CN114984025A - 小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用。提供的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其中,该小分子化合物包括人参皂苷Rh2,人身皂苷Rh2通过调控TFEB/TFE3激活细胞自噬,进而协同促进米托蒽醌诱导的免疫原性细胞死亡,产生具有全身抗肿瘤的T细胞反应,从而为增强抗肿瘤治疗效果,以达到联合治疗,有利于诱导持久的抗癌免疫反应以降低复发的可能性,适于广泛应用于激活TFEB/TFE3在各种疾病中的潜在治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用。
背景技术
激活机体的适应性抗肿瘤免疫应答对于长期的抗肿瘤疗效具有重要意义。近来研究表明,某些化疗药物如蒽环类药物(anthracyclines)、米托蒽醌(mitoxantrone,MTX)、奥沙利铂(oxaliplatin)及放疗、光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)等肿瘤治疗方法不仅可以诱导细胞凋亡,而且激活机体免疫系统来对抗死细胞抗原,赋予死亡的肿瘤细胞免疫原性,这一过程称为免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death,ICD)。当细胞发生ICD,细胞产生新的抗原表位并释放损伤相关分子模式(damage associated molecularpatterns,DAMPs),招募抗原呈递细胞,识别、吞噬死细胞抗原,并将其呈递给T细胞,激活适应性免疫应答识别并清除肿瘤抗原,从而产生长效的抗肿瘤免疫效应。因此,将ICD诱导剂应用到肿瘤治疗中,对于改善癌症患者预后、延长患者生存期具有重要意义。ICD的核心事件是细胞内ATP(三磷酸腺苷)的释放;内质网应激相关分子伴侣蛋白如钙网蛋白(calreticulin,CALR)从内质网转位到细胞膜表面;以及高迁移率蛋白1(high-mobiitygroup box 1,HMGB1)从细胞核释放到细胞外。
细胞自噬(autophagy)是一种独特的细胞生物学现象,它可以选择性降解损坏或者老化的细胞成分,包括功能失调的细胞器,和潜在的致病蛋白聚集体,进而维持机体的稳态。转录因子EB(Transcription factor EB, TFEB)和转录因子E3(Transcription factorE3, TFE3)是自噬的关键分子,其在转录水平上激活多种调节自噬的基因。因此激活TFEB/TFE3是一种有效激活自噬的方式。此外,越来越多的证据表明自噬在癌症中也具有重要作用。如癌细胞中的自噬水平会影响多种细胞因子和危险信号的释放,这些信号指示免疫效应物诱导免疫反应。当自噬激活时,肿瘤来源的细胞质成分可用于溶酶体水解,从而促进垂死肿瘤细胞中的抗原加工。此外,高度激活的自噬可以增加受压的肿瘤细胞分泌ATP,而ATP作为重要的信号通过作用嘌呤受体以激活树突状细胞和杀伤性T细胞并将它们募集到局部肿瘤微环境中,从而增强ICD的效果。然而,研究表明,现有的药物如米托蒽醌(MTX)虽然能诱导免疫反应,但是其效果相对比较微弱。因此,寻找新型的自噬激活剂进而增强MTX协同诱导ICD发挥抗癌作用的小分子药物非常迫切。
研究表明现有的部分化疗药物如米托蒽醌(MTX)等治疗癌症仍有一定的局限性,可能与其诱导的免疫反应依然比较弱有关。因此,寻找新型激活自噬的小分子化合物进而增强MTX诱导的ICD进而发挥抗癌作用的药物具有重要的意义。
发明内容
本申请旨在解决现有技术中部分化疗药物如米托蒽醌(MTX)进行治疗癌症时诱导的免疫反应较弱,导致抗癌效果不明显,治疗效果较差的技术问题,提供了一种小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用。
第一方面,本申请提供了一种小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,小分子化合物包括人参皂苷Rh2。
第二方面,本申请提供了一种用于促进免疫原性细胞死亡的药物组合物,药物组合物包括人参皂苷Rh2和米托蒽醌,其中,人参皂苷Rh2的浓度为1~10 μM。
本申请第一方面提供的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其中,该小分子化合物包括人参皂苷Rh2,人身皂苷Rh2通过调控TFEB/TFE3激活细胞自噬,进而协同促进米托蒽醌诱导的免疫原性细胞死亡,产生具有全身抗肿瘤的T细胞反应,从而为增强抗肿瘤治疗效果,以达到联合治疗,有利于诱导持久的抗癌免疫反应以降低复发的可能性,适于广泛应用于激活TFEB/TFE3在各种疾病中的潜在治疗作用。
本申请第二方面提供的用于促进免疫原性细胞死亡的药物组合物,由于药物组合物中包括了小分子化合物人参皂苷Rh2以及米托蒽醌,使人参皂苷Rh2和米托蒽醌协同作用,通过人参皂苷Rh2对TFEB/TFE3进行激活诱导细胞自噬,增强米托蒽醌诱导的免疫原性细胞死亡反应,以发挥更高效果的治疗作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中:
图1为人参皂苷Rh2促进TFEB和TFE3的细胞核转运。A-B,用如图所示浓度的人参皂苷Rh2处理U2OS 细胞24小时后,免疫荧光结果显示人参皂苷Rh2 (1,5,10 μM) 处理细胞24小时后,显著促进TFEB的细胞核转位。C,Western blot结果进一步确认人参皂苷Rh2 (1,5,10 μM) 处理细胞24小时后促进TFEB的细胞核转位。D-E,人参皂苷Rh2 (10 μM) 处理U2OS细胞24小时后,免疫荧光结果显示人参皂苷Rh2促进TFE3的细胞核转位。F,Western blot结果进一步确认人参皂苷Rh2 (10 μM) 处理细胞24小时促进TFE3的细胞核转位。Torin 1作为阳性对照。
图2为人参皂苷Rh2促进细胞自噬。A,U2OS细胞中, Western blot的结果显示人参皂苷Rh2 (1,5,10 μM) 处理细胞24小时后增加自噬标志蛋白LC3-II的含量。B-C,在溶酶体抑制剂CQ(氯奎)基础上人参皂苷Rh2进一步增加LC3-II的含量。D-E,免疫荧光显示人参皂苷Rh2 (10 μM) 处理细胞24小时后增加LC3的点状结构。F-G,免疫荧光结果显示人参皂苷Rh2 (10 μM) 处理细胞24小时后促进自噬溶酶体的形成。溶酶体抑制剂CQ(氯奎)作为阴性对照。
图3为人参皂苷Rh2促进细胞自噬依赖于TFEB和TFE3。A-B,在U2OS中,特异性的siRNA敲低TFEB和TFE3。C,同时敲低TFEB和TFE3后减弱人参皂苷Rh2 (10 μM)处理细胞24小时后诱导的自噬流。
图4为人参皂苷Rh2协同促进MTX诱导的ATP(三磷酸腺苷)的释放,并且依赖于TFEB/TFE3。A-B, 荧光染色结果显示人参皂苷Rh2(10 μM)协同低浓度的MTX(1 μM)处理细胞24后诱导的的ATP的释放。C-D,敲低TFEB和TFE3后抑制人参皂苷Rh2(10 μM)协同低浓度的MTX(1 μM)处理细胞24后诱导ATP的释放。高浓度的MTX(5 μM)作为阳性对照。
图5为人参皂苷Rh2协同MTX诱导的HMGB1的释放。A-B, 荧光染色及定量结果显示处理细胞24小时后人参皂苷Rh2(10 μM)协同低浓度的MTX(1 μM)的诱导的细胞内HMGB1的释放。C,Western blot结果显示参皂苷Rh2(10 μM)协同低浓度的MTX(1 μM)处理细胞24小时后可以诱导增加细胞外HMGB1的含量。高浓度的MTX(5 μM)作为阳性对照。
图6为人参皂苷Rh2协同MTX诱导CALR(钙网蛋白)的细胞膜移位。A-B,免疫荧光结果显示人参皂苷Rh2(10 μM)协同低浓度的MTX(1 μM)处理细胞24小时后诱导的CALR细胞膜移位。C,流式细胞分析进一步确认了人参皂苷Rh2协同低浓度的MTX(1 μM)诱导的CALR细胞膜移位。
图7为人参皂苷Rh2促进内质网应激。A-B,人参皂苷Rh2(1, 5,10 μM)处理细胞24小时后增加内质网应激的标志蛋白ATF4 的表达。C-D,人参皂苷Rh2(1,,5,10 μM)处理细胞24小时后增加内质网应激的标志蛋白CHOP 的表达。E-G,人参皂苷Rh2(1-10 μM)处理细胞24小时后增加内质网应激的关键分子eIF2α的磷酸化水平而不影响eIF2α总的水平。
图8为人参皂苷Rh2导致CALR的细胞膜转位和内质网应激相关。A,U2OS细胞中,敲低PERK后,抑制人参皂苷Rh2(10 μM)处理细胞24小时后诱导的内质网应激。 B-C,抑制内质网应激后,显著减弱人参皂苷Rh2(10 μM)协同MTX(1 μM)处理细胞24小时后诱导的CALR细胞膜移位。
图9为MCA205骨肉瘤细胞中。A,人参皂苷Rh2(1,5,10 μM)处理细胞24小时后促进自噬。B-C,人参皂苷Rh2(1,5,10 μM)处理细胞24小时后促进内质网应激。D-E,人参皂苷Rh2(10 μM)协同MTX(1 μM)处理细胞24小时后诱导CALR的细胞膜移位。F-G,人参皂苷Rh2(10 μM)协同MTX(1 μM)处理细胞24小时后诱导HMGB1的释放。H-I,人参皂苷Rh2(10 μM)协同MTX(1 μM)处理细胞24小时诱导的ATP的释放。
图10为在免疫正常的小鼠中,人参皂苷Rh2增加MTX抑制肿瘤的效果。A,人参皂苷Rh2协同MTX体内抑制肿瘤给药示意图,腹腔注射给药。B,人参皂苷Rh2,MTX单独或者协同给药不影响动物体重。C,人参皂苷Rh2协同MTX抑制肿瘤的生长。D,人参皂苷Rh2协同MTX抑制肿瘤体积。E,人参皂苷协同MTX增加杀伤性T细胞含量。F-G,人参皂苷Rh2协同MTX抑制杀伤性T细胞和调节性T 细胞(T reg)比例。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本申请实施例第一方面提供一种小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,小分子化合物包括人参皂苷Rh2。
本申请实施例第一方面提供的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其中,该小分子化合物包括人参皂苷Rh2,人身皂苷Rh2通过调控TFEB/TFE3激活细胞自噬,进而协同促进米托蒽醌诱导的免疫原性细胞死亡,产生具有全身抗肿瘤的T细胞反应,从而为增强抗肿瘤治疗效果,以达到联合治疗,有利于诱导持久的抗癌免疫反应以降低复发的可能性,适于广泛应用于激活TFEB/TFE3在各种疾病中的潜在治疗作用。
在一些实施例中,人参皂苷Rh2促进激活转录因子TFEB和转录因子TFE3的细胞核转位。
在一些实施例中,人参皂苷Rh2通过调控TFEB/TFE3激活转录因子TFEB和转录因子TFE3的细胞核转位激活自噬,激活自噬溶酶体形成,促进细胞自噬。
在一些实施例中,人参皂苷Rh2通过激活TFEB/TFE3,制备各种疾病的潜在药物进行应用。
在一些实施例中,人参皂苷Rh2增加内质网应激的标志蛋白激活转录因子4、激活转录因子6-C/EBP同源蛋白的表达,且增加内质网应激的真核起始因子2的磷酸化水平,以促进内质网应激。
在一些实施例中,药物还包括米托蒽醌。提供的米托蒽醌能诱导免疫反应,通过与人参皂苷Rh2的协同作用,可以增强米托蒽醌协同诱导免疫原性细胞死亡发挥抗肿瘤的作用。
在一些实施例中,由于细胞外ATP和细胞外HMGB1的释放是免疫原性细胞死亡(ICD)的关键信号,人参皂苷Rh2促进米托蒽醌导致的细胞外ATP以及HMGB1释放。
在一些实施例中,细胞膜CALR(钙网蛋白)的细胞膜转位也是免疫原性细胞死亡(ICD)关键信号,人参皂苷Rh2促进米托蒽醌诱导的细胞膜钙网蛋白细胞膜的移位和PERK介导的内质网应激。
在一些实施例中,由于人参皂苷Rh2协同米托蒽醌进行作用,诱导CALR的细胞膜移位、HMGB1的释放以及ATP的释放,进而确认人参皂苷Rh2协同米托蒽醌诱导促进免疫原性细胞死亡。
在一些实施例中,人参皂苷Rh2提高米托蒽醌的抗肿瘤作用;人参皂苷Rh2与米托蒽醌协同通过,人参皂苷Rh2通过增强米托蒽醌诱导的免疫原性细胞死亡进而提高发挥抗肿瘤作用。
本申请实施例第二方面提供了一种用于促进免疫原性细胞死亡的药物组合物,药物组合物包括人参皂苷Rh2和米托蒽醌,其中,人参皂苷Rh2的浓度为1~10 μM。
本申请实施例第二方面提供的用于促进免疫原性细胞死亡的药物组合物,由于药物组合物中包括了小分子化合物人参皂苷Rh2以及米托蒽醌,使人参皂苷Rh2和米托蒽醌协同作用,通过人参皂苷Rh2对TFEB/TFE3进行激活诱导细胞自噬,增强米托蒽醌诱导的免疫原性细胞死亡反应,以发挥更高效果的治疗作用。
在一些实施例中,一种用于促进免疫原性细胞死亡的药物组合物,药物组合物包括人参皂苷Rh2和米托蒽醌,其中,人参皂苷Rh2的浓度包括但不限于1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM。
在一些实施例中,药物组合物还包括药学上可接受的辅助剂,以方便其制备成满足各种给药途径的剂型。
在一些实施例中,药物的剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、液剂、乳剂、悬浮剂、软膏剂、注射剂、皮肤贴剂中的一种。
在一些实施例中,辅助剂包括填充剂、崩解剂、粘合剂、乳化剂、润滑剂、助流剂、着色剂中的一种或几种,但不限于此。
在一些实施例中,药物组合物用于基于促进免疫原性细胞死亡而增强抗肿瘤效果,其中,肿瘤包括但不限于恶性黑色素瘤,肝癌,肺癌,乳腺癌,结肠癌,鼻咽癌,膀胱癌,宫颈癌,食管癌,胃癌,前列腺癌和淋巴瘤。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种用于促进免疫原性细胞死亡的药物组合物,药物组合物包括人参皂苷Rh2和米托蒽醌,其中,人参皂苷Rh2的浓度为1 μM。
实施例2
一种用于促进免疫原性细胞死亡的药物组合物,药物组合物包括人参皂苷Rh2和米托蒽醌,其中,人参皂苷Rh2的浓度为5 μM。
实施例3
一种用于促进免疫原性细胞死亡的药物组合物,药物组合物包括人参皂苷Rh2和米托蒽醌,其中,人参皂苷Rh2的浓度为10 μM。
性质测定
性质测定(一)体外实验验证人参皂苷Rh2通过诱导自噬以增强米托蒽醌(MTX)诱导ICD的分子机制
⑴检测人参皂苷Rh2通过激活TFEB/TFE3诱导自噬
试验方法:
提供不同浓度人参皂苷Rh2(1 μM, 5 μM和10 μM)。
通过转染Flag-TFEB和GFP-TFE3质粒到U2OS细胞48h,用不同浓度人参皂苷Rh2(1μM, 5 μM和10 μM)处理细胞24h后,通过荧光显微镜检测TFEB和TFE3从细胞质入核的情况,同时分离细胞质和细胞核,通过Western blot 检测细胞质和细胞核中的TFEB 和TFE3在细胞核中的表达。进一步确认其促进TFEB和TFE3的细胞核转运。
为确定人参皂苷Rh2是否激活自噬,采用不同浓度人参皂苷Rh2(1 μM, 5 μM和10μM)处理U2OS 细胞24小时后,收集细胞,提取蛋白,用抗LC3的抗体通过Western blot检测LC3 的表达。用人参皂苷Rh2,氯奎(chloroquine,CQ),人参皂苷Rh2和CQ处理细胞后,收集细胞,提取蛋白,用抗LC3的抗体通过Western blot检测LC3-II的表达。CQ是自噬抑制剂,用于对照。
预期Rh2处理细胞后,会协同CQ增加其对LC3-II的诱导效应。然后用荧光报告系统mRFP-GFP-LC3来检测小分子对自噬流的影响。当探针定位于自噬溶酶体或者自噬小体中,该探针会同时发出红光和绿光。当溶酶体与自噬小体融合时,会导致PH降低,导致GFP信号猝灭,RFP由于对PH不敏感,其红色荧光会被检测出来。接着我们转染mRFP-GFP-LC3质粒到U2OS细胞,用人参皂苷Rh2处理细胞24小时后,固定细胞,荧光显微镜拍照检测。
同时,为确定人参皂苷Rh2诱导的自噬是否依赖于TFEB和TFE3,我们用siRNA干扰TFEB和TFE3 48h后,在对照组和处理组再加入人参皂苷Rh2(10 μM)处理细胞24小时,用Western blot检测LC3-II的变化,从而明确人参皂苷Rh2诱导的自噬是否依赖于TFEB和TFE3。
⑵检测人参皂苷Rh2协同MTX对ATP释放的影响
试验方法:
提供10 μM人参皂苷Rh2和1 μM的MTX的药物组合物;
复苏U2OS和MCA205细胞,传代3次后将细胞接种在12孔板中,用10 μM人参皂苷Rh2,低浓度(1 μM)的MTX,人参皂苷Rh2 (10 μM) 联合MTX (1 μM),以及高浓度(5 μM)的MTX作为对照处理细胞16h后,检测细胞内ATP的含量变化。细胞内含ATP的囊泡可以通过quinacrine(奎纳克林)孵育细胞30分钟后通过荧光显微镜进行检测。同时收集细胞培养基,通过ATP检测试剂盒检测细胞释放到胞外基质中的ATP水平,以反映ATP的释放。
⑶检测人参皂苷Rh2协同MTX诱导的ATP的释放是否依赖于TFEB/TFE3介导的自噬
试验方法:
在U2OS细胞中,用siRNA敲低自噬关键蛋白ATG5(自噬相关蛋白5)或者敲低TFEB和TFE3 48小时后,再加入10 μM人参皂苷Rh2,低浓度(1 μM)的MTX,人参皂苷Rh2 (10 μM) 联合MTX(1 μM),通过quinacrine染色检测细胞内ATP的变化,以及通过试剂盒检测细胞外ATP含量的变化,进而确定人参皂苷Rh2协同MTX诱导的ATP释放是否依赖于TFEB/TFE3介导的自噬。
⑷检测人参皂苷Rh2协同MTX对HMGB1的释放的影响
试验方法:
接种U2OS和MCA205细胞,用10 μM人参皂苷Rh2,低浓度(1 μM)的MTX,人参皂苷Rh2(10 μM)联合MTX(1 μM),以及高浓度的MTX(5 μM)作为对照处理细胞24h后,用4%多聚甲醛固定细胞后用HMGB1的抗体进行荧光抗体标记,荧光显微镜检测HMGB1的定位。同时收集细胞培养基,用Western blot检测细胞外HMGB1的含量。
⑸检测人参皂苷Rh2协同MTX对钙网蛋白CALR的释放的影响及其机制
试验方法:
在U2OS和MCA205细胞中,瞬时转染表达CALR-RFP的质粒到U2OS细胞48h后,用10 μM人参皂苷Rh2,低浓度(1 μM)的MTX,人参皂苷Rh2(10 μM)联合MTX(1 μM),以及高浓度的MTX(5 μM)作为对照处理细胞24h后,用4%多聚甲醛/PBS固定细胞并进行免疫染色,最后用荧光显微镜检测CALR-RFP荧光信号。
同时,参照上述处理后,在U2OS细胞中,用流式细胞仪检测内源性人参皂苷Rh2协同MTX对内源性CALR细胞膜转位的影响。药物处理结束后,收集细胞悬液,用PBS洗涤3次后,PI染色5分钟,用0.25%PFA固定5分钟;用2%驴血清封闭细胞30分钟以封闭非特异性结合位点;加入1:200稀释的抗CALR的抗体,与细胞共孵育30分钟;PBS清洗3次,用封闭液按1:500稀释Alexa 488偶联的二抗,与细胞共孵育30分钟;PBS清洗3次后,流式细胞仪上机检测CALR的转位情况。
性质测定(二)体内实验检测人参皂苷Rh2增强米托蒽醌(MTX)诱导的化疗抗癌效果
⑴建立小鼠肿瘤模型并给药
试验方法:
为了验证小分子药物可以有效地诱导免疫原性细胞反应,采用体内接种肿瘤细胞的实验来评估药物诱导ICD的疗效。接种MCA205小鼠纤维肉瘤癌细胞于具有免疫活性的C57BL/6小鼠,并在肿瘤形成时,开始腹腔注射小分子药物。我们将定期测量记录肿瘤大小变化,并在一定时间内,解剖小鼠,取出肿瘤,并测量肿瘤大小和重量。
⑵检测肿瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞的变化
试验方法:
解剖小鼠,取出肿瘤组织,消化成单细胞悬液。用抗CD3,CD8,CD4,CD25的荧光标记抗体四度孵育上述细胞30min,用FACS buffer 洗三遍。然后用1%PFA固定上述细胞15 min,用0.1% saponin透化细胞10分钟,四度孵育抗FOXP3的抗体30分钟,用FACS buffer洗三遍,进行流式细胞仪分析。我们将分析并比较对照组与模型组小鼠肿瘤中表达的CD3+ CD8+ 杀伤性T 淋巴细胞, CD4+ FOXP3+ CD25+ 调节性T细胞 (Treg, CD3+ CD8+ T )的比例。
结果分析
结果分析(一)
体外实验验证人参皂苷Rh2通过诱导自噬以增强米托蒽醌(MTX)诱导ICD的分子机制
⑴检测人参皂苷Rh2通过激活TFEB/TFE3诱导自噬
①人参皂苷Rh2促进TFEB和TFE3的细胞核转位
TFEB和TFE3是调节自噬溶酶体通路的开关。为了检测人参皂苷Rh2是否激活TFEB和TFE3,人参皂苷Rh2 (1,5,10 μM) 处理含有转染Flag-TFEB和GFP-TFE3质粒的U2OS细胞24小时后,如图1的A和图1的B显示,免疫荧光结果显示人参皂苷Rh2显著促进TFEB从细胞质转运到细胞核中,同时分离细胞质和细胞核后,如图1的C的Western blot检测结果显示TFEB在细胞质和细胞核中表达的变化,试验进一步确认了人参皂苷Rh2 (1,5,10 μM)处理细胞24h后,TFEB在细胞质中表达变少,而在细胞核表达量明显升高,表明人参皂苷Rh2促进TFEB从细胞质转运到细胞核。
同理,如图1的D和图1的E显示的免疫荧光分析图和图1的F的Western blot 的结果也显示人参皂苷Rh2 (10μM)处理细胞24小时后促进TFE3的细胞核转运。该结果表明人参皂苷Rh2(在1-10μM)处理细胞24h后可以促进TFEB和TFE3细胞核的积聚。
②人参皂苷Rh2促进细胞自噬
由于TFEB和TFE3是自噬的分子,进一步检测人参皂苷Rh2导致的TFEB和TFE3细胞核转位是否激活自噬。如图2的A的Western blot的结果显示,在U2OS细胞中,人参皂苷Rh2(1,5,10 μM) 处理细胞24小时后增加自噬标志蛋白LC3-II的含量。如图2的B和图2的C所示,在溶酶体抑制剂CQ(氯奎)的基础上人参皂苷Rh2 (10 μM)处理细胞24h后进一步促进LC3-II的增加,说明人参皂苷Rh2促进自噬流。如图2的D和图2的E所示,免疫荧光结果显示人参皂苷Rh2 (10 μM) 处理细胞24小时后进一步增加GFP-LC3的点状结构。处理GFP-RFP-LC3质粒表达的U2OS细胞,如图2的F和图2的G的免疫荧光结果显示,人参皂苷Rh2 (10 μM)处理细胞24小时后促进自噬溶酶体的形成。这些结果说明人参皂苷Rh2(在1-10μM)处理细胞24h显著促进细胞自噬。
③人参皂苷Rh2促进细胞自噬依赖于TFEB和TFE3
为确认人参皂苷Rh2导致的自噬是否依赖于TFEB和TFE3,首先用siRNA干扰的方式敲低TFEB(图3的A)和TFE3(图3的B)。结果显示同时敲低TFEB和TFE3后,如图3的C所示,显著减弱人参皂苷Rh2 (10 μM) 处理细胞24小时后导致的自噬流,表明人参皂苷Rh2导致的自噬依赖于TFEB和TFE3。
⑵检测人参皂苷Rh2协同MTX对ATP释放的影响以及确定诱导的ATP的释放是否依赖于TFEB/TFE3介导的自噬
细胞外ATP的释放是免疫原性细胞死亡(ICD)的关键信号,由于自噬对ATP的释放具有重要的影响,进一步检测人参皂苷Rh2是否促进MTX导致的ATP释放。如图4的A和图4的B所示,免疫荧光染色结果显示人参皂苷Rh2 (10 μM)增加低浓度的MTX (1 μM) 处理U2OS细胞24小时后诱导的细胞内ATP的释放。
如图4的C和图4的D所示,同时敲低TFEB和TFE3抑制人参皂苷Rh2导致的自噬后,显著抑制人参皂苷Rh2 (10 μM)协同低浓度的MTX (1 μM) 处理细胞24小时后诱导ATP的释放。这些结果说明人参皂苷Rh2协同促进MTX诱导的ATP的释放,并且依赖于TFEB/TFE3。高浓度的MTX (5 μM)处理细胞24小时作为阳性对照。
⑶检测人参皂苷Rh2协同MTX对HMGB1的释放的影响
细胞外HMGB1的释放也是免疫原性细胞死亡(ICD)关键信号,进一步检测人参皂苷Rh2是否促进MTX导致的HMGB1从细胞质释放到细胞外。如图5的A和图5的B所示,免疫荧光染色结果显示人参皂苷Rh2 (10 μM)增加低浓度的MTX (1 μM) 处理细胞24小时后诱导的细胞内HMGB1的释放。如图5的C,收集细胞外培养基也显示人参皂苷Rh2促进HMGB1的释放,这些结果说明人参皂苷Rh2协同MTX诱导的HMGB1细胞的释放。高浓度的MTX (5 μM)处理细胞24小时作为阳性对照。
⑷检测人参皂苷Rh2协同MTX对钙网蛋白CALR的释放的影响及其机制
①人参皂苷Rh2协同MTX诱导CALR的细胞膜移位
细胞膜CALR(钙网蛋白)的细胞膜转位也是免疫原性细胞死亡(ICD)关键信号,进一步检测人参皂苷Rh2是否促进MTX导致CALR的细胞膜转位。如图6的A和图6的B所示,免疫荧光染色结果显示人参皂苷Rh2 (10 μM) 增加低浓度的MTX(1 μM)处理细胞24小时后诱导的CALR的细胞膜转位。高浓度的MTX (5 μM)处理细胞24小时作为阳性对照。如图6的C所示,流式的结果进一步确认人参皂苷Rh2 (10 μM)增加低浓度的MTX(1 μM)处理细胞24小时诱导的内源性CALR的细胞膜转位。这些结果说明人参皂苷Rh2 (10 μM) 协同MTX诱导CALR的细胞膜移位。
②人参皂苷Rh2促进内质网应激
内质网应激是导致ICD的关键事件如CALR细胞膜转位的关键因素,由于人参皂苷Rh2促进MTX导致CALR的细胞膜移位,进一步检测其是否和内质网应激相关。结果显示人参皂苷Rh2(1,5,10 μM)处理细胞24小时后增加内质网应激的标志蛋白ATF4(Activatingtranscription factor 4,激活转录因子4)(图7的A和图7的B)、CHOP(激活转录因子6-C/EBP同源蛋白)(图7的C和图7的D) 的表达,并且增加内质网应激的关键分子eIF2α(真核起始因子2)的磷酸化水平而不影响eIF2α总的水平(图7的E和图7的G),这些结果说明人参皂苷Rh2促进内质网应激。
③人参皂苷Rh2增强MTX诱导的CALR细胞膜移位和内质网应激有关
为确定人参皂苷Rh2导致CALR的细胞膜转位是否和内质网应激相关,如图8的A所示,敲低了内质网应激的关键蛋白PERK,结果显示PERK缺失后抑制人参皂苷导致的内质网应激。如图8的B和图8的C所示,也抑制人参皂苷Rh2(10 μM)处理细胞24小时后协同MTX(1 μM)导致的CALR细胞膜的转位。这些结果显示人参皂苷Rh2增强MTX诱导CALR细胞膜的移位和PERK介导的内质网应激有关。
结果分析(二)
体内实验检测人参皂苷Rh2增强米托蒽醌(MTX)诱导的化疗抗癌效果
(1)在MCA205骨肉瘤细胞中,人参皂苷Rh2协同MTX诱导的ICD(免疫原性细胞死亡)
为进一步确认人参皂苷Rh2协同增强MTX诱导的ICD,在小鼠MCA205骨肉瘤细胞模型中进一步进行研究。如图9的A所示,与U2OS细胞实验结果类似,在MCA205中人参皂苷Rh2(1,5,10 μM)处理细胞24小时后促进自噬。如图9的B和图9的C所示,人参皂苷Rh2(1,5,10 μM)处理细胞24小时后促进内质网应激。同时人参皂苷Rh2(10 μM)协同MTX(1 μM)处理细胞24小时后诱导CALR的细胞膜移位(图9的D和图9的E)、ATP的释放(图9的F和图9的G)以及HMGB1的释放(图9的H和图9的I)。这些结果进一步确认在MCA205细胞中人参皂苷Rh2协同MTX导致的ICD。
(2)在免疫正常的小鼠中人参皂苷Rh2增加MTX抑制肿瘤的效果
为确定人参皂苷Rh2是否促进MTX抑制肿瘤的效果及分子机制,在免疫系统正常的小鼠(C57BL/6)体内接种MCA205细胞,待肿瘤长到肉眼可见的大小后,按图示的结果通过腹腔注射的方式给药(图10的A)(人参皂苷Rh2 30 mg/kg, MTX 5.17 mg/kg,腹腔注射)。结果显示人参皂苷Rh2不影响小鼠的体重的情况下(图10的B),其显著增强MTX抑制肿瘤生长的效果(图10的C和图10的D)。如图10 的E,流式细胞结果显示人参皂苷协同MTX增加肿瘤中杀伤性T细胞的含量,进而增加杀伤性T细胞和调节性T 细胞(Treg)的比例(图10的F和图10的G)从而发挥抗肿瘤作用。这些结果说明人参皂苷Rh2增强MTX诱导的ICD进而发挥抗肿瘤作用。
综上,提供的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其中,该小分子化合物包括人参皂苷Rh2,人身皂苷Rh2通过调控TFEB/TFE3激活细胞自噬,进而协同促进米托蒽醌诱导的免疫原性细胞死亡,产生具有全身抗肿瘤的T细胞反应,从而为增强抗肿瘤治疗效果,以达到联合治疗,有利于诱导持久的抗癌免疫反应以降低复发的可能性,适于广泛应用于激活TFEB/TFE3在各种疾病中的潜在治疗作用。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,因此依本发明权利要求所作的等同变化,仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其特征在于,所述小分子化合物包括人参皂苷Rh2。
2.根据权利要求1所述的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其特征在于,所述人参皂苷Rh2促进激活转录因子TFEB和转录因子TFE3的细胞核转位。
3.根据权利要求2所述的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其特征在于,所述人参皂苷Rh2通过调控TFEB/TFE3激活转录因子TFEB和转录因子TFE3的细胞核转位激活自噬,激活自噬溶酶体形成,促进细胞自噬。
4.根据权利要求1所述的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其特征在于,所述人参皂苷Rh2增加内质网应激的标志蛋白激活转录因子4、激活转录因子6-C/EBP同源蛋白的表达,且增加内质网应激的真核起始因子2的磷酸化水平,以促进内质网应激。
5.根据权利要求1所述的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其特征在于,所述药物还包括米托蒽醌。
6.根据权利要求5所述的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其特征在于,所述人参皂苷Rh2促进所述米托蒽醌导致的细胞外ATP以及HMGB1释放。
7.根据权利要求5所述的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其特征在于,所述人参皂苷Rh2促进所述米托蒽醌诱导的细胞膜钙网蛋白细胞膜的移位和PERK介导的内质网应激。
8.根据权利要求5所述的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其特征在于,所述人参皂苷Rh2协同所述米托蒽醌诱导促进免疫原性细胞死亡。
9.根据权利要求5所述的小分子化合物在制备促进免疫原性细胞死亡的药物的应用,其特征在于,所述人参皂苷Rh2提高所述米托蒽醌的抗肿瘤作用。
10.一种用于促进免疫原性细胞死亡的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括人参皂苷Rh2和米托蒽醌,其中,所述人参皂苷Rh2的浓度为1~10 μM。
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刘小霞等: "人参皂苷Rh2通过激活 p38诱导 K562细胞自噬凋亡的实验研究" * |
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