CN114948924A - Trpa1的激动剂在制备治疗子宫内膜炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物医药领域，提供TRPA1的激动剂在制备治疗子宫内膜炎药物中的应用，通过验证TRPA1在大鼠和人子宫组织的表达，TRPA1的激动剂在作用人子宫内膜上皮细胞后，检测炎性反应相关信号以及抗氧化应激信号水平，研究表明短时间激活TRPA1引起炎症因子iNOS表达升高，长时间激活TRPA1抑制iNOS表达；激活TRPA1任何时间点均抑制p‑p65ser536的表达，且12h抑制更明显；在人子宫内膜上皮细胞激活TRPA1上调HO‑1表达，且12h上调更明显，充分说明TRPA1可作为子宫内膜炎的潜在靶标，TRPA1的激动剂可应用在制备治疗子宫内膜炎药物中。

Description

TRPA1的激动剂在制备治疗子宫内膜炎药物中的应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，尤其涉及TRPA1的激动剂在制备治疗子宫内膜炎药物中的应用。

背景技术

瞬时受体电位通道A1(Transientreceptorpotential ankyrin-1,TRPA1)，属于温度敏感感受器TRP家族，主要通透Ca²⁺,可被多种内外源性刺激激活，它广泛分布于感觉神经元及其传入神经末梢，也分布于包括子宫内膜上皮细胞在内的多种非神经细胞上，参与疼痛感受、氧化应激及炎症反应等多种过程。TRPA1激活后对于炎症反应的影响报道不一，促炎作用：在气道上皮细胞激活TRPA1会引起炎症，且该促炎作用通过MAPK/NF-κB信号途径介导。TRPA1也可被LPS(脂多糖)激活，LPS激活肺上皮TRPA1引起钙内流，激活NADPH氧化酶，升高细胞内ROS(活性氧)水平，继而激活MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)/NF-κB(细胞核因子酉乙蛋白)信号，导致IL-8产生。

但是还有部分报道，表明TRPA1激活可通过下调巨噬细胞介导的炎症反应来保护肾脏，或通过保持线粒体的稳态来抑制败血症诱发的肾脏缺血再灌注损伤，在肺癌A549细胞，丁香酸甲酯通过激活TRPA1抑制低氧诱导的COX-2蛋白及mRNA表达，并抑制其启动子活性。过多的NO会损伤细胞，TRPA1激活还可减少亚硝酸盐的水平来减少NO产生，改善DNBS(2,4二硝基苯磺酰基)诱发的小鼠结肠炎。

子宫内膜炎是在生殖系统感染性疾病中很常见的疾病，我们所说的子宫体部的炎症，就是以子宫内膜炎为主，其危害通常有扰乱生理规律、危害输卵管及盆腔、影响胎儿发育，严重的会导致不孕。目前针对该病主要的治疗方法是服用相应的抗生素，但是抗生素滥用会导致毒副作用或使细菌产生耐药性，因此需要开发新的特效药物，而现有报道称TRPA1表达于人及大鼠子宫内膜上皮细胞，但其激活对于子宫内膜上皮细胞炎症反应的影响及机制还不清楚。

发明内容

为了探索TRPA1对子宫内膜炎的影响机制，本申请提供TRPA1的激动剂在制备治疗子宫内膜炎药物中的应用，表明TRPA1激活后会上调HO-1的表达，通过HO-1抑制炎症的作用。

本申请一方面提供TRPA1的激动剂在制备治疗子宫内膜炎药物中的应用，所述激动剂为异硫氰酸烯丙酯。

需要说明的是本申请涉及的激动剂不仅仅只包括AITC(亲电性共价激动剂，异硫氰酸烯丙酯)，还可以为其他可激活TRPA1的激动剂，并且任何包含AITC的组合物，如芥子油，都属于本申请的保护范围。

在一个实施方案中，所述治疗子宫内膜炎药物是通过激活抗氧化应激信号来治疗子宫内膜炎的药物。

在一个实施方案中，所述抗氧化应激信号包括：Nrf2、HO-1、NQO1或SOD。

其中，核因子NF-E2相关因子(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是一种重要的氧化还原敏感性转录因子，其通过诱导调控细胞内Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的组成型和诱导型表达，有利于改善机体氧化应激状态，促进细胞存活以及维持细胞的氧化还原稳态。

HO-1(血红素氧合酶1)，HO-1mRNA和蛋白表达可以在受到氧化应激和细胞损伤后上调，而Nrf2也可以直接调节HO-1启动子活性，因为对HO-1启动子的分析，鉴定出了其与ARE类似的结合位点。NQO1(醌氧化还原酶1,NADH1)，NQO1通过维持泛醌和α-生育酚醌的还原形式，在保护内源性抗氧化剂中起重要作用。SOD(超氧化物歧化酶)，是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，与很多疾病的发生、发展密不可分；基于SOD是作用于超氧阴离子自由基的专一歧化反应催化剂，故SOD作为医药产品，在治疗因自由基作用而导致的炎症、自身免疫性、心脑血管疾病等都有着显著疗效。SOD可利用其抗氧化作用抑制关节炎、胸膜炎、急性气管炎等炎症类型。

在一个实施方案中，所述抗氧化应激信号为HO-1。

在一个实施方案中，所述子宫内膜炎为通过MAPK或NF-κB信号通路激活，

和非脂多糖诱导的子宫内膜炎。

在一个实施方案中，所述NF-κB信号通路由MAPK途径介导。

在一个实施方案中，所述MAPK或NF-κB信号通路激活的相关因子包括：p-p65ser536、p-p65 ser276、ERK、p38-MAPK、JNK或iNOS。

Nuclear factor-κB(NF-κB)是一类转录因子包括RelA(p65)、RelB、c-rel、p50及p52，介导细菌病毒感染引起的免疫反应和炎症等。没有刺激因子的情况下，κB与胞浆中的抑制性蛋白IκB结合，处于失活状态，而前炎性因子TNF-α，IL-1β及LPS等可激活IκB激酶(IKK)磷酸化IκB，磷酸化的IκB被β-TrCP(beta-transducin repeat-containing protein)介导的泛素化降解，释放出NF-κB发生核转位激活炎症基因转录。

p-p65 ser536(磷酸化细胞核因子)是一种常见的转录因子，可以被炎症因子、生长因子或趋化因子等激活。p-p65 ser276与p-p65 ser536区别在于磷酸化的位点不同，一个是276位的丝氨酸被磷酸化，另一个指第536位的丝氨酸被磷酸化，p-p65表示活化的p65。ERK(细胞外调节蛋白激酶)，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。p38-MAPK(分子量为38kD的促分裂素原活化蛋白激酶)，其参与许多细胞生理和病理的过程，包括细胞的凋亡、细胞应激、细胞周期和机体的炎症反应。JNK(c-Jun氨基末端激酶，c-Jun N-terminalkinase)又被称为应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)，是哺乳类细胞中MAPK(mitogen-activatedprotein kinase，丝裂原活化蛋白激酶)信号通路的另一亚类，它在细胞周期、生殖、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用。iNOS(诱导型一氧化氮合酶)是一种炎性因子，存在于内皮细胞、巨噬细胞、神经吞噬细胞或神经细胞中。

在一个实施方案中，所述MAPK或NF-κB信号通路激活的相关因子为p-p65 ser536或iNOS。

在一个实施方案中，所述治疗子宫内膜炎药物是通过激活抗氧化应激信号来抑制MAPK或NF-κB信号通路以治疗子宫内膜炎的药物。

其中，抗氧化应激信号来抑制MAPK或NF-κB信号通路具体为：Nrf2可通过多种机制负性调控NF-κB：①通过降低细胞内ROS水平降低氧化应激介导的NF-κB激活；②通过阻止IκB-α的蛋白酶体降解，抑制NF-κB的核转录；③上调的Nrf2引起HO-1上调，阻断IκB-α的降解。

在一个实施方案中，所述治疗子宫内膜炎药物作用的最佳时间为12h，所述抗氧化应激信号激活导致所述MAPK或NF-κB信号抑制。

在一个实施方案中，所述子宫内膜炎为人或大鼠的子宫内膜炎。

在另一方面，本申请提供一种治疗子宫内膜炎的药物，所述药物包含TRPA1的激动剂作为活性成分。

在本申请中通过激活TRPA1，引起钙内流，胞内高钙可激活MAPK或NF-κB信号，引起炎症，同时，高钙引起氧化应激，激活Nrf2/HO-1,发挥抑炎的作用。

需说明的是TRPA1在炎症中的作用因研究对象及实验方法不同而有差异，但主要是通过MAPK或NF-κB信号途径，发挥促炎或抑炎的作用。TRPA1表达于感觉神经元及其传入神经纤维末梢，参与痛觉感受，且能被炎症致敏。

另有文献表明，温经暖宫中药里的成分如双去甲氧基姜黄素可通过Ca²⁺/CaMKⅡ(calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ)-ERK1/2促进Nrf2的核转录来诱导HO-1的表达，增加对细胞的抗氧化保护，缓解ROS的损伤，抑制炎性细胞因子的转录，而另一种温经暖宫的中药成分肉桂醛也可激活Nrf2/HO-1来抑制炎症反应改善糖尿病小鼠的血管功能紊乱，也可以抑制炎症改善小鼠溃疡性结肠炎，且肉桂醛可激活TRPA1后可引起Ca²⁺内流，因此，很有可能肉桂醛等成分就是通过激活TRPA1，激活Nrf2/HO-1进而减轻了子宫的炎症，改善了炎性寒痛。

从本申请实施方案可知TRPA1表达于人子宫内膜上皮细胞，TRPA1的激活是通过Nrf2/HO-1抑制炎症反应。

本申请提供TRPA1的激动剂在制备治疗子宫内膜炎药物中的应用，通过验证TRPA1在大鼠和人子宫组织的表达，TRPA1的激动剂在作用人子宫内膜上皮细胞后，检测炎性反应相关信号以及抗氧化应激信号水平，研究表明短时间激活TRPA1引起炎症因子iNOS表达升高，长时间激活TRPA1抑制iNOS表达；激活TRPA1任何时间点均抑制p-p65 ser536的表达，且12h抑制更明显；在人子宫内膜上皮细胞激活TRPA1上调HO-1表达，且12h上调更明显，充分说明TRPA1可作为子宫内膜炎的潜在靶标，TRPA1的激动剂可应用在制备治疗子宫内膜炎药物中。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例的整个技术方案试验流程图；

图2为TRPA1是否表达于人或大鼠子宫组织的结果图，其中，a为TRPA1蛋白在大鼠子宫、输卵管组织和INS-1细胞表达情况的WB结果，b为TRPA1蛋白在大鼠子宫组织表达位置的IHC(免疫组化)结果，其中b的A为阴性对照，b的B为100×、b的C为200×、b的D为400×；c为TRPA1蛋白在人子宫组织表达位置的IHC(免疫组化)结果，其中c的A为阴性对照，c的B为100×、c的C为200×、c的D为400×；R-FT：大鼠输卵管；R-U：大鼠子宫；INS-1：胰岛β细胞株，作为阳性对照；GADPH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)：内参；黑色箭头显示免疫阳性的位置；

图3为TRPA1激活后对iNOS(炎症因子)表达的影响，其中，A为100μMAITC处理细胞6h后iNOS WB结果，B为100μMAITC处理细胞12h后iNOS WB结果；C为A中WB对应的灰度值分析结果，D为B中WB对应的灰度值分析结果，纵坐标为iNOS蛋白表达情况；Control：对照组(不添加AITC)，AITC组：添加TRPA1的选择性激动剂AITC，HC-030031(TRPA1通道阻断剂)+AITC(HC+A)：在AITC处理前1h加入阻断剂，β-actin为内参；*p<0.05vs.Control，#p<0.05vs.AITC；

图4为AITC处理人子宫内膜上皮细胞对p-p65 ser536表达的影响，其中，A为100μMAITC处理细胞6h后p-p65 ser536 WB结果，B为100μMAITC处理细胞12h后p-p65 ser536 WB结果；C为A中WB对应的灰度值分析结果，D为B中WB对应的灰度值分析结果，纵坐标为p-p65ser536蛋白表达情况；Control：对照组(不添加AITC)，AITC组：添加AITC，HC-030031(HC+A)：在AITC处理前1h加入阻断剂，β-actin为内参；*p<0.05vs.Control，#p<0.05vs.AITC；

图5为AITC处理人子宫内膜上皮细胞对HO-1表达的影响，其中，A为100μMAITC处理细胞6h后HO-1WB结果，B为100μMAITC处理细胞12h后HO-1WB结果；C为A中WB对应的灰度值分析结果，D为B中WB对应的灰度值分析结果，纵坐标为HO-1蛋白表达情况；Control：对照组(不添加AITC)，AITC组：添加AITC，HC-030031(HC+A)：在AITC处理前1h加入阻断剂HC-030031，β-actin为内参；*p<0.05vs.Control，#p<0.05vs.AITC；

图6为不同浓度AITC处理不同时间对hEECs细胞活性的影响，横坐标为处理浓度，浓度依次为0μM、25μM、50μM、75μM、100μM、125μM、150μM，分别处理6h或12h；纵坐标为hEECs细胞活性；*P<0.05vs 12h 0μM，#P<0.05vs 6h 0μM；

图7为LPS处理人子宫内膜上皮细胞对iNOS和p-p65 ser536表达的影响，其中A为LPS和HC+LPS处理细胞6h和12h后iNOS和p-p65 ser536的WB结果，B为iNOS的WB结果对应的灰度值分析结果，C为p-p65 ser536的WB结果对应的灰度值分析结果，Control：对照组(不添加LPS和HC)，LPS：添加脂多糖组，LPS+HC：添加脂多糖和阻断剂组，L6h：LPS处理6h，L12h：LPS处理12h，HC：HC-030031；*p<0.05vs.control。

具体实施方式

下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。

实施例1TRPA1在大鼠和人子宫组织的表达

取大鼠的输卵管及子宫组织，从宁夏医科大学总医院病理科获取非妊娠人子宫内膜临床病理标本，通过IHC、WB对TRPA1的表达情况进行定性和定量检测。

IHC：人子宫内膜组织及大鼠子宫组织、输卵管组织4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，5μm切片，常规免疫组织化学染色。兔抗-TRPA1(cat.no.ab58844,1:200)孵育4℃过夜，二抗工作液孵育30min，HRP显色。

Western blot:大鼠子宫及输卵管组织入液氮，称重，匀浆，蛋白定量，10％SDS-PAGE进行蛋白分离，兔抗-TRPA1(cat.no.ab58844,1:1000)，辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000,ZB-2301)。GADPH为内参，抗体浓度为1:5000,cat.no.bs-0755R。

参见图2，结果显示TRPA1表达于人及大鼠子宫内膜组织。图2中a的WB结果表明TRPA1蛋白表达于大鼠子宫、输卵管组织和INS-1细胞，分子量为127kDa。图2中b和c为IHC实验结果，IHC显示TRPA1免疫阳性位于大鼠(参见图2中b)和人(图2中c)子宫内膜上皮细胞、腺体上皮细胞及间质细胞。

实施例2激活TRPA1后，检测炎性反应相关信号

细胞处理方法：常规培养hEECs，待细胞生长至融合度80-90％，消化传代并接种于新的培养皿内，分为对照组(不加AITC与阻断剂)，AITC组，HC-030031(TRPA1通道阻断剂)+AITC组，分别处理细胞6h及12h后，收集上清培养基及细胞，进行后续实验，其中HC-030031在AITC处理前1h加入。

指示检测：用WB法检测全细胞MAPK介导的NF-κB信号通路的激活水平，涉及的MAPK介导的NF-κB信号通路相关因子包括：p-p65 ser536、iNOS。参见图3，AITC(异硫氰酸丙酯)处理人子宫内膜上皮细胞对iNOS表达的影响。100μM AITC处理细胞6h后上调iNOS表达(参见图3中A和C)，处理12h后下调iNOS表达(参见图3中B和图3中D)。AITC对iNOS表达的影响可被TRPA1通道阻断剂HC-030031(100μM)阻断。而MAPK介导的NF-κB信号通路是促炎效应相关，也就是说AITC处理时间短具有促炎效应，而处理时间长具有抑炎效应。

参见图4，AITC(异硫氰酸丙酯)处理人子宫内膜上皮细胞对p-p65 ser536表达的影响。100μM AITC处理细胞6h和12h均下调p-p65ser536的表达，AITC引起的p-p65ser536下调均不能被TRPA1通道阻断剂HC-030031(100μM)逆转，在12h处理组可见AITC诱发的p-p65ser536下调程度更明显。从结果看，处理6h和12h都抑制了p-p65 ser536，意味着TRPA1激活后即抑制了NF-κB途径，处理时间越长，抑制越明显；AITC和HC+A是没有统计学差异的，意味着HC预处理后1h再加入AITC共同处理接下来的时间到满足6h和12h，AITC的作用没有被阻断，对p-p65 ser536的抑制不被HC逆转。

提示AITC对p-p65 ser536的抑制发生在钙内流之后，即在下游信号，因为HC-030031是选择性的可逆的拮抗TRPA1，提前1h加入，后又加入AITC，可能会竞争性与部分TRPA1结合，引起钙内流，激活Nrf2/HO-1，起到负性调控NF-κB的作用，因为HO-1高表达，且上调在6h可被HC阻断，但在12h，上调的HO-1不能被HC完全阻断，提示存在TRPA1激活的可能性，而一开始的TRPA1激活，不管是引起炎症还是氧化应激，这两种的产物都有激活TRPA1的可能，因此12h时，HO-1表达升高更明显(与6h比)，这和处理时间延长有关系，后面HO-1的上调不能完全被HC阻断，有可能是与TRPA1被其他信号激活有关。

实施例3激活TRPA1后，检测氧化应激及抗氧化应激相关信号水平

激活TRPA1后检测抗氧化应激相关信号水平：WB法检测全细胞匀浆的抗氧化应激信号包括：HO-1的水平。

参见图5，检验AITC处理人子宫内膜上皮细胞对HO-1表达的影响。100μM AITC处理细胞6h和12h均上调HO-1的表达，在6h处理组，HO-1的上调可被TRPA1通道阻断剂HC-030031(100μM)完全逆转(参见图5中A和C)，在12h处理组部分阻断(参见图5中B和D)，且AITC诱发的HO-1上调程度在12h处理组更明显。HO-1上调抑制NF-κB信号通路的激活水平，从而说明TRPA1激动剂有一定的抑炎作用。

实施例4选取100μM浓度AITC进行试验，对hEECs细胞活性影响因素的排除

在确认TRPA1激活对人子宫内膜上皮细胞炎性反应及氧化应激的影响时，需要选取合适的AITC浓度，通常选择细胞活性抑制率小于50％的浓度，经查阅文献，在本申请实施例中，选取100μMAITC进行后续试验，为此需先验证100μMAITC对hEECs细胞活性的影响。

培养人子宫内膜上皮细胞，CCK8实验检测TRPA1激动剂AITC对细胞活性的影响，选择合适的作用浓度及时间。

人子宫内膜上皮细胞培养及CCK8检测：人子宫内膜上皮细胞购买自北京北纳创联生物技术研究院，DMEM/F-12培养基(DMEM,Gibco,Thermo Fisher)含10％胎牛血清(FBS,CLΛRK，FB35015)，500U/mL青霉素和500μg/mL链霉素(Solarbio,P1400)常规培养人子宫内膜上皮细胞(Human endometrial epithelial cells,hEECs)，待细胞贴壁生长至对数生长期后，将细胞消化计数并接种于96孔板内(5×103个/孔)继续培养，待细胞贴壁后，弃去旧的培养基加入含有不同浓度ATIC的完全培养基分别培养hEECs 6h和24h，CCK-8法检测各组细胞活力(凯基，KGA317s-500)。

参见图6，为不同浓度AITC处理不同时间对hEECs细胞活性的影响。可知AITC浓度依次为0μM、25μM、50μM、75μM、100μM、125μM、150μM，分别处理6h或12h对细胞活性皆有影响，根据验证实验，100μMAITC处理细胞明显影响iNOS和HO-1，而CCK8试验说明100μM对细胞活性有影响，但没有到抑制50％的细胞活性，毒性较弱，因此在本申请实施例中选择100μM的浓度可作为后续试验的AITC浓度，可基本排除对hEECs细胞活性的影响因素。

实施例5阻断TRPA1对LPS诱发的炎症反应的影响

分为对照组(不加LPS与阻断剂)，LPS组，LPS+HC(加LPS和阻断剂)，分别处理子宫内膜上皮细胞6h及12h；用WB法检测全细胞MAPK介导的NF-κB信号通路的激活水平，涉及的MAPK介导的NF-κB信号通路相关因子包括：iNOS、p-p65 ser536。

参见图7，由7中B可知，LPS处理人子宫内膜上皮细胞6h和12h均上调iNOS和p-p65ser536，说明LPS激活了NF-κB信号，而HC-030031预处理后，在6h不影响LPS的作用，在12h，对iNOS的上调比LPS处理6h引起的iNOS上调减弱，且HC预处理后，减弱被逆转。而p-p65536是调控iNOS等炎性因子的上游，由图7中C可知，阻断TRPA1不影响LPS引起的p-p65ser536激活，提示，LPS引起的NF-κB途径激活不依赖于TRPA1，TRPA1激动剂对LPS引起的子宫内膜炎几乎无效，也即TRPA1的激动剂在制备治疗子宫内膜炎药物中的应用中，所述子宫内膜炎为通过MAPK或NF-κB信号通路激活，但是除脂多糖诱导的子宫内膜炎以外。

本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。

Claims (9)

1.TRPA1的激动剂在制备治疗子宫内膜炎药物中的应用，所述激动剂为异硫氰酸烯丙酯。

2.根据权利1所述的应用，其特征在于，所述治疗子宫内膜炎药物是通过激活抗氧化应激信号来治疗子宫内膜炎的药物。

3.根据权利2所述的应用，其特征在于，所述抗氧化应激信号包括：Nrf2、HO-1、NQO1或SOD。

4.根据权利1所述的应用，其特征在于，所述子宫内膜炎为通过MAPK或NF-κB信号通路激活，和

非脂多糖诱导的子宫内膜炎。

5.根据权利4所述的应用，其特征在于，所述MAPK或NF-κB信号通路激活的相关因子包括：p-p65ser536、p-p65 ser276、ERK、p-p38-MAPK、JNK或iNOS。

6.根据权利1所述的应用，其特征在于，所述治疗子宫内膜炎药物是通过激活抗氧化应激信号来抑制MAPK或NF-κB信号通路以治疗子宫内膜炎的药物。

7.根据权利6所述的应用，其特征在于，所述治疗子宫内膜炎药物作用的最佳时间为12h，所述抗氧化应激信号激活导致所述MAPK或NF-κB信号抑制。

8.根据权利1所述的应用，其特征在于，所述子宫内膜炎为人或大鼠的子宫内膜炎。

9.一种治疗子宫内膜炎的药物，其特征在于，所述药物包含TRPA1的激动剂作为活性成分。

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