CN114989301A

CN114989301A - 一种人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段及其应用

Info

Publication number: CN114989301A
Application number: CN202210411800.7A
Authority: CN
Inventors: 张慧君; 杜勇; 陈太标
Original assignee: Jiangsu Fenghua Biological Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Fenghua Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-04-19
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2022-09-02

Abstract

本发明涉及一种人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段，其由小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的重链和轻链CDR区与人源IgG抗体Fab片段的框架所组成；通过将编码hGPba的核苷酸序列经合适的重组表达质粒载体转染到CHO细胞后，转染的CHO细胞分泌表达了hGPba蛋白，此hGPba蛋白可以与人GP IIb/IIIa受体特异结合，并能够抑制ADP、胶原蛋白和肾上腺素诱导的血小板聚集效应；也能够抑制血小板对vWF、纤维蛋白原、纤维连接蛋白的粘附作用；且随着抗体浓度的提高，其抑制作用也随着增强，提示这种抑制作用也存在着剂量‑效应关系，可以用于制备与血小板GP IIb/IIIa受体相关性疾病的药物，以治疗与血小板GP IIb/IIIa受体相关性的疾病。

Description

一种人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程重组蛋白质药物技术领域，尤其是涉及一种人源化抗人GPIIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段及其应用。

背景技术

血栓性心脑血管疾病严重危害着人类健康。在血栓形成过程中，血小板聚集发挥了关键作用，如动脉粥样硬化板块处的血小板聚集和其后的血栓形成是急性心肌梗塞、溶栓后的再次栓塞及血管成形术(Angioplasty)后栓塞的重要原因。

血栓的形成始于血管壁损伤部位血小板的粘附；血小板粘附由血小板表面受体介导，血小板表面受体与暴露内皮下的细胞外基质蛋白(如von Willebrand 因子、胶原、纤维连接蛋白、卵黄连接蛋白和层粘连蛋白)结合；血小板粘附形成单层血小板，随后在肾上腺素(epinephrine)、二磷酸腺苷(ADP)、胶原蛋白(collagen)和凝血酶等激动剂的作用下激发血小板活化。这种活化作用导致血小板表面的糖蛋白IIb/IIIa受体(GP IIb/IIIareceptor)暴露，暴露的GP IIb/IIIa 受体不仅可以与纤维蛋白原结合而介导血小板聚集，而且还可以与其他粘附蛋白(如von Willebrand因子)结合而导致血小板交联和聚集；因此，粘附分子(如纤维蛋白原或von Willebrand因子)与GP IIb/IIIa的结合导致血小板聚集是血栓形成的一个常见步骤，这使得GP IIb/IIIa受体成为药物研发的一个有吸引力的靶点。

GP IIb/IIIa受体(也称为整合素αIIbβ3)是通过GPIIb和GPIII的钙依赖性结合形成的复合物，其存在于血小板表面，作为纤维蛋白原和von Willebrand因子的受体发挥作用，有助于血小板活化而发生交联和聚集。研究发现GP IIb/IIIa 受体的结构在静态血小板中处于无活性状态，不能与其主要配体结合；但经激活后，GP IIb/IIIa受体胞外结构域转变为一种与配体亲和力强的活性形式。

心梗患者通常使用组织型纤溶酶原激活剂(TPA)或链激酶等溶栓剂进行治疗，这些药物可溶解血栓中的纤维蛋白成分；而与纤溶相关的一个主要并发症是因为血小板聚集而引发的再次栓塞，从而导致心脏的进一步损伤。由于GP IIb/IIIa受体能够引发血小板聚集，因此在溶栓治疗过程中使用用于阻断GP IIb/IIIa受体的药物能够减少或防止溶栓治疗后的再次栓塞、并加快溶栓速率，同时这些药物也有望用于治疗其它血管栓塞性疾病。

一篇申请号为205207的欧洲专利公开了一种鼠源的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3：单克隆抗体7E3通过阻断GP IIb/IIIa受体而抑制血小板的聚集，提示其可能用于人血栓性疾病的治疗。但作为一株鼠源的单克隆抗体，单克隆抗体7E3会引发人体的人抗鼠抗体(Human anti-mouse Antibodies,HAMA)反应，从而降低治疗效果和/或引起人体的过敏或超敏反应；而血管栓塞性疾病常常需要重复使用此类治疗药物，这进一步增加了发生HAMA的几率。

为预防HAMA的发生，一篇申请号为US5976532的美国专利公开了一种基于单克隆抗体7E3的人鼠嵌合抗体，它由单克隆抗体7E3的轻链和重链的可变区和人类抗体的恒定区组成。随后这种人鼠嵌合抗体被开发成阿昔单抗 (Abciximab)，阿昔单抗通过结合血小板GP IIb/IIIa受体而抑制血小板聚集。 1994年初，美国食品和药物管理局(FDA)批准了该药的临床使用，主要用于经皮穿刺冠状动脉介入治疗期间及之后，以防止患者的血小板粘连；或心脏缺血并发症并计划在24小时内进行经皮穿刺冠状动脉介入治疗时的药物治疗。

虽然阿昔单抗采用了抗体嵌合技术来预防HAMA的发生，但在大量、长期的临床应用中发现，大约6％的患者在使用阿昔单抗2-4周后产生了抗嵌合抗体 (Human anti-chimeric antibody，HACA)。由于抗嵌合抗体的存在，一方面会引发人体的过敏反应、降低疗效；另一方面，将导致以后不能再重复使用阿昔单抗，甚至引发对其它单克隆抗体药物的过敏反应。

基于此，有必要进一步研发一种安全性高、免疫原性低的GP IIb/IIIa受体抗体药物，来满足临床日益需要的抗血栓治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段及其应用。

为达到本发明之目的，采用如下技术方案：

一种人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段，该单克隆抗体Fab 片段由小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的互补决定区和人源IgG抗体 Fab片段的框架所组成，其能够与人GP IIb/IIIa受体蛋白特异结合。

优选的，所述小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的互补决定区中，其重链CDR区的氨基酸序列由如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.7 所示的氨基酸序列组成。

优选的，所述小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的互补决定区中，其轻链CDR区的氨基酸序列由SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10 所示的氨基酸序列组成。

优选的，该单克隆抗体Fab片段的氨基酸序列由如SEQ ID NO.13的Fd片段氨基酸序列与如EQ ID NO.14所示的轻链氨基酸序列组成。

进一步的，本发明还提供了一种编码上述人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中Fd片段的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID.15所示。

同时还提供了一种编码上述人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中轻链片段的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID.16所示。

此外，本发明还提供了一种重组表达质粒载体，该重组表达质粒载体包含如SEQID.15所示的核苷酸编码序列或如SEQ ID.16所示的核苷酸编码序列。

基于上述重组表达质粒载体，本发明还提供了一种宿主细胞，其包含上述重组表达质粒载体；所述宿主细胞为CHO衍生细胞株。

经研究发现，本发明的人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段能够用于制备人血小板GP IIb/IIIa受体相关疾病药物。

本发明中与抗体相关的名词如下：

抗体：抗体是动物的免疫系统受到外源物(如抗原或细菌、病毒等外源微生物)刺激后，由B细胞产生的一类大分子免疫球蛋白，分为IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 5个亚型，其中IgG是主要亚型。IgG是由两条分子量为25kDa的轻链和两条分子量为50kDa的重链组成的“Y”形状的四聚体。

Fab片段：Fab即抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)，一个完整的IgG抗体分子经木瓜蛋白酶降解后，分解为两个相同的Fab片段和一个Fc 片段。Fab由一个完整的轻链(VL+CL)和1/2重链(VH+CH1)(Fd片段)通过二硫键结合而成。VL和VH共同构成了单价的抗原结合区(paratope)。

轻链可变区：轻链可变区(variable domain，VL)指的是抗体轻链N端1/2 部分，VL包含3个高变区(hypervariable region，HV)和4个框架区(framework， FR)，在蛋白折叠时，这3个高变区形成3个环(loop)，这3个环常被称为轻链的互补决定区。

重链可变区：重链可变区(variable domain，VH)指的是抗体重链N端1/4 部分，VH包含3个高变区(hypervariable region，HV)和4个框架区(framework， FR)，在蛋白折叠时，这3个高变区形成3个环(loop)，这3个环常被称为重链的互补决定区。

人源化抗体：人源化抗体指将CDR区外的氨基酸序列替换为人源抗体的氨基酸序列。人源化抗体保留了亲本非人源单克隆抗体的亲和力和特异性，同时又降低了其异源性，能够显著减轻人体可能产生的人抗鼠抗体(Human anti-mouse antibody，HAMA)反应。

互补决定区：互补决定区(complementarity-determining regions，CDRs) 指的是重链和轻链可变区在蛋白折叠时分别所形成的3个环，因为它们的形状和其相应抗原的形状互补而得名。重链和轻链的6个环共同形成一个抗原结合区，可以结合一个特异的抗原表位(epitope)。

Fd片段：Fd片段即Fab片段内的重链部分，约由220个氨基酸构成，包含重链的可变区和恒定区CH1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段(以下简称hGPba) 是由小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的重链和轻链CDR区与人源IgG 抗体Fab片段的框架所组成；通过将编码hGPba的核苷酸序列经合适的重组表达质粒载体转染到CHO细胞后，转染的CHO细胞分泌表达了hGPba蛋白，此 hGPba蛋白可以与人GP IIb/IIIa受体特异结合，并能够抑制ADP、胶原蛋白和肾上腺素诱导的血小板聚集效应；也能够抑制血小板对vWF、纤维蛋白原、纤维连接蛋白的粘附作用；且随着抗体浓度的提高，其抑制作用也随着增强，提示这种抑制作用也存在着剂量-效应关系，可以用于制备与血小板GP IIb/IIIa受体相关性疾病的药物，以治疗与血小板GP IIb/IIIa受体相关性的疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明的hGPba中Fd片段的编码核苷酸及其氨基酸序列；其中含有预测的3个单克隆抗体7E3重链CDR区及胚系人IgG抗体Fd片段的框架区的氨基酸序列，编码的核苷酸全长为675bp，编码225个氨基酸残基。

图2为本发明的hGPba中轻链的编码核苷酸及其氨基酸序列；其中含有预测的3个单克隆抗体7E3轻链CDR区及胚系人IgG抗体轻链的框架区的氨基酸序列，编码的核苷酸全长为642bp，编码214个氨基酸残基。

图3为本发明的hGPba对ADP诱导的血小板聚集的抑制作用的测试结果图； ADP可有效诱导血小板的聚集，而hGPba、abciximab都能够抑制血小板的聚集，两者的抑制程度无明显差别，并且随着抗体浓度的提高，其抑制作用也随着增强，提示这种抑制作用存在着剂量-效应关系。

图4为本发明的hGPba对胶原蛋白诱导的血小板聚集的抑制作用的测试结果图；胶原蛋白可有效诱导血小板的聚集，而hGPba、abciximab都能够抑制血小板的聚集，两者的抑制程度无明显差别，并且随着抗体浓度的提高，其抑制作用也随着增强，提示这种抑制作用存在着剂量-效应关系。

图5为本发明的hGPba对肾上腺素诱导的血小板聚集的抑制作用的测试结果图；肾上腺素可有效诱导血小板的聚集，而hGPba、abciximab都能够抑制血小板的聚集，两者的抑制程度无明显差别，并且随着抗体浓度的提高，其抑制作用也随着增强，提示这种抑制作用存在着剂量-效应关系。

图6为本发明的hGPba对血小板粘附vW F的抑制作用的测试结果图； hGPba、abciximab都能够抑制血小板对vWF的粘附作用，两者的抑制程度无明显差别，并且随着抗体浓度的提高，其抑制作用也随着增强，提示这种抑制作用也存在着剂量-效应关系。

图7为本发明的hGPba对血小板粘附纤维蛋白原的抑制作用的测试结果图；hGPba、abciximab都能够抑制血小板对纤维蛋白原的粘附作用，两者的抑制程度无明显差别，并且随着抗体浓度的提高，其抑制作用也随着增强，提示这种抑制作用也存在着剂量-效应关系。

图8为本发明的hGPba对血小板粘附纤维连接蛋白的抑制作用的测试结果图；hGPba、abciximab都能够抑制血小板对纤维连接蛋白的粘附作用，两者的抑制程度无明显差别，并且随着抗体浓度的提高，其抑制作用也随着增强，提示这种抑制作用也存在着剂量-效应关系。

具体实施方式

为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。

实施例1：确定小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的氨基酸序列。

小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3是以人血小板为免疫原，免疫 BALB/c小鼠而制备的一株抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体；小鼠抗人GP IIb/IIIa 受体单克隆抗体7E3能够完全阻止由ADP诱发的血小板和纤维蛋白原的结合；但由于天然的小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3抗体来源于小鼠，其异源性使之不能直接应用于人体。而通过人源化处理能够改变其异源性质，为临床应用提供了可能性。

阿昔单抗是由鼠源的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的可变区和人IgG1稳定区/κ链构成的嵌合抗体。因此，阿昔单抗的氨基酸序列中应包含有鼠源的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3重链和轻链的可变区氨基酸序列。

首先，我们从基因库(GenBank)的蛋白质数据库中，搜索阿昔单抗的氨基酸序列。

在GenBank数据库中，我们搜索到阿昔单抗的重链氨基酸序列为6V4P_C (ChainC,Abciximab,heavy chain)；轻链的氨基酸序列为6V4P_D(Chain D, Abciximab,lightchain)。

阿昔单抗的重链氨基酸序列由225个氨基酸残基组成，其序列如下表1或 SEQ IDNO.1所示：

表1：阿昔单抗的重链氨基酸序列

阿昔单抗的轻链氨基酸序列由214个氨基酸残基组成，其序列如下表2或 SEQ IDNO.2所示：

表2：阿昔单抗的轻链氨基酸序列

根据阿昔单抗的氨基酸序列，确定了其中的鼠源重链可变区的氨基酸序列如下表3或SEQ ID NO.3所示，轻链可变区的氨基酸序列如下表4或SEQ ID NO.4所示，此重链可变区和轻链可变区即为鼠源的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的相应片段；这两个氨基酸序列含有重链和轻链各自的3个CDR区，这6个CDR区能够组成一个特异的抗原结合区而特异结合人GP IIb/IIIa受体蛋白。

表3：鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3重链可变区的氨基酸序列

表4：鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3轻链可变区的氨基酸序列

实施例2：鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3重链和轻链互补决定区(CDRs)的氨基酸序列的预测与确定。

目前有多种方法预测人或小鼠抗体的CDR区，为最大限度地保证所确定的 CDR区与GP IIb/IIIa受体的亲和力与特异性，我们共采用了Kabat、IMGT、 Chothia、North和Contac共5种方法来预测鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3重链和轻链的CDR区。

其中，上述5种方法的具体内容可参考其对应的文献。

Kabat：Kabat,E.A.et al.,In:Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, NIH Publication,1991:91-3242。

IMG：Lefranc,M.P.,The IMGT unique numbering for Immunoglobulins,T-cellreceptors,and Ig-like Domains.The Immunologist,1999:7,132-136。

Chothia：Al-Lazikani B et al.,"Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins".Journal of Molecular Biology.1997:273(4):927– 48。

North：North B et al.,A new clustering of antibody CDR loopconformations. Journal of Molecular Biology.2011:406(2):228–56。

Contac：R M MacCallum et al.Antibody-antigen interactions:contactanalysis and binding site topographyJMol Biol.1996Oct 11；262(5):732-45。

基于实施例1中确定的鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的重链可变区氨基酸序列，通过上述5种方法预测的鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体 7E3的重链CDR区氨基酸的位置和序列如下表5所示；其中不同方法预测的 CDR1由5-13个氨基酸组成、CDR2由6-17个氨基酸组成、CDR3由9-11个氨基酸组成；结合各自预测的位置和序列，确定重链3个CDR的最大化序列为： CDR1由第23-36位的14个氨基酸构成，其序列为EASGYTFTNYWMHW(SEQ ID NO.5)；CDR2由第47-66位的20个氨基酸构成，其序列为WIGAIYPGNSDTSYIQKFKG(SEQ ID NO.6)；CDR3由第97-107位的11个氨基酸构成，其序列为TLYDGYYVFAY(SEQ ID NO.7)。

表5：鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的重链CDR区氨基酸的位置和序列

同时，基于实施例1中确定的鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3轻链可变区的氨基酸序列，通过上述5中方法预测的鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3轻链CDR区氨基酸的位置和序列如下表6所示，其中不同方法预测的CDR1由6-11个氨基酸组成、CDR2由3-10个氨基酸组成、CDR3由8-9个氨基酸组成；结合各自预测的位置和序列，确定轻链3个CDR的最大化序列为： CDR1由第24-36位的13个氨基酸构成，其序列为RASRDISNNLHWF(SEQ ID NO.8)；CDR2由第46-56位的11个氨基酸构成，其序列为LLIKYASQSMS(SEQ IDNO.9)；CDR3由第89-97位的9个氨基酸构成，其序列为QQTNSWPYT(SEQ ID NO.10)。

表6：鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3轻链CDR区氨基酸的位置和序列

综上所述，根据5种预测方法所确定的鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体 7E3重链和轻链CDR区的氨基酸序列如下表7所示。

表7：

实施例3：作为框架的人源抗体可变区氨基酸序列的筛选与确定。

分别以上述实施例1中鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3重链和轻链可变区的氨基酸序列作为搜索序列，在IMGT(ImMunoGeneTics，www.imgt.org) 数据库中搜索同源性高的胚系(germline)人抗体可变区氨基酸序列。

表8和表9是以鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3重链可变区氨基酸序列搜索到的5个高同源性胚系人抗体重链可变区的氨基酸序列，其中表8所示的是覆盖氨基端96个氨基酸的序列，同源性为62.5％-65.6％；表9是近羧基端的14个氨基酸序列，同源性为85.7％。选取同源性最高的IGHV1-46*01和 IGHJ4*01作为人源化的框架，其序列与鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3 的同源性比较见表10。

表8:鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的高同源性胚系人抗体重链可变区序列(氨基端)

表9:鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的高同源性胚系人抗体重链可变区序列(羧基端)

表10:鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3重链可变区与胚系人源抗体重链可变区氨基酸序列IGHV1-46*01比较

根据表10的比较结果，确定人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的重链可变区框架如下表11所示。

表11：人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的重链可变区框架

其中的“xxxxxx”将是CDR的移植位置。

表12和表13是以鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3轻链可变区氨基酸序列搜索到的5个高同源性胚系人抗体轻链可变区序列，其中表12所示的是覆盖氨基端的95个氨基酸序列，同源性为62.1％-65.3％；表7是近羧基端的 12个氨基酸序列，同源性为91.7％。选取同源性最高的序列IGKV6-21*02和 IGKJ2*01作为轻链人源化的框架，其与鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3 的同源性比较见表14。

表12:鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的高同源性胚系人抗体轻链可变区序列(氨基端)

表13:鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的高同源性胚系人抗体轻链可变区序列(羧基端)

表14：鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3轻链可变区与胚系人源抗体轻链可变区氨基酸序列比较

根据表14的比较结果，确定人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的轻链可变区框架如下表15所示。

表15：抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的轻链可变区框架

其中的“xxxxxx”将是CDR的移植位置。

实施例4：鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3人源化抗体重链Fd 和轻链的氨基酸序列的构建

CDR移植是指将非人源单克隆抗体可变区中的CDR序列取代人源抗体相应的CDR序列，构成了由非人源抗体的CDR区和人源抗体的框架区所组成的重组抗体。抗体重链和轻链的可变区由CDR区和框架区(FR)组成。其中可变区的6个CDR组成识别和结合抗原的区域，它们直接与抗原接触，决定了抗体的特异性。骨架区是可变区以外的其它部分，主要起着支撑CDR的作用，它们的氨基酸组成和排列相对保守。因此，将非人源单克隆抗体的CDR区移植到人单克隆抗体的骨架区就可以达到人源化的目的。这种人源化抗体保持了非人源单克隆抗体和抗原结合的特异性和亲和力，并最大限度地降低了非人源单抗的异源性。

将上述实施例2所确定的鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的重链和轻链CDR区氨基酸序列分别移植到如表11和表15所示的作为框架的胚系人源抗体可变区相应的位置处，获得人源化抗体可变区的氨基酸序列。

其中，人源化抗体重链可变区氨基酸序列如下表16或SEQ ID NO.11所示，下划线部分为移植入的鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3重链CDR区的氨基酸序列。

表16：人源化抗体重链可变区氨基酸序列

其人源化抗体轻链可变区氨基酸序列如下表17或SEQ ID NO.12所示，下划线部分为移植入的鼠源抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3轻链CDR区的氨基酸序列。

表17：人源化抗体轻链可变区氨基酸序列

将上述人源化抗体重链可变区序列，连接上保守的人IgG抗体重链恒定区1 (CH1)序列，获得人源化的抗人GP IIb/IIIa受体Fd片段的氨基酸序列，具体如下表18或SEQ IDNO.13所示。

表18：人源化抗人GP IIb/IIIa受体Fd片段的氨基酸序列

将上述人源化抗体轻链可变区序列，连接上保守的人IgG抗体轻链恒定区 (CL)序列，获得人源化的抗人GP IIb/IIIa受体轻链的氨基酸序列，具体如下表19或SEQ IDNO.14所示。

表19：人源化的抗人GP IIb/IIIa受体轻链的氨基酸序列

上述人源化的抗人GP IIb/IIIa受体Fd片段和人源化的抗人GP IIb/IIIa受体轻链在基因工程重组表达时，通过各自的半胱氨酸残基形成二硫键而折叠成一个完全的Fab分子，即得到本发明中的人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体 Fab片段—hGPba。

实施例5：人源化的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中Fd片段和轻链编码核苷酸的构建。

在基因工程重组表达由此Fd片段和轻链所构成的Fab分子时，需要根据其氨基酸序列反向推导出各自的核苷酸编码序列。由于核苷酸编码氨基酸的简并性，相同的氨基酸序列可以反向推导出多种组合的核苷酸编码序列。通常的做法是根据所选择的宿主细胞对编码氨基酸的偏性而合成相应的核苷酸序列。

本实施例中选择中国仓鼠细胞(CHO)作为宿主细胞，相应地，根据鼠细胞的氨基酸编码偏性合成相应的核苷酸序列。

人源化的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中Fd片段的核苷酸编码序列如下表20或SEQ ID NO.15所示：

表20：人源化的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中Fd片段的核苷酸编码序列

上述表20中人源化的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中Fd片段的核苷酸编码序列为675bp，编码225个氨基酸残基，包括人源化的抗人GP IIb/IIIa受体重链可变区和CH1区。

人源化的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中轻链的核苷酸编码序列如下表21或SEQ ID NO.16所示。

表21：人源化的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中轻链的核苷酸编码序列

上述表21中人源化的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中轻链的核苷酸编码序列为642bp，编码214个氨基酸残基，包括人源化的抗人GP IIb/IIIa 受体轻链可变区和恒定区。

实施例6：人源化的抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中Fd片段和轻链的重组表达载体的构建。

本实施中载体选用pCDdhfr质粒。pCDdhfr质粒上外源蛋白的启动子为鼠 CMV早期启动子。筛选基因是二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，dhfr) 基因。pCDdhfr重组质粒转染入dhfr缺陷型CHO细胞后，质粒序列可以随机整合到细胞的基因组内。转染的dhfr缺陷型CHO细胞在叶酸合成抑制剂甲氨蝶呤 (methotrexate，MTX)的压力下，整合的质粒需要不断扩增而强化dhfr的表达，从而使串联的重组蛋白基因随之扩增而提高表达量。

操作技术为基因工程重组的常规技术，具体流程如下：

(1)采用基因合成的方式获得分别含有编码抗人GP IIb/IIIa受体Fd片段和轻链基因的重组载体pUCGPII和pUCGPIII。在实施例5中Fd片段和轻链核苷酸编码序列的基础上，作如下构建：⑴为利于目的蛋白的分泌表达，在编码 Fd片段和轻链核苷酸序列的5’端分别添加了信号肽编码序列。Fd片段的信号肽氨基酸序列为MDWTWRVFCLLAVAPGAHS，其核苷酸编码序列为ATG GAT TGG ACC TGG AGG GTC TTT TGT CTT CTG GCA GTG GCC CCC GGTGCT CAC AGC；轻链的信号肽氨基酸序列为MLPSQLIGFLLLWVPASRG，其核苷酸编码序列为ATG TTG CCT TCA CAG CTT ATA GGG TTT CTC CTC CTG TGG GTT CCC GCT TCT CGC GGT；⑵在上述信号肽起始密码子ATG的5’端添加Kozak序列gccacc。⑶在两个基因的3’端添加终止密码子TGA。⑷在两个基因Kozak序列的5’端和终止密码子的3’端分别添加了限制性内切酶EcoR I (gaattc)和NotI(gcggccgc)的识别序列，以利于后续构建重组表达质粒。

(2)对pUCGPII、pUCGPIII和pCDdhfr 3个质粒作EcoR I和NotI双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，并从琼脂糖凝胶中回收酶切后的Fd片段基因(约 760bp)、轻链基因(约720bp)和pCDdhfr(约5.6kb)。

(3)用T4连接酶分别连接pCDdhfr质粒与Fd基因、pCDdhfr质粒与轻链基因。

(4)常规CaCl2转化方法将连接产物转化至大肠杆菌DH5α。用T7(TAATACGACTCACTATAGGG)和T3(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)引物作PCR扩增筛选阳性转化菌株。将阳性菌株分别命名为pCDGPII和 pCDGPIII。

(5)分别提取纯化pCDGPII和pCDGPIII质粒，进行DNA测序确认所插入目的基因的序列。

实施例7：hGPba在CHO细胞的重组表达

hGPba是由本发明中的人源化抗人GP IIb/IIIa受体Fd片段和人源化抗人GP IIb/IIIa受体轻链在宿主细胞内共表达时所自发形成的异源二聚体，两者间经由二硫键连接。本实施方案选用dhrf缺陷型CHO细胞作为重组表达的宿主，按常规细胞转染和稳定细胞株构建技术操作。

(一)pCDGPII和pCDGPIII质粒的共转染

1.在转染的前一天，按5x105/孔接种dhfr缺陷型CHO细胞至6孔细胞培养板。

2.按脂质体Lipofectamine说明书进行转染操作，转染时的细胞密度达到80％融合度(confluent)，每孔的质粒用量为1μg的pCDGPII和2μg的pCDGPIII (比例1:2)。转染后6小时，换成含血清的完全培养基(含10％胎牛血清的IMDM 培养基)，在5％CO2、37℃的条件下培养转染的细胞。

3.转染后48小时，按实施例九中的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，检测细胞培养上清液中分泌表达的hGPba。

结果显示在转染细胞的上清中检测到了能和人GP IIb/IIIa受体蛋白特异结合的hGPba片段，提示共转染的两个质粒在宿主细胞内得到了表达，并分泌至细胞外。

(二)hGPba稳定表达细胞株的构建

1、按有限稀释法将转染的CHO细胞稀释、转移到96孔细胞培养板，数量为1个细胞/每孔。在5％CO2、37℃的条件下继续培养。

2、10天后，显微镜下可以看到生长的单个细胞克隆；ELISA检测每孔内只有一个细胞克隆的培养上清液。

3、将OD450读数高的细胞克隆转移到24孔板，加入终浓度为10-8的MTX，在5％CO2、37℃的条件下继续培养。

4、待细胞长满孔后，按1:5稀释比例转移细胞至新的培养板，相同条件下继续培养。

5、待细胞再次长满孔后，ELISA检测上清液中的hGPba。

6、按步骤4-5，将表达量高的细胞株倍增MTX浓度进行压力筛选，直至表达量不再明显增加。亚克隆高表达细胞株，鉴定后冻存及继续后续试验。

实施例8：CHO细胞重组表达的hGPba的纯化

蛋白L(Protein L)是由大消化链球菌(Peptostreptococcusmagnus)产生的一种结构蛋白，由719个氨基酸构成。蛋白L可以特异结合多种动物抗体的 kappa轻链，因此固相化的蛋白L常被用作纯化抗体Fab片段的介质。

所构建的hGPba稳定表达细胞株，其培养上清液在AKTA系统上经HiTrap 蛋白L纯化柱(HiTrap Protein L column)亲和层析纯化，按说明书操作步骤进行，基本步骤如下：

1、收集2升hGPba表达细胞的培养上清，10000rpm离心30分钟以去除细胞碎片；再用0.22μm滤膜真空抽滤，备用。

2、用结合缓冲液(20mM sodium phosphate,150mM NaCl,pH 7.2)平衡 HiTrap蛋白L纯化柱，直至紫外扫描和导电率平稳。

3、将步骤1的样品上样。

4、用结合缓冲液洗涤HiTrap蛋白L纯化柱，直至紫外扫描和导电率平稳且回到基线。

5、用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白(100mM glycine-HCl,pH 2.5)。

所纯化的蛋白经SDS-PAGE分析，非还原状态下，分子量约为45kD，经还原剂DTT处理后，变成分子量约为25kD的单体，提示所分泌表达的hGPba蛋白结构为二聚体，且两个单体的分子量接近(约25kD)，符合预期结果。

实施例9：hGPba和人GP IIb/IIIa受体蛋白的特异结合试验。

为分析本发明中hGPba与GP IIb/IIIa受体的结合特性，建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测所表达的hGPba蛋白，操作方法为常规的相关技术，基本步骤如下：

1、将GP IIb/IIIa受体蛋白包被在96孔的微孔板上，GP IIb/IIIa受体蛋白的包被浓度为2μg/ml，包被液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液，包被量为100μl/孔，4℃ 过夜后，用含5％脱脂奶粉的PBS缓冲液室温下封闭2小时，再用含吐温-20 (Tween-20)的洗液洗涤微孔3次备用。

2、加入100μl的待检样品(如不同稀释度的hGPba蛋白或细胞培养上清、对照等)，室温下反应2小时，再以洗液洗涤微孔5次。

3、加入100μl的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人Fab抗体(1:2000稀释)，室温下反应2小时，再以洗液洗涤微孔5次。

4、加入100μl的TMB底物，室温下反应15分钟，加入100μl的2M硫酸终止酶促反应。

5、在酶联仪上测定OD450读数。

结果显示，不管是细胞培养上清，还是纯化的hGPba片段，都能与微孔板上的GPIIb/IIIa受体蛋白特异结合。随液相中hGPba浓度的增高，结合反应的酶促信号也随之增强，表明hGPba与GP IIb/IIIa受体蛋白的结合有浓度-效应反应关系。作为对照的正常人IgG抗体Fab片段和包被的GP IIb/IIIa受体蛋白无明显反应。

实施例10：血小板凝集抑制试验。

血小板经二磷酸腺苷(ADP)、肾上腺素(epinephrine)和胶原蛋白(collagen) 等刺激因子诱导后，血小板膜糖蛋白经纤维蛋白原介导而发生相互聚集，形成血小板栓塞。而阿昔单抗可以阻断GP IIb/IIIa受体抑制血小板的凝集，达到防止血小板栓塞形成的目的。

为验证本发明的人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段仍然具有抗血小板聚集效应，我们设计了血小板凝集抑制试验：

血小板的制备：

取健康志愿者的抗凝血100ml，室温下200g离心8分钟。转移上层血浆至一新离心管内，室温下1000g离心10分钟，吸去上层血浆，留底层约5ml的血小板富集血浆(PRP)。

上述PRP中加入5ml的Tyrode’s-Hepes缓冲液(3.8mM Hepes,137mM NaCl, 2.7mMKCl,2.9mM NaH2PO4,5.6mM葡萄糖，pH6.7)和10单位的马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶(potato Apyrase)，37℃孵育10分钟，室温下1000g离心15 分钟，吸去上清。

用5ml的Tyrod’s-Hepes缓冲液(pH7.4)重悬血小板沉淀，备用。

在样品管内加入400μl的血小板(3x105/μl)和50μl不同浓度的的待测抗体(hGPba、abciximab)，37℃孵育10分钟；

每个样品管内分别加入50μl的ADP(20μM)、或胶原蛋白(0.2mg/ml)、或肾上腺素(10μM)作为血小板聚集的诱导剂，在血小板聚集仪上测定其浊度。计算加入抗体和未加抗体浊度的百分比作为凝集效应。

结果显示，ADP、胶原蛋白和肾上腺素均可有效诱导血小板的聚集，而hGPba、abciximab都能够抑制血小板的聚集，两者的抑制程度无明显差别，并且随着抗体浓度的提高，其抑制作用也随着增强，提示这种抑制作用存在着剂量-效应关系(如图3、图4、图5所示)。

实施例11：血小板粘附抑制试验。

在生理或病理情况下，血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)和血管壁破裂后暴露的胶原纤维等蛋白同时结合血小板，使血小板粘附性增高；大量血小板以vWF为中介，粘附在胶原纤维上，易于形成血栓。

为验证本发明的人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段保留了抑制血小板粘附的活性，我们设计了血小板粘附抑制试验：

用PBS缓冲液配制vWF、纤维蛋白原(fibrinogen)、纤维连接蛋白(fibronectin)和牛血清白蛋白(BSA，阴性对照)，终浓度为10μg/ml。在96孔板的每孔分别加入100μl的上述蛋白溶液，4℃孵育过夜。

倒掉蛋白溶液，每孔加入120μl的3％BSA(20mM Tris–HCl，pH 8.0， 150mM NaCl)，37℃封闭1小时，倒掉封闭溶液，备用。

每孔加入100μl不同浓度的抗体溶液(20mM Tris–HCl，pH 8.0，150mM NaCl)和2x104制备的血小板，37℃孵育1小时。

倒掉抗体溶液和血小板，用洗液(20mM Tris–HCl pH 8.0，150mM NaCl， 0.05％Tween 20)洗微孔板3次。

每孔加入100μl的4mg/ml磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenylphosphate，PNPP)， 37℃孵育1小时。

每孔加入50μl的1N NaOH终止反应。读取A405吸光度。

结果显示，hGPba、abciximab都能够抑制血小板对vWF、纤维蛋白原、纤维连接蛋白的粘附作用，两者的抑制程度无明显差别，并且随着抗体浓度的提高，其抑制作用也随着增强，提示这种抑制作用也存在着剂量-效应关系(如图 6、图7、图8所示)。

所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。

序列表

<110> 江苏丰华生物制药有限公司

<120> 一种人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 225

<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Ile Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Thr Ser Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Leu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His

225

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Phe Gln Gln Thr Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

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<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Ile Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Thr Ser Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Leu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Phe Gln Gln Thr Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Tyr

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<211> 14

<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met His Trp

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<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Ile Gln

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<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

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<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Asn Asn Leu His Trp Phe

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<211> 11

<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

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<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 10

Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Tyr Thr

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<211> 118

<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Ile Gln Lys Phe

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 未知(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 12

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Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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<210> 15

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 15

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1 5 10 15

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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Ile Gln Lys Phe

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Leu Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

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Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

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Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His

225

<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 14

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Met Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

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210

<210> 15

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 15

caggtccaac ttgttcaatc aggcgcagaa gttaagaagc ctggagcatc agttaaagta 60

tcttgtaagg catcaggata tacatttaca aattattgga tgcactgggt gcgccaggcc 120

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atccagaagt tcaaaggtcg ggtcacaatg acaagggaca catcaacatc aactgtgtac 240

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gcagctctcg gttgccttgt taaagactac tttcccgagc ctgtaacagt ctcttggaac 480

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tatagtcttt cctctgtcgt gaccgtgcca tcctccagcc ttggtacaca aacatatatt 600

tgcaatgtaa accataagcc atccaataca aaggtggaca agaaagttga gcccaagagc 660

tgtgataaga cccat 675

<210> 16

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 16

gaaatagtcc ttacacaatc ccctgacttt caatctgtaa cacccaaaga gaaggttaca 60

atcacatgcc gagcatccag ggacatatct aacaatttgc actggttcca gcaaaaacct 120

gaccaaagtc caaaacttct cattaagtat gcttcccaat ccatgagcgg tgtcccttcc 180

cggttctctg ggtctggctc agggacagac tttacactca caatcaattc actggaggca 240

gaagatgccg ccacttatta ttgccaacaa acaaattctt ggccctacac tttcggacag 300

ggcactaaac ttgaaatcaa gaggaccgta gccgcaccat ccgtctttat atttccacca 360

tctgatgaac aacttaaatc aggtaccgcc tcagtagttt gcttgctgaa taacttctat 420

ccacgggagg caaaagttca gtggaaggta gacaacgctt tgcaatctgg taactcacag 480

gagtccgtca ctgaacagga ttcaaaagac agtacctaca gtctgtcatc cactcttacc 540

ttgagtaaag ccgattatga aaagcacaag gtctatgctt gtgaagtcac ccaccaaggg 600

ctttccagtc ctgtgaccaa atctttcaat aggggtgagt gt 642

Claims

1.一种人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段，其特征在于：该单克隆抗体Fab片段由小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的互补决定区和人源IgG抗体Fab片段的框架所组成，其能够与人GP IIb/IIIa受体蛋白特异结合。

2.根据权利要求1所述的一种人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段，其特征在于：所述小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的互补决定区中，其重链CDR区的氨基酸序列由如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求2所述的一种人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段，其特征在于：所述小鼠抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体7E3的互补决定区中，其轻链CDR区的氨基酸序列由SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求3所述的一种人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段，其特征在于：该单克隆抗体Fab片段的氨基酸序列由如SEQ ID NO.13的Fd片段氨基酸序列与如EQ ID NO.14所示的轻链氨基酸序列组成。

5.一种编码如权利要求4所述的人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中Fd片段的核苷酸序列，其特征在于：该核苷酸序列如SEQ ID.15所示。

6.一种编码如权利要求4所述的人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段中轻链片段的核苷酸序列，其特征在于：该核苷酸序列如SEQ ID.16所示。

7.一种重组表达质粒载体，其特征在于：包含如权利要求5所述的核苷酸编码序列。

8.一种重组表达质粒载体，其特征在于：包含如权利要求6所述的核苷酸编码序列。

9.一种宿主细胞，其特征在于：包含如权利要求7或权利要求8所述的重组表达质粒载体；所述宿主细胞是CHO衍生细胞株。

10.权利要求1-9任意一项所述的人源化抗人GP IIb/IIIa受体单克隆抗体Fab片段在用于制备人血小板GP IIb/IIIa受体相关疾病药物中的应用。