CN114980909A - 用于坏死性小肠结肠炎的无细胞胎盘治疗 - Google Patents

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Abstract

一种液体制剂，其包含胎盘组织的无细胞提取物和溶剂，当将治疗有效量的该液体制剂递送到受试者的胃系统时，其可以预防该受试者的肠道病症的发作或减轻该受试者中的肠道病症的症状。

Description

用于坏死性小肠结肠炎的无细胞胎盘治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年11月27日提交的美国临时申请第62/941,382号的权益，其通过引用整体并入本文。
本申请的申请人/受让人已经得到由美国国立卫生研究院授予的SBIR1R44HD100243-01A1下的美国政府支持。美国政府可以拥有本发明的某些权利。
发明领域
本申请总体上涉及生物组合物以及其使用方法。更具体地，但不通过限制性的方式，本申请涉及源自胎盘膜的提取物的组合物以及其使用方法。
技术背景
肠道疾病，包括坏死性小肠结肠炎(NEC)，可以影响生活质量和患者死亡率。NEC和其他肠道障碍可以导致小肠(intestine)和直肠(bowel)的坏死或穿孔，这可能需要肠道切除以去除患病或受损的组织。穿孔的直肠可以允许细菌从小肠进入腹腔，并且可以导致危及生命的感染，包括腹膜炎。许多NEC病例可能需要肠切除。大多数NEC病例发生在具有低出生体重的极早产婴儿中。NEC缺乏治愈方法，并且受NEC影响的新生儿的死亡率可以最高达30％。用于NEC的治疗已包括给予广谱抗生素、启动肠休息以及提供体液和肌力支持(inotropic support)以维持心肺功能。其他治疗针对早产肠道的不良微生物防御并且寻求用抗生素和益生菌使肠道微生物组正常化。
概述
本文描述了可以用于预防或治疗受试者的肠道病症诸如坏死性小肠结肠炎(NEC)的制剂。例如，制剂可以预防性地用于受试者中以预防NEC的发生。在一些实例中，制剂可以是可以口服给药的液体。口服制剂可以包含胎盘组织的无细胞提取物和溶剂。在一些实例中，胎盘组织可以包含胎盘盘(placental disc)。在一些实例中，溶剂可以包含奶、水、盐水、乳酸钠溶液或糖溶液。任选地，口服制剂可以进一步包含稀释剂、赋形剂、载体或一种或多种外源性蛋白酶抑制剂。
本文还描述了用包含胎盘组织的无细胞提取物和溶剂的液体制剂预防或减轻受试者的肠道病症的症状的方法。在一些实例中，该方法可以包括获得液体制剂和将治疗有效量的液体制剂递送到受试者的胃系统。在一些实例中，受试者可以是具有1500克或更低的出生体重的早产婴儿。在一些实例中，可以将液体制剂通过自然喂养或口胃管口服递送到胃系统，或者通过胃饲管或十二指肠饲管经皮递送到胃系统。
附图简述
图1是具有蛋白酶抑制剂的胎盘盘提取物、足月羊水和16-20周羊水的蛋白质浓度的图表。
图2是一系列胎盘盘提取物蛋白质浓度下空肠细胞生长的图表。
图3是一系列胎盘盘提取物蛋白质浓度下空肠细胞生长的图表。
图4是响应LPS刺激的一系列胎盘盘提取物蛋白质浓度的MIF浓度的图表。
图5是响应LPS刺激的一系列胎盘盘提取物蛋白质浓度的IL-10浓度的图表。
图6是响应LPS刺激的一系列胎盘盘提取物蛋白质浓度的TNF浓度的图表。
详述
本申请的某些方面和特征涉及包含胎盘组织提取物的制剂。在一些实例中，制剂可以用于预防或治疗受试者的肠道病症。例如，制剂可以预防性地用于受试者中以预防坏死性小肠结肠炎(NEC)的发生。
NEC可以是危及生命的疾病。NEC可以影响新生儿，其中早产婴儿的NEC风险最大。NEC的大多数病例发生在具有小于1500克(3.3磅)的出生体重的极早产婴儿中。肠未成熟及其先天免疫应答可能是新生儿中NEC发生的因素。其他因素可以是肠道微生物定殖的改变或缺氧、缺血和/或再灌注损伤。在一些情况下，NEC的治疗可以靶向未成熟肠的炎症倾向。
在一些实例中，羊水替代品可以加速肠成熟并抑制可以引发或加剧NEC的炎症驱动的微血管功能障碍。在子宫内，胎儿可以吞咽可以具有抗炎特性并可以预防感染的羊水。在晚期妊娠期间，人胎儿可以每天吞咽约800mL的羊水。通过早产或胎膜早破剥夺羊水可以延迟胎儿肠的成熟或成熟可能进行得更慢。
在一些实例中，羊水替代品可以使用胃肠道给药。在一些实例中，给药可以口服进行。在一些实施方案中，羊水替代品包含：足月、分娩后哺乳动物胎盘的胎盘组织的无细胞提取物的无细胞制剂(描述在于2019年1月28日提交的美国专利申请第16/321,075号中，其通过引用并入本文中)，可以非常类似于孕中期羊水。该制剂可以提取和保存储存在胎盘盘内的细胞因子和生长因子，并且排除羊膜上皮细胞和炎性趋化因子，它们合成并释放到足月羊水中以引发分娩或对抗胎膜破裂之后的潜在感染。胎盘组织的无细胞提取物的炎性趋化因子环境可以低于足月羊水，尤其是其IL-6与IL-10的比率。在一些实例中，包含类似于16至20周羊水的胎盘组织的无细胞提取物的制剂可以预防或减少新生儿中NEC的发生。在一些实例中，包含胎盘组织的无细胞提取物的制剂可以降低新生儿中NEC的严重程度。
通过使用可以口服或经皮给药的液体形式可以促进制剂向患者，尤其是新生儿的递送。在一些实例中，包含胎盘组织的无细胞提取物的制剂可以呈液体形式。在一些实例中，胎盘组织的无细胞提取物可以是保存稳定的、最终灭菌的结晶粉末。在一些实例中，液体制剂可以包含胎盘组织的无细胞提取物和溶剂。在一些实例中，溶剂可以用于稀释、溶解或悬浮胎盘组织的无细胞提取物以形成液体制剂。在一些实例中，用于口服递送的液体制剂中溶剂与无细胞提取物的比率可以不同于用于经皮递送的比率。制剂可以在出生与正常喂养之间的过渡期间给药，并且可以改善和维持肠道成熟。
不同的生长因子有效性以及血管舒张治疗的成功和羊水制剂的广泛趋化因子环境可以表明存在多种诱发病因。治疗性胎盘提取物制剂可以将使胎儿肠道成熟的能力与可以是抗炎和血管舒张的因素组合。在一些实例中，可以减少可驱动未成熟肠道的肠粘膜损伤的高炎症环境。
口服制剂
在一些实例中，如本文所描述的液体制剂或口服制剂可以包含胎盘组织的无细胞提取物和溶剂。在一些实例中，溶剂可以包括奶、水、盐水、林格氏乳酸盐溶液、右旋糖溶液、蔗糖溶液、合成糖溶液或其组合。在一些实例中，溶剂可以包含天然的哺乳动物奶或合成的哺乳动物奶。在某些实例中，奶可以是脱水的，并且可以用水、盐水、林格氏乳酸盐溶液、右旋糖溶液、蔗糖溶液、合成糖溶液或其组合重构。
在一些实例中，无细胞提取物可以来自包含胎盘盘的胎盘组织。在一些实例中，无细胞提取物可以来自包含丛密绒毛膜的胎盘组织。在某些实例中，无细胞提取物可以来自包含胎盘盘和丛密绒毛膜的胎盘组织。
在一些实例中，来自无细胞提取物的一种或多种蛋白质在液体制剂中的浓度可以最高达25mg/mL(例如，2-10mg/mL、4-15mg/mL、3-20mg/mL)。例如，一种或多种蛋白质的浓度可以是0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL或最高达25mg/mL。
在一些实例中，口服制剂可以进一步包含稀释剂、赋形剂、载体或其组合。任选地，口服制剂可以进一步包含一种或多种外源性蛋白酶抑制剂。例如，口服制剂可以包含4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)、牛肺抑肽酶、N-(反式-环氧琥珀酰基)-L-亮氨酸4-胍基丁酰胺、亮抑酶肽、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(2-氨基乙基(醚)NNN’N’-四乙酸、氯化铵、波普瑞韦(boceprevir)、丹诺普韦(danoprevir)、那拉匹韦(narlaprevir)、特拉匹韦(telaprevir)或伐尼匹韦(vaniprevir)中的一种或多种。在一些实例中，口服制剂可以进一步包含维生素或矿物质。在某些实例中，口服制剂可以进一步包含抗生素。
使用胎盘提取物制剂的方法
本文还描述了用于预防或减轻受试者的肠道病症的症状的方法。该方法可以包括获得液体制剂；和将治疗有效量的液体制剂递送到受试者的胃系统。液体制剂可以包含胎盘组织的无细胞提取物和溶剂。在一些实例中，肠道病症可以包含坏死性小肠结肠炎(NEC)。
在一些实例中，受试者可以是人。例如，受试者可以是新生婴儿。在某些实例中，受试者可以是早产或妊娠37周之前出生的婴儿。在一些情况下，婴儿或新生儿可以具有低的出生体重。例如，早产婴儿可以具有1500g或更低的出生体重。在一些实例中，受试者可以是哺乳动物。例如，受试者可以是马、牛、盘羊、山羊、猪、犬、猫科动物、熊科动物、灵长类动物、骆驼科动物或其他。
在一些实例中，受试者年龄可以小于100天(例如，小于90天、小于45天、小于21天、小于10天、小于3天、小于1天)。例如，受试者的年龄可以小于100天、95天、90天、85天、80天、75天、70天、65天、60天、55天、50天、45天、40天、35天、30天、29天、28天、27天、26天、25天、24天、23天、21天、20天、19天、18天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或小于24小时。
在一些实例中，可以预防性地给予液体制剂以预防肠道病症的发作。在其他实例中，可以给予液体制剂以降低症状的严重程度或肠道病症的持续时间。在一些实例中，可以将液体制剂通过自然喂养或口胃管口服递送到受试者。递送的时机可以与膳食的时机配合，并且与受试者的定期喂养同时递送到受试者。在一些实例中，可以将液体制剂与营养物喂养一起提供。在一些实例中，液体制剂可以包含天然的哺乳动物奶、合成的哺乳动物奶、水、盐水、乳酸钠溶液或糖溶液。
在其他实例中，可以将液体制剂通过饲管经皮递送到受试者。例如，胃饲管或十二指肠饲管可以用于递送液体制剂。在一些实例中，可以将液体制剂与其他药物或治疗性处理一起提供。
在一些实例中，可以将液体制剂以连续方式或以1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时或72小时的频率给予受试者。在一些实例中，可以将液体制剂给予受试者持续最高达100天(例如，最高达90天、最高达45天、最高达21天、最高达13天或最高达5天)的治疗期。例如，可以将液体制剂给予受试者持续最高达100天、95天、90天、85天、80天、75天、70天、65天、60天、55天、50天、45天、40天、35天、30天、20天、18天、16天、14天、12天、10天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天的治疗期。
在一些实例中，治疗量的液体制剂可以预防肠道病症诸如NEC的发作。在一些实例中，治疗量的液体制剂可以减轻肠道病症的严重程度或症状。例如，治疗量的液体制剂可以减少受试者的肠中的炎症。在一些实例中，可以增加受试者的肠的绒毛高度。在一些实例中，可以增加受试者的肠的隐窝深度。
肠道病症NEC
在一些实例中，可以将液体制剂给予患有包括NEC的肠道病症的受试者。对NEC的炎症反应可以导致粘膜屏障破坏、细菌易位和GI结构完整性的丧失。包含胎盘组织的无细胞提取物的制剂可以降低炎症反应，并且可以增加肠道干细胞的增殖能力以使小肠(intestine)或直肠(bowel)能够恢复其原始功能。在一些实例中，以包含无细胞胎盘提取物的制剂局部给予高浓度的抗炎和免疫调节趋化因子也可以是用于NEC的治疗策略。
羊水
母乳，尤其是初乳，可以刺激正常的胃肠发育和成熟，并且可以调节不成熟的肠道免疫系统。初乳可以包含抗微生物蛋白(即免疫球蛋白、酪蛋白、溶菌酶、乳铁蛋白)和抗炎细胞因子和生长因子，诸如抗炎细胞因子白介素(IL)-10、转化生长因子(TGF)和表皮生长因子(EGF)。羊水可以包含在母乳中发现的许多因子。
目前还没有模拟新生儿的羊水或其在胎儿肠道中的功能的治疗。用于NEC的动物模型已经显示当用羊水补充喂养时发病率降低。不旨在受理论束缚，羊水中的抗炎细胞因子和生长因子，包括表皮生长因子、肝细胞生长因子和IL-10，可以有效预防NEC。羊水，其蛋白质组成由胎盘提供，可以含有高浓度的免疫调节肽诸如IL-10，并且可以含有生长因子诸如EGF、胰岛素样生长因子1IGF-1以及TGF，如表1中所示。在不暴露于羊水的情况下的降低的胎儿肠道生长可能提示羊水的成分对于子宫内胃肠发育可能是重要的并且可有助于抑制炎症反应。在出生时，早产婴儿失去了吞咽羊水的免疫调节和发育益处。
表1
Figure BDA0003665392980000071
Figure BDA0003665392980000081
而在子宫内，吞咽的羊水可以使未成熟的肠上皮细胞浸泡在源自胎盘的免疫调节因子、抗微生物因子和促生长因子中。这些因子可以使肠道在出生之后立即准备好从高度受控的子宫内环境转变为极其有压力的环境。在胎儿绵羊模型中，通过食道结扎中断羊水摄取显示导致粘膜萎缩、绒毛钝化和肠上皮细胞异常。在该模型中，在去除食道结扎线并恢复羊水摄取之后，中断的羊水吞咽对肠粘膜的作用逐渐逆转。通过单独输注乳酸林格氏溶液，作用不逆转。
羊水已经经由Toll样受体(TLR)4和EGR受体途径在10日龄的NEC缺氧小鼠模型中显示出降低的NEC严重程度。出生后将猪羊水作为微量肠内营养物给予早产仔猪已显示增加的体重增加、改变细菌定殖和NEC严重程度以及诱导编码参与肠道炎症反应的基因的mRNA的差异表达。
在NEC的大鼠模型中，腹膜内给予羊水干细胞已经显示改善的存活和增强的修复。在该研究中，腹膜内给予羊水干细胞与表达环氧合酶2(COX-2)的基质细胞从小肠绒毛的固有层迁移到接近肠隐窝的基部的位置有关。羊水干细胞对NEC的有益作用被选择性COX-2抑制剂阻断，表明这些表达COX-2的基质细胞的迁移参与羊水干细胞的保护作用。临床可扩展性目前不可行，因为剖腹产术时获得的羊水的中值体积是大约70mL。
实施例
实施例1
如下制备无细胞胎盘提取物。通过胎盘捐赠从合同医院获得胎盘/羊膜，并分离人胎盘匀浆。将胎盘/羊膜置于0.9％生理盐水溶液(NS，154mM NaCI，308mOsm/L)中。从0.9％NS中取出胎盘，将胎盘盘与羊膜、绒毛膜和脐带分离，并切成大约1.5英寸×2英寸的块。将这些更小块的胎盘盘置于含有大约400mL的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS，137mM NaCl，2.7mMKCl，4.3mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4，pH 7.4)的容器中。将容器置于摇床上并以120rpm摇动12至24小时。用1X PBS或含有1X终浓度的蛋白酶抑制剂(PI)(AEBSF 500uM，抑肽酶150nM，E-64 1uM，亮抑蛋白酶肽1uM)的1X PBS，使用实验室搅拌机将胎盘盘块粗匀浆。将粗匀浆置于250mL容器中并在4,000倍重力下离心10分钟。将粗匀浆以大约1:5的组织体积:总体积的比率倒入容器中。将容器涡旋/摇动以再悬浮团块。将悬浮液在4,000倍重力下离心10分钟。重复该洗涤程序总共三次洗涤以从组织中去除血液。最后一次洗涤之后不离心混合物。将250mL容器的内容物用1X PBS或IX PBS-1X PI稀释至两倍体积。然后将混合物置于连接到高压匀浆器的贮存器进料装置(reservoir feed)中。然后将匀浆置于250mL容器中并在15,000倍重力下离心10分钟。
使用Bio-Plex MAGPIX多重读数器(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)定量从胎盘盘提取的溶液中存在的细胞因子和生长因子的量。获得Bio-Plex Pro人趋化因子面板，40重分析(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。用适当的稀释剂稀释标准品。将分析珠稀释并将50μL添加到96孔板的每个孔中，并用分析缓冲液洗涤两次。将板置于磁性板固定器上，并将溶液从孔中去除。将标准品、样品和空白加载到96孔板的每个相应孔中并在室温下孵育1小时(对每个标准品、样品和空白进行重复测量)。通过以下步骤洗涤板：将板置于磁性板固定器上，去除溶液，用洗涤缓冲液洗涤，并通过将孔板置于磁性板固定器上去除洗涤缓冲液。将检测抗体添加到每个孔中并在室温下孵育30分钟。将板用洗涤缓冲液洗涤3次，并将链霉亲和素-PE指示剂添加到每个孔中。将板在室温下在黑暗中孵育10分钟。将板在分析缓冲液中洗涤3次，并在MAGPIX多重读数器上进行测量。在Bio-Plex读数器软件(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)上分析数据，并利用双因素ANOVA比较治疗组。
无细胞胎盘提取物的趋化因子谱与公开的16至20周羊水的趋化因子谱相似。无细胞胎盘提取物的收率在冻干之前是约两升/胎盘。图1中显示了足月羊水(n＝10)、无细胞胎盘提取物(n＝10，与羊水匹配的供体)和16-20周羊水(来自公开的结果)中存在的蛋白质浓度的比较。使用Bio-Plex Pro人趋化因子面板测量足月羊水和无细胞胎盘提取物的浓度。文献中报道了16-20周羊水的值。如表2中所示，无细胞胎盘提取物中的炎症组分显著低于足月羊水中的炎症组分。使用配对t-检验，与足月羊水相比，在无细胞胎盘提取物中观察到变异系数％降低33％，具有p<0.05的显著性。
表2
Figure BDA0003665392980000101
Figure BDA0003665392980000111
无细胞胎盘提取物的表征使用Bioplex Multiplex分析进行。表3显示了提取物中确定的蛋白质。许多可能在肠道成熟过程中具有重要作用。
表3(n＝24)
Figure BDA0003665392980000112
实施例2
使用实施例1的方法制备无细胞胎盘提取物，直到高压匀浆的步骤。代替高压匀浆，将混合物置于冷冻器安全容器中并在-80℃下冷冻。一旦被冷冻，将材料从冷冻器中取出，在40℃水浴中解冻，并置于离心容器中。通过将超声发生器尖端置于溶液中持续一分钟，然后取出持续至少一分钟以循环该过程，将材料在400W下超声处理5分钟。将裂解的细胞溶液在15,000倍重力下离心30分钟。
对肠上皮细胞(空肠细胞)是否响应无细胞胎盘提取物浓度的增加而增殖或分化进行确定。为了测量增殖，确定1600×1600像素正方形中的细胞总数目。为了测量细胞分化，评价肠干细胞标志物(包含富亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5[Lgr5])、杯状细胞标志物(粘蛋白2[Muc2])、肠上皮细胞标志物(蔗糖酶-异麦芽糖酶[SI])以及潘氏细胞标志物(溶菌酶[Lyz])的表达。
实验设计：使空肠细胞在具有5％CO2的37℃组织培养箱中在25％Altis扩增培养基中生长1天。铺平板后二十四小时，用含有增加浓度的无细胞胎盘提取物的培养基替换该培养基。使细胞生长48小时并且然后收集用于以下实验中概述的最终时间点。
增殖研究：然后在室温下用4％多聚甲醛固定培养物20分钟。进行用于CD-326(EPCAM)蛋白和细胞核(Hoescht染色)的可视化的免疫染色。对于每个目标荧光波长，使用荧光镜和自动化平台以4X单独地对孔进行平铺(tile)扫描。使用Image J软件将图像拼接在一起并叠加以可视化免疫染色的共定位。从每个孔的中部分离出1,600×1,600像素的正方形，并用于定量：细胞的总数目(Hoechst+；EPCAM+)。为了测量汇合度，使用Image J软件对EPCAM免疫染色的整个孔图像设定阈值并创建二元掩模。然后通过扩展每个像素来增强掩模，并用每个孔的总面积来测量像素的面积。
结果：如图2中所示，细胞的总数目随着0.003–0.01mg/mL的无细胞胎盘提取物蛋白质而增加，但随着无细胞胎盘提取物蛋白质的浓度大于0.15mg/ml而减少。虽然肠的顶面可以暴露于来自子宫内羊水的大约4mg/mL总蛋白，但在隐窝的底部提供给干细胞的浓度可以是在顶部观察到的水平的约1/100。汇合度测量还显示，每孔的细胞的汇合度随着无细胞胎盘提取物蛋白质的浓度增加(0.003至0.3mg/mL)而显著增加，并且然后在无细胞胎盘提取物蛋白质浓度达到1mg/mL时降低(参见图3)。图2和3显示响应无细胞胎盘提取物的空肠细胞生长。图2显示总细胞数目随着0.003至0.01mg/mL的无细胞胎盘提取物浓度而增加，并且然后随着蛋白质浓度大于0.15mg/mL而减少。图3显示每个孔的覆盖百分比随着0.01-0.3mg/mL的剂量的无细胞胎盘提取物而显著增加，并且然后在1mg/mL剂量的无细胞胎盘提取物中降低。与0mg/mL无细胞胎盘提取物处理的孔相比，用Tukey事后检验的单因素ANOVA具有p<0.01的显著性。条是n＝3的标准偏差。
分化研究结果：细胞分化的基因表达分析显示于表4中。在0.01和0.15mg/mL无细胞胎盘提取物处理物中肠干细胞和杯状细胞增加。在0.003-0.3mg/mL处理物中肠上皮细胞增加。观察到在0.003-0.15mg/mL无细胞胎盘提取物处理物下潘氏细胞增加。
表4
Figure BDA0003665392980000131
实施例3
来自实施例2的无细胞胎盘提取物用于Transwell研究。使用细胞单层平台特异性测量上皮屏障功能的变化。该系统允许测量跨上皮电阻和跨过上皮屏障的通量。
实验设计：将细胞传代到4个板上的48个小室(transwell)中，并在生长培养基中生长5天。在第6天，将培养基更换成分化培养基并生长4天。在第9天，将具有增加剂量的无细胞胎盘提取物(0mg/ml、0.25mg/ml、1mg/ml和4mg/ml)的处理物与增加剂量的LPS(0ng/ml、100ng/ml、250ng/ml和500ng/ml)一起添加到顶面以刺激细胞内的炎症反应。在处理后48小时收集基底外侧的培养基，并根据制造商的说明书(R&D Systems以及ThermofisherScientific)通过ELISA测量IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和MIF。用双因素ANOVA分析处理物之间的相互作用。
结果：如图4-6中所示，无细胞胎盘提取物对未暴露于LPS的空肠细胞具有有益作用。图4-6显示响应LPS刺激的空肠细胞蛋白质分泌。细胞在小室(transwell)板中以单层生长。将LPS(0ng/mL、100ng/mL、250ng/mL和500ng/mL)和无细胞胎盘提取物(0mg/mL、0.25mg/mL、1mg/mL和4mg/mL的蛋白质水平)的处理物添加到小室的顶面，每种处理一式三份进行。通过ELISA测量来自小室的基底外侧的培养基的MIF、IL-10和TNF-α。当进行双因素ANOVA时，所有蛋白质显示统计学显著的相互作用(p<0.01)。
TNF-α在任何给药剂量下均未改变，MIF在4mg/mL剂量下增加，而其他剂量则无作用，并且IL-10在0.25mg/mL和1mg/mL剂量下增加并且在4mg/mL剂量下未观察到。响应LPS，无细胞胎盘提取物继续降低炎症反应并增加抗炎反应。来自对每种蛋白质的双因素ANOVA的结果显示LPS与无细胞胎盘提取物处理物之间的统计学显著相互作用(MIF p<0.0001，TNF-αp<0.01，IL-10p<0.01)。
这些体外结果证明无细胞胎盘提取物可以增加细胞数目、覆盖度和几种肠道细胞的分化。无细胞胎盘提取物也可以通过增加从培养物中的细胞的基底外侧分泌的抗炎蛋白和在相同的分析中减少炎症蛋白来对抗炎症反应。
实施例4
进行无细胞胎盘提取物的体内研究。广泛使用的NEC的仔猪模型用于测试无细胞胎盘提取物的功效。使用实施例2的方法制备无细胞胎盘提取物，不同的是处理了八个胎盘。将来自所有8个胎盘的离心液体汇集到单个容器中并充分混合。经由Bradford蛋白质分析法(ThermoScientific)测量溶液的总蛋白质。将溶液等分到50mL容器中，使得每个容器容纳120mg的总蛋白质。将50mL容器冻干(冷冻干燥)，并且随后用2MRad(毫拉德)的γ辐射灭菌。
实验设计：根据由Bjornvad等人建立的方案，所使用的仔猪在妊娠的第105天(115天足月)娩出，相当于32周人妊娠。紧接着娩出后，仔猪(n＝9)在生命的前48小时经由口服胃管接受无细胞胎盘提取物。“标准护理”(SOC)的对照组(n＝3)(仅IV喂养，就像早产婴儿在危重婴儿护理室接受的一样)。娩出后四十八小时，停止无细胞胎盘提取物治疗和IV喂养，并且将仔猪转到口服制剂。在开始口服配方喂养之后48小时，按照IACUC指导原则处死动物。处死时，进行尸检，并且然后将小肠分成三份。将来自每个部分的5-10cm块固定、用石蜡包埋、切片并用苏木精和曙红(H&E)染色。将肠、肝脏、肺、心脏和肾脏保存在福尔马林中用于随后的组织病理学分析。
存活和尸检分析：无细胞胎盘提取物组的48小时存活率是SOC的48小时存活率的两倍(无细胞胎盘提取物的6/9相对于SOC的1/3)。对照仔猪的历史数目显示于表5中。与SOC的临床NEC的42％-77％的发病率相比，无细胞胎盘提取物消除了NEC的临床发病率。尸检时，取出胃肠道并进行分析。
表5
患有NEC的仔猪的数目 仔猪的总数目 来源
5 12 Bjornvad等人，2005
137 283 Bjornvad等人，2008
17 22 Siggers等人，2008
26 46 Sanglid等人，2006
13 22 Thymann等人，2009
28 40 Ghoneim等人，2014
21 38 Zamora等人，2015
0 9 无细胞胎盘提取物治疗的仔猪
为了表征NEC损伤的程度，如由小肠中炎症、水肿、出血和坏死的宏观证据所示的，应用以下临床NEC评分系统：(1)无或最小程度的局灶性充血性胃小肠结肠炎；(2)轻度局灶性胃小肠结肠炎；(3)中度局部广泛性胃小肠结肠炎；(4)重度局部广泛出血性胃小肠结肠炎；(5)严重局部广泛出血性和坏死性胃小肠结肠炎；和(6)严重弥漫性出血性和坏死性胃小肠结肠炎。对一个胃肠切片所给出的NEC评分为3或更高的仔猪被认为NEC阳性。用无细胞胎盘提取物治疗的仔猪的肠在尸检时没有显示NEC的临床征象：9只仔猪中的0只评分≥3。
组织病理学分析：由经过委员会认证的病理学家对H&E染色的切片进行盲检。小肠的组织病理学分析显示于表6中。无细胞胎盘提取物治疗组没有显示NEC的组织学征象，而1/3的SOC动物呈现组织学NEC。每个切片测量10个绒毛的绒毛高度和隐窝深度。与标准护理对照组相比，无细胞胎盘提取物显著增加绒毛高度和隐窝深度(p<0.0001)。
表6
Figure BDA0003665392980000161
实施例5
具体目标1.开展无细胞胎盘提取物的体外生物活性和效能分析以预测体内性能。
基本原理：无细胞胎盘提取物可以(1)增加培养物中肠道细胞的增殖；(2)证明无细胞胎盘提取物可以有益地改变细胞对缺氧的响应，体内观察到的应激是由于肠的脉管系统发育不全，并且血液/气体/营养物交换不良导致肠道上皮的渗透性增加。在此提出的猪细胞培养实验可以模拟具体目标2中提出的动物模型。
实验设计：将从出于研究目的安乐死的1至3日龄的雄性和雌性野生型约克夏仔猪中获取组织。将回肠的8-10cm节段切下并纵向打开。将在含有EDTA、Y-27632、DTT和盘尼西林/链霉素的PBS中在4℃下孵育组织。组织将被转移到预先温热的PBS、EDTA、Y27632和盘尼西林/链霉素的溶液中，在37℃下孵育并摇动以使隐窝/绒毛单位松动。剩余的肠将从溶液中被取出并且隐窝组分将被富集、量化和制粒。这些隐窝将用于生长单层或冷冻用于将来的实验以确定无细胞胎盘提取物增强增殖、TEER和渗透性的能力，并且然后确定无细胞胎盘提取物对缺氧诱导的应激的作用。
细胞增殖：将在96孔板中培养从以上所描述的程序分离的细胞。无细胞胎盘提取物的处理物将通过所使用的最高剂量是足月羊水(4mg/mL)的总蛋白来确定。根据初步实验，该剂量被确定为在剂量反应曲线的毒性侧，但由于在体内的隐窝中观察到的浓度梯度，因此该剂量仍然是临床相关的。将进行对高剂量的4mg/mL蛋白质的连续稀释，以达到0.002mg/mL蛋白质的最低剂量。该最低剂量对应于在初步工作中测试的与未处理对照没有显著差异的最低剂量。将测量单层岛状物(island)尺寸以及达到100％汇合度的时间作为增殖的指标。
TEER评价和渗透性：将细胞从以上所描述的程序分离并接种在transwell板中。将按照制造商的说明使用双平面电极仪器(上皮伏特/欧姆计[EVOM])测试单层的肠道完整性和渗透性。如先前所描述的，将细胞暴露于缺氧环境(1％O2，5％CO2，并且用N2平衡并加湿)或常氧环境(21％O2，5％CO2，并且用N2平衡并加湿)。在单层发育期间，将每天监测TEER值持续共10-11天。数据将表示为电阻/平方厘米。将通过在实验结束之前24小时将异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FD4)置于transwell的顶面上并定量基底外侧隔室中的量来确定渗透性。用于评估渗透性的无细胞胎盘提取物的剂量将由来自以上实验的增加细胞增殖的无细胞胎盘提取物的最有效浓度确定。
对缺氧的细胞反应的定量：将在每个实验结束时收集来自每个transwell的基底外侧的培养基并冷冻。将对HIF-1进行定量以确定是否观察到响应缺氧的任何变化。将按照制造商的说明对IL-10、TNF-α、IL-6(R&D Systems)进行ELISA，以检查对缺氧模型的炎症反应的任何改变。最后，将通过VEGF、EGF和IGF-1的存在监测对缺氧的营养响应的迹象。
统计分析：来自此目标的所有数据均是定量数据，并且将通过双因素ANOVA与Tukey事后检验进行分析，以确定特定组之间的显著性。
预期结果、潜在问题和替代方法：在之前的研究中，无细胞胎盘提取物增加了人肠道干细胞的数目。该研究试图证明在猪回肠肠道干细胞中是否发生相同的作用。预期这些分析没有任何问题，因为有发表的结果显示小组和羊水可以阳性识别和影响猪肠道上皮细胞。从增殖研究到TEER和渗透性分析的剂量的向下选择引入了错过最佳剂量的可能性，以证明可以观察到效果。如果没有观察到效果，将扩大用于TEER和渗透性分析的剂量。在初步数据中，在未成熟仔猪模型中观察到无细胞胎盘提取物响应LPS而增加细胞数目并降低NEC的发病率。这些结果增加了在这些体外分析中成功的可能性。
结果可以包括：(1)剂量反应曲线，其证明无细胞胎盘提取物对猪肠道细胞增殖的作用。(2)无细胞胎盘提取物维持TEER和降低响应缺氧应激的渗透性的能力。(3)当用无细胞胎盘提取物治疗时，对缺氧应激的细胞响应改变。
具体目标2.评价无细胞胎盘提取物对预防早产仔猪中NEC的功效和剂量反应。
基本原理：本研究将使用早产仔猪NEC模型。该模型利用在妊娠102至105天之间娩出的仔猪并且已经被广泛描述。该模型的关键属性包括与人婴儿相似的大小(0.6至1.1kg)，以及受损的呼吸、营养、免疫和代谢反应。早产仔猪也耐受处理程序并且具有类似于人婴儿的胃肠特征。该模型用于生成关于现在正在临床试验中测试的母乳和益生菌产品的临床前数据。如初步数据中所描述的，将从娩出给予无细胞胎盘提取物，直到娩出后48小时开始肠道喂养。这将足以在婴儿提早娩出时代替明显缺失的羊水组分。将以与婴儿在子宫内吞咽羊水的剂量速率相当的剂量速率给予无细胞胎盘提取物(治疗剂量，4mg/mL总蛋白，以2.5mL/kg/h)，并以2个递增剂量给予，以测试增加提供到肠道壁的无细胞胎盘提取物的量是否具有有益效果。
实验设计：在大约95天的妊娠期，研究机构将接收在其第一次产仔中具有至少12头仔猪的定时妊娠的约克夏母猪。第二次产仔母猪将用于确保由6头母猪分娩足够的仔猪，因为第二次产仔母猪育有增加的每窝产仔数。仔猪将在妊娠第102-105天经由剖腹产娩出，以1个标准护理比3个无细胞胎盘提取物的抽样方案随机分配到治疗组，并在出生后3小时内给予治疗。无细胞胎盘提取物治疗将在生命的前24小时经由口服胃管以2.5mL/kg/h的速率给予，并且在生命的第二个24小时内以5mL/kg/h的速率给予。将以与羊水相似的总蛋白浓度(4mg/mL，n＝33)给予无细胞胎盘提取物。对照动物(n＝11)将不会接受任何进入肠道中的治疗，该治疗在人早产婴儿中是常规的。在完成功效研究之后，将开始剂量递增研究。同样，将在出生之后和开始治疗之前将仔猪随机分配到组中。计划2X(8mg/mL)和5X(20mg/mL)无细胞胎盘提取物的治疗以评价增加的剂量对系统的影响。所有动物将在前48小时内经由脐导管给予全胃肠外营养(TPN)；然后，TPN将被停止并且开始配方喂养，如先前所描述的。将在开始配方喂养之后48小时处死仔猪并进行尸检。该研究的主要结果将是仔猪中NEC的临床观察结果。次要结果将包括肠道形貌的组织学评估。
临床观察：NEC的临床评分将通过由Thymann等人描述的系统完成并用于生成初步数据。将每3小时监测仔猪的肠道疾病(粪便颜色和稠度、腹胀、触诊疼痛和呼吸窘迫)。在组织收集时，胃肠道将被置于冰冷的表面上、打开并清除其内容物。将在胃、小肠的3个区域和结肠中检查NEC的宏观评分。基于水肿、出血、坏死和/或积气的程度，每个部分将被给予1-5的评分。NEC的存在将被定义为任何部分中的评分大于3。
组织学评估：小肠将被分成三份，并且从三份中每份的中部切下2-5cm的非坏死部分，固定并包埋。胃和结肠的一部分将被类似地处理。组织的每个固定部分将被切成3-5μm的切片并置于载玻片上。将用H&E对每个组织块的切片进行染色。然后将在每个切片上确定NEC的组织学评分，以及测量来自三份中每份的切片的10个代表性绒毛的绒毛高度和隐窝深度。
还将通过免疫组织化学检查组织样品中SOX9(肠道干细胞增殖的标志物)、裂解的半胱天冬酶3(CC3；细胞死亡的标志物)和Ki-67(细胞增殖的标志物)的存在。免疫组织化学将被用于量化特定细胞类型的数目的变化。将通过将载玻片置于120℃下的柠檬酸盐目标修复溶液中30秒，随后置于90℃下的帕斯卡压力室中10秒进行热诱导表位修复。载玻片将被冷却至室温并移至载玻片染色器，之后它们将在肽封闭剂中被孵育30分钟。将使用先前显示阳性识别正常猪组织中的干细胞和祖细胞的一抗。一抗将被施加到在普通抗体稀释剂(BioGenex)中稀释的组织切片。将以1:200稀释兔α-SOX9(EMD Millipore)，以1:500稀释小鼠α-Ki-67，以及αCC3(兔，1:400)。一抗孵育将在室温下进行30分钟。载玻片将在1:1稀释的ImmPRESSTM聚合物抗兔IgG试剂中孵育30分钟，随后在ImmPact DAB过氧化物酶底物溶液中孵育30分钟。
对于所评价的每个载玻片，将仅使用取向良好的隐窝以获得细胞计数。取向良好的隐窝将被确定为隐窝基部紧贴肌层粘膜层并且可以延伸并完全打开进入肠腔的隐窝。将对每种蛋白质生物标志物的至少10个取向良好的隐窝进行成像，并且如先前所描述对每个隐窝的阳性细胞进行计数和取平均值。这些标志物将提供隐窝内干细胞健康以及绒毛内细胞凋亡和增殖的考察。将对常规病理器官(心脏、肺、肝脏、肾脏)进行观察、固定并切片用于确定毒性的迹象。
统计分析：为了确保所提出的研究的严谨性和重现性，该研究将(1)将每个测试组的受试动物随机化；(2)所有实验中具有阴性和阳性对照；(3)对样本进行盲法分析；和(4)使用适当的测试以确定实验组之间差异的显著性。NEC发病率的组间差异将通过Fisher精确检验进行评价。将通过非参数Kruskal-Wallis检验分析胃肠道的病变评分。将经由双因素ANOVA分析对增殖、绒毛高度和隐窝深度的定量数据，以确定剂量对动物的影响。将进行Tukey事后检验以确定特定组之间的差异。
该实验的主要结果可以是无细胞胎盘提取物治疗的动物体内临床NEC的减少。该模型中无细胞胎盘提取物的初步研究未显示NEC的临床征象。该研究有力地证明NEC发病率降低75％，具有95％的功效并且α＝0.05。基于所提供的体外数据(图1-3)，观察结果可以包括在无细胞胎盘提取物治疗的动物中隐窝内SOX9的增加、裂解胱天蛋白酶3的减少和Ki-67的增加。这可以表明干细胞增加、凋亡减少和响应无细胞胎盘提取物的增殖增加。会遇到的潜在问题主要在于动物研究的活体部分的实施。该研究包括将最多达18只仔猪同时置于本质上是新生儿重症监护的场所中，持续96小时。基于初步研究，气管内导管尺寸、复苏药物(例如纳洛酮(Narcan))和仪器的最佳顺序是问题。组织的免疫组织化学分析可能是困难的。可用于猪组织中的这些标志物的抗体有限。然而，这些技术被执行和优化用于一起观察这些标志物。
具体目标3.在新生啮齿动物中的标准毒理学测试评估中评价口服给予的无细胞胎盘提取物的安全性。
基本原理：无细胞胎盘提取物是趋化因子的复杂混合物。出于该目的提出了剂量范围的青少年毒理学研究。在生命的第4天开始，经由灌胃喂养给予Sprague-Dawley大鼠无细胞胎盘提取物，其中从1mg/mL总蛋白质开始剂量递增(低剂量、目标剂量和2个更高剂量)并增加至20X以评估可能的毒性。给药将持续至第18天。将经由对每只动物每两周重复一次的体重、胫骨长度和头顶到尾部测量值监测生长的活体评估。将用心脏、肺、肝脏、肾脏和脑的组织学评价毒性。将以6个间隔测量大鼠的血清内的人蛋白质。雄性和雌性大鼠将用于此目的以允许比较效价、毒性和动力学的性别差异。这些测试将评价由无细胞胎盘提取物治疗产生的任何临床或组织学毒性。
实验设计：本研究的目的是评估无细胞胎盘提取物的毒性。还将测试溶媒(生理盐水)以建立基线毒性。将在研究期间的6个时间点和第19天时将大鼠安乐死。将在安乐死当天从所有大鼠收集血液，随后进行全面尸检。将评价血液和组织的异常。
羊水是在大约260天中刺激受精卵发育成足月婴儿的物质。胎盘组织可以是固有免疫赦免的。基于羊膜的产品已被用作人类疗法超过一个世纪，具有最小的不良事件。因此，预期将在本研究中监测的毒理学终点中没有不良事件。大鼠的血清中人蛋白质的定量不应存在任何问题。然而，收集来自对照组和预处理血清的血清以观察人蛋白质ELISA中大鼠蛋白质的任何干扰。这些样品的结果将用于确定并扣除观察到的任何背景。
脊椎动物-程序描述
具体目标1
在具体目标1中提出的实验中，雄性和雌性1-2日龄仔猪将用于获得用于干细胞培养的组织。仔猪将被重度镇静并且然后立即使其安乐死用于组织收集。基于用于计算功效分析的初步数据，研究组估计一年内将使用6只动物用于目标1，包括对照动物。在目标1中，将使用雄性和雌性1-2日龄的约克夏交叉(Yorkshire Cross)同窝仔猪。安乐死(戊巴比妥过量给药；IV)将在镇静后进行。将立即从回肠收集组织。
具体目标2
早产仔猪模型将按照IACUC批准的方案进行。早产仔猪经由剖腹产娩出之后，将使其复苏并用脉搏血氧计测量初始O2饱和度和心率。复苏将包括：将羊水从鼻咽吸完，用氧气接受间歇袋式面罩通气以辅助呼吸，并置于维持在31℃-32℃下的温度调节保温箱中。多沙普仑盐酸盐将被经舌下或经由脐血管提供给未充分通气的新生猪。一旦仔猪稳定，它们将被安置口胃饲管(如果尚未安置)，以及在脐动脉中安置导管以有利于口胃喂养、全胃肠外营养(TPN)喂养和在96小时研究期间给予测试化合物。口胃饲管(5或8法制尺寸)将经由颊中、牙齿后面的小切口引入(以防止仔猪咀嚼管)，并进入胃或远端食道。如果尚未安置，则无菌导管将被安置在脐动脉中并推进17-20cm进入背侧胸主动脉，并且将通过两根或更多根结扎线固定至脐带残端。无菌母体血浆(10至20mL/kg母体血浆)将被输注至每头仔猪以提供被动免疫。仔猪将在出生后的前48小时期间接受补充氧并且将逐渐脱离补充氧直至出生后72小时。所有仔猪将被单独圈养在31℃-32℃的环境温度下用作保温箱的保温笼中。
所有仔猪在出生时将被称重并以1:3比率随机分配至对照组或研究组。对照组(n＝11)，无细胞胎盘提取物4mg/ml蛋白质(n＝12)，无细胞胎盘提取物8mg/ml蛋白质(n＝12)和无细胞胎盘提取物20mg/ml蛋白质(n＝33)。组的分层将基于重量和初始O2饱和度。当母猪处于手术麻醉的深平面中时，一旦从母猪的子宫中取出所有的仔猪后，就使用60cc注射器从子宫静脉之一收集尽可能多的母体血液。一旦收集血液后，将在麻醉下用戊巴比妥药物以110mg/kg IV对母猪进行安乐死。
对照组将接受胃肠外喂养，随后口服喂养。口服喂养将在娩出之后48小时开始，并且可以以每3小时一次的推注或以每3小时达到15ml/kg的连续滴注给予，以满足每日热量需要。仔猪将首先使用Kabiven系列产品(Fresenius Kabi USA,LLC.)经由动脉导管连续输注48小时来接受TPN，从4mL/kg开始持续前24小时，并增加至6mL/kg/小时，并调节以满足其营养要求(参见Bjornvad 2008)。
在48小时的TPN之后，仔猪在安乐死和组织收集之前将仅接受口服喂养3天。在肠内喂养的前6小时期间，所有仔猪将接受配方(每升水80g Pepdite、70g Maxipro和75gLiquigen)。另外，在娩出后前24小时，通过口胃管以2.5mL/kg/小时的速率给予乳酸林格氏溶液，然后在娩出后历经48小时增加至5mL/小时/kg。此时，如由Bjornvad(2008)所描述的，仔猪将被切换到5mL/kg/小时的配方。
治疗组将接受动脉递送的TPN和口服递送的无细胞胎盘提取物，随后口服喂养。口服喂养可以以每3小时一次的推注或以每3小时达到15ml/kg的连续滴注给予，以满足仔猪的每日热量需要。仔猪将使用Kabiven系列产品(Fresenius Kabi USA,LLC.)通过动脉导管接受TPN持续48小时，从4mL/kg开始持续前24小时，并增加至6mL/kg/小时，调节组成以满足早产猪的营养要求。在2天的TPN和口服无细胞胎盘提取物之后，仔猪仅接受持续3天的口服喂养，然后安乐死和组织收集。在肠内喂养的前6小时期间，所有仔猪将接受配方(每升水80g Pepdite、70g Maxipro和75g Liquigen)。除了TPN以外，无细胞胎盘提取物将在出生的3小时内经由口胃管给予。无细胞胎盘提取物将被溶解在乳酸林格氏溶液中至4mg/mL总蛋白质的浓度，并且在娩出后的前24小时以2.5mL/kg/小时的速率给予，然后在娩出后历经48小时增加至5mL/小时/kg。此时，如由Bjornvad所描述的，仔猪将被切换至5mL/kg/小时的制剂。
为了补偿不成熟的肺功能，在出生之后的前6至12小时，将1至2L/min的100％加湿氧气引入保温箱环境中。其后，补充的加湿氧气将仅被提供给显示呼吸窘迫迹象的仔猪。
监测：前2天，每15-20分钟对所有动物进行监测。接下来3天，每30分钟对其进行监测。将每小时记录生命体征以及粘膜和毛细血管再充盈时间，每3小时进行全面身体检查。将每小时通过脉搏血氧计测量氧饱和度和心率。
早期终点包括降低的活动水平、喂养不耐受、腹胀、呕吐，腹泻和血便。在症状发作6小时内没有改善的仔猪将被人道地安乐死并进行尸检。每次喂养前将每3小时对每头仔猪进行身体检查和评估。将立即评估心率范围为163-175bpm、相应SpO2为70％或更低的仔猪，并且如果必要则将其安乐死。在先前的研究中，患有暴发性NEC的动物具有163-175bpm的心率、降低的小于87％且更低的O2饱和度和下降的体温，不太可能存活。
尸检：在第5天，将通过脐导管以至少110mg/kg的剂量给予基于戊巴比妥的安乐死溶液使所有仔猪安乐死。动物一旦死亡，则将进行尸检。胃肠道将被取出并打开以确定NEC的存在。以下临床NEC评分系统将应用于表征由如胃、小肠和/或结肠中出现炎症、水肿、出血、坏死和肠壁积气的宏观证据所指示的损伤的程度：1.无或最小程度的局灶性充血性胃小肠结肠炎；2.轻度局灶性胃小肠结肠炎；3.中度局部广泛性胃小肠结肠炎；4.重度局部广泛出血性胃小肠结肠炎；5.严重局部广泛出血性和坏死性胃小肠结肠炎；和6.严重弥漫性出血性和坏死性胃小肠结肠炎。
对于一个胃肠切片，3或更高的NEC评分将被认为NEC阳性。来自所有仔猪的胃肠道的切片将被置于缓冲福尔马林中用于显微镜评价和分级。
该目标被设计成2个阶段：为了证明NEC发病率的主要结果降低75％，以及为了显示用无细胞胎盘提取物治疗的剂量效应。共需要6头母猪和72头仔猪。该目标的功效部分将需要48头早产仔猪。使用所提出的模型发表的结果证明，当给予标准护理(48小时经由脐静脉的TPN营养，随后肠内喂养2天)时，NEC的发病率大约是50％。要求的动物数目提供95％功效和0.05α以证明主要结果NEC发病率降低75％。无细胞胎盘提取物干预的标准护理的1:3取样方案将产生n＝11的对照和n＝33的治疗组。在相同的1:3方案中，该研究将允许计划额外的4头仔猪以防任何仔猪必须从研究中去除，在功效研究中总共48头仔猪。剩余的24头早产仔猪(n＝12/组)将在2X与5X无细胞胎盘提取物组之间平均分配，用于目标的剂量递增部分。这足以确定与功效部分中治疗组的预期结果(16.5％)相比，任一递增剂量的NEC发病率的变化为7.5％，功效为80％并且α为0.05。
无细胞胎盘提取物制备：胎盘和羊膜由组织库所雇佣的胎盘捐献协调员获得。协调员/QA部门如上所述的筛选捐赠者。协调员将胎盘/羊膜置于0.9％生理盐水中。转移至Plakous后，通过粗组织匀浆将胎盘盘与羊膜、绒毛膜和脐带分离。然后使用实验室搅拌器将胎盘盘块与还含有蛋白酶抑制剂(PI)的PBS一起充分匀浆。然后将粗匀浆离心以分离血性流体(丢弃)。混合的组织在容器的底部处形成团块，并且然后以～1:5的组织体积:总体积的比率再悬浮于具有PI的PBS中。将混合物冷却至4℃并通过高压匀浆实现细胞裂解。通过离心和过滤灭菌去除细胞碎片。然后将提取物冷冻干燥并置于无菌小瓶中。
质量控制：生物活性测试。冷冻干燥后，测试每批提取物的生物活性。目前使用成纤维细胞增殖分析以确定生物活性。当前通过/未通过被确定为在48小时的治疗中与胎牛血清的对照显著不同的增殖。将验证该提案的目标1中所开发的方法，以将该成纤维细胞分析替换为NEC产品清除率的生物活性分析。已经提供了软骨细胞分析的体外结果。这些数据产生自3个不同的批次，包括单独的胎盘制备和合并的胎盘批次二者。
组分浓度一致性测试。总蛋白(mg/ml)计划作为用于无细胞胎盘提取物的释放标准。由于该产品含有趋化因子、细胞因子和生长因子，该研究将在临床前实验中用多重分析定量6种与预防NEC和肠道发育有关的特异性蛋白(IL-10、IL-4、EGF、FGF、GRO-α和SDF-1)。该方法类似于用于其他生物治疗剂的方法，包括IVIg、合并的新鲜冷冻血浆和由培养的非粘附胎盘细胞的分泌蛋白质组开发的治疗剂。
合适的组合物、纤维、复合材料、产品的说明性实施方案。
如以下所使用，对用于肠道病症的制剂或方法的任何提及应理解为分别对那些制剂或方法中的每一种的提及(例如，“说明性实施方案1-4应理解为说明性实施方案1、2、3或4”)。
说明性实施方案1是一种制剂，其包含：胎盘组织的无细胞提取物和溶剂。
说明性实施方案2是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中胎盘组织包含胎盘盘。
说明性实施方案3是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中胎盘组织进一步包含丛密绒毛膜。
说明性实施方案4是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中溶剂包含奶、水、盐水、乳酸钠溶液或糖溶液。
说明性实施方案5是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中奶是天然的哺乳动物奶或合成的哺乳动物奶。
说明性实施方案6是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中奶是脱水的。
说明性实施方案7是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其进一步包含稀释剂、赋形剂或载体。
说明性实施方案8是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其进一步包含一种或多种外源性蛋白酶抑制剂。
说明性实施方案9是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中该一种或多种外源性蛋白酶抑制剂包含4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)、牛肺抑肽酶、N-(反式-环氧琥珀酰基)-L-亮氨酸4-胍基丁酰胺、亮抑酶肽、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(2-氨基乙基(醚)NNN’N’-四乙酸、氯化铵、波普瑞韦、丹诺普韦、那拉匹韦、特拉匹韦或伐尼匹韦。
说明性实施方案10是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其进一步包含维生素或矿物质。
说明性实施方案11是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其进一步包含抗生素。
说明性实施方案12是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中无细胞提取物包含一种或多种蛋白质。
说明性实施方案13是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中该一种或多种蛋白质在口服制剂中的浓度最高达25mg/mL。
说明性实施方案14是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中该一种或多种蛋白质在口服制剂中的浓度最高达15mg/mL。
说明性实施方案15是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中该一种或多种蛋白质在口服制剂中的浓度是2mg/mL至10mg/mL。
说明性实施方案16是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中无细胞提取物悬浮在溶剂中。
说明性实施方案17是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中无细胞提取物溶解在溶剂中。
说明性实施方案18是任何先前或随后的说明性实施方案的制剂，其中制剂是口服给药的。
说明性实施方案19，一种用于预防或减少受试者中肠道病症的症状的方法，该方法包括：获得包含胎盘组织的无细胞提取物和溶剂的液体制剂；和将治疗有效量的液体制剂递送到受试者的胃系统。
说明性实施方案20是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中肠道病症包括坏死性小肠结肠炎(NEC)。
说明性实施方案21是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中受试者是在妊娠37周或更早出生的早产婴儿。
说明性实施方案22是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中早产婴儿具有1500g或更低的出生体重。
说明性实施方案23是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中液体制剂的递送是口服的。
说明性实施方案24是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中液体制剂的递送通过经皮饲管进行。
说明性实施方案25是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中液体制剂减少受试者的肠中的炎症。
说明性实施方案26是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中受试者的肠的绒毛高度增加。
说明性实施方案27是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中受试者的肠的隐窝深度增加。
说明性实施方案28是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中将液体制剂连续递送到受试者最高达30天。
说明性实施方案29是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中将液体制剂连续递送到受试者最高达10天。
说明性实施方案30是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中将液体制剂与受试者的定期喂养同时递送到受试者。
说明性实施方案31是任何先前或随后的说明性实施方案的方法，其中溶剂包含奶、水、盐水、乳酸钠溶液或糖溶液。
说明性实施方案32是任何先前的说明性实施方案的方法，其中来自无细胞提取物的一种或多种蛋白质在液体制剂中的浓度最高达25mg/mL。
对某些实施例(包括所示出的实施方案)的前述描述仅出于说明和描述的目的而呈现，并且不旨在是穷尽性的或将本申请限制为所公开的确切形式。在不脱离本申请的范围的情况下，其许多修改、改变和使用对于本领域技术人员将是显而易见的。

Claims (30)

1.一种口服制剂，其包含：胎盘组织的无细胞提取物和溶剂。
2.如权利要求1所述的口服制剂，其中所述胎盘组织包含胎盘盘。
3.如权利要求1或2所述的口服制剂，其中所述胎盘组织进一步包含丛密绒毛膜。
4.如权利要求1-3中任一项所述的口服制剂，其中所述溶剂包含奶、水、盐水、乳酸钠溶液或糖溶液。
5.如权利要求4所述的口服制剂，其中所述奶是天然的哺乳动物奶或合成的哺乳动物奶。
6.如权利要求4或5所述的口服制剂，其中所述奶是脱水的。
7.如权利要求1-6中任一项所述的口服制剂，其进一步包含稀释剂、赋形剂或载体。
8.如权利要求1-7中任一项所述的口服制剂，其进一步包含一种或多种外源性蛋白酶抑制剂。
9.如权利要求8所述的口服制剂，其中所述一种或多种外源性蛋白酶抑制剂包含4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)、牛肺抑肽酶、N-(反式-环氧琥珀酰基)-L-亮氨酸4-胍基丁酰胺、亮抑酶肽、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(2-氨基乙基(醚)NNN’N’-四乙酸、氯化铵、波普瑞韦、丹诺普韦、那拉匹韦、特拉匹韦或伐尼匹韦。
10.如权利要求1-9中任一项所述的口服制剂，其进一步包含维生素或矿物质。
11.如权利要求1-10中任一项所述的口服制剂，其进一步包含抗生素。
12.如权利要求1-11中任一项所述的口服制剂，其中所述无细胞提取物包含一种或多种蛋白质。
13.如权利要求12所述的口服制剂，其中所述一种或多种蛋白质在所述口服制剂中的浓度最高达25mg/mL。
14.如权利要求12所述的口服制剂，其中所述一种或多种蛋白质在所述口服制剂中的浓度最高达15mg/mL。
15.如权利要求12所述的口服制剂，其中所述一种或多种蛋白质在所述口服制剂中的浓度是2mg/mL至10mg/mL。
16.如权利要求1-15中任一项所述的口服制剂，其中所述无细胞提取物悬浮在所述溶剂中。
17.如权利要求1-15中任一项所述的口服制剂，其中所述无细胞提取物溶解在所述溶剂中。
18.一种用于预防或减少受试者中肠道病症的症状的方法，所述方法包括：
获得包含胎盘组织的无细胞提取物和溶剂的液体制剂；和
将治疗有效量的所述液体制剂递送到所述受试者的胃系统。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述肠道病症包含坏死性小肠结肠炎(NEC)。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述受试者是在妊娠37周或更早出生的早产婴儿。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述早产婴儿具有1500g或更低的出生体重。
22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述液体制剂的递送是口服的。
23.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述液体制剂的递送通过经皮饲管进行。
24.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述液体制剂减少所述受试者的肠中的炎症。
25.如权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述受试者的肠的绒毛高度增加。
26.如权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述受试者的肠的隐窝深度增加。
27.如权利要求18-26中任一项所述的方法，其中将所述液体制剂连续递送到所述受试者最高达30天。
28.如权利要求18-27中任一项所述的方法，其中将所述液体制剂与所述受试者的定期喂养同时递送到所述受试者。
29.如权利要求18-28中任一项所述的方法，其中所述溶剂包含奶、水、盐水、乳酸钠溶液或糖溶液。
30.如权利要求18-29中任一项所述的方法，其中来自所述无细胞提取物的一种或多种蛋白质在所述液体制剂中的浓度最高达25mg/mL。
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