任一项所述的方法，其中所述病毒蛋白不与所述CRISPR/Cas系统共价结合。

100.权利要求93至97中任一项所述的方法，其中所述病毒蛋白和所述CRISPR/Cas系统是融合蛋白。

101.权利要求76所述的方法，其中所述反式剪接系统包含一个剪接受体修复模板。

102.权利要求76所述的方法，其中所述反式剪接系统包含多于一个的剪接受体修复模板。

103.权利要求76所述的方法，其中所述反式剪接系统包含一个剪接供体修复模板。

104.权利要求76所述的方法，其中所述反式剪接系统包含多于一个的剪接供体修复模板。

105.权利要求101至104中任一项所述的方法，其中所述修复模板包含与MS2结合蛋白特异性结合的ms2发夹。

106.权利要求101至104中任一项所述的方法，其中所述修复模板包含与λN蛋白特异性结合的boxB发夹。

107.权利要求101至104中任一项所述的方法，其中所述修复模板包含与PP7衣壳蛋白特异性结合的PP7发夹。

108.权利要求101至104中任一项所述的方法，其中所述修复模板包含与Qβ衣壳蛋白特异性结合的Qβ发夹。

109.权利要求76至108中任一项所述的方法，其中所述反式剪接系统的至少一部分的表达是瞬时的。

110.权利要求76至108中任一项所述的方法，其中所述反式剪接系统的至少一部分的活性是瞬时的。

111.权利要求109或110所述的方法，其中所述反式剪接系统的至少一部分的活性由小分子调节。

112.权利要求111所述的方法，其中所述小分子选自脱落酸(ABA)、雷帕霉素(或雷帕霉素类似物)、FK506、环孢素A、FK1012、赤霉素3-AM、FKCsA、AP1903/AP20187和生长素。

113.权利要求112所述的方法，其中所述反式剪接系统的至少一部分包含Cas13多肽。

114.权利要求113所述的方法，其中所述Cas13多肽还包含小分子结合结构域。

115.权利要求114所述的方法，其中所述Cas13多肽和所述小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。

116.权利要求114或115所述的方法，其中所述小分子结合结构域是ABA结合结构域。

117.权利要求116所述的方法，其中所述ABA结合结构域包含ABI1多肽。

118.权利要求111所述的方法，其还包括病毒蛋白。

119.权利要求118所述的方法，其中所述病毒蛋白还包含小分子结合结构域。

120.权利要求119所述的方法，其中所述病毒蛋白和所述小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。

121.权利要求119或120所述的方法，其中所述小分子结合结构域是ABA结合结构域。

122.权利要求121所述的方法，其中所述ABA结合结构域包含PYL1多肽。

123.权利要求122所述的方法，其中ABA的添加诱导靶前体mRNA的靶向反式剪接。

124.权利要求76至123中任一项所述的方法，其中所述反式剪接系统的至少一部分向细胞的递送是病毒的。

125.权利要求124所述的方法，其中病毒是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、指环病毒或杆状病毒。

126.权利要求76至122中任一项所述的方法，其中所述反式剪接系统的至少一部分向细胞的递送是非病毒的。

127.权利要求126所述的方法，其中非病毒递送系统选自阳离子脂质载剂、电穿孔、磷酸钙转染、机械转染和纳米粒递送。

128.权利要求76至127中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统与所述细胞中的RNA缔合。

129.权利要求128所述的方法，其中所述RNA是前体mRNA。

130.权利要求76至129中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统与所述细胞中的DNA缔合。

131.权利要求76至129中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统不与所述细胞中的DNA缔合。

132.权利要求76至129所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统介导所述细胞的核中前体mRNA的反式剪接。

133.权利要求76至129所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统介导所述细胞的胞质中前体mRNA的反式剪接。

134.权利要求132或133所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在内含子-外显子连接处的反式剪接。

135.权利要求132或133所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在外显子-内含子连接处的反式剪接。

136.权利要求76至135中任一项所述的方法，其中剪接修复模板不包含剪接受体。

137.权利要求76至135中任一项所述的方法，其中剪接修复模板不包含剪接供体。

138.权利要求76至135中任一项所述的方法，其中剪接修复模板包含剪接受体和剪接供体二者。

139.权利要求76至138中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在所述前体mRNA的5’端的反式剪接。

140.权利要求76至138中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在所述前体mRNA的3’端的反式剪接。

141.权利要求76至138中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在前体mRNA中内部位点处的反式剪接。

142.权利要求76至138中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在3’非翻译区(UTR)中的反式剪接。

143.权利要求76至138中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas系统介导前体mRNA在5’非翻译区(UTR)中的反式剪接。

144.权利要求76至143中任一项所述的方法，其中所述细胞是分裂细胞。

145.权利要求76至143中任一项所述的方法，其中所述细胞是有丝分裂后细胞。

146.权利要求145所述的方法，其中所述有丝分裂后细胞选自神经元、肌细胞和脂肪细胞。

147.权利要求76至146中任一项所述的方法，其中所述反式剪接系统的至少一部分的表达是诱导型的。

148.权利要求76至146中任一项所述的方法，其中所述反式剪接系统的至少一部分的活性是诱导型的。

149.权利要求144至146中任一项所述的方法，其中所述细胞是患有疾病或病症的对象中的。

150.权利要求149所述的方法，其中所述疾病或病症是神经退行性的、神经性的或者神经肌肉的疾病或病症。

151.权利要求150所述的方法，其中所述神经退行性的、神经性的或者神经肌肉的疾病或病症选自脊髓性肌萎缩、雷特综合征、安格尔曼综合征、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、额颞痴呆、溶酶体贮积病、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化(ALS)。

152.靶向反式剪接系统，其包含：

核酸结合蛋白结构域；

特异性RNA结合结构域；以及

修复模板，其包含剪接供体和/或剪接受体以及在严格条件下与所述特异性RNA结合结构域杂交的RNA序列。

153.权利要求152所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域靶向剪接受体(SA)位点。

154.权利要求152所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域靶向剪接供体(SD)位点。

155.权利要求152至154中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述特异性RNA结合结构域包含病毒蛋白。

156.权利要求155所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白是MS2结合蛋白。

157.权利要求155所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白是λN蛋白。

158.权利要求155所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白是PP7衣壳蛋白。

159.权利要求155所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白是Qβ衣壳蛋白。

160.权利要求155至159中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白与所述核酸结合蛋白结构域共价结合。

161.权利要求155至159中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白不与所述核酸结合蛋白结构域共价结合。

162.权利要求155至159中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白和所述核酸结合蛋白结构域是融合蛋白。

163.权利要求152所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统包含一个剪接受体修复模板。

164.权利要求152所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统包含多于一个的剪接受体修复模板。

165.权利要求152所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统包含一个剪接供体修复模板。

166.权利要求152所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统包含多于一个的剪接供体修复模板。

167.权利要求152所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统包含含有剪接供体和/或剪接受体的修复模板。

168.权利要求163至167所述的靶向反式剪接系统，其中所述修复模板的至少一部分包含与MS2结合蛋白特异性结合的ms2发夹。

169.权利要求163至167所述的靶向反式剪接系统，其中剪接修复模板包含与λN蛋白特异性结合的boxB发夹。

170.权利要求163至167所述的靶向反式剪接系统，其中剪接修复模板包含与PP7衣壳蛋白特异性结合的PP7发夹。

171.权利要求163至167所述的靶向反式剪接系统，其中剪接修复模板包含与Qβ衣壳蛋白特异性结合的Qβ发夹。

172.权利要求152至171中任一项所述的靶向反式剪接系统，其还包含细胞。

173.权利要求172所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分被引入到所述细胞中。

174.权利要求172或173中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分的表达和/或活性是瞬时的。

175.权利要求174所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分的活性由小分子调节。

176.权利要求175所述的靶向反式剪接系统，其中所述小分子选自脱落酸(ABA)、雷帕霉素(或雷帕霉素类似物)、FK506、环孢素A、FK1012、赤霉素3-AM、FKCsA、AP1903/AP20187和生长素。

177.权利要求174所述的靶向反式剪接系统，其中至少一部分是所述核酸结合蛋白结构域。

178.权利要求177所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域还包含小分子结合结构域。

179.权利要求178所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域和所述小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。

180.权利要求178或179所述的靶向反式剪接系统，其中所述小分子结合结构域是ABA结合结构域。

181.权利要求180所述的靶向反式剪接系统，其中所述ABA结合结构域包含ABI1多肽。

182.权利要求174所述的靶向反式剪接系统，其中至少一部分是病毒蛋白。

183.权利要求182所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白还包含小分子结合结构域。

184.权利要求182或183所述的靶向反式剪接系统，其中所述病毒蛋白和所述小分子结合结构域通过甘氨酸-丝氨酸接头连接。

185.权利要求184所述的靶向反式剪接系统，其中所述小分子结合结构域是ABA结合结构域。

186.权利要求185所述的靶向反式剪接系统，其中所述ABA结合结构域包含PYL1多肽。

187.权利要求186所述的靶向反式剪接系统，其中ABA的添加诱导靶前体mRNA的靶向反式剪接。

188.权利要求172至187中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分向所述细胞的递送是病毒的。

189.权利要求188所述的靶向反式剪接系统，其中病毒是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、指环病毒或杆状病毒。

190.权利要求172至187中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分向细胞的递送是非病毒的。

191.权利要求190所述的靶向反式剪接系统，其中非病毒递送系统选自阳离子脂质载剂、电穿孔、磷酸钙转染、机械转染和纳米粒递送。

192.权利要求152至191中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域靶向DNA。

193.权利要求152至191中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域靶向RNA。

194.权利要求152至193中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域与细胞中RNA缔合。

195.权利要求194所述的靶向反式剪接系统，其中所述RNA是前体mRNA。

196.权利要求152至192中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域与细胞中DNA缔合。

197.权利要求152至192中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域不与细胞中DNA缔合。

198.权利要求152至197中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述系统介导细胞的核中前体mRNA的反式剪接。

199.权利要求152至197中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述系统介导细胞的胞质中前体mRNA的反式剪接。

200.权利要求198或199所述的靶向反式剪接系统，其中所述系统介导前体mRNA在内含子-外显子连接处的反式剪接。

201.权利要求198或199所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域介导前体mRNA在外显子-内含子连接处的反式剪接。

202.权利要求152至201中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中剪接修复模板不包含剪接供体。

203.权利要求152至201中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中剪接修复模板不包含剪接受体。

204.权利要求152至201中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中剪接修复模板包含剪接受体和剪接供体二者。

205.权利要求152至204中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述系统包含多个剪接模板。

206.权利要求152至205中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述多个剪接模板包含含有剪接受体的剪接修复模板和含有剪接供体的剪接修复模板。

207.权利要求206所述的靶向反式剪接系统，其中多个剪接修复模板中的至少一些包含剪接受体和剪接供体。

208.权利要求152至207中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述系统介导前体mRNA在所述前体mRNA的5’端的反式剪接。

209.权利要求152至207中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述系统介导前体mRNA在所述前体mRNA的3’端的反式剪接。

210.权利要求152至207中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述系统介导前体mRNA在前体mRNA中内部位点处的反式剪接。

211.权利要求152至210中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述系统替换靶mRNA的5’或3’端。

212.权利要求208至211中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述靶mRNA是前体mRNA。

213.权利要求152至212中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述系统包括替换所述靶mRNA的一个或更多个外显子，不包括所述靶mRNA的第一个和最后一个外显子。

214.权利要求152至213中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域介导前体mRNA在3’非翻译区(UTR)中的反式剪接。

215.权利要求152至213中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域介导前体mRNA在5’非翻译区(UTR)中的反式剪接。

216.权利要求152至215中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接发生在分裂细胞中。

217.权利要求152至215中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接发生在有丝分裂后细胞中。

218.权利要求217所述的靶向反式剪接系统，其中所述有丝分裂后细胞是神经元、肌细胞或脂肪细胞。

219.权利要求152至218中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分的表达是诱导型的。

220.权利要求152至218中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述反式剪接系统的至少一部分的活性是诱导型的。

221.权利要求152至220中任一项所述的靶向反式剪接系统，其中所述核酸结合蛋白结构域是来自锌指核酸酶(ZFN)或Pumby模块的结构域，或者是RNA识别基序。