CN114982746A - 基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，该基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：S1：制备胆碱丙氨酸离子液体备用；S2：向1.9‑2.0ml的超纯水中加入0.4mlCTAB(100mM)和0.1mlHAuCl4(10mM)，搅拌混合至溶液变澄清；S3：向S2所得混合溶液中快速注入50‑200μl的胆碱丙氨酸离子液体(1M)，搅拌混合一段时间后，向其中快速注入0.07‑0.2ml抗坏血酸(100mM)，并继续搅拌混合一段时间后，停止搅拌并进行水浴处理，水浴温度29‑32℃，水浴时间至少1.5h；S4：将水浴处理后的溶液于4800‑5500rpm下进行离心，离心后的颗粒分散在CTAB(1‑100mM)溶液中既得金纳米花抗菌剂，能够有效破坏细菌生物膜并引起氧化应激反应，对食品中的致病菌具有高效抑制作用。

Description

基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及食品抗菌领域，尤其涉及一种基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法。
背景技术
微生物耐药性问题，同样也是食品安全问题。食物链(Food chain)是耐药性微生物影响食品安全最主要的途径，在动物肠道繁殖的耐药性微生物可经食物链传播。在食品的生产、包装及运输过程中，使用抗菌材料可以有效延缓食物腐败，减少致病菌引起的食源性疾病。目前，市面上能见到的抗菌剂多种多样，但却不一定适合添加在食品中，例如同银、铜及其它金属氧化物等的纳米抗菌剂，其具备一定的抗菌特性，但对人体也有一定的毒性，并不适宜制成食品接触用抗菌材料；而金作为惰性贵金属，性质稳定，不易分解为离子，相对安全性更高，有望作为一种具有广谱性的绿色抗菌剂应用于食品抗菌。近年来研究发现，金纳米簇具有一定的抗菌特性，部分研究者也做出了一些可用抗菌剂，但是却存在制备过程复杂、产生毒害等缺陷，以至于在食品抗菌中的并不具备较大优势。
目前金纳米粒子自身的抗菌效果仍有争议，基于金纳米粒子抗菌应用也主要围绕金对不同抗生素或其他配体的载药能力，然而其对抗生素类的抗菌物质的依赖性，对于解决耐药性微生物这一问题，仅仅起到推迟和缓解的作用，无法真正遏制其产生。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，制备过程简单快速、安全性高，且制得的金纳米花抗菌剂，可以有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：
一种基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：制备胆碱丙氨酸离子液体备用；
S2：向1.9-2.0ml的超纯水中加入0.4mlCTAB(100mM)和0.1mlHAuCl4(10mM)，搅拌混合至溶液变澄清；
S3：向S2所得混合溶液中快速注入50-200μl的胆碱丙氨酸离子液体(1M)，搅拌混合一段时间后，向其中快速注入(0.07ml-0.2ml)抗坏血酸(100mM)，并继续搅拌混合一段时间后，停止搅拌并进行水浴处理，水浴温度29-32℃，
水浴时间至少1.5h；
S4：将水浴处理后的溶液于4800-5500rpm下进行离心，离心后的颗粒分散在CTAB(1mM-100mM)溶液中既得金纳米花抗菌剂。
其中mM和M为物质的量浓度单位，1mM＝1mmol/L，1M＝1mol/L。
进一步的，S2中，搅拌条件为：600rpm下至少搅拌30s。
进一步的，S3中，向S2所得混合溶液中快速注入50-200μl的胆碱丙氨酸离子液体(1M)，600rpm下搅拌混合15-20s后，向其中快速注入0.07-0.2ml抗坏血酸(100mM)，并继续搅拌8-10min，之后在30℃下水浴2h。
进一步的，S3中，向S2所得混合溶液中快速注100μl的胆碱丙氨酸离子液体(1M)，搅拌一段时间后向其中快速注入0.07ml抗坏血酸(100mM)，此注入量下，抑菌效果较好。
进一步的，对于大肠杆菌，金纳米花抗菌剂的最小抑菌浓度为16μg/mL。
进一步的，对于金黄色葡萄球菌，金纳米花抗菌剂的最小抑菌浓度为64μg/mL。
进一步的，S1中，胆碱丙氨酸离子液体的制备方法如下：在常温下，将氢氧化胆碱水溶液按1:1的摩尔比，缓慢滴入丙氨酸溶液中，搅拌至反应完全，之后蒸除多余水分后真空干燥得胆碱丙氨酸离子液体。
进一步的，氢氧化胆碱水溶液和丙氨酸溶液的搅拌过程采用磁力搅拌，搅拌反应完全后于50℃下采用旋转蒸发以除去多余水分，后于65-75℃下真空干燥至恒重。
本发明采用上述结构，所具有的优点是：本申请金纳米花抗菌剂，利用食源性胆碱丙氨酸离子液体制备，其制备方法简单快速、安全性高；且获得的金纳米花抗菌剂，能够有效破坏细菌生物膜并引起氧化应激反应，对食品中的致病菌具有高效抑制作用，例如可高效抑制食品中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。
附图说明
图1为本发明胆碱丙氨酸离子液体的制备过程和成品图；
图2为本发明一锅法合成金纳米花抗菌剂的示意图
图3为本发明合成[Ch][Ala]-AuNFs的消光光谱图、水合粒径大小和表面携带的Zeta电位图。
图4为本发明合成[Ch][Ala]-AuNFs的扫描电镜图和透射电镜图；
图5为不同浓度下[Ch][Ala]-AuNFs、胆碱丙氨酸离子液体([Ch][Ala])、金纳米球(AuNSs，直径为20nm)、[Ch][Ala]和AuNSs的物理混合物、空白实验五组材料的抑菌效果图(其中(i)为大肠杆菌；(ii)为金黄色葡萄球菌)。
图6为32μg/mL的[Ch][Ala]-AuNFs对大肠杆菌作用的电镜图(其中，(i)为大肠杆菌的TEM图像：(a-i)对照；(b-i)破裂和断损；(c-i)内容物外泄；(ii)为大肠杆菌的SEM图像：(a-ii)对照；(b-ii)内容物外泄；(c-ii)细胞碎片)。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，但是，本申请还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本申请的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
1、实验材料：氢氧化胆碱和丙氨酸购自东京化成工业株式会社；三水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自美国Sigma-Aldrich公司；其它化学试剂均为国药化学试剂，未经进一步纯化即可使用。
2、实验过程
第一步：制备胆碱丙氨酸离子液体，具体的在常温下，将氢氧化胆碱水溶液按1:1的摩尔比，缓慢滴入丙氨酸溶液中，25℃下磁力搅拌48h左右，以保证反应完全；之后在50℃下旋转蒸发以除去多余水分，所得液体于65-75℃下真空干燥，直到恒重，得胆碱丙氨酸离子液体。
如图1所示，制备过程中，仅有水作为反应溶剂，水分在反应后简单易除，不产生副产物，胆碱丙氨酸离子液体在室温下为粘稠液体，颜色呈现浅黄色，放置12月无变化。
第二步：合成金纳米花抗菌剂([Ch][Ala]-AuNFs)，具体的先向1.9-20ml的超纯水中加入0.4mlCTAB(100mM)和0.1mlHAuCl4(10mM)，溶液从无色迅速变为深黄色，600rpm下搅拌30s左右后，黄色逐渐变澄清；之后向所得混合溶液中快速注入50-100μl左右的胆碱丙氨酸离子液体(1M)，溶液从较为清澈的深黄色瞬间变为淡黄色，5s内变无色。之后继续搅拌15s左右后，向其中快速注入0.07-0.2ml抗坏血酸(100mM)，继续搅拌90s左右出现浅蓝色，随后蓝色逐渐加深，2min左右变成稳定的深蓝色。加入抗坏血酸在600rpm下匀速搅拌10min左右后，停止搅拌并将混合体系置于30℃下水浴2h。之后将水浴处理后的溶液以4800-5500rpm在25℃下离心5min左右除去未反应的试剂，离心后的颗粒分散在CTAB(1mM-100mM)溶液中既得金纳米花抗菌剂，其中在CTAB(100mM)中分散性较好、保存时间较长。
金纳米花抗菌剂，采用CTAB作为溶剂，可以稳定保存至少1个月的时间，使用时进行离心将沉淀用水复溶即可。
如图2所示，金纳米花抗菌剂制备中，HAuCl4提供金原子，CTAB作为表面活性剂，抗坏血酸作为还原剂，胆碱丙氨酸离子液体携带大量的羟基、羧基和氨基，可以稳定的修饰在金纳米花表面。
3、结果表征
如图3a所示的消光光谱中，合成的[Ch[Ala]-AuNFs的最大吸收峰在650nm左右，合成的胶体金溶液为蓝色。如图3b所示，[Ch[Ala]-AuNFs的水合粒径大小为123.4nm，PDI为0.178，分散性良好。[Ch[Ala]-AuNFs的表面携带正电荷，Zet为21.7mV，如此有利于和带负电荷的微生物细胞膜相接触。
如图4a所示，在扫描电子显微镜下，[Ch[Ala]-AuNFs形似疏松的花朵，表面凹凸不平，显示具有高比表面积；再结合图4b，在透射电子显微镜中可以看到，[Ch[Ala]-AuNFs存在着明显突出枝角状边缘，透光程度不均一。
通过以上表征结果可知，合成的[Ch[Ala]-AuNFs不仅具有较高的比表面积，且表面带正电荷，如此利于与大量微生物接触作用，以发挥其抗菌性能。
4、抗菌性能探究
下面以食品中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为例来研究[Ch[Ala]-AuNFs的抗菌性能。
1)菌种活化
选择食品中常见的革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌作为指示菌。从冻藏的甘油管中取少量菌液复苏，在10mL普通营养肉汤培养基中扩大培养，37℃有氧条件下生长24h。选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种，在普通营养琼脂培养基上划线生长。
2)最小抑菌浓度的测定
最小抑菌浓度由微量肉汤稀释法进行测定，同时通过稀释涂布平板法进行可视化表征。将活化至对数生长期的菌液稀释至104CFU/mL，用灭过菌的普通营养肉汤培养基将[Ch][Ala]-AuNFs稀释成不同的浓度(1、2、4、8、16、32、64和128μg/mL)。然后，向酶标板的每个孔中注入50μL稀释后的菌液，再加入50μL[Ch][Ala]-AuNFs。每个实验组重复三次，未经处理的为对照组。用酶标仪读取吸光度初始读数，在37℃下培养24h后，再次测量吸光度。吸光度数值未增长所对应的浓度视为[Ch][Ala]-AuNFs的最小抑菌浓度。
另取100μL菌液与最小抑菌浓度的100μL[Ch][Ala]-AuNFs混合反应10min后，在普通营养琼脂培养基表面进行平板涂布。涂布完毕后于37℃恒温培养24h，观察有无细菌生长。以未加入胆碱丙氨酸-金纳米花，只加入菌液的平板作为对照组。若对照组有大量菌落生成，而加入[Ch][Ala]-AuNFs的实验组没有菌落生成，则证明[Ch][Ala]-AuNFs在该浓度下具有显著的抗菌活性。
如图5所示，以大肠杆菌组为例，合成后的[Ch][Ala]-AuNFs的最小抑菌浓度为16μg/mL，而单独的[Ch][Ala]、AuNSs及其物理混合物，即使将浓度提高到128μg/mL的情况下，依然没有表现出明显的抗菌活性。同理，合成后的[Ch][Ala]-AuNFs对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为64μg/mL，而其他组均没有抑制细菌生长的迹象。
进一步的，如图6所示，通过TEM和SEM观察AuNFs处理后的细菌细胞形态是否有发生变化。与形态完好的对照组相比(图6a)，经过[Ch][Ala]-AuNFs处理后的细菌出现了内容物外流，表面出现了明显的破裂和断损(图6b)。同时由于静电相互作用，带正电荷的AuNFs吸附在细菌的表面(图6c)，最终使得细菌发生裂解死亡。其中b-i和c-i图为相同尺寸下不同观察角度的透射电镜图；b-ii和c-ii图为不同尺寸不同观察角度的扫描电镜图。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本领域技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员公知技术。

Claims (8)

1.基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：制备胆碱丙氨酸离子液体备用；
S2：向1.9-2.0ml的超纯水中加入0.4mlCTAB(100mM)和0.1mlHAuCl4(10mM)，搅拌混合至溶液变澄清；
S3：向S2所得混合溶液中快速注入50-200μl的胆碱丙氨酸离子液体(1M)，搅拌混合一段时间后，向其中快速注入0.07-0.2ml抗坏血酸(100mM)，并继续搅拌混合一段时间后，停止搅拌并进行水浴处理，水浴温度29-32℃，水浴时间至少1.5h；
S4：将水浴处理后的溶液于4800-5500rpm下进行离心，离心后的颗粒分散在CTAB(1-100mM)溶液中既得金纳米花抗菌剂。
2.根据权利要求1所述的基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，其特征在于，S2中，搅拌条件为：600rmp下至少搅拌30s。
3.根据权利要求1所述的基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，其特征在于，S3中，向S2所得混合溶液中快速注50-200μl的胆碱丙氨酸离子液体(1M)，于600rpm下搅拌混合15-20s后，向其中快速注入0.07ml抗坏血酸(100mM)，并继续搅拌8-10min，之后在30℃下水浴2h。
4.根据权利要求1或3所述的基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，其特征在于，S3中，向S2所得混合溶液中快速注100μl的胆碱丙氨酸离子液体(1M)。
5.根据权利要求1所述的基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，其特征在于，对于大肠杆菌，金纳米花抗菌剂的最小抑菌浓度为16μg/mL。
6.根据权利要求1或5所述的基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，其特征在于，对于金黄色葡萄球菌，金纳米花抗菌剂的最小抑菌浓度为64μg/mL。
7.根据权利要求1所述的基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，其特征在于，S1中，胆碱丙氨酸离子液体的制备方法如下：在常温下，将氢氧化胆碱水溶液按1:1的摩尔比，缓慢滴入丙氨酸溶液中，搅拌至反应完全，之后蒸除多余水分后真空干燥得胆碱丙氨酸离子液体。
8.根据权利要求7所述的基于食源性离子液体合成金纳米花抗菌剂的制备方法，其特征在于，氢氧化胆碱水溶液和丙氨酸溶液的搅拌过程采用磁力搅拌，搅拌反应完全后于50℃下采用旋转蒸发以除去多余水分，后于65-75℃下真空干燥至恒重。
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