CN114901836A

CN114901836A - 肝移植的临床和分子预后标志物

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Publication number: CN114901836A
Application number: CN202080083716.6A
Authority: CN
Inventors: 爱德华多·巴罗索; 雨果·平托·马奎斯; 荷西·佩雷拉·利尔; 乔安娜·卡多索·瓦兹
Original assignee: Ofer Ormix Biotechnology Research & Development Ag
Current assignee: Ofer Ormix Biotechnology Research & Development Ag
Priority date: 2019-10-02
Filing date: 2020-10-02
Publication date: 2022-08-12
Also published as: WO2021064230A1; EP4038205B1; JP2022552809A; EP4038205A1; US20220228218A1

Abstract

本发明涉及一种用于预测肝移植结果以治疗肝细胞癌(HCC)的方法，或者一种用于安排HCC患者接受肝移植的方法，包括以下步骤：确定选自遭受HCC的患者肝样本的指示基因(包括皮肤桥蛋白、丛生蛋白、钙蛋白酶小亚基1、含F‑box和WD重复蛋白7和SproutyRTK信号拮抗剂2)的表达水平，并将该指示基因表达水平与内参基因的表达水平进行比较，且将此通过线性支持向量机算法与可变肿瘤总体积相结合，以预测肝移植受者的良好预后。

Description

肝移植的临床和分子预后标志物

本申请要求日期为2019年10月2日的欧洲专利申请EP19201218.5的优先权，该申请以引用方式并入本文。

本发明涉及一种用于在肝细胞癌的治疗过程中预定或考虑接受肝移植的患者的预后或确定其阳性结果可能性的方法。与当前选择患者的标准相比，临床和分子标志物的综合应用允许更好地选择潜在的肝移植候选者。它的应用将有助于改进肝细胞癌患者的肝移植选择。

说明书

肝细胞癌(HCC)是一种高度流行的疾病，显著影响死亡率和生活质量。重要的是要了解其多因素的病因和复杂的发病机制，以便为当前的治疗提供患者分层信息或设计出针对患者基因组的优化的个性化药物。肝移植(LT)是治疗肝硬化HCC的最佳方法，但由于该疾病极有可能出现不良结果，因此器官可用性受到限制。此外，据信，当前标准的扩大将导致对移植的需求增加，进而导致移植前名单上的等待时间延长、退出率升高和意向治疗结果恶化。即使器官可用，LT的益处也必须与供体的风险相平衡。

因此，优化选择HCC患者势在必行。目前临床形态学模型的严格性，即米兰标准(MC)，可能会排除优秀的候选者，例如在疾病晚期发现的晚期然而“良性”肿瘤患者。相反，MC可能不排除以更具侵袭性的肿瘤行为为特征的患有早期HCC的患者。在肝硬化背景下确定患有HCC的患者肝移植的最佳候选者可能会增加LT候选者的数量，从而影响对供体库的需求。

分子生物标志物可提供有关肿瘤生物学行为的相关信息。然而，目前尚无可用于正确选择移植患者的公认的预后生物标志物，因为很少有研究将HCC分子生物标志物用于患者。本发明人提出，关注影响预后的基因或基因特征很重要，因为基于肿瘤形态的标准只能部分区分预后良好/不良的患者。其中在预后良好的HCC患者中表达的基因(即上调导致良好结果的基因)可补充目前公认的标准，以选择受益于LT可能性高的亚组患者。当然，阴性预测基因也有重要作用，因为其可识别疾病可能复发的患者。

皮肤桥蛋白(DPT)

DPT，也称为TRAMP(富含酪氨酸的酸性基质蛋白)(基因ID GC01M168664)，是一种细胞外基质蛋白，其可能在细胞-基质相互作用和基质组装中发挥作用。该蛋白存在于各种组织中，并被认为在间充质细胞(成纤维细胞和肌成纤维细胞)和巨噬细胞中表达。这种分子对于细胞外基质组装、细胞粘附和伤口愈合至关重要。它还加速胶原原纤维的生成，并通过与体内细胞外基质微环境中的核心蛋白聚糖的相互作用来改变TGF-β的行为。DPT抑制核心蛋白聚糖TGF-β1复合物的形成，并可能增大对TGF-β的细胞反应，并增强其生物活性。此外，它已被确定为维生素D受体的下游靶标。维生素D受体转而介导1,25-二羟基维生素D3下游的信号传导，从而对HCC发挥抗增殖作用。DPT与细胞粘附和肿瘤侵袭性有关。DPT的强表达与口腔癌和骨巨细胞瘤的转移抑制有关。DPT的下调通过与TGF-β1的可能相互作用和其他潜在机制而与HCC的癌变和进展有关。在HCC组织的DPT表达水平明显低于在健康的肝脏。

钙蛋白酶小亚基1(CAPNS1)

钙蛋白酶是一个蛋白酶家族，其通过改变细胞粘附分子和细胞骨架成分的结构或通过干扰细胞内信号通路，参与细胞迁移和侵犯。其调节亚基CAPNS1和CAPN4可能在钙蛋白酶活性中起重要作用。敲低恶性内皮细胞中的CAPNS1可能会降低恶性内皮细胞的扩散能力，而CAPNS1的上调与动物在HCC切除后的肿瘤大小、数量和甲胎蛋白(AFP)水平的升高有关。

丛生蛋白(CLU)

由CLU基因伴侣(CLU，基因ID GC08M027596)编码的蛋白质，具有胞质性和分泌性。与EIF3I复合的CLU激活Akt通路，进而促进HCC细胞的转移。

含F-box和WD重复蛋白7(FBXW7，基因ID GC04M152321)

基因“含F-box和WD重复域蛋白7(FBXW7)”，也称为Sel10、hCDC4或hAgo，可编码F-box蛋白家族的成员，F-box蛋白家族的成员用作SCFE3泛素连接酶的底物的识别成分。FBXW7蛋白是一种关键的肿瘤抑制因子，也是人类癌症中最通常失调的泛素-蛋白酶体系统蛋白之一。FBXW7控制蛋白酶体介导的癌蛋白的降解，例如cyclin E、c-Myc、Mcl-1、mTOR、Jun、Notch和AURKA。在卵巢癌和乳腺癌细胞系中检测到该基因的突变，表明该基因在人类癌症发病机制中具有潜在作用。体外研究表明，FBXW7可用作肝细胞癌的预后标志物，且表明FBXW7的较低表达水平与HCC患者的较低生存率有关。因此，FBXW7在HCC进展中具有重要作用，即它通过Notch1信号通路可抑制HCC细胞的迁移和侵袭。

Sprouty RTK信号拮抗剂2(SPRY2，基因ID GC13M080335)

果蝇Spry(dSPRY)基因家族包括四个同源物SPRY1至SPRY4，被认为参与了与HCC癌变相关的RAF/MEK/ERK通路的负反馈回路。特别是SPRY2通过调节受体酪氨酸激酶(RTK)的信号传导和抑制RAF/MEK/ERK通路，来拮抗生长因子介导的细胞增殖、迁移和分化。该蛋白是与癌症发展相关的重要途径的重要调节剂，重要途径例如血管生成、细胞生长、侵犯、迁移和胞质分裂。

基于上述最新技术，本发明的目的是提供有助于从所有HHC患者中准确选出LT的最佳候选者的分子标志物。这些分子标志物应该能够预测肿瘤的行为和侵袭性。该目的是通过作为一个整体的本说明书的权利要求和本说明书中提供的进一步的有利实施方式实现的

本发明人完善了选择肝硬化HCC患者进行LT的临床标准，并评估了所选生物标志物在人群中的作用。本发明人验证了当前临床标志物的作用，以具体确定在米兰标准的当前临床金标准外的亚组患者中LT的最佳候选者，从而整合临床和分子特征以准确解决肿瘤的生物学问题。

通过使用公共存储库中的临床数据、关于HCC的分子预后生物标志物主题的系统评价以及本发明人可获得的内部临床数据，鉴定了一组可能的候选基因。本发明人鉴定了具有预后价值的单基因改变，并将其组合成预测性多变量特征。系统评价能够鉴定与HCC进展相关的基因，这些基因被认为可提供LT后的预后信息，从而有助于LT的患者选择。

本发明人在此证明，DPT、CLU、CAPNS1、FBXW7和SPRY2在LT后有或无HHC复发的患者中表现出差异表达。此外，DPT和CLU单独或联合地有效区分出LT后未复发HCC的亚组患者，因此预后良好。

术语“基因表达”或“表达”，或者术语“基因产物”，可以指核酸(RNA)的生成或者肽或多肽的生成(也分别称为转录和翻译)两者之一的或两者兼有的过程及其产物，或者指调节遗传信息处理以产生多肽产物的任何中间过程。术语“基因表达”也可用于RNA基因产物的转录和处理，RNA基因产物例如调节性RNA或结构性RNA(如核糖体RNA)。如果表达的多核苷酸来自基因组DNA，则该表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。可在转录和翻译的水平上，又称mRNA和/或蛋白质产物，测定表达。

本发明上下文中的术语“良好预后”是指在LT后五年内HHC疾病未复发。在实施例中，良好预后是通过其与患者生存率的直接关联来衡量的，因此总体生存率或无病生存率在很大程度上是等效的。

在本发明的上下文中，术语“支持向量机”、“SVM”、“线性核SVM”或“SVM算法”是指能够对数据进行分类和/或执行回归分析的监督机器学习模型。它有时被称为支持向量网络，并且在本发明的上下文中被用作二进制线性分类算法的一种形式。在本发明的上下文中，该算法使用训练步骤，其中患者数据样本与一组变量相关联以建立模型，变量包括但不限于基因表达水平或肿瘤体积测量值，该模型将样本分配给一个或另一个类别，例如生存率或五年后未生存率。

一方面，本发明涉及一种用于预测肝移植结果以治疗HCC的方法。在该方面的替代方面，本发明涉及一种通过肝移植治疗HCC的方法。在另一替代方面，本发明涉及一种用于将HCC患者分成不同组的方法，这些患者或多或少可能从接受肝移植中受益，换言之，这些患者在LT之后将表现出更长的总体生存期，而没有疾病复发。

根据本发明该方面的方法包括确定步骤，其中肝样本中的遗传生物标志物或指示基因的表达水平(特别是mRNA水平)(指示基因的表达水平在本文中也称为指示基因表达水平)是从遭受HCC的患者身上获得的，其中所述指示基因选自包括如下的列表：

a.皮肤桥蛋白；

b.丛生蛋白；

c.钙蛋白酶小亚基1；

d.含F-box和WD重复蛋白7；

e.Sprouty RTK信号拮抗剂2。

在某些实施方式中，指示基因为CLU或DPT

在本发明的所述第一方面的替代方面，所述用于预测肝移植结果以治疗HCC的方法包括：

-在确定步骤中，确定从遭受HCC的患者获取的肝样本内的包括CLU和DPT的指示基因组中每种指示基因的表达水平；

-在分类步骤中，基于指示基因的表达水平，指定患者预后良好作为肝移植的结果。

在某些实施方式中，这组指示基因还包括以下至少一种：

-钙蛋白酶小亚基1；

-含F-box和WD重复蛋白7；

-Sprouty RTK信号拮抗剂2。

在某些实施方式中，任何指示基因的过表达表明预后良好。

在某些实施方式中，DPT和/或CLU表达的过表达表明预后良好。

在某些实施方式中，指示基因相对于阈值过表达。在替代实施方式中，将指示基因表达水平与对照样本进行比较，对照样本选自每个疾病结果子集的代表性患者。

在某些实施方式中，通过使用对样本中存在的编码指示基因的mRNA水平敏感的定量聚合酶链式反应(PCR)，确定指示基因表达水平。表6中示出了扩增本发明指定的目的指示基因区域的特异性引物，该特异性引物可特别用于根据本发明提供的方法确定指示基因的表达水平。全局RNA测序是一种替代方法，可产生根据本发明使用的基因表达水平，

可将指示基因表达水平与内参基因进行比较，特别是与管家基因的表达水平进行比较。在特定实施方式中，将其与核糖体蛋白L13A(RPL13A)(基因ID23521)的表达水平进行比较。其他可能性包括其他管家基因，例如GADPH和/或TBP，，或者基因组合。

在某些实施方式中，通过PCR确定指示基因表达水平。将相对于阈值的指示基因表达值确定为所述指示基因的阈值循环数与内参基因的阈值循环数之差。阈值循环数是指检测产物[所述指示基因和所述内参基因]时的PCR循环数。

在某些实施方式中，以下计算用于获得反映指示基因表达水平的值：

目标量＝ACt

ACt(R)＝Ct(R中的DPT)–Ct(R中的参考基因)

ACt(nonR)＝Ct(nonR中的DPT)–Ct(nonR中的参考基因)

其中R为有疾病复发的样本，而nonR为无疾病复发的样本。

在某些实施方式中，指示基因为DPT，阈值为基因表达差异或ACt，且高于7。

在某些实施方式中，指示基因为CLU，阈值为基因表达差异或ACt，且高于-0.54。

在某些实施方式中，指示基因的阈值循环数的差值，高于该差值的基因被称为被过表达，该差值为：DPT表达水平ACt值高于7，CLU表达水平ACt值高于-0.54。

这里提供的阈值是ACt值的例子，可用于根据本发明对基因表达水平进行分类。它们反映了基因相对于管家基因的表达。正值的基因表达水平表示该基因比管家参考基因表达多，而负表达值表示该基因比管家参考基因表达少。指示基因的过表达被定义为ACt阈值以上的表达，该阈值将预后不良的患者与预后良好的患者区分开。

在某些实施方式中，DPT的过表达以及肿瘤总体积≤115cm³的测定结果表明预后良好。

在某些实施方式中，CLU的过表达以及肿瘤总体积≤115cm³的测定结果表明预后良好。

在某些实施方式中，多个患者因子或变量用于预测患者结果，例如CLU、DPT和肿瘤体积的表达水平。在本发明该方面的特定实施方式中，预测性指示基因CLU和DPT的表达水平超过指定阈值表明预后良好。在相关实施方式中，指示基因表达和HHC肿瘤体积≤115cm³的附加非遗传变量表明预后良好。

在某些实施方式中，将患者样本中一个或多个指示基因的表达水平和/或肿瘤体积测量纳入算法中，以提供反映疾病复发可能性的值，特别是其中该算法为支持向量机算法，更特别是其中该算法为线性核支持向量机算法。

在某些实施方式中，指示基因表达水平和肿瘤大小变量用于预测算法，特别是机器学习算法，更特别是线性核支持向量机(SVM)学习算法，该算法将患者分为，特别是在LT后的未来五年，可能或不可能有良好预后的子集。

实施例中提供的数据将CLU的过表达分类为在该队列中的Ct范围从27.36至40.5以及对于DPT从33.49至35.69。-0.54被表示为与对照组相比的Ct变化(也称为delta或ACt)，从而被确定为CLU过表达的有用阈值。同样，ACt阈值7被确定为患者样本中DPT表达的有用阈值。还发现肿瘤体积小于或等于115cm³也表明预后良好。肿瘤体积值是指患者肝脏内所有肿瘤的体积总和；可从计算机断层扫描和磁共振成像中选择可用于确定肿瘤体积的有用方法。诸如在本发明的这一方面中指定的阈值可特别用于对患者值的二值化，以帮助对患者结果的分类。实施例5中的数据给出了CLU、DPT和肿瘤体积的有用阈值。表达水平或体积低于该值的样本被赋值为0分，测量值高于该阈值的样本被赋值为1分。实施例中展示了将患者队列中的二值化格式的多变量数据合并到SVM算法中，以创建分类系统，其中所得分数表示LT后的患者结果。

在某些实施方式中，确定步骤包括确定DPT的表达以及确定选自CLU、CAPNS1、FBXW7和SPRY2的基因的表达，特别是DPT和CLU的表达。

在某些实施方式中，单独的CLU或DPT的过表达表明预后良好。在某些实施方式中，将本发明提供的基于指示基因表达水平和/或TTV或两者兼有的预测分类与附加的例如米兰标准下的评估的预后预测因子相结合。实施例中的数据表明，CLU的表达水平可准确预测被归类为米兰标准外的HHC患者子集中的疾病结果。

米兰标准由Mazzaferro于1996年引入(Mazzaferro et al,N Engl J Med.1996Mar 14；334(11):693-9)，该标准对患有HCC的成人的移植有如下限制：(1)单个肿瘤的直径小于5cm；(2)肿瘤病灶的数量不超过三个，且每个病灶的大小不超过3cm；(3)无血管侵犯；(4)无肝外受累。

本发明还涉及一种用于检测肝移植生物标志物高表达的系统。该系统包括这样的装置，该装置用于确定DPT的表达以及确定选自CLU、CAPNS1、FBXW7和SPRY2的基因的表达，特别是DPT和CLU的表达。

另一方面，本发明包括用于扩增和检测DPT和CLU以及任选地选自CLU、CAPNS1、FBXW7和SPRY2的其他生物标志物的表达的引物在用于分析生物标志物的试剂盒中的应用，以预测用于治疗HCC的肝移植的结果。此外，本发明包括一种通过肝移植手术治疗先前被诊断为患有HHC的患者的方法，其中根据上述任一方面和实施方式中说明的方法已将该患者分类为可能具有良好预后。

附图说明

图1示出验证集中根据复发率选择的基因的差异表达的RT-qPCR结果。复发(R：左)与未复发(noR：右)。Wilcoxon(Mann-Whitney)检验(置信水平＝0.95)。

图2示出关于DPT表达和肿瘤复发的受试者操作特征(ROC)分析。曲线下面积(AUC)为0.77。选择了ACt临界值为7，其对应于84％的敏感性和63％的特异性。

图3示出由DPT表达得到的无病生存率。

图4示出米兰标准(MC)内外的患者中由DPT表达得到的生存率。

图5示出在TTV>115cm³的患者(A)、低分化的患者(B)或微血管侵犯的患者(C)中由DPT表达得到的无病生存率。

图6示出HCV亚组患者中由DPT表达得到的生存率。

图7示出由CLU表达得到的无病生存率。

图8示出根据“不良预后”亚组中的CLU表达得到的无病生存率：A.MC外的患者；B.TTV>115cm³的患者；C.微血管侵犯的患者；D.低分化肿瘤的患者。

图9示出根据丙型肝炎病毒(HCV)患者中的CLU表达得到的生存率。

图10示出由DPT/CLU复合评分得到的无病生存率。

图11示出在MC外的患者(A)、TTV>115cm³的患者(B)、低分化肿瘤的患者(C)以及微血管侵犯的患者(D)中使用复合基因评分得到的DFS。

图12示出用于TTV≤115cm³患者的复合基因评分的DFS。

图13示出根据DPT和/或CLU的表达的无病生存率。与CLU相比，DPT表达显示出更好的预测长期生存者的能力。

图14预测算法的混淆矩阵。

图15示出队列的总人口基于使用CLU、DPT和TTV值的算法的无病生存率KaplanMeier曲线。

图16示出米兰标准外的患者基于使用CLU、DPT和TTV值的算法的无病生存率Kaplan Meier曲线。

图17示出米兰标准内的患者基于使用CLU、DPT和TTV值的算法的无病生存率Kaplan Meier曲线。

实施例

实施例1：分子预后生物标志物的研究

本发明人基于形态特征分析了几种当前选择标准的性能，强调了它们排除良好候选者和错误地纳入不良候选者的可能性。本发明人测试了先前鉴定的移植后作为HCC预后的推定生物标志物的基因。DPT和CLU基因能够有效地将HCC肝移植后复发概率极低的亚组患者区分、分离或两者兼有。

实施例2：肝细胞癌的预后分子标志物

由于可在接受肝切除术(LR)的患者队列中获得重要信息，因而将LR中的生物标志物研究纳入分析。与单基因相反，特征之间的重叠在文献中并不常见，并且基因特征通常不可复制。出于这个原因，本发明人特别关注单基因生物标志物而非基因特征。此外，由于许多生物标志物未在其原始研究环境之外得到进一步的测试和验证，因此它们在当前工作中的使用至少代表了外部验证的努力成果。

本发明人检索到了以下数据：数据类型(mRNA、miRNA和蛋白质)，预后信息，涉及的特定基因，良好或不良的预后基因，改变类型(过表达、下调、高/低甲基化、突变)，患者样本和统计数据以及作者的观察。

实施例3：试验集

实施该第一组是为了更好地修剪与在整个文献检索中确定的更好预后相关的生物标志物，并进一步减少与早期复发相关的推定生物标志物的数量。在最初提出的20名患者(参见实施例6，样本收集)中，由于从老年患者的第一批样本中提取RNA存在困难，因而在测试集中又增加了9名患者。由于样本不足，未使用3名患者的样本。因此，试验集由26名患者组成(6名MC外未复发的患者；7名MC外复发的患者；7名MC内未复发的患者；6名MC内复发的患者)。提取RNA后，获得cDNA并进行RT-qPCR。最后，被评估基因的差异表达与临床数据相关。表1示出根据MC内或外的复发情况得出的测试集结果。

表1：基因表达的结果基于测试集及其与复发的关系。p值根据Mann-Whitney检验结果得出。

在MC内的患者中，Clusterin(CLU，p＝0.09)、CAPNS1(p＝0.05)和FBXW7(p＝0.04)的表达根据复发情况存在显著差异。在MC外的患者中，Clusterin(p＝0.02)、Dermatopontin(p＝0.06)和SLC16A4(p＝0.08)的表达根据复发情况也存在显著差异。Clusterin是区分总体复发情况的最佳标志物(p＝0.01)。然后将满足试验研究中选择标准的选定生物标志物CAPNS1、DPT、CLU和FBXW7的子集应用于验证集。此外，本发明人将SPRY2纳入验证集中用于进一步的下游分析，因为其p值在试验集的“米兰标准内”组中具有临界显著性(p＝0.13)，尽管在其他两组中不显著。另一个在“所有标准”组中也具有临界显著性p值(p＝0.14)的基因MUC15，被排除在验证集中待测试的基因组之外。该排除是由于其在RT-qPCR中的性能不佳(Ct过高和频繁的样本失败)，这种性能不佳可能与极低的表达水平相关。

实施例4：验证集

考虑了1992年9月至2014年2月期间因HCC而接受LT的301名患者的完整人群。根据纳入和排除标准(参见实施例6，研究人群)，在该分析中确定了总共275名患有经组织学证实的HCC的患者。在被排除的44名患者中，32名有围手术期死亡率，12名有残留和/或肝外疾病。先前纳入试验集的患者(26人)以及LT后5年内的患者(38人)也被排除在外。最初的研究人群由167名患者组成。有33名患者(19.7％)由于广泛的肿瘤坏死(14/167；8.3％)、低质量RNA提取(12/167；7.2％)或福尔马林固定石蜡包埋组织不可用(7/167；4.2％)而无法接受样本分析。因此，增加了20名LT后5年内的患者，即验证集中总共154名患者。样本接受了分子标志物分析的患者总数为180人。表2概述了试验集(n＝26)、验证集(n＝154)和总人群(n＝180)的一般特征。

正如所料，与验证集相比，试验集表现出更具侵袭性的肿瘤特征，因为MC内外的患者在该第一集中均匀分布。试验集患者的血管侵犯更频繁，肿瘤更大，TTV更高，且MC内患者比例更低。在总人群中，供体年龄中位数为38岁，这与FAP供体(患有家族性淀粉样多发性神经病的患者接受活体移植治疗，而他们的肝脏可用于治疗其他患者)的高比例一致。患者感染中VHC占主导地位占46％。一个重要的观察结果是LT前的短暂等待时间——中位数为1个月，所对应的平均等待时间为2.2(0-18)个月。肿瘤的中位数为1，所对应的平均值为2.17(1-11)以及最大肿瘤尺寸为2.75cm(平均值为3.25cm，从0.3cm至20cm不等)。只有120名(66.7％)患者在MC内，154名(85.6％)患者在TTV<115cm³内。

表2：试验集、验证集和总人群的人口统计学和临床/病理学特征的比较。仅在试验集和验证集之间进行比较。IQR：四分位距；AFP：甲胎蛋白；MELD：终末期肝病模型。

在验证集中分析了CAPNS1、DPT、CLU、FBXW7、SLC16A4和SPRY2的表达水平。在大量样本中，SLC16A4表达太低而无法被确定，而放弃了对该特定生物标志物的进一步分析。图1示出通过使用Wilcoxon(Mann-Whitney)检验而得到的根据复发率选择的基因的差异表达。

钙蛋白酶小亚基1(CAPNS1)

CAPNS1被纳入验证集，因为其在试验集中对米兰标准内的患者中的复发表现出边缘差异表达(p＝0.05)。因此，根据验证集(OR 1.448，C.I.1.140-1.840，p＝0.002)中的复发情况，肿瘤组织中CAPNS1的表达水平存在显著差异。然而，这并没有转化为危险比的相应显著性，无论是关于DFS(HR 1.073，C.I.0.978-1.178，p＝0.136)还是关于OS(HR 1.014，C.I.0.913-1.125，p＝0.796)。ROC曲线用于确定复发率的临界值。当AUC为0.63时，最佳临界值似乎为deltaCT值0.20，其对应于65％的敏感性和45％的特异性。然而，在对该变量进行分类后，未发现对DFS(p＝0.378)或OS(p＝0.655)的影响。尽管该标志物与复发有一定的关联，但其分布显示复发和非复发患者之间存在大量重叠。

皮肤桥蛋白(DPT)

DPT被纳入验证集中，这是因为其在米兰标准外患者中的复发差异表达几乎是显著的(p＝0.06)。DPT与验证集(OR1.283，C.I.1.103-1.494，p＝0.001)中的复发率密切相关。与(HR 1.048，C.I.0.977-1.123，p＝0.192)或OS(HR 1.036，C.I.0.961-1.116，p＝0.357)的关联最初并不明显。ROC曲线分析显示AUC为0.77(图2)，并允许确定deltaCT临界值为7，其对应于84％的敏感性和63％的特异性。通过使用该值，观察到DFS的HR值为0.480(C.I.0.295-0.782，p＝0.003)。检测到OR的HR为0.503(C.I.0.305-0.831，p＝0.007)。由于DPT的强表达(OR 0.116，C.I.0.037-0.363，p<0.001)，使得复发风险降低近9倍。

总之，DPT过表达表明LT后预后良好。在DPT强表达的患者中，复发风险降低了5倍，无病生存率升高了50％，总体生存率升高了40％。DPT表达能够将LT后预后良好的患者与预后不良的患者区分开。发现它与微血管侵犯有关联，可能与CLU表达有协同作用。这种关联可能与其在细胞外基质组装和细胞粘附中的功能有关，最终影响微血管侵犯。这是第一篇将DPT表达与因HCC而LT后的预后相关联的报告，也第一次证明该基因是良好预后的独立预测因子。

Sprouty RTK信号拮抗剂2(SPRY2)

该蛋白是与癌症发展相关的重要途径(例如血管生成、细胞生长、侵犯、迁移和胞质分裂)的重要调节剂。Song等人(Hepatobiliary&Pancreatic Diseases International2012；11(2):177-184)使用来自240名随机选择的接受肝切除术的HCC患者的样本来研究组织微阵列上的SPRY2表达。有207名患者(86.3％)表现出SPRY2表达下调，这与较低的生存率(p＝0.002)和较高的复发率(p＝0.003)相关，其用作HCC患者术后复发的独立预测因子(HR＝1.47；95％CI，1.02-2.08；p＝0.037)。本发明人的研究首次将SPRY2的过表达与因HCC接受LT治疗的患者群体的复发率升高相关联。然而，由于两组之间存在显著重叠，使得本发明人无法确定可有效区分复发和非复发患者的临界值。因此，SPRY2的临床相关性仍有待未来研究的检验。

SPRY2在试验集中对米兰标准内的复发表现出一些差异表达(p＝0.13)。在验证集中，SPRY2与复发显著相关，OR为1.342(C.I.1.106-1.628，p＝0.003)。然而，在DFS(HR1.050，C.I.0.962-1.145，p＝0.273)或OS(HR 1.030，C.I.0.943-1.125，p＝0.514)上未发现相关性。当AUC为0.68，我们确定最佳临界值为deltaCT值7.6，其对应于69％的敏感性和65％的特异性。然而，在分类后仍未获得相关性，无论是在DFS(HR 1.420，C.I.0.897-2.248，p＝0.134)上还是在OS(HR 1.305，C.I.0.814-2.094，p＝0.269)中。

丛生蛋白

在试验集中，CLU揭示了对米兰标准外患者的复发的差异表达(P＝0.02)，并且在整集样本中类似(p＝0.01)。根据Wilcoxon检验(图36)，在验证集中，CLU表达似乎与复发无关。然而，逻辑回归分析显示CLU表达与验证集(OR 1.219，C.I.1.059-1.403，p＝0.006)中的复发相关。这些结果并非不相容，因为Wilcoxon检验虽然是一种更稳健的统计检验，但对组之间相当细微的差异并不敏感，在我们的例子中，这些差异转化为复发组与非复发组之间的细微表达差异。最初未发现与DFS(HR 1.073，C.I.0.978-1.178，p＝0.136)或OS(HR1.014，C.I.0.913-1.125，p＝0.796)有关联。通过使用ROC曲线，确定了ACT临界值为-0.54，其对应于AUC为0.59(敏感性为7％，特异性为35％)。有了这个临界值，DFS的HR为1.568(C.I.0.951-2.584，p＝0.078)，OS的HR为1.550(C.I.0.926-2.595，p＝0.096)。尽管这种关联似乎很弱，但我们认为它足以在多元逻辑回归和cox回归分析中得到检验。

含F-box和WD重复蛋白7(FBXW7)

根据试验集中米兰标准内患者的复发情况，FBXW7水平似乎表现出差异表达(p＝0.04)。然而，这种差异并未在验证集中得到证实。逻辑回归显示复发率的OR为1.238(C.I.0.894-1.052，p＝0.545)。由Cox回归得出DFS的HR为1.023(C.I.0.929-1.128，p＝0.640)以及OS的HR为1.000(C.I.0.900-1.113，p＝0.994)。

实施例5：总人群分析

本发明人分析了由180名患者构成的整个人群。考虑到在验证集中获得的结果，在该分析中包括通过与在肿瘤组织中管家基因表达相关的ACT值测得的CLU和DPT表达水平。

在该人群中使用多元逻辑回归测试了与复发相关的因子(表3)。本发明人观察到，肿瘤数量、微血管侵犯和低分化与复发独立相关，组织学肿瘤总体积(TTV)也是如此。通过使用DPT表达，预测的复发风险降低了5倍以上，而CLU表达预测了复发风险降低61％。然而，当二者都被引入模型时，只有DPT表达仍然独立预测复发(OR 0.178，C.I.0.063-0.507，P＝0.001)，而不是CLU(OR 0.729，C.I.0.063-0.507，p＝0.554)。在使用复发率作为结果变量(p＝0.402)的情况下，未检测到变量“DPT表达”与“CLU表达”之间的统计交互作用。CLU(p＝0.94)和DPT(p＝0.960)的表达均与低分化肿瘤无关。

表3：总人群复发的多元逻辑回归分析(N＝180)。OR：优势比；Cl：置信水平。

DPT强表达与微血管侵犯减少相关(OR 0.370，C.I.0.140-0.979，p＝0.045)，而CLU表达则不相关(p＝0.173)。然而，当微血管侵犯是结果变量时，检测到DPT与CLU之间存在相互作用(p＝0.033)，这意味着DPT低或高表达的肿瘤中微血管侵犯的发生与CLU的表达密切相关。在这项研究中，21.2％(14/66)的DPT低表达患者存在微血管侵犯。在该亚组中，如果CLU强表达，则微血管侵犯的发生率为4.8％(1/21)；如果伴有CLU低表达，则28.9％(13/45)的患者存在微血管侵犯(p＝0.027)。这种相互作用从未在科学文献中找到，仍有待在未来的研究中得到解释，这表明这些基因之间存在联系。

表4：180名患者中无病生存率的多变量Cox回归分析。

表4示出了总人群中DFS的多变量cox回归分析结果。微血管侵犯是与DFS降低相关的唯一因子。相反，DPT和CLU的强表达水平用作阳性预测因子，且与生存率的升高相关。虽然在模型中同时引入CLU和DPT(HR 0.600，C.I.0.351-1.026，p＝0.062)时CLU不再是自变量，但未在CLU与DPT之间检测到统计交互作用(p＝0.822)。

皮肤桥蛋白(DPT)

本发明人根据强与弱的DPT表达来观察DFS(图3)。具有DPT强表达(定义为ACT水平高于7)的患者在5年和10年时的DFS分别为70％和52.2％。DPT强表达也可用于识别预后较好的亚组患者，即使在MC外的患者中也是如此(图4)。这也适用于表现出其他不良预后标准的患者，例如TTV>115cm³、存在微血管侵犯或低分化的患者(图5A、B和C)。最后，具有DPT强表达的HCV亚组患者的5年和10年DFS分别为79.2％和58.8％(图6)。

丛生蛋白(CLU)

使用组织微阵列分析了198个HCC样本中的CLU表达(Wang et al，Oncotarget2015；6(5)；2903-16)。CLU蛋白主要在肿瘤细胞的细胞质中被检测到。多变量Cox回归分析表明CLU过表达是肿瘤切除后复发的独立预后因子(HR 1.628)。此外，同一项研究发现，CLU的过表达显著促进了体外HCC细胞的侵袭，并促进了体内远处肺转移，而沉默CLU降低了HCC细胞在体内外的侵袭能力。CLU过表达可增强前列腺癌、肾细胞癌、胆囊癌和乳腺癌的转移潜能。

在当前队列中，CLU过表达表现出与复发率和生存率相关，并且能够将LT后预后良好的患者与预后不良的患者区分开。CLU对无病生存率(DFS)也有重要影响(图7)。具有CLU强表达的患者的5年和10年生存率分别为68.9％和56.1％。虽然CLU表达值不如DPT显著，但其在用于不良预后组时能够选出具有更好结果的患者，例如米兰标准外的患者(A)或TTV>115cm³的患者(B)。根据CLU表达，微血管侵犯的患者(C)或低分化的患者(D)与生存率之间没有统计学上的显著相关性，尽管注意到有明显的趋势(图8)。具有CLU强表达的HCV亚组患者的5年和10年DFS分别为74％和67％(图9)。

表5：总体生存率的多变量Cox回归。

还对总体生存率(OS)进行了多变量cox回归分析。乙醇消耗量和微血管侵犯与OS降低独立相关。虽然微血管侵犯是一个已知的风险因子，但乙醇消耗导致OS下降，而DFS没有相应下降，这可能与乙醇中毒中常见的相关合并症例如乙醇性心肌病有关。DPT和CLU的强表达与OS的升高独立相关(表5)。

具有预测能力的多元组合

为了加强与HHC结果相关的基因的预后能力，开发了结合所有基因的预测能力的多基因模型，以研究DPT与CLU之间的协同效应。使用基于两种基因组合后的表达的简单评分。由于它们的DFS风险比相近，因此每种基因分值相同：两种基因的弱表达为0分，一种基因的强表达为1分，两种基因的强表达为2分。两种基因的强表达分别与5年和10年的生存率78％和60％相关，使得基因组合优于单独的DPT或CLU(图10)。该评分可区分米兰标准外的患者(图11A)、TTV>115cm³的患者(图11B)和低分化肿瘤的患者(图11C)在LT后的良好预后。同样，在微血管侵犯的患者中注意到生存率升高的趋势，尽管未达到统计显著性(图11D)。结果优于每种基因单独获得的结果。图12示出使用该简单组合基因评分与TTV<115cm³相结合所预测的生存率。该组合确定了一组LT后预后非常好的患者、一组LT后预后中等但仍可接受的患者以及一组LT后预后不良的患者。

根据先前针对每个单独基因显示的结果，DPT相比于CLU可能具有更好的预测能力。因此，在不使用评分的情况下评估了这些基因的组合，以更好地评估仅强表达两种基因之一的患者的预后能力(图13)。

对于将多种基因纳入到HCC预测策略中的第二种方法，在线性核支持向量机分类算法中，将两种基因CLU和DPT的表达水平值与TTV一起使用。为了评估算法的性能，使用了一种Jackknifing策略，即使用除一个数据点之外的所有数据点对算法进行训练，并使用该去除的数据点进行评估，然后对每个数据点重复该过程并收集结果。移除测试样本后，剩余的数据集经过了数据增强(SMOTE)和归一化(单位方差和零均值)处理程序。这样做是为了获得平衡的训练数据集，防止过度拟合成最普遍的分类，并确保所有特征在分类特征空间中均具有可比性。

使用具有三个变量的多变量算法对由154名患者组成的队列进行了评估。使用阈值技术对变量进行了二值化，其中低于阈值的患者因该特征而被赋予了数值0，高于阈值的患者被赋予了数值1。阈值单位与相应特征(基因表达的ACt和肿瘤体积的体积单位)相同。CLU使用的阈值为-0.54ACt，DPT使用的阈值为7ACt，TTV使用的阈值为115cm³。在评估程序之后获得了以下结果，由此证明了一种与源于多个指示基因和肿瘤体积的二进制数据结合的算法，该算法可精确地对LT后可能出现疾病复发的患者进行分类以治疗HCC(准确率67％，误报率22％，精确率91％，召回率64％，图14、15)。对分类为当前临床实践中使用的米兰标准之内的患者子集(准确率69％，误报率36％，精确率92％，召回率71％，图16)或之外的患者子集(准确率62％，误报率11％，精确率87％，召回率45％，图17)进行分类时，分类的精确率也是有利的，由此表明根据基于指示基因表达阈值和肿瘤体积的二元评分对患者进行分类，可识别出有可能在LT后获得有利结果的患者子集，除此之外的患者将被排除接受该手术。

例如，对于患者1具有数值DPT＝10.48、CLU＝5.34和TTV＝18.0和患者2具有数值DPT＝4.39、CLU＝0.84和TTV＝5.0，使用相应的阈值对这些数值进行二值化，从而为每个变量生成二进制值。将这些变量提供给线性核SVM算法，以产生二进制值，用于指示对复发的预测结果。该模型能够产生估计概率；在本实施例中，结果本身被二值化，以将高于和低于50％概率的值分开，从而简化输出。对结果的解释很简单，因为二进制值形式的输出只表明预测是会发生复发(R，0)还是可预见不会复发(NR，1)(表7)。

表7：使用SVM算法对HHC患者进行LT结果分类的实施例。

最后，还考虑了异质性问题。从7名患者身上获得了来自同一肿瘤不同部位的样本。对表达水平变化的测量与CLU和DPT的管家基因有关，也与不同的值是否会导致由先前计算的临界值设置的组的迁移(“组迁移”)有关。在这些样本中，DPT的表达水平几乎没有变化，并且没有患者必须根据这些值迁移到另一组。另一方面，CLU表达似乎与肿瘤异质性有关。这些结果表明DPT的肿瘤内基因表达更有可能具有同质性。

CAPNS1

在一项涉及192名因HCC接受LT的患者的研究中，CAPNS1过表达与肿瘤数量和大小、肿瘤包裹、静脉侵犯和pTNM分期显著相关。多变量分析显示，CAPN4表达是影响HCC患者生存率的一个强有力的独立预后因子(HR4.068，C.I.2.524-6.555；p<0.001)。本发明人证明了CAPNS1表达与复发率之间的相关性(p<0.001)。然而，没有证明与OS或DFS相关，也没有证明ACt的临界值可用于区分会或不会复发的患者。CAPNS1是一种有希望与其他鉴别性标志物组合的标志物。

实施例6：材料和方法

分子预后生物标志物

一旦确定了与预后相关的临床因子，本发明人就旨在确定对HCC的预后具有更高鉴别能力的分子生物标志物。因此，Curry Cabral医院的CHBPT与Ophiomics-PrecisionMedicine公司开展了一项合作研究，由José Pereira Leal教授担任首席研究员，还有一名联合研究员Joana Cardoso Vaz。分子生物标志物的研究包括对关于HCC患者的公共存储库和已发表的关于HCC生物标志物的文献进行数据挖掘和生物信息学分析。

数据挖掘和生物信息学分析

对接受肝切除和移植的HCC患者在公共存储库中的分子数据进行了挖掘和生物信息学分析。使用本发明人的分析流程重新分析了关于HCC患者的可用公共数据，包括miRNA和mRNA的表达谱数据。

肝细胞癌的预后分子标志物：系统评价

本发明人在文献中搜索了先前发表的关于接受LT的HCC患者的生物标志物。由于LT患者的数据稀缺，并且可在接受肝切除的患者队列中获得重要信息，因此分析中包括了对LR生物标志物的研究。本文对分子生物标志物在接受HCC切除或移植的患者的预后中的作用的现有证据进行了系统的文献评价。该评价遵循美国国家科学院医学研究所系统评价标准的一般指导方针。该评价的目的是评估分子生物标志物在因HCC接受LR或LT治疗的患者的预后中的作用。

总体：搜索仅限于英语期刊文章，且时间为2008年1月至2016年10月。仅以摘要形式发表的研究、未发表的研究和发表在非同行评论期刊上的文章不包括在内。动物和体外研究也被排除在外。与HCC预后无关的分子标志物研究也被排除在外。干预措施：遭受HCC的患者的肝切除和移植。选择切除的原因是缺乏对LT的研究。结果：搜索的主要结果是无病生存率、复发率和总体生存率。研究设计：由于随机对照试验(RCT)和对照试验在这种情况下很少见，且由于数据稀缺，使得队列研究(即使是回顾性研究)有资格被纳入。病例系列被接受，而病例报告被排除在评价之外。经济评估也被排除在外。使用以下关键词以不同的组合搜索PubMed、Clinical key和Cochrane数据库：肝细胞癌、手术、切除、移植、预后、分子和生物标志物。在确定的文章中引用的参考文献用于查找进一步的相关出版物。检索到的数据包括数据类型(mRNA、miRNA和蛋白质)、预后信息、涉及的特定基因、良好或不良的预后基因、改变类型(过表达、下调、高/低甲基化和突变)、患者样本、统计数据以及作者的观察。根据预测能力、不同中心的引用次数、复制技术的能力和可用试剂来选择生物标志物。在严格筛选出最佳候选生物标志物之后，进行了初步研究。

研究人群

纳入和排除标准与先前在临床生物标志物研究中使用的相同。纳入标准：因肝细胞癌而接受肝移植的患者。排除标准：年龄低于18岁；无肝硬化；纤维层组织学类型或肝胆管癌组织学类型；缺乏HCC的组织学证明；此外，由于本发明人的主要结果指标是复发率/无病生存率，本发明人排除了围手术期死亡率、肝外侵犯和残留疾病的病例。考虑了1992年9月至2014年2月期间因HCC而接受LT的301名患者的完整人群。在应用排除标准后获得的231名患者中，本发明人仅纳入了随访时间超过5年的患者。本研究中使用的最终样本集(试验集和验证集)包括180名患者。试验集：试验集包括米兰标准外的患者(n＝6)和未复发的患者(n＝7)，以及米兰标准内早期复发的患者(n＝6)和未复发的患者(n＝7)。在试验研究中满足选择标准的生物标志物子集通过验证集进行了第二轮分析。验证集：通过从最初的275名患者中排除出先前纳入试验集的患者、围手术期死亡的患者、肝外侵犯的患者、残留疾病的患者以及随访不到5年的患者，最初纳入验证集的患者有154名。

样本采集

在Curry Cabral医院的肝胆胰和移植中心接受肝移植的180名患者的肿瘤标本采用福尔马林固定，并保存在石蜡块中。对于所有选定的块，在经验丰富的病理学家的监督下，对苏木精和伊红(HE)染色切片进行了组织病理学表征和区域选择。Curry Cabral医院的医学伦理审查委员会和NOVA医学院的伦理审查委员会均批准了这项研究。

RNA提取和cDNA合成

将归档的FFPE组织切片(5μm)脱蜡，并用Mayer的苏木精和伊红复染。在病理学家的指导下对所有样本进行宏观解剖。根据制造商的说明的基础上稍加修改，使用RNeasyFFPE试剂盒(Qiagen)提取总RNA：在56℃下过夜进行蛋白酶K细胞裂解。包括RNase-FreeDNase Set(Qiagen)“on column”DNA消化程序。使用SuperScriptTM VILO^TMcDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对每个提取的RNA样本进行逆转录。

表6：靶基因和参考基因的引物序列。

定量实时PCR

由于已知的FFPE降解问题和少量提取的样本，无法使用标准方法评估RNA浓度和完整性。因此，本发明人已使用高灵敏度RNA ScreenTape(Agilent)在Agilent2200TapeStation系统(Agilent)上获取了分离的RNA样本的数量和质量。引物集是用NCBIPrimer-BLAST工具(Ye et al,BMC Bioinformatics 2012；13:134)设计的，工作温度为60℃，扩增子长度为70-100bp(表6)，购自Invitrogen(Thermo Fisher Scientific)。在10μL含有模板(1μL，0.5-1ng/μL)和引物(各0.5μM)的反应混合物中，使用SsoFast^TM

Supermix(Bio-Rad，Hercules CA，USA)试剂通过RT-qPCR分析每个样本的复制物。根据循环规划，在CFX96 Touch^TM实时PCR检测系统(Bio-Rad，Hercules CA，USA)中处理样本：98℃持续120s，98℃持续5s和60℃持续15s进行50个循环。在60℃进行荧光数据收集。进行数据和统计分析。采用RT-qPCR对靶基因所进行的相对差异表达分析是基于2-AACt或ACt方法进行的，以计算表达的倍数变化，其中高于1的值表示上调，低于1的值表示下调(Livak et al,Methods 2001；25(4):402-8)，且使用复制物的平均量化周期作为周期阈值(Ct)与校准基因核糖体蛋白L13a(RPL13A)的Ct进行比较。使用有疾病复发的样本集(R)与无疾病复发的样本集(nonR)之间采用RT-qPCR数据进行的靶基因的差异表达，是使用R语言进行统计计算(Team RDC，Austria，2009)以及使用Wilcoxon秩和检验(置信水平＝0.95)计算统计显著性。

此外，通过使用与先前描述的临床标志物相同的方法，还将获得的RT-qPCR数据就每个候选靶基因而言分别与患者的无病生存率关联起来。将连续变量表示为中位数即四分位距(IQR)或平均值和标准差(SD)，并使用独立样本t检验进行比较。根据情况，采用Student t检验、Pearson卡方检验或Fisher精确检验对目标移植患者的人口统计学变量进行比较。结果变量为复发(无病生存率)和死亡(总体生存率)。使用移植日期直到事件发生日期或未经历事件的患者的最后一次随访日期来计算出结果的时间。构建Kaplan-Meier生存曲线，用于移植后的结果分析。使用对数秩检验和Cox回归模型研究人口统计学变量对无病生存率和总体生存率的影响。临界值由受试者操作特征(ROC)分析确定。对于多变量分析，所有对结果P<0.20显著的变量都包含在Cox比例风险模型(Therneau et al；Springer-Verlag,2000)或取决于结果的类型的多元逻辑回归模型中。进行后向选择以保留显著变量。必要时进行单独的分层生存分析。小于0.05的p值被认为是显著的。使用SPSS22.0版和24.0版(SPSS Inc.，Chicago，IL)进行统计分析。线性核SVM算法是在Python 3.6.7环境中开发的，其使用以下软件包进行数据操作和分类：scikit-learn(0.23.2)；numpy(1.19.1)；pandas(0.23.4)。

序列表

<110> Ophiomics

<120> 肝移植的临床和分子预后标志物

<130> oph101wo

<160> 34

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gtctcaagga tacctgctac agaa 24

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

cgtgcgaggt atgctgcccc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

ggcggtggga tgccgtcaaa 20

Claims

1.一种用于预测肝移植结果以治疗肝细胞癌(HCC)的方法，其包括：

-在确定步骤中，确定指示基因组中每种指示基因的表达水平，所述指示基因组包括：

-从遭受HCC的患者获取的肝样本内的

a.丛生蛋白(CLU，基因ID GC08M027596)；以及

b.皮肤桥蛋白(DPT，基因ID GC01M168664)；

-在分类步骤中，基于所述指示基因的所述表达水平，指定患者预后良好作为肝移植的结果。

2.根据权利要求1所述的用于预测肝移植结果以治疗HCC的方法，其中所述指示基因组进一步包括以下至少一种：

a.钙蛋白酶小亚基1(CAPNS1，基因ID GC19P036434)；

b.含F-box和WD重复蛋白7(FBXW7，基因ID GC04M152321)；以及

c.Sprouty RTK信号拮抗剂2(SPRY2，基因ID GC13M080335)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述指示基因相对于阈值过表达。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于预测肝移植结果以治疗HCC的方法，其中所述指示基因的过表达，特别是DPT和/或CLU的过表达，表明预后良好。

5.根据前述权利要求1至4中任一项所述的方法，其中：

a.DPT和CLU的过表达；以及

b.肿瘤总体积≤115cm³；

表明预后良好。

6.根据前述权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述指示基因表达水平是通过聚合酶链式反应测定的；且其中相对于所述阈值的所述指示基因表达值被确定为所述指示基因的阈值循环数与内参基因的阈值循环数之差；其中所述阈值循环数是检测产物[所述指示基因和所述内参基因]时的PCR循环数。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于预测肝移植结果以治疗HCC的方法，其中如果所述指示基因的所述阈值循环数之差如下，则认为指示基因过表达：

a.DPT高于7；以及

b.CLU高于-0.54。

8.根据前述权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将患者样本中一个或多个所述指示基因的表达水平和/或肿瘤体积测量纳入算法中，以提供反映疾病复发可能性的值，特别是其中所述算法为支持向量机算法，更特别是其中所述算法为线性核支持向量机算法。

9.一种用于检测肝移植生物标志物高表达的系统，其中所述系统包括这样的装置，该装置用于确定DPT的表达以及确定选自CLU、CAPNS1、FBXW7和SPRY2的基因的表达，特别是DPT和CLU的表达。

10.用于扩增和检测DPT和CLU以及任选地选自CLU、CAPNS1、FBXW7和SPRY2的其他生物标志物的表达的引物在用于分析生物标志物的试剂盒中的应用，以预测用于治疗HCC的肝移植的结果。

11.一种通过肝移植手术治疗先前被诊断为患有HHC的患者的方法，其中根据权利要求1至9中任一项所述的方法已将患者分类为可能具有良好预后。