CN114981424A - 在染色质靶点处dna链断裂的诱导 - Google Patents

Abstract

本公开的一个方面涉及物质组合物，所述物质组合物包括编码肽的核苷酸构建体，所述肽至少包括：被配置为与具有降低的表观遗传抑制模式的染色质结合的靶向结构域；以及DNA链断裂诱导结构域。当通过在染色质位点结合而积累时，链断裂诱导结构域可能导致DNA的特异性双链断裂，诱导表现出表观遗传抑制模式的细胞中的细胞死亡。

Description

在染色质靶点处DNA链断裂的诱导

相关申请的交叉引用

本申请要求于 2020 年 1 月 17 日提交的美国临时申请号 62/962,766 的优先权，其全部内容通过引用并入本文作为参考。

背景技术

许多癌症类型与异常的表观遗传调节有关。肿瘤抑制基因通常通过表观遗传学下调而受到抑制，而生长和复制促进基因被上调。许多癌细胞类型发展出相似的表观遗传模式，导致不受控制的生长和失调。

发明内容

提供本发明内容以便以简化的形式介绍将在下面的详细描述中进一步描述的一些概念。本发明内容并非旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。此外，要求保护的主题不限于解决在本公开的任意部分中提到的任意或所有缺点的实现。

本公开的一个方面涉及物质组合物。该物质组合物包含编码肽的核苷酸构建体。所述肽至少包括被配置成结合至具有降低的表观遗传抑制模式的染色质的靶向结构域，和DNA链断裂诱导结构域。当通过结合染色质位点而累积时，链断裂诱导结构域可能会导致DNA 的特定双链断裂，从而诱导表现出降低的表观遗传抑制模式的细胞中的细胞死亡。

附图说明

图1示意性地说明了允许和抑制染色质包装的示例。

图2示出了包括与DNA链断裂诱导结构域偶联的甲基化敏感DNA结合结构域的示例性构建体。

图3示出了包含与DNA链断裂诱导结构域偶联的修饰敏感组蛋白结合结构域的示例性构建体。

图4示意性地示出了靶向癌细胞的物质的示例性组合物。

图5示出了用于治疗携带肿瘤的哺乳动物的示例性方法。

图6示出了通过低甲基化LINE-1元件的靶向诱导DNA损伤的实验数据。

具体实施方式

该具体实施方式提出了一种针对在许多癌症中发生的常见表观遗传变化的治疗方法，所述表观遗传变化包括组蛋白修饰的变化和重复 DNA 元件处胞嘧啶甲基化的丧失（“低甲基化”）。利用表观遗传抑制的这种丧失，可以进行精确影响异常细胞中的功能的治疗，而在健康的、适当调节的细胞中具有有限的活性。

典型的化疗剂，虽然通常对癌细胞有效，但经常受到对正常的、健康的细胞的“脱靶”不利影响的困扰。因此，开发新的化疗剂的主要目标是消除或最小化这些“脱靶”效应。实现这一目标的一种方法是通过靶向区分癌细胞与正常细胞的生物化学过程和/或事件。这种差异的一个例子是破坏大多数癌症中的正常 DNA 甲基化模式。这种失调可能表现为在基因组中特定位置处胞嘧啶甲基化的获得（高甲基化）和丧失（低甲基化）。

癌症中的基因特异性的高甲基化通常在与肿瘤抑制基因 (TSG) 的启动子相关的DNA 序列中发现。异常的高甲基化被认为是导致高甲基化 TSG 的转录被关闭或“沉默” 事件的表观遗传级联的重要部分。 TSG的沉默在肿瘤发生中起着显著和直接的作用。

另外或可选地，大多数癌症显示 DNA 甲基化的整体损失，其中大部分的这种损失发生在重复 DNA 序列中，这些序列（例如，长散布核元件 (LINE)、短散布核元件 (SINE)，例如 Alu 序列、LTR 反转录转座子、非 LTR 反转录转座子、DNA 转座子、中心粒周围重复序列等）构成人类基因组的重要部分 (例如，大约80%)。这种重复 DNA 序列的低甲基化被认为会导致染色体不稳定和增加突变事件，从而有助于驱动肿瘤发生。因此，异常的高甲基化和低甲基化都存在“肿瘤标记”。异常的甲基化标记可用于识别癌细胞，而使用新的靶向方法，可以在治疗上利用低甲基化特征来破坏或杀死癌细胞。

图 1 显示细胞内的 DNA 被包装成染色质，染色质是一种由作为基本构建块的核小体组成的动态结构。组蛋白是核小体的中心成分，形成包含四个核心组蛋白（H3、H4、H2A、H2B）、周围包裹着约 147 个碱基对的 DNA 片段的八聚体。每个组蛋白都有一个包括许多赖氨酸和精氨酸残基的特征性的氨基末端尾部。组蛋白尾部受到广泛的翻译后修饰，特别是在这些碱性残基上。这些修饰与 DNA 的 CpG 二核苷酸中的胞嘧啶残基的甲基化一起协同控制局部染色质的状态。

广义地说，染色质以活性/允许和限制/抑制状态存在。这些状态的示例在图1中示出。在 100 处，显示了四个组蛋白 (102) 在允许状态下包裹在 DNA (105，虚线) 中。其中，染色质是开放的（常染色质），允许转录因子和其他靶向 DNA 序列的结合剂。DNA 105包括未甲基化的 CpG 二核苷酸 107。显示出转录活性染色质的代表性组蛋白修饰指征，包括 H3K4me3 (110)、H3K9ac (112) 和 H3K27ac (114)。

在 150处，组蛋白 102 和 DNA 105 显示为处于抑制状态。染色质被浓缩（异染色质），阻止转录因子的结合。DNA 105 包括甲基化 ^mCpG 二核苷酸 152。显示出染色质转录失活的代表性组蛋白修饰指征，包括 H4K20me3 (160)、H3K9me3 (162)、H3K27me3 (164)和 H3K79me3 (166)。这些差异可用于靶向癌细胞和/或具有异常表观遗传调控的其他细胞。通过靶向具有降低的表观遗传抑制的重复模式的染色质，例如那些具有与异常表观遗传特征相关的 DNA 序列和组蛋白修饰的染色质，“正常”细胞可以单独存在，从而实现精确靶向。

本说明书提供了设计用于靶向和切割癌细胞中低甲基化的重复DNA序列的方法和物质组合物。这可以使用甲基化敏感的序列特异性 DNA 结合剂和/或特异性靶向与活性染色质缔合的组蛋白部分的试剂来完成。此类靶向剂可以与DNA链断裂诱导剂偶联，例如转录激活因子型效应核酸酶(TALEN)或其他靶向DNA核酸酶/机器，例如以甲基化敏感方式切割DNA的那些。在靶向癌细胞中诱导的由此产生的全基因组双链断裂 (DSB) 旨在通过细胞凋亡过程或其他细胞死亡机制触发它们的死亡。

作为一个实施例，低甲基化诱导的靶介导的细胞凋亡 (HITMA) 可用于特异性靶向和诱导癌症和其他疾病中低甲基化、重复 DNA 元件中的 DSB。与在正常细胞中适当甲基化的相同序列相比，引发 HITMA的试剂（HITMA 剂）和组合物可以显着的特异性地靶向并结合染色质中与这些低甲基化重复元件相关的特定序列。通过这种方式，癌细胞对细胞凋亡的诱导可能比正常细胞高很多倍。

如本文所用，术语“甲基化敏感性”是指肽或核酸，其与靶 DNA 序列的结合亲和力因 DNA（例如胞嘧啶）甲基化和/或组蛋白修饰和/或其他潜在的通常与 DNA 甲基化有关的染色质结构而改变。在本文的大多数实施例中，“甲基化敏感性”表示与未甲基化的DNA相比，此类试剂与甲基化的DNA的结合受到抑制和/或显著降低。然而，在一些实施例中，“甲基化敏感性”可以指对甲基化 DNA 序列具有更高结合亲和力（例如，甲基化亲和力）的试剂。

许多基因毒性抗癌药物（例如博来霉素、依托泊苷、喜树碱）和治疗（例如电离辐射）会诱导 DSB，DSB是一种特别具有细胞毒性的 DNA 损伤，因为它很难修复。DSB 的积累触发了一系列事件，导致细胞凋亡（程序性死亡）。然而，这些抗癌治疗中的大多数还会对正常细胞造成不利的脱靶效应。此外，有些难以用于某些癌症类型，而且许多需要联合施用可能进一步损伤正常细胞的其他药物或治疗。

图2示出了可用于诱导癌细胞中的靶向甲基化敏感双链断裂的示例性物质组合物。在200处，示出了包含一对肽分子(202、205)的组合物201，每个肽分子具有靶向结构域(210a和210b)，物理偶联至DNA链断裂诱导结构域(212a和212b)。可以看出，每个肽分子进一步包括在各自的靶向结构域和DNA链断裂诱导结构域之间的连接结构域(214a和214b)，以及末端结构域(216a和216b)。每个末端结构域可用于纯化、稳定、靶向或以其他方式辅助肽分子的功能。

作为一个实施例，组合物201可以归入一类试剂中，该类试剂包括转录激活因子型效应核酸酶(TALEN)，其是包括可定制的DNA结合结构域和核酸酶结构域（例如FokI限制性内切酶的核酸酶结构域）的人工核酸酶。然而，靶向结构域210a可以包括识别靶DNA序列并且对其识别序列的DNA甲基化敏感的任何合适的靶向结构域(例如，基于DNA、RNA和/或肽的)。识别序列可以与重复元件相关联，并且可能具有癌症特异性的低甲基化模式。靶向结构域210b可以被配置为在靶向结构域210a的阈值距离内的相邻序列处结合，以诱导双链断裂。例如，靶向结构域210a和210b可以结合到相对DNA链上的序列，以便在碱基对的阈值数目内诱导两条链上的链断裂。其他实施例中靶向结构域结合组蛋白或其他基于蛋白质的染色质结构和修饰在本文和关于图3进行了描述。

类似地，DNA链断裂诱导结构域212a和212b可以包含任何合适的DNA链断裂诱导剂（例如，核酸酶、限制性酶、化学试剂、纳米机器、催化RNA）。在一些实施例中，链断裂诱导结构域可以包括一种或多种化学试剂、生化试剂、机械试剂（例如，DNA剪辑纳米机器）、生物机械试剂、和/或当被带入 DNA 分子附近时能够产生单链或双链断裂其他生物试剂（例如，肽核酸酶结构域、催化RNA）。在一些实施例中，DNA链断裂诱导剂可能对DNA甲基化敏感（例如，甲基化敏感的限制性内切酶结构域）。

靶向结构域 210a 和 210b 可以设计为靶向几乎任何序列基序，并且可以对其识别序列的 DNA 甲基化敏感。例如，在200处，示出了甲基化DNA序列220。甲基化的胞嘧啶残基阻止靶向结构域210a和210b的结合。由于链断裂诱导结构域212a和212b不与DNA邻近结合，因此在重复序列中不产生DSB。然而，在250处，低甲基化重复序列255使得靶向域210a和210b能够结合到它们各自的识别序列。然后，将DNA链断裂诱导结构域212a和212b足够接近地(例如，在阈值距离内)定位在DNA序列255处，以便当每条链断裂时在重复DNA序列255中产生双链断裂。

靶向结构域210a和210b可以结合相同的重复序列基序或不同的序列基序，使得结构域与序列的结合使核酸酶结构域在彼此的阈值距离内配对。例如，DNA 结合结构域的高特异性和易于设计使得研究人员能够使用 TALEN 在各种生物体中进行靶向基因组编辑。为了在 DNA 中产生 DSB，可以使用两种 TALEN 单体，一种用于结合 DNA 的顶部（Watson）链，如 250 所示，另一种结合 DNA 的底部（Crick）链，其间有约 15-30 个碱基对的间隔区。通过靶向重复序列，可以在整个基因组中产生大量 DSB，这可能更有可能触发细胞凋亡的发生。

因此，HITMA 可以应用每个 TALEN 单体的 DNA 结合结构域区域的设计，以靶向重复 DNA 序列中适当间隔的识别序列。这些识别序列可包含一个或多个CpG二核苷酸，其中胞嘧啶(C)在正常细胞中通常是甲基化的，但在癌症中异常甲基化不足。不同的重复元素在不同的癌症类型/亚型中显示出可变的异常甲基化不足，因此很可能的是不同的 HITMA-TALEN，并且可能将靶向结构域和双链断裂诱导结合域的组合设计为特异性靶向每种癌症类型和亚型。

在另一个实施例中，图3示出了包括与DNA链断裂诱导结构域偶联的修饰敏感性组蛋白结合结构域的肽构建体实例。在300处，示出了肽构建体310，其包括通过接头区316与DNA链断裂诱导结构域315偶联的修饰敏感性组蛋白结合结构域312。利用图1所示的示例性染色质构建体，修饰敏感性组蛋白结合结构域312可以结合允许染色质114内的组蛋白，例如以未修饰的H3K79部分为特征的组蛋白。这样，在300处，肽构建体310可以结合组蛋白，使DNA链断裂诱导结构域315接近DNA 105，由此可以诱导DNA链断裂。

相反，在 350 处，由于抑制性染色质具有 H3K79me3 部分，肽构建体 310 可能不会通过修饰敏感性组蛋白结合结构域 312 与组蛋白结合，因此 DNA 链断裂诱导域 315不能作用于 DNA 105。在其他示例中，其他部分，例如组蛋白 H3K9 甲基化可用于区分组蛋白。在一些实施例中，修饰敏感性组蛋白结合结构域可以与甲基化敏感性DNA结合结构域和/或链断裂诱导结构域配对，从而为健康染色质提供额外的保护层。组合物可以包括两种或更多种肽，其中呈现了多个不同的修饰敏感性组蛋白结合结构域和/或甲基化敏感性DNA结合结构域。因此，多个 DNA 链断裂诱导结构域可能位于彼此接近的位置，从而增加了产生双链断裂的可能性。

本文讨论了 HITMA 方法的许多变化，但这些不是限制性变化。HITMA-TALEN 构建体可以通过多种方式进行修改。例如，最近的研究报告说，修饰的 FokI 结构域ELD 和 KKR的异二聚化会增加核酸酶的活性。在其中可以在待靶向的重复序列中识别适当间隔的回文序列基序的情况下，将可能仅使用单个 TALEN 单体。据进一步报道，当非特异性核酸内切酶 FokI 被序列特异性 I-TevI归巢核酸内切酶替代时，可以用 TALEN::I-TevI单体诱导DSB。这种方法可适用于其他作为单体起作用的归巢核酸内切酶，但可能不适用于经典的II 型限制性内切酶，因为这些酶通常作为二聚体起作用。缺点是要求内切核酸酶的特异性识别序列位于靶序列内。该平台还允许灵活地用于其他工程化HITMA 靶向的方法，例如以下指定的方法，这些方法可能包括但不限于改变试剂的 DNA 甲基化敏感性结构域、改变促进核酸酶活性变构激活的区域、DNA -靶向特异性等。

在一些实施例中，可使用除TALEN之外的试剂将核酸内切酶靶向低甲基化的重复序列。作为一个实施例，可以使用限制酶(RE)或其他内切核酸酶。有许多 RE对靶序列中的甲基化胞嘧啶敏感的实施例。然而，大多数 RE的识别序列都很短，并且对重复序列不是特异性的。在癌细胞和正常细胞中的其他基因组序列可能会发生显著的脱靶切割。 RE，很可能是甲基化敏感性的，可以连接到其他蛋白质（TAL、锌指蛋白、“酶促死亡”CAS9 (dCAS9)、DNA 结合结构域等）上，这些蛋白质可以将它们引导至特定序列，这种连接可以是一个在癌症中的异常低甲基化序列上靶向和诱导 DSB 的成功方法的实施例。

可以对大范围核酸酶进行工程改造以靶向特定序列，但这种蛋白质工程改造比改造TALEN要困难得多。据报道，大范围核酸酶对 DNA 甲基化具有一定的敏感性，这取决于甲基化的胞嘧啶在其识别位点内的位置。如果可以克服蛋白质工程挑战，这可能是一种很好的方法。

成簇规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 代表了一种技术，它可以靶向特定序列，但与使用 TALEN 相比，具有更大的脱靶效应潜力。CRISPR 对引导 RNA (gRNA) 靶序列的 DNA 甲基化不敏感，但有证据表明，通常与 DNA 甲基化相关的高阶染色质结构可以抑制其访问。这种方法的有效性可以很容易地在细胞系（癌症与正常）中进行测试。 CRISPR还可以潜在地用于基于 HITMA 的方法中作为以降低或抑制 gRNA 与甲基化 DNA 序列杂交的能力的方式修饰 gRNA 核苷酸的机制。

锌指核酸酶(ZFN)可以被设计成靶向几乎任何序列基序，但目前对 DNA 甲基化不敏感。然而，以这种方式修饰锌指结合结构域使得 DNA 结合结构域对 DNA 甲基化敏感，可能为实施 HITMA 方法提供了另一种选择。

组合的“布尔逻辑”DNA 和甲基化状态特异性靶向可用于增强特异性和系统的一些效率。在一些例子中，可以使用递送系统，其中甲基化特异性DSB制剂和 DNA 序列特异性靶向制剂并行加入，而不是组合在同一制剂中。在这个系统中，甲基化敏感性核酸酶或 DSB诱导剂可以被设计成其激活取决于 DNA 序列特异性试剂的募集情况。这将允许将多种DNA 序列特异性试剂引入到存在甲基化敏感性 DSB 试剂的系统中。这种类型的系统可以具有许多优点，包括但不限于：1）在经由用于DNA特异性靶向的单个载体可以同时靶向的序列的数量方面更加容易/灵活；2）将 HITMA 组分分成可增强传输的更小的传输载体；3)通过将 DSB 效应物及其激活剂分离到单独的载体中来增加安全性。

图4示意性地示出了示例性癌细胞400，其至少包括细胞核405、基因组410、内质网415和至少表达细胞表面受体421、422、423和424的细胞膜420。向癌细胞400递送一种或多种所述的HITMA试剂可以以多种方式发生。第一组合物430可以包括编码HITMA试剂的DNA载体。第一组合物430可以靶向表面受体421，并且可以靶向递送至细胞核405。一旦处于癌细胞400中，所包含的DNA载体可以暂时存在（例如，未整合到基因组中）可以在位点431随机或靶向整合到基因组410中。 HITMA试剂编码序列的表达可以由组成型表达的启动子、诱导型启动子驱动，或者为了提供进一步的癌症特异性，在靶向的癌症类型/亚型中具有活性的启动子。

在另一个实施例中，第二组合物435可以包括编码一种或多种HITMA试剂的mRNA。第二组合物435可以结合表面受体422，并且可以被靶向递送至内质网415，以翻译成HITMA试剂肽。在其他实施例中，第三组合物440可以是编码HITMA试剂并通过表面受体423递送至细胞400的病毒或逆转录病毒。第四组合物445包括HITMA试剂肽本身，并且可以通过表面受体424靶向细胞核405。

HITMA试剂的递送机制，无论是作为肽还是核苷酸构建体，都为提高癌细胞的选择性和生物利用度提供了进一步的机会。如 450 所示，HITMA 试剂可以被包封在脂质体、胶束或特殊设计的纳米颗粒中，这些纳米颗粒优先通过称为胞吞作用的过程被癌细胞吸收。可以使用产生物理梯度或改变生物物理特性的其它方法，例如对流增强递送，来改善组合物的递送，特别是对实体瘤的递送。通过称为“增强渗透和保留 (EPR) 效应”的机制，这种递送载体的可用性对于实体瘤通常更大。这些递送载体可以通过附着靶向在癌细胞中过度表达的细胞表面受体的肽配体或抗体来进一步修饰。类似地，病毒和逆转录病毒可以靶向这些过度表达的细胞表面受体。

一旦进入癌细胞中，HITMA试剂450可以寻找并结合到低甲基化重复DNA序列和/或组蛋白部分，它们被设计为通过链断裂诱导结构域的作用靶向并产生DSB。由于目标序列的重复性，可能会出现大量 DSB。如果癌细胞的 DNA 修复机制修复了 DSB，那么 HITMA 试剂的持续存在可能会继续诱导 DSB，直到在癌细胞中的细胞死亡途径被触发。由于许多癌症已经缺乏 DSB 的 DNA 修复，这使得它们在本质上对 HITMA 试剂的细胞凋亡诱导作用更敏感。

图5示出了根据当前公开的用于治疗表观遗传抑制降低的哺乳动物细胞的示例性方法500。作为非限制性示例，方法500可用于治疗人类细胞，或多个患有肿瘤的人类细胞。

在510，方法500包括产生肽，该肽包括被配置为结合染色质的靶向结构域，该染色质具有与DNA链断裂诱导结构域偶联的降低的表观遗传抑制的模式。在一些实施例中，肽可以在细胞外部产生。附加地或替代地，方法500可包括提供编码肽的核苷酸构建体，并在细胞内诱导肽的产生，如按照图4所述。

在520，方法500包括将治疗剂量的所产生的肽引导至细胞核。在其中肽于细胞外部产生的实施例中，它可以被包装在包括针对靶向细胞核的一种或多种细胞表面受体的结合剂的组合物中。在肽于细胞内产生的实施例中，一个或多个靶向序列可以被包括在核苷酸构建体中，当转录时，该靶向序列将肽引导至细胞核。

在530，方法500包括在核的DNA中产生双链断裂，通过将靶向结构域与核的染色质结合，使DNA链断裂诱导结构域接近所述核的DNA。在一些实施例中，方法500可以包括产生第二肽，所述第二肽包括与第二靶向结构域偶联的第二DNA链断裂诱导结构域，所述第二靶向结构域被配置为与重复元件相关的第二DNA序列结合，所述第二DNA序列位于相反链上第一DNA序列的阈值距离内，并且将治疗剂量的第二产生的肽引导至细胞核，如按照图2在540处继续描述的，方法500可以包括通过在细胞核的DNA中累积阈值数量的双链断裂来触发细胞凋亡。

图6显示实验数据600，其显示通过低甲基化LINE-1元件的靶向诱导DNA损伤。在这个实施例中，TALEN的表达被设计为靶向长分散核元件 1 (LINE-1) 重复元件的 CpG 岛，从而引起位于 SW480 结肠癌细胞系中的丝氨酸 139残基 (γH2A.X) 磷酸化的组蛋白变体 H2A.X的诱导。LINE-1 元件的正常 DNA 甲基化（异常低甲基化）的丧失是 SW480 结肠癌细胞系的一个特征（参见 Kawakami 等人，Cancer Sci. 2011 Jan；102(1):166-74）。γH2A.X 的诱导是 DNA 损伤（例如，双链 DNA 断裂）的一个指征。

SW480细胞要么被模拟转录(顶行，610)，用喜树碱（中间行，615），一种已知的DNA双链断裂诱导剂处理，要么被LINE-1 TALEN(s) mRNA转染，在其 5' 端（底行，620）编码 V5表位标签。24 小时后，将细胞在 4% 多聚甲醛中在室温下固定 10 分钟，然后通过在封闭缓冲液（1 × 磷酸盐缓冲盐水 [PBS]、5% 正常山羊血清、0.3% Triton X-100）中孵育 60分钟来封闭/透化。封闭后，将细胞与抗V5表位（中间柱，625）和 γH2A.X（细胞信号技术）（右侧柱，630）的抗体在 4℃下孵育过夜，然后用 1 X PBS（3x - 5分钟）。然后将细胞与Alexa Fluor® 偶联二抗（细胞信号技术）在室温下避光孵育 60 分钟，用 1 × PBS 洗涤（3x - 5 分钟），然后用含有 DAPI （赛默飞世尔科技）的 Prolong Diamond Antifade 试剂- 核 DNA 染色剂（左栏，635）覆盖。免疫染色的细胞用荧光细胞成像仪可以观察和获取图像。

如在 640 处所见，用 LINE-1 TALEN mRNA 转染的细胞表现出与用喜树碱处理的细胞（645）相似的、显著的 yH2AX 诱导，因此表明LINE-1 TALEN被表达了，并且表达的肽确实诱导了SW480 癌细胞的凋亡。

此外，当将“成对”的 LINE-1 TALEN 转染到细胞中时，以及当使用单个 LINE-1TALEN 时，都可以看到磷酸化 的H2A.X 蛋白诱导。LINE-1 元件可以是高度重复的，并且在核的不连续部分中聚集在一起。这种聚集可以将阈值量的单个 TALEN 元件的 FokI 核酸酶结构域聚集在一起，以引起它们的激活。

在许多实施例中，可以使用用于增强 HITMA 的联合治疗方法。使用药物（例如PARPi、DNA-Pki）或其他方法（例如 siRNA、RNAi、CRISPR 等）来抑制细胞中的 DSB DNA 修复过程可能会增强 HITMA 的凋亡作用。事实上，DSB能够触发细胞凋亡的证据来自对 DNA修复缺陷细胞系的研究。通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组 (HR) 修复 DSB 缺陷的细胞对 IR 诱导的细胞杀伤敏感，其中 NHEJ 起主要保护作用。其他药物可能通过抑制抗凋亡蛋白（例如 [Bcl-2]、凋亡抑制蛋白、FLICE 抑制蛋白 [c-FLIP]）和/或上调促凋亡蛋白（例如 BAX）来促进 HITMA 的凋亡作用。其他药物（如 5-氮杂胞苷、5-氮杂-2'-脱氧胞苷等）或方法（如 siRNA、RNAi、CRISPR 等）可用于抑制 DNA 甲基转移酶（DNMTs）的活性，从而减少癌细胞中的 DNA 甲基化以增强 HITMA 效应。类似地，设计为靶向抑制性染色质状态的分子也可用于增强 HITMA 的可及性和靶向性，例如影响组蛋白翻译后修饰沉积的分子（例如，组蛋白脱乙酰化酶抑制剂 (HDACi)、多梳抑制复合物抑制剂）、影响组蛋白翻译后修饰识别的分子（例如，溴结构域抑制剂），以及影响染色质结构的分子（例如，染色质重塑抑制剂）。

虽然主要针对人类癌症治疗进行了描述，但 HITMA 也可用于非人类哺乳动物的兽医药物中。尽管还没有研究伴侣动物中发现的癌症的异常 DNA 甲基化到其在人类中的程度，但在动物癌症中也会发生类似的异常的甲基化异常。重复序列因物种而异，因此，可以设计物种特异性 HITMA-TALEN。

为了，特异性靶向和诱导癌症中低甲基化重复 DNA 序列中的 DSB 以诱导癌细胞中的细胞凋亡是新颖的和非显而易见的。因在正常细胞中预期的“脱靶”效应有限，它还具有癌症特异性的优点。此外，可以将独特的 HITMA 方法应用于每种癌症类型/亚型，从而创建 HITMA 治疗剂的目录。通过选择 HITMA 的递送、选择 用于HITMA 表达的启动子以及通过选择用于联合治疗的补充疗法，可以进一步增强这种方法的癌症特异性。

定义（改编自维基百科）

“DNA甲基化”描述的是，在嘧啶环上的5位发生胞嘧啶甲基化形成5-甲基胞嘧啶。在哺乳动物中，DNA 甲基化几乎只存在于 CpG 二核苷酸中，两条链上的胞嘧啶通常都是甲基化的。

“重复 DNA 序列”——（也称为重复序列、重复元件、重复单元或重复）是在整个基因组中以多个副本出现的核酸模式。重复序列或重复序列的主要类别包括但不限于：串联重复序列——直接或倒置的彼此相邻的副本；卫星 DNA —— 通常存在于着丝粒和异染色质中；小卫星——大约 10 到 60 个碱基对的重复单元，存在于基因组的许多地方，包括着丝粒；微卫星——少于 10 个碱基对的重复单元；这包括端粒，通常有 6 到 8 个碱基对重复单元；散布的重复序列（又名散布的核元件）；转座因子； DNA转座子；反转录转座子；LTR-反转录转座子 (HERVs)；非 LTR 反转录转座子； SINE（短散布核元件）； LINE（长散布核元件）；和 SVA。

“转录激活因子型效应器”(TALE) 包括黄单胞菌在感染各种植物物种时通过其III 型分泌系统分泌的蛋白质。这些蛋白质可以结合宿主植物中的启动子序列，并激活有助于细菌感染的植物基因的表达。它们通过由可变数量的约 34 个氨基酸重复组成的中心重复结构域识别 DNA 序列。

“转录激活因子型效应核酸酶”(TALEN) 包括可以被工程化以切割DNA的特定序列的限制性内切酶。它们可以通过将 TAL 效应子 DNA 结合结构域与 DNA 切割结构域（切割DNA 链的核酸酶）融合来制备。 TALE 可以被工程化为与几乎任何所需的 DNA 序列结合，因此当与核酸酶结合时，可以在特定位置切割 DNA。

“细胞凋亡”是在多细胞生物中发生的程序性细胞死亡的一种形式。“基因毒性”描述了化学试剂破坏细胞内的遗传信息而引起突变的性质，所述突变可导致癌症。 “核酸内切酶”是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。“归巢核酸内切酶”是编码为内含子中的独立基因、或编码为与宿主蛋白的融合体、或编码为自剪接内含肽（例如，能够自我切除并催化蛋白质剩余部分的肽结合的蛋白质片段）的核酸内切酶的集合。它们在合成它们的细胞内催化基因组 DNA 的水解，但在极少数甚至单一位置进行水解。宿主细胞对水解 DNA 的修复经常导致编码归巢核酸内切酶的基因被复制到切割位点，因此使用“归巢”一词来描述这些基因的运动。

在一个实施例中，一种物质组合物包括编码肽的核苷酸构建体，所述肽至少包括：被配置为与具有降低的表观遗传抑制模式的染色质结合的靶向结构域；和 DNA 链断裂诱导结构域。在这样的实施例或任何其他实施例中，靶向结构域另外或可选地被配置为与和DNA甲基化不相关的组蛋白部分结合。在任何前述实施例或任何其他实施例中，所述靶向结构域附加地或可替代地为甲基化敏感性DNA结合结构域，其被配置为与重复元件相关的第一DNA序列结合，该DNA序列具有癌症特异性低甲基化模式。在任何前述实施例或任何其他实施例中，与重复元件相关的第一DNA序列附加地或可替代地为长散布核元件(LINE)序列。在任何前述实施例或任何其他实施例中，所述核苷酸构建体额外地或可替代地编码第二肽，所述第二肽包含第二靶向域，该第二靶向域被配置为与重复元件相关的第二DNA序列结合，第二DNA序列位于相对链上第一DNA序列的阈值距离内；和 DNA 链断裂诱导结构域。在任何前述实施例或任何其他实施例中，所述DNA链断裂诱导结构域额外地或可替代地包括核酸酶结构域。在任何前述实施例或任何其他实施例中，核酸酶结构域附加地或可替代地包括FokI核酸酶结构域。在任何前述实施例或任何其他实施例中，所述DNA链断裂诱导结构域附加地或可替代地包括甲基化敏感核酸酶结构域。在任何前述实施例或任何其他实施例中，核苷酸构建体附加地或可替代地是mRNA构建体。在任何前述实施例或任何其他实施例中，核苷酸构建体附加地或可替代地是DNA构建体。

在另一个实施例中，一种治疗具有降低的表观遗传抑制的哺乳动物细胞的方法，包括产生包括靶向结构域的肽，所述靶向结构域被配置为结合具有与DNA链断裂诱导结构域偶联的降低的表观遗传抑制模式的染色质；将治疗剂量的所产生的肽导向细胞核；通过将靶向结构域与细胞核的染色质结合，使 DNA 链断裂诱导结构域靠近所述细胞核的 DNA，从而在所述细胞核的 DNA 中产生双链断裂；以及通过在细胞核的DNA中累积阈值数量的双链断裂来触发细胞凋亡。在这样的实施例或任何其他实施例中，该方法附加地或可替代地包括提供编码所述肽的核苷酸构建体；并诱导细胞内肽的产生。在任何前述实施例或任何其他实施例中，附加地或可替代地，将治疗剂量的所产生的肽导向细胞核包括将肽包装在组合物中，所述组合物包括一种或多种靶向细胞核的细胞表面受体的结合剂。在任何前述实施例或任何其他实施例中，所述靶向结构域附加地或可替代地被配置为与DNA甲基化不相关的组蛋白部分结合。在任何前述实施例或任何其他实施例中，所述靶向结构域另外或可替代地为甲基化敏感性DNA结合结构域，其被配置为与重复元件相关并具有癌症特异性低甲基化模式的第一DNA序列结合。在任何前述实施例或任何其他实施例中，所述方法附加地或可替代地包括产生第二肽，所述第二肽包括与第二靶向结构域偶联的第二DNA链断裂诱导结构域，所述第二靶向结构域被配置为与重复元件相关的第二DNA序列结合，所述第二DNA序列位于相对链上第一DNA序列的阈值距离内；以及将治疗剂量的第二种产生的肽导向细胞核。在任何前述实施例或任何其他实施例中，所述核酸酶结构域附加地或可替代地包括FokI核酸酶结构域。

在又一个实施例中，一种物质组合物包括第一肽，所述第一肽包括与第一甲基化敏感性DNA结合结构域偶联的第一核酸酶结构域，所述第一核酸酶结构域被配置为与重复元件相关的并且具有癌症特异性重复低甲基化模式的第一DNA序列结合；第二肽，包括与第二甲基化敏感性DNA结合结构域偶联的第二核酸酶结构域，所述第二核酸酶结构域被配置为在与相对链上的第一DNA序列相距阈值距离处结合第二DNA序列。在这样的实施例或任何其他实施例中，第一和第二核酸酶结构域另外或可选地包括FokI核酸酶结构域。在任何前述实施例或任何其他实施例中，具有癌症特异性重复低甲基化模式的第一DNA序列附加地或可替代地是长散布核元件(LINE)序列。

应当理解，这里描述的配置和/或方法本质上是示例性的，并且这些特定实施例或示例不应被认为具有限制意义，因为许多变化是可能的。本文描述的特定例程或方法可以代表任意数量的处理策略中的一个或多个。这样，所示和/或描述的各种动作可以以所示和/或描述的顺序，以其他顺序、并行或省略来执行。同样，可以改变上述处理的顺序。

本公开的主题包括各种过程、系统和配置以及本文公开的其他特征、功能、动作和/或特性的所有新颖和非显而易见的组合和子组合，以及任何及其所有等价物。

Claims (20)

1.一种物质组合物，包括：

编码肽的核苷酸构建体，所述肽至少包括：

被配置为与具有降低的表观遗传抑制模式的染色质结合的靶向结构域；以及

DNA 链断裂诱导结构域。

2.根据权利要求1所述的物质组合物，其特征在于，所述靶向结构域被配置为与和DNA甲基化不相关的组蛋白部分结合。

3.根据权利要求1所述的物质组合物，其特征在于，所述靶向结构域为甲基化敏感DNA结合结构域，被配置为与重复元件相关的第一DNA序列结合，所述DNA序列具有癌症特异性低甲基化模式。

4.根据权利要求3所述的物质组合物，其特征在于，所述与重复元件相关的第一DNA序列为长散布核元件(LINE)序列。

5.根据权利要求3所述的物质组合物，其特征在于，所述核苷酸构建体进一步编码第二肽，所述第二肽包括：

被配置为与重复元件相关的第二DNA序列结合的第二靶向域，所述第二DNA序列位于相对链上第一DNA 序列的阈值距离内；以及

DNA 链断裂诱导结构域。

6.根据权利要求1所述的物质组合物，其特征在于，所述DNA链断裂诱导结构域包括核酸酶结构域。

7.根据权利要求6所述的物质组合物，其特征在于，所述核酸酶结构域包括FokI核酸酶结构域。

8.根据权利要求1所述的物质组合物，其特征在于，所述DNA链断裂诱导结构域包括甲基化敏感核酸酶结构域。

9.根据权利要求1所述的物质组合物，其特征在于，所述核苷酸构建体是mRNA构建体。

10.根据权利要求1所述的物质组合物，其特征在于，所述核苷酸构建体是DNA构建体。

11.一种治疗具有降低的表观遗传抑制的哺乳动物细胞的方法，其特征在于，包括：

产生包括靶向结构域的肽，所述靶向结构域被配置为结合具有与DNA链断裂诱导结构域偶联的降低的表观遗传抑制模式；

将治疗剂量的所产生的肽导向细胞核；

通过将靶向结构域与细胞核的染色质结合，使 DNA 链断裂诱导结构域靠近所述细胞核的 DNA，从而在所述细胞核的 DNA 中产生双链断裂；以及

通过在细胞核 DNA 中累积阈值数量的双链断裂来触发细胞凋亡。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，还包括：

提供编码所述肽的核苷酸构建体；以及

诱导细胞内肽的产生。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，将治疗剂量的所产生的肽导向细胞核包括将肽包装在组合物中，所述组合物包括一种或多种靶向细胞核的细胞表面受体的结合剂。

14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述靶向结构域被配置为与DNA甲基化不相关的组蛋白部分结合。

15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述靶向结构域为甲基化敏感DNA结合结构域，被配置为与重复元件相关并具有癌症特异性低甲基化模式的第一DNA序列结合。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，还包括：

产生第二肽，所述第二肽包括与第二靶向结构域偶联的第二DNA链断裂诱导结构域，所述第二靶向结构域被配置为与重复元件相关的第二DNA序列结合，所述第二DNA序列位于相对链上第一DNA序列的阈值距离内；以及

将治疗剂量的第二种产生的肽导向细胞核。

17.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述核酸酶结构域包括FokI核酸酶结构域。

18.一种物质组合物，其特征在于，包括：

第一肽，包括与第一甲基化敏感DNA结合结构域偶联的第一核酸酶结构域，所述第一核酸酶结构域被配置为与重复元件相关并具有癌症特异性重复低甲基化模式的第一DNA序列结合；以及

第二肽，包括与第二甲基化敏感性DNA结合结构域偶联的第二核酸酶结构域，所述第二核酸酶结构域被配置为在与相对链上的第一DNA序列相距阈值距离处结合第二DNA序列。

19.根据权利要求18所述的物质组合物，其特征在于，所述第一和第二核酸酶结构域包括FokI核酸酶结构域。

20.权利要求18的物质组合物，其特征在于，具有癌症特异性重复低甲基化模式的第一DNA序列是长散布核元件(LINE)序列。

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