CN114867848A - 新的调节性巨噬细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型免疫调节性巨噬细胞，其可用于治疗不同的免疫性和非免疫性疾病和病症。所述细胞的特征在于使它们区别于其他细胞的特异性标志物和活动模式。新型免疫调节性巨噬细胞具有高吞噬能力，并且能够抑制T细胞的增殖。本发明还提供一种用于在悬浮培养中从血液单核细胞制备免疫调节性巨噬细胞的新方法。所述方法适合于高度自动化。在仍然另一方面，本发明涉及一种包含本发明免疫调节性巨噬细胞的药用组合物。

Description

新的调节性巨噬细胞及其用途

发明领域

本发明涉及新型免疫调节性巨噬细胞，其可用于治疗不同的免疫性和非免疫性疾病和病症。这些细胞的特征在于使它们区别于其他细胞的特异性标志物和活动模式。新型免疫调节性巨噬细胞具有高吞噬能力，并且能够抑制T细胞的增殖。本发明还提供一种在悬浮培养中从血液单核细胞制备免疫调节性巨噬细胞的新方法。该方法适合于高度自动化。在仍然另一方面，本发明涉及一种包含本发明免疫调节性巨噬细胞的药用组合物。

技术背景

调节性巨噬细胞(在本文和文献中称为“Mreg”)反映巨噬细胞分化的独特状态，其与其他活化状态巨噬细胞的区别在于其强大的表型以及其免疫抑制、抗炎和血管生成特性。

已发现人类Mreg作为实体器官移植中的免疫调节疗法特别有效。最重要的是，这些细胞在体外抑制促分裂原刺激的T细胞增殖，这可归因于干扰素(IFN) γ诱导的吲哚胺2,3-双加氧酶活性以及活化T细胞的接触依赖性缺失。另外，Mreg驱动活化的诱导的调节性T细胞的发育，这进而抑制效应T细胞的增殖和抑制树突状细胞的成熟。因此，当将Mreg给予接受者时，假设启动免疫调节的前馈环，从而导致长期免疫接受外来移植或预防免疫病理学。在一系列病例研究和两项早期临床试验中，已将含有Mreg的细胞制剂作为辅助免疫抑制治疗形式给予肾移植接受者[1]-[5]。这些研究证实了Mreg在抑制导致器官排斥的免疫反应方面的可行性。离体制造的Mreg移植研究表明，这些细胞为安全的并且耐受性良好[6]。Mreg也被用于治疗其他临床病症，比如与外周动脉功能缺陷相关的不愈合的糖尿病足溃疡。在这方面，WO 2019/053091 A1描述了Mreg用于治疗下肢的大血管病或微血管病的用途。进一步地，提示将Mreg用于缺血或再灌注相关的疾病[7]。

本领域已知数种使用血液单核细胞作为用于制备Mreg细胞的起始材料的方案。通过通常已知的方法(比如白细胞分离术)从外周血样品中分离单核白细胞。分离单核细胞之后，在含有巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人类血清(比如人类AB血清(HABS))的培养基中温育细胞。3-6天之后，用干扰素γ (IFN-γ)刺激细胞另外18-24小时，之后收获Mreg细胞。

Mreg一般地在组织培养瓶中制造[2]-[4]。然而，单核细胞及其衍生物紧紧地粘附于硬塑料或玻璃表面上，使得收获需要从表面刮下Mreg，这会导致可用于疗法的活细胞大量丧失。因此，这种方法对于制备大量用于临床用途的Mreg是不可行的。WO 2017/153607A1描述了一种用于制造Mreg的改进方法，该方法使用气体渗透性分化袋。当在这些袋中分化单核细胞时，获得了均质Mreg群，它们在其表型和功能性方面不同于烧瓶培养的对应物。然而，细胞在袋中半着生地生长，使得从袋中收获细胞而没有不期望的活力丧失仍然有些麻烦。

因此，本领域需要可用于从血液单核细胞制备Mreg细胞的改进方法。这些方法应符合GMP要求，并包括最少数量的可能会影响所得治疗性细胞产物的无菌性的干预措施。另外，为了允许经济地制造大量治疗性细胞产物，这些方法应适合于放大和自动化。

发明内容

本发明提供一种用于产生Mreg的新方法，其对产生Mreg高度有效，并且使无菌性和收获问题最小化。该方法允许将从单核细胞富集获得的整批细胞在单个生物反应器袋中进行悬浮分化。因此，该方法可易于放大至工业规模并避免另外的酶或苛刻的收获方法，从而保证产物的高质量。进一步地，该方法还可应用于所有不同类型的调节性巨噬细胞，包括本领域例如在WO 2017/153607 A1中描述的那些巨噬细胞。调节性巨噬细胞在悬浮中的早期没有分化，因为认为为了获得调节性表型，单核细胞至少需要短暂地粘附于培养系统的表面[6]。

出乎意料地，如下文所述，该方法产生了新型的Mreg细胞。具体地讲，发明人发现，当用于制备Mreg细胞的单核细胞在悬浮中培养，即细胞没有任何显著粘附于细胞容器的表面时，获得了独特表型的Mreg细胞，其发挥免疫调节特性，使其高度适合于基于细胞的治疗方法。这些细胞在本文中称为“Mreg-sc”以使其区别于已知的Mreg。值得注意的是，通过本发明方法获得的细胞不是在人体内天然存在的。相反，其为独特的细胞类型，在存在如下文所述的生长因子和细胞因子的情况下响应单核细胞的培养而发育。

因此，在第一方面，本发明涉及一种用于产生Mreg细胞的方法，其包括在存在M-CSF/GM-CSF、CD16配体(比如免疫球蛋白)和IFN-γ的情况下于悬浮培养中培养来自受试者的血液样品的单核细胞，而不使大部分细胞粘附于培养容器的内表面。

在第二方面，本发明涉及一种新型的Mreg细胞，即Mreg-sc细胞，其可通过本发明第一方面中提及的方法获得。Mreg-sc细胞具有在现有技术中未观察到的独特表型。Mreg-sc细胞介导赋予这种细胞类型独特并且在现有技术中没有描述的有用治疗特性的生物活性。特别是，Mreg-sc细胞发挥免疫抑制、抗炎和组织修复特性，这些特性使其区别于天然存在的巨噬细胞，并使其对治疗目的具有高度吸引力。

在第三方面，本发明涉及一种包含本发明第二方面的Mreg-sc细胞或所述细胞的亚细胞级分的药用组合物。含有本发明新细胞类型的药用组合物还可根据需要进一步含有活性成分或赋形剂。

在第四方面，本发明涉及本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分或本发明第三方面的药用组合物用于治疗目的，特别是用于抑制不良免疫反应的用途。

在第五方面，本发明涉及一种用于通过在合适的条件下分解Mreg-sc细胞来制备本发明第二方面的Mreg-sc细胞的亚细胞级分的方法。

最后，在第六方面，本发明涉及一种用于通过将来自受试者血液样品的T细胞与本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分共培养来制备免疫调节性T细胞的方法。

发明详述

根据本发明，Mreg细胞衍生于人类CD14+血液单核细胞。为了诱导Mreg-sc细胞的特征性生物学特性，单核细胞在悬浮培养中生长，并用生长因子、细胞因子和受体配体的特定组合进行处理。从本发明方法获得的细胞的特征在于独特表型，使其区别于现有技术中描述的血液单核细胞、其他类型的单核细胞衍生的巨噬细胞、单核细胞衍生的树突状细胞和其他抑制性骨髓单核细胞产物。

因此，在第一方面，本发明涉及一种用于制备免疫调节性巨噬细胞的方法，所述方法包括：

(a) 从受试者的血液样品中分离CD14阳性单核细胞；

(b) 在含有(i) M-CSF和/或GM-CSF，和(ii) CD16配体的培养基中培养单核细胞；

(c) 使单核细胞或单核细胞衍生的细胞与IFN-γ接触；和

(d) 从培养基中获得免疫调节性巨噬细胞，

其中步骤(b)和(c)在容器中进行，所述容器经搅动以最小化或基本上避免细胞粘附于容器的表面。最小化或基本上避免细胞粘附于容器表面的容器搅动保持细胞培养的至少4天、至少5天、至少6天或至少7天。更优选地，在整个培养期，即在将单核细胞引入到培养容器中至收获Mreg-sc之间的整个时间段内保持容器的搅动。

本发明的方法使用血液单核细胞作为起始材料。尽管优选的是本发明的方法用于从人类血液单核细胞产生Mreg细胞，但本发明不限于人类来源细胞的分化。事实上，本发明也适用于其他类型的非人类细胞，特别是脊椎动物细胞，例如非人灵长类动物或猪细胞。以这种方式，本发明在异种移植医学领域做出了重要贡献。

根据一个优选的实施方案，本发明的方法用于将人类供体的CD14阳性单核细胞分化成Mreg。用作本发明方法的起始材料的单核细胞为从人类供体的外周血中获得。供体可为健康受试者或者患有一种或多种疾病的患者。在一个优选的实施方案中，单核细胞供体也为Mreg细胞的接受者(自体方法)。在另一个优选的实施方案中，单核细胞供体为不同于Mreg细胞接受者的人(同种异体方法)。在后者情况下，供体和接受者可在遗传上相关或无关。在另一个实施方案中，单核细胞供体同时将器官捐献给Mreg细胞的接受者。供体和接受者之间的优选关系取决于临床应用。为了避免某些不良反应，使用自体Mreg细胞可为优选的。因此，在再生或抗炎疗法的情况下，使用自体Mreg细胞为优选的。在移植环境中，使用供体衍生的Mreg细胞作为免疫抑制疗法为优选的，因为表达供体抗原的细胞比接受者来源的细胞更有效。

本领域已知用于从外周血中富集单核细胞的不同方法，并且这些方法中的每一种均可用于本发明的上下文中。例如，通过静脉穿刺获得的血液可用抗凝剂处理，并且随后通过使用分离介质(比如Ficoll-Paque Plus)进行分离。为此，将抗凝剂处理的血液样品基于Ficoll-Paque Plus溶液分层并离心，这将导致形成含有不同细胞类型的层。底层含有已被Ficoll-Paque Plus试剂聚集和沉积的红细胞。红细胞层紧接上方的层主要含有已迁移通过Ficoll-Paque Plus层的粒细胞。由于其密度较低，发现单核细胞和淋巴细胞处于血浆和Ficoll-Paque Plus之间的界面。单核细胞级分的富集可通过分离层及随后的清洗和离心来实现。

另一种用于从血液样品中分离单核白细胞的常用方法包括白细胞分离术。白细胞分离术为一种特定类型的血浆分离置换法，其中白细胞在连续过程中根据其相对密度从外周血中获得。在这个程序中，受试者的血液通过收集预先定义的白细胞级分的特殊离心装置，并使剩余的血细胞和血浆返回至供体。现今，白细胞分离术为一种用于从外周血中获取白细胞或干细胞的常规临床措施。在本发明的上下文中，可从数个制造商处获得可用于进行白细胞分离术的不同装置，例如来自Terumo BCT的COBE® Spectra Apheresis System。在使用COBE® Spectra Apheresis System进行白细胞分离术的情况下，优选的是使用制造商提供的手动方案，因为与AutoPBSC方案相比较，发现该方案可产生质量更好的单核细胞。

以上用于白细胞富集的方法和装置将提供除单核细胞之外还含有淋巴细胞的细胞级分。根据本发明，单核细胞可通过已知方法进一步富集并与淋巴细胞分离，例如通过磁珠分离、经流式细胞术分选、淘析、过滤或塑料粘附，然后将细胞引入到本发明制备方法。然而，在本发明的方法中使用均质单核细胞级分不是强制性的。事实上，单核细胞级分中存在0.1-20%，更优选地0.1-1%的量的淋巴细胞可积极地影响单核细胞向调节性巨噬细胞的分化。

在本发明的一个优选实施方案中，用于本发明方法的单核细胞级分基本上为纯的并且含有少于15%、少于10%、少于5%、少于4%、少于3%、少于2%或少于1%的非单核细胞有核血细胞，比如淋巴细胞或粒细胞。为了获得富含单核细胞的单核细胞制剂，可将外周血单核细胞例如与CD14阳性单核细胞结合的CD14微珠接触。在一个实施方案中，步骤(a)中的单核细胞通过白细胞分离术进行分离，并且随后进行使用CD14亲和分子，优选地CD14抗体的分离步骤。这种纯化步骤大大地减少非单核细胞对起始材料的污染。从患者安全的角度来看，减少T细胞污染非常有价值，因为其将供体与接受者反应的潜在风险降至最低。

在本发明的一个优选实施方案中，用于本发明方法的CD14阳性单核细胞已用细胞制造装置比如CliniMACS® Technology (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach,Germany)分离。例如，可根据制造商的说明(LP-14系统用户手册)使用符合GMP要求的全封闭LP14过程进行CD14单核细胞富集。该方法基于用与抗CD14抗体缀合的铁葡聚糖颗粒标记单核细胞，并经磁分离柱进行进一步选择。在本发明一个特别优选的实施方案中，来自外周血样品的CD14单核细胞通过使用CliniMACS Prodigy®装置分离或富集。

如上所述分离的CD14阳性单核细胞级分可通过与M-CSF和/或GM-CSF和CD16配体一起温育直接用于分化，或者可将其储存于补充有抗凝剂枸橼酸葡萄糖溶液(ACD-A)的自体血浆或任何其他合适的缓冲液中直至进一步使用。如果必须将单核细胞级分运送至其中进行分化过程的不同部位，应注意在细胞分离之后24小时内，优选地在单核细胞分离之后18小时内、12小时内、6小时内、4小时内或2小时内，开始通过与M-CSF/GM-CSF一起温育来进行细胞分化。对于长期储存，可使单核细胞级分重新悬浮于合适的冷冻保存溶液中并在低于20℃、优选地低于80℃的温度下长时间储存。

为启动富集的单核细胞向Mreg的转化，细胞在存在M-CSF/GM-CSF和CD16配体的情况下温育。优选地，可将细胞引入含有M-CSF和/或GM-CSF和CD16配体的培养基中。或者，也可在细胞培养开始之后一段时间添加M-CSF/GM-CSF和CD16配体。用于以上方法的步骤(b)的培养基可为文献中描述为适合用于培养单核细胞和/或巨噬细胞的任何培养基。合适的培养基包括例如PromoCell巨噬细胞生成培养基(PromoCell Macrophage GenerationMedium) (PromoCell GmbH, Heidelberg, Germany)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM)、DMEM:F12掺混物、Medium 199或RPMI-1640培养基。培养基优选地为化学成分确定的培养基。除M-CSF/GM-CSF之外，培养基还可含有其他促进Mreg存活和分化的因子，包括：生长因子和细胞因子，比如表皮生长因子(EGF)或IL-4；脂肪酸、胆固醇和其他脂质；维生素类、转铁蛋白和微量元素；胰岛素、糖皮质激素类、胆钙化醇或麦角钙化醇以及其他激素；非特异性免疫球蛋白和其他血浆蛋白。在本发明的一个优选实施方案中，培养基为RPMI-1640或由其衍生的培养基。

用于温育分离的CD14阳性单核细胞的培养基含有M-CSF (也称为CSF1)、GM-CSF(也称为CSF2)或两者兼有。M-CSF在本领域称为影响单核细胞、巨噬细胞和骨髓祖细胞的增殖、分化和存活的造血生长因子。GM-CSF为一种单体糖蛋白，起细胞因子的作用，由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、NK细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌。已经描述了来自不同物种的M-CSF和GM-CSF蛋白，并且可从不同制造商处购买。用于本发明方法的M-CSF和/或GM-CSF的选择将取决于待分化成Mreg细胞的单核细胞的来源。例如，如果使用本文所述的方法将人类单核细胞分化为Mreg，则所用培养基将含有人类M-CSF和/或人类GM-CSF，优选重组人类M-CSF和/或重组人类GM-CSF。类似地，如果在分化方法中使用猪单核细胞，则添加至培养基中的M-CSF和/或GM-CSF将具有猪来源。在本发明一个特别优选的实施方案中，M-CSF和/或GM-CSF具有人类来源，比如重组人类M-CSF和/或GM-CSF，并且单核细胞为人类单核细胞。

技术人员将能够通过常规方法发现适合于将高比例的单核细胞分化成Mreg-sc的M-CSF和/或GM-CSF的量。通常，以上方法步骤(b)中培养基中的M-CSF的浓度在1-100 ng蛋白/ml培养基的范围内。如例如在WO 2017/153607 A1中教导的，测量培养基中M-CSF量的时间过程实验表明，M-CSF随着时间的推移被消耗或降解，使得初始剂量为5 ng/ml M-CSF的培养物到培养的第2天含有亚生理浓度；相反，初始剂量为25 ng/ml M-CSF的培养物在整个7天培养期保持>10 ng/ml的浓度。因此，在本发明一个优选的实施方案中，培养基中M-CSF的浓度在20-75 ng/ml、20-50 ng/ml或20-25 ng/ml的范围内。特别优选浓度为至少25 ngM-CSF/ml培养基。优选地，以上浓度是指重组人类M-CSF。

在使用GM-CSF替代M-CSF的情况下，可在培养基中使用与以上M-CSF的上下文中概述的相同浓度。由于GM-CSF与M-CSF相比较似乎更加有效，因此本文建议GM-CSF浓度为0.1-100 ng蛋白/ml培养基。在其中培养基中使用M-CSF和GM-CSF两者的情况下，这两种生长因子的总浓度将在上述范围内，即在20-75 ng/ml、20-50 ng/ml或20-25 ng/ml的范围内。特别优选M-CSF和GM-CSF的总浓度为25 ng/ml培养基。

除M-CSF和/或GM-CSF之外，用于以上方法步骤(b)中的培养基还包含CD16配体。已经发现，需要刺激单核细胞上的CD16细胞表面受体来诱导其分化成Mreg-sc细胞。更具体地讲，实验表明在补充有人类AB血清(HABS)的培养基中生长的单核细胞会发育成Mreg，而在补充有胎牛血清(FCS)的培养基中生长的单核细胞不会发育成Mreg。在两种血清的等量混合物中生长的单核细胞形成Mreg表型。因此，HABS含有积极的Mreg诱导活性。去除HABS的氯仿可提取级分表明HABS的Mreg诱导活性主要存在于耐氯仿级分内，因此很可能为蛋白。通过大小分级，发现负责Mreg发育的HABS的主要蛋白成分为>100 kDa，从而导致未知因子为免疫球蛋白(Ig)的假设。使用蛋白A/G琼脂糖耗尽Ig的HABS无法支持发展Mreg形态和DHRS9mRNA表达。将淘析的Ig重新添加回到Ig耗尽的血清中(或添加IVIg)恢复了其诱导DHRS9表达的能力。类似地，当在补充有人类Ig的FCS中培养单核细胞时，与单独的FCS对照相比较，观察到DHRS9 mRNA表达增加，并获得了正常的Mreg形态。用抗Fc_γRIII抗体处理的单核细胞表达DHRS9 mRNA的水平显著低于用抗Fc_γRI (CD64)、抗Fc_γRIIa/b (CD32a/b)或对照抗体处理的单核细胞，并且没有发展Mreg形态。阻断单独的Fc_γRIIb或DC-SIGN，或者同时阻断两者受体，对DHRS9⁺ Mreg的产生没有影响。为了加强Fc_γRIII是Mreg产生所必需的这一观察结果，使用siRNA使Fc_γRIII表达沉默。在10% HABS中培养的新鲜分离的单核细胞中实现了FCGR3A和FCGR3B转录物表达的瞬时抑制；重要的是，这种操作并未降低FCGR2B的表达。流式细胞术证实了Fc_γRIII在蛋白水平的敲低(使用阴性对照siRNA时为35.2% ± 4.4 CD16⁺细胞，相对于用FCGR3 siRNA时为15.3% ± 3.7；n=4，p=0.002)。沉默Fc_γRIII表达(但不抑制MAPK1表达或用阴性对照siRNA处理)导致DHRS9 mRNA表达的显著下调。

得出的结论是，血清Ig通过Fc_γRIII (CD16)作用以诱导Mreg表型。Mreg分化对Fc_γRIII的依赖性使Mreg区别于现有技术中描述的其他Ig复合物诱导的巨噬细胞类型。特别是，衍生方式使Fc_γRIII诱导的Mreg区别于Fc_γRIIb诱导的巨噬细胞、Fc_γRI诱导的巨噬细胞以及在现有技术中描述的于不存在免疫球蛋白的情况下产生的巨噬细胞。

由于CD16细胞表面受体的刺激对于分化成期望的Mreg表型至关重要，本发明的方法包括在步骤(b)中将单核细胞与CD16配体一起温育。与受体结合的配体优选地为人类或非人类免疫球蛋白，并且更优选地为人类免疫球蛋白或其片段。免疫球蛋白片段可为例如免疫球蛋白的Fc片段。优选地将免疫球蛋白或免疫球蛋白片段添加至无血清培养基中。或者，可使用包含免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的序列，比如人类免疫球蛋白的序列的重组蛋白。在另一个实施方案中，通过其抗原识别结构域与CD16特异性地结合的非人类或人类抗体或其片段用于促进Mreg-sc分化。在仍然另一个实施方案中，小分子用于刺激CD16信号传导通路以促进Mreg-sc分化。

在一个优选的实施方案中，用于产生Mreg细胞的培养基含有1-20%的人类血清或等量的某些血清成分，比如免疫球蛋白。更优选地，培养基补充有10%血清。如果含有血清的培养基用于实施本发明的方法，则培养基包含5-15%，优选地10%的人类血清。含有10%人类AB血清的培养基特别优选。换句话说，优选的是以约0.01-10%，优选地约0.1-1%，和更优选地约1%的浓度添加血清。当使用免疫球蛋白或免疫球蛋白片段作为CD16配体时，可使用稍低的浓度。如果免疫球蛋白或其他CD16配体固定于组织培养表面、珠粒或其他物理基质上，则可使用显著较低的浓度。优选的是人类血清比如AB血清源于男性供体。当使用来自女性供体的血清时，优选地供体不使用孕酮或孕酮-雌激素避孕药。进一步优选的是，所述培养基不应含有针对单核细胞或Mreg细胞或任何中间体形式的抗体，包括针对主要组织相容性分子的抗体。

发现培养基中的抗生素对通过本发明方法产生的Mreg-sc的活力、产量、表型或抑制功能没有可测量的影响。然而，优选的是用于本发明方法步骤(b)中的培养基不含任何抗生素。

在Mreg-sc细胞旨在用于其中期望诱导血管生成的治疗应用(见下文)中的情况下，用于在本发明方法的步骤(b)中培养单核细胞的培养基除M-CSF/GM-CSF和CD16配体之外还可包含toll样受体(TLR)配体，比如脂多糖(LPS)、单磷酰脂质A (MPLA)或高迁移率族盒蛋白(High Mobility Group Box protein) 1 (HMGB1)，以增强血管生成因子如VEGF-A的产生。TLR配体可以10 ng/ml-1 μg/ml，优选地50-500 ng/ml之间的浓度范围，比如以100ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml或400 ng/ml添加至培养基中。在其中添加多于一种TLR配体的情况下，这些配体的总组合浓度应在上述范围内。TLR配体可在生产方法的任何阶段添加。其可存在于用于培养单核细胞的初始培养基中，即在培养的第0天，或者其可在稍后阶段添加，例如在培养的第5、6 或7天。优选地，与添加IFN-γ同时添加TLR配体。

根据本发明，在存在M-CSF/GM-CSF和CD16配体的情况下培养细胞的步骤以及在存在IFN-γ的情况下培养细胞的步骤在容器中进行，所述容器经搅动以避免细胞粘附于容器表面。因此，细胞在悬浮培养中非粘附培养。这通过在生物反应器中进行本发明方法的步骤(b)和(c)来实现，生物反应器轻轻地不断搅动包含细胞的容器(例如袋)，使得细胞不会粘附于容器的内表面上。已经发现波浪式生物反应器特别适用于这一目的。如本文使用的波浪式生物反应器优选地用于悬浮培养。波浪式生物反应器通过培养基的波浪式运动提供细胞和培养基的混合。用于本发明方法的波浪式生物反应器的一个实例为Xuri^TM细胞扩增系统(GE Healthcare)。这种波浪式生物反应器最初是为T细胞的扩增而开发和验证的，并且其机械原理为细胞培养物始终处于运动状态。

一旦单核细胞已经悬浮于合适的培养基中，就可将悬浮液转移到合适的容器中，容器适合于接收细胞培养物并且可用于在规定的条件下培养细胞。容器可具有与细胞培养相容的材料，例如玻璃或塑料。在一个优选的实施方案中，容器由塑料例如乙烯乙烯醇(EVOH)、乙烯醋酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚烯烃等制成。在另一个优选的实施方案中，容器由聚乙烯比如低密度聚乙烯(LDPE)或线性低密度聚乙烯(LLDPE)制成。在仍然另一个实施方案中，容器为由任何以上材料制成的塑料袋。

用于将单核细胞分化成Mreg-sc细胞的容器(例如袋)的体积为至少0.5 L，并且优选地至少1.0 L、至少1.5 L、至少2.0 L、至少2.5 L、至少3.0 L、至少3.5 L、至少4.0 L、至少4.5 L或者至少5.0 L或更多。细胞悬浮液体积与容器(例如袋)体积的比率为至少约1:6、至少1:5、至少1:4、至少1:3或至少1:2。1:2的比率意指1 L细胞悬浮液用于2 L容器中。例如，如果使用2 L的袋，则细胞悬浮液的体积将在0.3 L-1 L之间，特别优选为0.5-0.6 L。如果使用10 L的袋，则细胞悬浮液的体积将在1.5-5 L之间，特别优选为2.5-3.0 L。如果使用20 L的袋，则细胞悬浮液的体积将在3.0 L-10 L之间，特别优选为5.0-6.0 L。在一个特别优选的实施方案中，Xuri^TM细胞扩增系统与体积为2 L、10 L或20 L的袋一起使用。

在将单核细胞转移至容器(例如培养袋)之后，在IFN-γ刺激之前细胞在存在M-CSF/GM-CSF和 CD16配体(例如人类血清或人类免疫球蛋白)的情况下于容器中温育至少3天。如本文使用的“1天”培养期是指培养24小时。因此，“至少3天”的培养期是指培养72小时以上。IFN-γ刺激的最佳时间段为至少12小时，优选地为18小时，和更优选地为24小时。根据本发明，总培养期，即从将单核细胞引入到培养容器中到收获Mreg-sc的时间段，为至少4天，但优选地为至少5天、至少6天、至少7天或至少8天。优选地，从将单核细胞引入到培养容器中到收获Mreg-sc的时间段为不超过9天。换句话说，总培养期在4-8天之间，优选地在6-8天之间，更优选地为7天。容器中的单核细胞在允许其生长和分化成Mreg-sc细胞的条件下温育。用于培养单核细胞或巨噬细胞的一般条件为在细胞培养领域工作的人已知的。

例如，可将含有悬浮液的袋转移至使得能够选择规定的温度、湿度和CO₂条件的温育室。合适的条件为温度在30-40℃的范围内，优选地在32-38℃之间，和更优选地在37-38℃之间，例如37℃。用于培养的湿度通常在30-70%，优选地40-60%，和更优选地50-60%的范围内，例如60%湿度。温育室可包含高达10% CO₂。高达5% CO₂、高达4% CO₂、高达3% CO₂、高达2% CO₂或高达1% CO₂的含量为特别优选。

进行本发明方法的所有培养步骤使得容器中的大部分细胞保持悬浮并且不粘附于容器的表面，例如容器的底部。优选地，进行培养使得容器中不超过10%的细胞，和更优选地容器中不超过5%或不超过1%的细胞粘附于容器的内表面，例如容器的底部。这通过以一定程度不断搅动容器以使细胞的粘附最小化来实现。需要的搅动速度将取决于细胞容器的大小及用于培养和分化的生物反应器装置。基于常规实验，技术人员将易于能够确定防止粘附和保持细胞处于悬浮的最小搅动速度。例如，如果Xuri^TM细胞扩增系统用于培养和分化，则可使用2-10 rpm，和更优选地2-6 rpm、并且甚至更优选地2-4 rpm之间的搅动速度。托盘的角度优选地调整为2-12°，更优选地为2-8°，并且甚至更优选地为2-4°。

在本发明方法的步骤(c)中，细胞与细胞因子干扰素γ (IFN-γ)接触。本领域已知细胞因子改变超过30个基因的转录，从而产生多种生理和细胞反应。IFN-γ蛋白已从不同物种分离出来，并且可从不同制造商处购买。用于本发明方法的IFN-γ的选择将取决于经受本发明方法的单核细胞的来源。例如，如果使用本文描述的方法将人类单核细胞分化为Mreg-sc，则添加的IFN-γ将为人类IFN-γ，优选地为重组人类IFN-γ。类似地，如果在分化方法中使用猪单核细胞，则添加至培养基中的IFN-γ将具有猪来源。在本发明一个特别优选的实施方案中，IFN-γ为人类IFN-γ，更优选地为重组人类IFN-γ。

可添加任何量的IFN-γ，所述量有效诱导培养物中的单核细胞表达吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)。优选地，要添加至单核细胞培养物中的IFN-γ的量将在5-100 ng/ml的范围内，更优选地在10-80 ng/ml之间，仍然更优选地在20-50 ng/ml之间。25 ng IFN-γ/ml培养基的量在本文中为特别优选。

可将 IFN-γ与M-CSF/GM-CSF和CD16配体同时添加至培养基中，这意味着可例如在将单核细胞引入到其中进行分化的容器中时添加细胞因子。在这种实施方案中，待通过本发明方法分化的单核细胞将在存在M-CSF/GM-CSF、CD16配体和IFN-γ的情况下培养整个培养期。然而，优选的是在存在IFN-γ的情况下的培养期比在存在M-CSF/GM-CSF的情况下的培养期短得多，这意味着仅在存在M-CSF/GM-CSF的情况下培养细胞至少3天之后才添加IFN-γ。在一个优选的实施方案中，已经在存在M-CSF/GM-CSF的情况下培养细胞3-6天之后添加IFN-γ。优选地，在添加IFN-γ之前，在存在M-CSF/GM-CSF的情况下将细胞培养至少3天、至少4天、至少5天或至少6天。在一个特别优选的实施方案中，已经在存在M-CSF/GM-CSF的情况下培养细胞3-6天之后添加IFN-γ，并然后再继续培养18-72小时。

在本发明一个特别优选的实施方案中，在第7天，例如在含有M-CSF/GM-CSF和CD16配体的培养基中培养单核细胞6天然后进行18-24小时IFN-γ刺激之后收获分化的细胞。在数个容器已进行平行培养的情况下，容器的内容物可在培养过程结束时合并。分化的巨噬细胞可用与巨噬细胞使用相容的缓冲液清洗。例如，优选地补充有5%人类血清白蛋白的林格溶液或磷酸盐缓冲盐水(PBS)可用于通过经离心和倾析上清液连续更换缓冲液来清洗细胞。由于细胞不粘附于容器表面，本发明方法的收获步骤不包括添加胰蛋白酶。

优选地，本发明方法的收获步骤(d)不包括将细胞从容器表面机械分离，例如从容器的内表面刮下细胞。在一个优选的实施方案中，细胞的收获为通过使用逆流离心装置比如Gibco CTS Rotea逆流离心系统进行。这种装置使用逆流技术从培养基中分离细胞并形成致密的沉淀(参见例如US 1 009 922 8B2)。细胞在液体床内漂浮，并因此比常规离心期间更能保护细胞免受剪切应力的影响。通过调整离心力和逆流速度，可使碎片和死细胞与活Mreg-sc细胞分离，从而纯化最终产物。

在一个特别优选的实施方案中，逆流离心装置也可用于将单核细胞从富集装置转移到生物反应器中。例如，如果CliniMACS Prodigy®装置用于单核细胞富集，则可将单核细胞转移到波浪式反应器中，例如至Xuri™细胞扩增系统。为此，用于培养Xuri™细胞扩增系统的单核细胞的袋无菌焊接至逆流离心装置的管道系统。以这种方式，Mreg分化可作为一个全封闭过程来进行。

收获细胞之后，可通过测量IP-10 (干扰素γ诱导蛋白10)来确定分化过程的质量。响应IFN-γ刺激，Mreg细胞在周围培养基中产生和分泌IP-10蛋白。因此，培养基中IP-10的浓度与分化的Mreg-sc细胞的数量相关。为此，培养基中IP-10的浓度可用作制备过程的质量控制标志物。以这种方式，不需要将由该过程产生的细胞用于质量控制目的。在一个优选的实施方案中，大于5,000 pg IP-10/ml培养基的浓度表明单核细胞充分分化成Mreg-sc细胞。优选地，大于10,000 pg、大于15,000 pg、大于20,000 pg、大于25,000 pg或大于30,000 pg/ ml培养基的浓度表明充分分化。

这些Mreg-sc细胞可转移并储存于输液袋、玻璃输注装置或另一个封闭系统容器中，这允许够将细胞运送至治疗中心或患者床边。为此，将分化的细胞悬浮于合适的保存培养基中。保存培养基可为例如林格溶液，其优选地补充有5%人类血清白蛋白。在一个特别优选的实施方案中，保存培养基为无血清和/或无蛋白的即用型培养基。市售的合适的即用型培养基为HypoThermosol® FRS (Stemcell Technologies SARL, Köln, Germany)。优选地，培养基的pH在6.5-8.0之间，更优选地在7.0-7.5之间，比如为7.4。细胞溶液应储存于4℃下以使能量消耗和细胞粘附最小化。或者，可使Mreg-sc细胞重新悬浮于冷冻保存溶液比如10%二甲基亚砜加人类AB血清(DMSO-HABS)中，并以冷冻形式储存直至最终使用。

本发明分化的巨噬细胞的表型和功能稳定性取决于赋形剂和储存温度的选择。当重新悬浮于补充有人类血清白蛋白的林格溶液中时，本发明的巨噬细胞在细胞收获之后于20℃-25℃下稳定长达24小时。当重新悬浮于补充有5%人类血清白蛋白的Plasmalyte/PBS中时，巨噬细胞可在细胞收获之后于2-8℃，优选地于4℃下储存至少48小时。当需要更长的储存期时，细胞可经受冷冻或冷冻保存。通常，发现本发明的细胞在其免疫抑制表型方面是稳定的。

本发明用于制备Mreg-sc细胞的方法可按照常用方法自动化，例如通过使用符合GMP要求的平台，平台提供简化细胞处理工作流程的集成解决方案。该过程优选地发生于“封闭系统”中，该系统利用封闭的一次性用品，管道组、缓冲液和试剂的任选定制，带有无菌过滤器的多条输入线，用于任选的过程中控制的输出线以及显著降低的洁净室要求。例如，平台可包括使得可使单核细胞与白细胞级分分离的细胞分离系统。细胞分离系统应当能够从100-1000 ml血浆分离置换物(apheresate)或全外周血的起始体积中分离单核细胞。然后可分离在分离的单核白细胞级分中含有的单核细胞，例如经与CD14+细胞结合的磁珠。然后在适当的培养基中培养这些细胞。平台使得能够经多个输入端口向细胞培养物提供培养基、生长因子和/或细胞因子。在培养过程结束时，细胞会被自动清洗、收获并转移到适当的无菌递送袋中。可使用定制的管密封器，其允许对PVC和EVA管进行无菌密封。细胞产物可带有条形码，并且可在线监测整个制造过程用于质量控制目的。

在第二方面，本发明涉及一种新型Mreg细胞，称为Mreg-sc细胞(“源自悬浮培养的Mreg”的缩写)，其可通过本发明第一方面的方法获得。如本文使用的调节性巨噬细胞或“Mreg”为能够防止促分裂原刺激的同种异体或自体T细胞增殖的巨噬细胞。本发明提供的细胞为单核细胞衍生的人类巨噬细胞，并且因此表达常见的白细胞标志物和巨噬细胞谱系标志物，特别是CD45和CD33。Mreg-sc细胞也表达标志物CD85h、CD258和CD206。

发现Mreg-sc细胞始终表达特征性标志物CD16、CD163和多配体聚糖-3。出乎意料的是，据报道所有其他Mreg均缺乏CD16的表达和CD163的表达。因此，这些标志物高度适合于区分Mreg-sc细胞超过先前已知的Mreg。另外，Mreg-sc细胞还表达标志物CD51、CD72和CD11c。所有人类Mreg，无论是在袋中、在烧瓶中还是在悬浮中培养，均表达相对高水平的视黄醇脱氢酶SDR家族的视黄醇脱氢酶DHRS9。

类似地，所有人类Mreg细胞均表达吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)，其在现有技术中描述的其他单核细胞衍生的巨噬细胞类型中通常观察不到。在先前的研究中，IDO1已鉴定为免疫调节的关键分子之一，并且特别是在抑制效应T细胞介导的不良炎症反应方面[8]-[10]。提出的机制包括通过色氨酸剥夺直接消除效应T细胞[11]-[12]和经Stat3介导的调节性T细胞诱导间接免疫调节。因此，其已被鉴定为衡量单核细胞衍生的细胞疗法产物的效力和治疗潜力的主要候选者之一。IFN-γ为IDO1基因转录的有效诱导剂。IFN-γ在Mreg-bc和Mreg-sc的制造期间以及在促炎性M1巨噬细胞的产生期间添加，但对抗炎M2a不添加。因此，在蛋白水平上在M2a中未检测到IDO1表达，并且当与CD14+单核细胞相比较时，其在转录的mRNA水平上似乎下调。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种新型免疫调节性巨噬细胞，其特征在于标志物CD16、CD163和多配体聚糖-3的表达。在一个实施方案中，提供一种表达标志物CD16、CD51、CD163和多配体聚糖-3的巨噬细胞。在另一个实施方案中，提供一种表达标志物CD16、CD11c、CD163和多配体聚糖-3的巨噬细胞。在仍然另一个实施方案中，提供一种表达标志物CD16、CD11c、CD51、CD163和多配体聚糖-3的巨噬细胞。在仍然另一个实施方案中，提供一种表达标志物CD16、CD11c、CD51、CD72、CD163和多配体聚糖-3的巨噬细胞。优选地，巨噬细胞还表达标志物IDO1。

在本文中，如果如通过流式细胞术测量的细胞的荧光强度小于相应同种型对照染色样品的第99个百分位数的荧光强度，则该细胞对于特定表面标志物为阴性的。

此外，Mreg-sc细胞要么对CD38呈阴性，要么其表达低水平的CD38。在Mreg-sc细胞的产生期间，初始单核细胞群会下调细胞表面的CD38表达。Mreg-bc发育期间CD38的下调可表示为第7天Mreg-sc上CD38的表达与培养第0天(d0)的单核细胞相比较的百分数。CD38的表达与同种型对照染色细胞和特定CD38信号之间的平均荧光强度差异成比例。因此，%下调=100-100×(CD38d7-Isod7)/(CD38d0-Isod0),，其中CD38d7为第7天的特定信号；Isod7为第7天的同种型对照信号；CD38d0为第0天的特定信号；Isod0为第0天的同种型对照信号。通过使用标准流式细胞术方法可便利地确定Mreg-sc细胞对CD38的下调。根据一个优选的实施方案，Mreg-sc细胞的CD38表达相对于培养第0天单核细胞的CD38初始表达下调超过50%，更优选地超过60%，超过70%、超过80%、超过90%、超过95%或超过99%。

因此，通过本发明方法提供的Mreg-sc细胞为可通过以下标志物模式之一来描述的巨噬细胞：

(1) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺，

(2) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺，

(3) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺，

(4) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺，

(5) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺，

(6) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺，

(7) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺，

(8) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺，

(9) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺，

(10) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺，

(11) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺，

(12) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺，

(13) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺，

(14) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72、IDO1⁺，

(15) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺，

(16) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺，

(17) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD86^低，

(18) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD86^低，

(19) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD86^低，

(20) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD86^低，

(21) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD86^低，

(22) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD86^低，

(23) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD86^低，

(24) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD86^低，

(25) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD86^低，

(26) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD86^低，

(27) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD86^低，

(28) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD86^低，

(29) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺、CD86^低，

(30) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72、IDO1⁺、CD86^低，

(31) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺、CD86^低，

(32) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺、CD86^低，

(33) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD83^低，

(34) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD83^低，

(35) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD83^低，

(36) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD83^低，

(37) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD83^低，

(38) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD83^低，

(39) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD83^低，

(40) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD83^低，

(41) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD83^低，

(42) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD83^低，

(43) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD83^低，

(44) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD83^低，

(45) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺、CD83^低，

(46) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72、IDO1⁺、CD83^低，

(47) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺、CD83^低，

(48) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺、CD83^低，

(49) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD370^低，

(50) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD370^低，

(51) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD370^低，

(52) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD370^低，

(53) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD370^低，

(54) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD370^低，

(55) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD370^低，

(56) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、CD370^低，

(57) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD370^低，

(58) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD370^低，

(59) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD370^低，

(60) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、IDO1⁺、CD370^低，

(61) CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺、CD370^低，

(62) CD16⁺、CD51⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72、IDO1⁺、CD370^低，

(63) CD16⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺、CD370^低，

(64) CD16⁺、CD51⁺、CD11c⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺、CD72⁺、IDO1⁺、CD370^低，

标志物的表达可在mRNA或蛋白水平上确定。对于蛋白水平上的标志物确定，Mreg-sc细胞的标志物谱可通过使用标准流式细胞术方法便利地确定。流式细胞术为一种广泛使用的用于分析细胞表面标志物和细胞内分子表达的方法。其通常用于应用如细胞计数、细胞分选和生物标志物概况分析。特别是其可用于定义异质细胞群中的不同细胞类型。流式细胞术通常包括测量由检测细胞表面标志物的荧光标记抗体产生的荧光强度。尽管其也可用于检测细胞内标志物，但这种检测不太理想，因为抗体必须渗透到细胞中，这通常会杀死细胞。这阻止用于细胞分选应用的细胞内标志物的检测，该应用旨在提供活的均质细胞群。因此，细胞内标志物如IDO1为在mRNA水平上确定，例如通过使得能够定量或半定量检测mRNA水平的通常已知方法，例如定量RT-PCR (例如TaqMan™ RT-PCR)、实时RT-PCR、Northern-Blot分析等。

根据本发明，已经在转录组分析中鉴定了数种基因，其可用于区分Mreg与其他巨噬细胞，比如M0、M1或M2a巨噬细胞。这些基因包括ARMH1基因(犰狳样螺旋结构域包含蛋白1(armadillo like helical domain containing 1) - NCBI参考序列：NM_001145636.2 -SEQ ID NO:1)、CA11 (碳酸酐酶11 - NCBI参考序列：NM_001217.5 - SEQ ID NO:2)、SMARCD3基因(SWI/SNF相关、基质相关、肌动蛋白依赖性染色质调控因子，亚家族d，成员3 -NCBI 参考序列：NM_001003801.2 - SEQ ID NO:3)和HLA-DOA基因(主要组织相容性复合物，II类，DOα-NCBI参考序列：NM_002119.4 - SEQ ID NO:4)。尽管ARMH1、CA11和SMARCD3基因在M0、M1和M2a细胞中以相同水平表达，但它们在Mreg中的表达为超过4倍强。与其他巨噬细胞相比较，HLA-DOA的Mreg表达为多于8倍高。因此，在另一个优选的实施方案中，提供Mreg细胞，其表达表面标志物模式(1)-(64)中的任何一种，更优选地表达CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺，并且如通过定量RT-PCR测量的，与静息巨噬细胞(M0)相比较另外显著更强地表达在SEQ ID NO:1-4中阐述的基因中的至少一种，优选地2倍或3倍强。换句话说，提供Mreg细胞，其表达表面标志物模式(1)-(64)中的任何一种，更优选地表达CD16⁺、CD163⁺、多配体聚糖-3⁺，并且如通过定量RT-PCR测量的，与静息巨噬细胞(M0)相比较另外表达在SEQID NO:1-4中阐述的基因中的至少一种强至少50%、至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、至少500%、至少600%、至少700%或至少800%。

此外，转录组学分析表明数个可用于区分Mreg-sc细胞与其他Mreg细胞(比如Mreg-bc细胞)的基因。这些基因包括SELENOP基因(硒蛋白P - NCBI参考序列：NM_005410.4- SEQ ID NO:5)、RNASE1 (核糖核酸酶A家族成员1 - NCBI参考序列：NM_002933.5 - SEQID NO:6)、C1QC基因(补体C1q C链-NCBI参考序列：NM_172369.5 - SEQ ID NO:7)和NRA4A3(核受体亚家族4 A组成员3 - NCBI参考序列：NM_006981.4 - SEQ ID NO:8)。尽管与Mreg-bc细胞相比较，基因SELENOP、RNASE1和C1QC基因在Mreg-sc细胞中表达更强，但基因NRA4A3在Mreg-sc中下调。因此，在另一个优选的实施方案中，提供Mreg细胞，其如通过定量RT-PCR测量的，与其他类型的Mreg细胞(比如Mreg-bc细胞)相比较，显著更强地表达在SEQ ID NO:5-7中阐述的基因中的至少一种，优选地2倍或3倍强。换句话说，提供Mreg细胞，其如通过定量RT-PCR测量的，与其他类型的Mreg细胞(比如Mreg-bc细胞)相比较，表达在SEQ ID NO:5-7中阐述的基因中的至少一种强至少50%、至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、至少500%、至少600%、至少700%或至少800%。

在仍然另一个优选的实施方案中，提供Mreg细胞，其如通过定量RT-PCR测量的，与其他类型的Mreg细胞(比如Mreg-细胞)相比较，将在SEQ ID NO:8中阐述的基因表达至显著更低的水平，优选地1/2或1/3。换句话说，提供Mreg细胞，其如通过定量RT-PCR测量的，与其他类型的Mreg细胞(比如Mreg-bc细胞)相比较，表达在SEQ ID NO:8中阐述的基因低至少50%、至少100%、至少200%、或至少300%、至少400%、至少500%、至少600%、至少700%或至少800%。

Mreg-sc细胞特别适合用于治疗目的，如以下更详细解释的那样。从概念上讲，Mreg-sc疗法为一种功能获得性疗法，这意味着给予具有免疫抑制、抗炎或组织修复功能的Mreg-sc细胞将补充接受者中这些细胞功能的缺陷。通过应用适当的大剂量，将有可能恢复或超过接受者的所述活性。在移植和自身免疫模型中，Mreg-sc治疗的治疗效果在接受者的体内持续超过其自身寿命。这种持久效果可通过Mreg-sc治疗对接受者T细胞的影响来解释。Mreg-sc细胞的给予可以3种互补方式影响接受者T细胞反应。

(a) Mreg-sc细胞直接与接受者T细胞相互作用，导致特定的T细胞缺失或转化成活化的诱导的调节性T细胞(iTreg)。

(b) Mreg-sc细胞通过直接相互作用或抗炎介质的释放改变接受者树突状细胞的行为。Mreg-sc细胞的一个重要功能可为在适当的自我调节环境中死亡并将抗原送交给接受者树突状细胞，其继而特异性地抑制接受者T细胞。

(c) Mreg-sc细胞或其亚细胞级分通过释放可直接作用或通过接受者骨髓单核细胞发挥作用的可溶性介质而发挥主动或被动非特异性抑制作用。

在第三方面，本发明涉及一种包含本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分的药用组合物。药用组合物将包含作为第一组分的有效量的本发明Mreg-sc细胞或其亚细胞级分。如本文使用的待静脉内给予患者的Mreg-sc细胞的有效量将在约1×10⁴-约1×10⁸/kg体重的范围内，优选地在约1×10⁵-约1×10⁷/kg体重之间，和更优选地在约1×10⁶-约9×10⁶/kg体重之间，比如约1×10⁶/kg、约2×10⁶/kg、约3×10⁶/kg、约4×10⁶/kg、约5×10⁶/kg、约6×10⁶/kg、约7×10⁶/kg或约8×10⁶/kg待治疗患者的体重。类似地，在本发明包括给予本发明Mreg-sc细胞的亚细胞级分的情况下，这些级分将基于对应于上述与细胞给予相关的范围之一的细胞量来制备。如本文使用的Mreg-sc细胞的亚细胞级分可包括坏死细胞颗粒、凋亡细胞颗粒或包括细胞的主要组织相容性(MHC)分子的外来体。也可使用通过用低渗溶液处理细胞、使用去污剂或酸溶解、冻融或加热、声处理、放射、机械破碎或延长储存而制备的细胞裂解物。亚细胞级分还可包括含有总细胞蛋白、膜蛋白、细胞质蛋白或纯化的MHC分子的细胞提取物。在药用组合物被配制用于局部给予例如皮内应用的情况下，细胞量将会不同。

除细胞或细胞的亚细胞级分之外，药用组合物还可进一步包含赋形剂，比如缓冲剂、pH调节剂、防腐剂等。本发明药用组合物中包含的赋形剂的性质和量将取决于预期的给予途径。通常，不同的给予途径对于向需要治疗的患者提供本发明的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分为可行的。优选地，本发明的药用组合物将被配制用于胃肠外给予，比如皮下、肌内、静脉内或皮内给予。特别优选的是通过静脉内给予将Mreg-sc细胞或其亚细胞级分或者包含所述细胞或级分的组合物给予患者。

将本发明的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分配制成药用组合物可通过应用药物配制领域中已知的常规方法来实现。例如，在标准教科书中描述了合适的方法。适合于通过注射或输注进行静脉内给予的药用组合物通常包括无菌水溶液剂或混悬剂和用于临时制备无菌溶液剂或混悬剂的无菌粉剂。为了使得能够在注射器或输注袋中进行便利处理，旨在注射的组合物必须为无菌的并且应为流体。

组合物在给予条件下应为稳定的，并且优选地通过在组合物中包括对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来防止微生物比如细菌和真菌的污染作用。对于静脉内给予，合适的载体可包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL™ (BASF)或磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。载体还可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可例如通过使用包衣比如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持需要的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。无菌可注射溶液剂可通过将所需量的细胞或亚细胞级分掺入具有一种或多种上述成分的适当溶剂中然后进行无菌过滤来制备。通常，通过将活性化合物即细胞或其亚细胞级分掺入到含有基本分散介质和来自上述那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备混悬剂。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉剂的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其产生细胞或其亚细胞级分加来自其先前无菌过滤的溶液剂的任何另外期望的成分的粉剂。

旨在输注或注射的组合物将具有50-500 ml之间的体积，其中90 ml-250 ml之间的体积特别优选，并且其中90 ml-150 ml之间的体积甚至更优选。对于局部给予，例如皮内给予，每次注射的体积将在0.1-1.0 ml的范围内。

Mreg-sc细胞可通过不同的给予方案给予需要治疗的患者。例如，在细胞或细胞级分通过静脉内输注给予患者的情况下，待给予的Mreg-sc细胞或Mreg-sc细胞级分的总量可通过一次或多于一次输注来提供。在一个优选的实施方案中，通过具有200 μm过滤器的输液器将Mreg-sc细胞或细胞级分提供给患者。包含Mreg-sc细胞或Mreg-sc细胞级分的混悬剂可用0.9% NaCl引发。混悬剂可以单次输注，更优选地在少于60分钟内的短期输注，例如在60分钟、30分钟、20分钟或15分钟内给予。优选地中心静脉导管用于给予Mreg-sc混悬剂。

Mreg-sc细胞或细胞级分的给予可伴随在其他活性剂之前、同时或随后给予。例如，在给予本发明Mreg-sc细胞或细胞级分以防止接受器官移植的患者的免疫反应的情况下，可将免疫抑制药物与本发明的细胞或细胞级分一起给予。移植医学领域通常使用的免疫抑制药物包括(但不限于)环孢素A (CSA)、他克莫司、硫唑嘌呤(AZA)、吗替麦考酚酯、雷帕霉素和类固醇(STE)。通常，接受者血液中免疫抑制药物的存在不影响本发明的细胞或细胞级分的有效性。

尽管从本发明第一方面中描述的方法获得的Mreg-sc细胞表现出稳定的表型，但出于安全原因，建议在从细胞培养物收获Mreg-sc细胞之后24小时内给予它们或由其获得的亚细胞级分。优选地，在从培养物收获细胞之后20小时内、16小时内、12小时内、8小时内或4小时内给予细胞。

在第四方面，本发明涉及本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分或本发明第三方面的组合物的治疗应用。如本文别处指明的，由本发明提供的Mreg-sc细胞表现出许多药理学特性，比如免疫抑制、免疫调节、血管生成和抗炎特性，这使其高度适合用于免疫抑制、抗炎或组织修复疗法。例如，本发明人工诱导的Mreg-sc细胞为T细胞抑制性的并且介导活化T细胞的主动缺失。因此，这些细胞高度适合用作多种免疫介导的疾病(比如器官移植)的辅助免疫抑制疗法。

因此，在本发明的一个实施方案中，本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分或本发明第三方面的药用组合物用于在接受移植的受试者中抑制移植排斥和/或延长移植存活的方法。因此，本发明涉及一种在接受移植的受试者中抑制移植排斥和/或延长移植存活的方法，其包括(i) 给予有效量的本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分，或(ii) 给予本发明第三方面的药用组合物。优选地，移植为器官、组织或细胞移植。根据本发明，待移植的器官的类型不受限制，但其优选地为肾脏、肝脏、心脏、肺或胰腺。特别优选的是待移植到接受者的器官为人体器官。

在其中移植为组织移植而不是器官移植的情况下，本发明的Mreg-sc也可用于抑制移植排斥和/或延长移植存活。再次，待移植到接受者中的组织没有特别限制。本发明的Mreg-sc可防止或改善接受者中源自同种异体供体的任何组织的排斥。待移植的组织优选地为人体组织，比如肠、角膜、皮肤、复合组织、骨髓或胰岛组织。

根据本发明方法制备的Mreg-sc还可通过抑制接受者中的免疫反应来支持将细胞移植到接受者中。在移植为细胞移植的情况下，待移植的细胞的性质通常没有限制，但优选的是待移植的细胞选自成体干细胞移植物、分离的肝细胞移植物或白细胞移植物。在本发明一个优选的实施方案中，Mreg-sc细胞用于促进骨髓或HSC移植之后造血干细胞(HSC)的植入。

为了抑制接受者中的移植排斥并诱导同种异体器官、组织或细胞移植的接受，本发明的Mreg-sc细胞或者包含Mreg-sc细胞或其亚细胞级分的药用组合物可通过如上所述的注射或输注静脉内给予。注射或输注可在手术前或手术后给予。如果Mreg-sc细胞在手术前给予，则其将在手术之前给予接受者至少1次，优选地2次，并且更优选地3次。优选的是将Mreg-sc不早于手术之前一周，例如手术之前6天、5天、4天、3天、2天或1天给予接受者。如果Mreg-sc细胞在手术后给予，则优选地在手术之后24小时内，更优选地在手术之后36小时、48小时、60小时或72小时内给予第一次给予。或者，在稳定免疫抑制的移植接受者中，可在移植之后的任何时间给予Mreg-sc疗法。或者，可将Mreg-sc给予经历急性或慢性移植排斥的移植接受者。然后，Mreg-sc能够抵制接受者的免疫系统对移植物的T细胞反应，并在接受者的体内(尤其是脾脏、肝脏、肺和骨髓)持续足够长的时间段以赋予接受者长期接受移植。

当在接受移植的受试者中使用本发明的Mreg-sc来抑制移植排斥或延长移植存活时，移植通常为同种异体移植，即源自尽管遗传不同但与接受者属于相同物种的供体的移植。在这种情况下，基于从所述供体获得的血液单核细胞产生Mreg-sc细胞。单核细胞可从活体供体或死体供体获得。在死体供体即身体捐献的情况下，出于器官保存的目的，通常通过主要动脉的造管术用灌注介质冲洗供体的身体。从身体中取出静脉血并且可收集其用于根据本文所述的方法制备Mreg-sc。或者，也可从自供体的脾脏中分离的骨髓单核细胞制备Mreg-sc。在手术后应用从已故供体制备的Mreg-sc细胞的情况下，可通过给予在器官移植期间通常用于该目的的免疫抑制剂来防止移植器官的排斥。

在另一个实施方案中，本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分或本发明第三方面的药用组合物用于促进或维持基于调节性T细胞的医药产品的植入或作用的方法中。因此，本发明还涉及在受试者中促进或维持基于调节性T细胞的医药产品的植入或作用的方法，其包括(i) 给予有效量的本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分，或(ii)给予本发明第三方面的药用组合物。

除免疫调节和免疫抑制特性之外，本发明的Mreg-sc细胞还具有抗炎特性，这使得能够消除慢性炎症免疫过程。因此，本文提供的Mreg-sc细胞也可用于治疗特征在于免疫状态失调或炎症反应过度的疾病或障碍，特别是慢性炎症性疾病。这种疾病或障碍包括例如自身免疫性疾病、炎症性疾病和超敏反应。

因此，在仍然另一个实施方案中，本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分或本发明第三方面的药用组合物用于治疗或预防自身免疫性疾病、炎症性疾病和超敏反应的方法中。

在Mreg-sc细胞用于治疗自身免疫性疾病的情况下，所述疾病可为(a) 主要为T细胞介导的，(b) 主要为抗体介导的或(c) 主要由免疫系统的其他细胞组分介导的。疾病可为局部或全身性自身免疫性病症。根据本发明，待用Mreg-sc疗法治疗的自身免疫性病症的类型不受限制，并且包括系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、干燥综合征(Sjögren’ssyndrome)、多发性肌炎、皮肌炎和其他系统性自身免疫性病症；类风湿性关节炎(RA)、幼年型类风湿性关节炎和其他炎症性关节炎；溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohn’s disease)和其他炎症性肠病；自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和其他自身免疫性肝病；皮肤小血管炎、肉芽肿性多血管炎、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、贝塞病(Behçet’s disease)、血栓闭塞性血管炎、川崎病(Kawasaki disease)和其他自身免疫性病因的大、中或小血管炎；多发性硬化(MS)和神经免疫障碍；I型糖尿病、自身免疫性甲状腺功能障碍、自身免疫性垂体功能障碍及其他自身免疫性内分泌障碍；溶血性贫血、血小板减少性紫癜及其他血液和骨髓的自身免疫性障碍；牛皮癣、寻常型天疱疮、类天疱疮及其他自身免疫性皮肤病症。

Mreg-sc细胞也可有效治疗急性或慢性炎症性疾病以及具有病理生理学显著炎症性成分的疾病。待治疗的炎症性疾病可为局部或全身性的。受益于用Mreg-sc治疗的炎症性疾病或病症的类型没有限制，并且包括(但不限于)动脉闭塞性疾病，比如外周动脉闭塞性疾病(pAOD)、严重肢体缺血、动脉硬化、脑梗塞、心肌梗塞、肾梗塞、肠梗塞、心绞痛和其他由动脉闭塞或收缩引起的病症；微血管心绞痛，也称为心脏X综合征；与代谢障碍相关的全身性炎症，包括II型糖尿病和肥胖相关的代谢综合征；皮肤病，包括湿疹。优选地，待治疗的炎症性疾病的特征在于动脉壁内膜的慢性炎症，例如心肌梗塞、中风、严重肢体缺血性血管炎和pAOD。

在期望治疗超敏反应的情况下，超敏反应优选地选自哮喘、湿疹、过敏性鼻炎、血管性水肿、药物超敏反应和肥大细胞增多症。

这些细胞也可用于治疗pAOD。已知由于其动脉闭塞的程度或位置或由于显著的并存病而不适合于血运重建手术的患者的pAOD为一种严重衰弱且普遍的病症，截肢是其唯一的治疗选择。截肢仍然是最后的治疗手段，并且与相对高的死亡率相关，且仅有少数患者随后恢复完全的活动能力。从本文所述的方法获得的Mreg-sc细胞，作为其在现有技术中描述的对应物，可通过促血管生成生长因子比如VEGF、FIGF (VEGF-D)、PDGFB和MDK的基础和刺激表达积极促进新血管形成，即新血管的形成。

在一个实施方案中，将Mreg-sc细胞肌内或皮下注射到缺血肢体中。在缺血组织中，Mreg-sc细胞将不可避免地暴露于充当TLR4激动剂的微生物成分和坏死组织成分(例如HMGB1)。因此，Mreg-sc可用于通过促血管生成生长因子的局部分泌来促进组织再生。在另一个实施方案中，可在制造过程期间用TLR配体离体刺激Mreg-sc细胞，以确保其高水平产生促血管生成生长因子。所述TLR配体可包括(但不限于)脂多糖(LPS)或单磷酰脂质A(MPLA)。待用本发明Mreg-sc治疗的pAOD可为任何等级或类别的pAOD。例如，pAOD可为I级1-4类的pAOD或II-IV级pAOD。

根据本发明方法制备的Mreg-sc细胞也可用于治疗腿部溃疡，特别是慢性腿部溃疡。更具体地讲，这些细胞可用于治疗受试者下肢的微血管病和大血管病。如本文使用的微血管病为一种影响身体中的小血管和毛细血管(比如小脑血管、小冠状血管或腿部小血管)的血管疾病。在微血管病期间，毛细血管基底膜变厚变硬，导致毛细血管或小动脉阻塞或破裂，继而导致组织坏死和功能丧失。相比之下，大血管病为一种影响大血管(比如动脉)的血管疾病。大动脉阻塞会导致糖尿病患者心脏病发作、中风和外周血管疾病的发病率高。腿部动脉阻塞通常会导致脚部和腿部溃疡缓慢愈合。外周血管疾病也会导致间歇性跛行，即行走期间疼痛，这严重损害活动能力。在很多情况下，大血管病需要截肢一或两条腿，特别是在糖尿病患者中。

微血管病和大血管病的原因之一为长期糖尿病。在糖尿病患者中，高血糖水平会导致血管内皮细胞吸收比正常更多的葡萄糖。然后这些细胞在其表面形成比正常更多的糖蛋白，并且还导致血管壁中的基底膜异常地变得更厚和更弱。结果，血管壁变得渗漏并减慢通过身体的血液流动，使得一些组织无法获得足够的氧气并受损。

根据本发明，待治疗的微血管病优选地选自由以下组成的疾病组：血管炎、动脉炎、血管发育不良、白色萎缩(atrophy blanche)、硬皮病、德特曼氏综合征(Determannsyndrome)、糖尿病性血管病、闭塞性血管内膜炎(endangiitis obliterans)、红斑性肢痛症、纤维肌发育不良、穿通病、门克伯格硬化(Mönckeberg Sclerosis)、奥斯勒氏病(Osler's disease)、间隔综合征、Paget-von-Schroetter综合征(Paget-von-Schroettersyndrome)、雷诺氏综合征(Raynaud's syndrome)和腿部溃疡。在一个特别优选的方面，待根据本发明治疗的微血管病或大血管病为腿部溃疡。如本文使用的腿部溃疡包括糖尿病腿部溃疡和静脉腿部溃疡。

根据本发明，待治疗的大血管病优选地选自动脉瘤、夹层(dissection)、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化血栓形成、外周动脉闭塞性疾病(PAD)、间歇性跛行、坏死和坏疽、血管畸形、勒里施氏综合征(Leriche syndrome)或压迫综合征。

给予Mreg细胞或细胞级分可伴随在其他活性剂之前、同时或随后给予。例如，在将Mreg细胞或细胞级分给予患有微血管病或大血管病的患者的情况下，抗血液高粘滞症的化合物比如羟苯磺酸钙，发挥毛细血管稳定作用的化合物比如萘醌腙等可在Mreg给予之前、同时或之后给予。

在另一方面，本发明的Mreg-sc细胞可用于促进受试者的手术、创伤或其他伤口愈合。Mreg疗法可用于促进急性或慢性伤口的愈合，任选地与常规管理(即清洁、闭合和敷料)结合使用。伤口可为开放或闭合的。开放性伤口可包括切口、撕裂伤、擦伤、撕脱伤、穿透伤或刺伤。闭合性伤口可包括挤压伤或血肿。切口可为创伤性或医源性的(即手术切口)。Mreg可用于促进自体或同种异体皮肤移植物的植入。Mreg可与常规管理结合使用，可加速烧伤的愈合，烧伤可为由于皮肤暴露于热、极冷、化学物质、摩擦、辐射或电流引起的。与溃疡治疗相关进行的陈述同样适用于伤口或烧伤的治疗。

如上所述，本发明的Mreg-sc可具有血管生成特性，使得本文考虑其用于治疗需要新血管形成的疾病或病症的用途。因此，本发明还涉及本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分或本发明第三方面的药用组合物，其用于在缺氧组织中诱导血管生成或血管发生，通过参与组织重塑、组织再生来促进组织修复过程，预防或减少纤维化，减轻缺血性疼痛或避免主要肢体截肢的方法。因此，本发明涉及一种在缺氧组织中诱导血管生成或血管发生，通过参与组织重塑、组织再生来促进组织修复过程，预防或减少纤维化，减轻缺血性疼痛或避免主要肢体截肢的方法，其包括(i) 给予有效量的本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分，或(ii) 给予本发明第三方面的药用组合物。

自身免疫性疾病、炎症性疾病或超敏反应的治疗可用衍生自与患者同种异体的单核细胞的Mreg-sc (如上文在移植应用的上下文中所述)，或用需要治疗的患者自体的单核细胞来实现。在可能的情况下，自身免疫性疾病、炎症性疾病或超敏反应的治疗将用自体单核细胞进行。为此，Mreg-sc可在有或没有同时局部肌内注射的情况下静脉内给予。

在仍然另一个实施方案中，本发明第二方面的Mreg-sc细胞或其亚细胞级分或本发明第三方面的药用组合物用作递送基因疗法的媒介物。因此，本发明涉及一种递送基因疗法的方法，其包括(i) 给予有效量的本发明第二方面的包含转基因的Mreg-sc细胞，或(ii) 给予包含本发明第二方面的包含转基因的Mreg-sc细胞的药用组合物。

根据第五方面，本发明涉及一种用于制备免疫调节性巨噬细胞的亚细胞级分的方法，所述方法包括：

(a) 提供如在本发明第一方面的上下文中描述的免疫调节性巨噬细胞，

(b) 分解免疫调节性巨噬细胞以提供亚细胞级分，

(c) 获得亚细胞级分。

本发明的Mreg-sc细胞可按照常规方法进行分解。例如，可通过用低渗溶液、去污剂或酸处理细胞来裂解Mreg-sc细胞。或者，可通过冻融或加热、声处理、放射、机械破碎或延长储存来分解细胞。在方法的最后步骤中，获得细胞的亚细胞级分，比如全蛋白级分、膜蛋白级分、细胞质蛋白级分。这些级分可用于上述治疗目的而不是活的Mreg-sc细胞。或者，可进一步纯化这些级分以分离某些蛋白，比如MHC蛋白。

根据第六方面，本发明涉及一种用于制备免疫调节性T细胞的方法，所述方法包括：

(a) 获得受试者的T细胞；

(b) 将T细胞与如上定义的Mreg-sc细胞共培养，即源自悬浮培养的Mreg细胞或其亚细胞部分；

(c) 从培养基中获得免疫调节性T细胞。

如本文别处所述，已与Mreg-sc共培养的T细胞抑制T细胞增殖。因此，从以上方法获得的免疫调节性T细胞可单独或与本发明的Mreg-sc细胞组合使用，用于治疗本文别处讨论的任何疾病或障碍。在第一步中，从受试者的血液样品中获得T细胞。可例如从血液样品或分离置换物，或者从受试者的组织，例如从骨髓或脾脏获得细胞。细胞可通过常规方法获得，例如在来自血液的细胞的情况下通过静脉穿刺。用于以上方法的T细胞将为例如CD3+ T细胞或其亚群。在与Mreg-sc细胞共培养之前，CD3+ T细胞可通过常规方法纯化或富集，例如通过磁微珠分离或流式细胞术分选。

然后使T细胞与本发明的Mreg-sc接触。可以不同的Mreg:Treg比率接触细胞。例如，可以1:5-5:1之间、优选地1:2-2:1之间的Mreg:Treg比率接触细胞级分。更优选地，Mreg:Treg比率为约1:1。不同的培养基可用于共培养方法。培养基可为上述与用于制备Mreg-sc细胞的方法相关的那些。在一个优选的实施方案中，培养基为来自Lonza的X-vivo10。培养基可进一步含有添加剂，比如M-CSF和/或GM-CSF，优选人类重组M-CSF和/或GM-CSF。M-CSF和/或GM-CSF的量将在本文别处提及的范围内，例如5-100 ng/ml，优选20-25ng/ml。培养基还可含有其他添加剂，比如1-5 mM，优选地2 mM的量的Glutamax。

将细胞共培养1-8天，优选地至少3天、至少4天或至少5天。在预定的培养期之后，可通过常规方法重新分离T细胞，例如通过富集CD4⁺ CD25⁺ TIGIT⁺ FoxP3⁺ Treg的细胞。如果需要，可将细胞进一步配制为药用产物。

附图说明

图1显示Mreg-sc和Mreg-bc细胞上23种细胞外标志物表达的比较。(A) 每种标志物的背景归一化中值荧光强度以点印迹显示，其中每个点代表一个批次，即供体。(B) 在瀑布图中，条形代表通道归一化中值荧光强度(nMFI)的对数尺度倍数变化。在R v3.5中，通过对测定和通道进行分组，然后减去该组内发生的FMO MFI测量值来计算nMFI。(C) 10种EC标志物在统计学显著性程度上在两种不同Mreg产物中的表达不同。(D) 巨噬细胞表型分型门控策略的代表性图表。对于细胞内分析，将CD45替换为CD33，并使用APC通道的可固定活力染料。在使用7-AAD的情况下，门控逻辑再次相似。为评价非目标细胞污染的程度，门被扩展以覆盖小尺寸细胞，比如淋巴细胞。

图2显示不同巨噬细胞中的基因表达分析结果：(A) 根据RT-qPCR的IDO1 mRNA表达；(B) 根据流式细胞术的IDO1蛋白表达；(C) IDO1蛋白表达与检测到的mRNA水平的相关性；(D) 根据RT-qPCR的DHRS9 mRNA表达。对于两种产物之间表达差异的统计显著性，p<0.0001用***表示；p< 0.001用**表示和p< 0.01用*表示。在图(A)和(D)中，Log2[Rq] = 0处的虚线表示mRNA表达没有变化；线上方的数值表示mRNA上调，线下方的数值表示mRNA下调。在面板(B)和(C)中，MFI= 2处的虚线表示初步检测阈值，其中IDO1蛋白由巨噬细胞表达，为背景荧光的至少两倍。

图3显示基于DHRS9和IDO1 mRNA表达的调节性巨噬细胞与M1和M2a巨噬细胞的分离。

图4为初步稳定性数据(n=2)的描绘，表明Rotea配制的Mreg细胞当在+4 ℃下储存时保持高活力至少长达48小时。(A) Mreg-sc (B)、Mreg-bc和(C) 热处理的对照在0小时、24小时和48小时于5% HSA plasmalyte中。为确定细胞活力和质量，使用Annexin VApoptosis试剂盒并通过MUSE® Cell Analyser进行分析。

图5显示Mreg-bc和Mreg-sc的基础分泌组谱非常相似。测量的27个因子中仅有IP-10差异分泌至培养基中。以pg/mL为单位的估计浓度显示于y轴上。

图6显示使用pHrodo Green大肠杆菌的吞噬作用测定的结果。将Mreg细胞与大肠杆菌颗粒一起温育1小时，并用流式细胞术进行分析。(A) 在Mreg-bc中作为pHrodo Green荧光强度测量的吞噬颗粒的代表性直方图。浅灰色虚线图表示在+37℃下温育的没有颗粒的对照，浅灰色图显示在冰上温育的含有颗粒的对照，和深灰色图代表在+37℃下温育的含有颗粒的样品。(B) 内化标记的大肠杆菌颗粒的细胞百分比的点图。结果描绘为活CD45阳性群体(T细胞的活CD45+CD3+)内pHrodo Green阳性细胞的平均值±SD百分比。

图7表明Mreg-sc细胞能够在共培养物(72小时)中抑制T细胞(CD3+)增殖。结果显示为3-5个Mreg批次(即3-5个供体)的平均值±SD。统计显著性显示为* p<0.05，***p<0.001。向共培养物中添加IDO1抑制剂(1 mM 1-甲基DL-色氨酸)将T细胞的增殖恢复至用非抑制性单核细胞观察到的水平。图例：第一条形=单核细胞；第二条形= Mreg-bc；第三条形=Mreg-sc。

图8显示CD72在Mreg-bc和Mreg-sc以及M0、M1和M2a巨噬细胞中的表达结果。

图9显示转录组分析的结果。将Mreg-sc、Mreg-bc、M1和M2a与M0巨噬细胞进行比较。呈现基因ARMH1、CA11、SMARCD3和HLA-DOA的基因转录物的log2倍数变化。ARMH1、CA11、SMARCD3在M0、M1和M2a细胞中的表达水平相同。这些基因在Mreg中的表达为M0、M1和M2a的>4倍(大约> log2倍数变化)。HLA-DOA的Mreg表达为其他巨噬细胞的3倍。

图10显示SELENOP、RNASE1、C1QC和NRA4A3的基因转录物可用作Mreg-sc的特异性标志物。在Mreg-sc中NRA4A3被下调，而SELENOP、RNASE1和C1QC被上调。

实施例

Mreg根据现行的无菌医药产品生产的GMP规范制造。在每个处理步骤均应注意保护产品、材料和设备免受污染和杂质的影响。

外周血单核细胞从经认可的血液收集而收集的健康志愿者的白细胞分离产物中分离出来。根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)和按照转换指令2002/98/EC和2004/23/EC的法律规定获得单采捐赠的知情同意。

实施例1：单核细胞的富集

为富集单核细胞，根据制造商的说明(LP-14系统用户手册，2015-03发布)，在CliniMACS Prodigy® (Miltenyi Biotec GmbH)中用符合GMP要求的全封闭LP14过程分离CD14+单核细胞。在该过程之前，对一小部分白细胞分离产物进行取样，并通过NucleoCounter® NC-200™自动细胞计数器(ChemoMetec)确定总细胞计数和活力，并通过流式细胞术从所有CD45+白细胞中确定CD14+细胞和CD3+淋巴细胞的百分比。类似地，在分离过程之后，检查目标细胞群的纯度、细胞回收率和活力。

实施例2：Mreg分化

为使实施例1中获得的单核细胞分化成Mreg，将单核细胞分成两个不同的级分。根据本发明的方法，第一级分在Xuri™细胞扩增系统中于悬浮培养中分化成Mreg，从而提供Mreg-sc细胞。第二级分在气体渗透性袋中分化成Mreg，以提供Mreg-bc细胞。两种过程的关键参数如以下表1所示。

表1：Mreg细胞制造过程的关键参数。

分化成Mreg-bc

如[6]所述，使单核细胞在气体渗透性MACS GMP分化袋(Miltenyi Biotec)中分化。当在这些袋中分化单核细胞时，Mreg变得半着生且为比其烧瓶培养的对应物更均质的细胞群。简言之，将1.8 x 10⁸个单核细胞在180 ml (即1 x 10⁶个细胞/ml)培养基中接种于3 L分化袋中。两种方法均使用相同的培养基(表1)：补充有10%人类AB血清(HABS)、2 mMGlutaMAX™ (Invitrogen, Germany)、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素(Invitrogen)和25 ng/ml重组人类M-CSF (R&D Systems, Germany)的RPMI 1640。将袋置于具有37℃加湿气氛和5% CO₂的温育器中。第二天，将袋翻转，以便为单核细胞提供更多的附着表面。袋表面的细胞密度为0.27 x 10⁶个细胞/cm² (如果仅计数一个表面，672 cm²)或0.13 x 10⁶个细胞/cm² (如果计数两个表面，1344 cm²)。在第6天(收获之前18-24小时)，添加人类重组干扰素-γ ((IFN-γ; Merck, Germany)并再次翻转袋。在7天培养期期间，未进行培养基更换。

在7天培养期结束时，大力振摇袋中的细胞，以使其从袋的内表面脱离。然后通过注射器将细胞转移至离心管中(收获1)，之后用DPBS冲洗袋，以便从袋中收集剩余的细胞(收获2)。两个收获级分保持分开，并且管在室温下以300 x g离心10分钟。接下来，收集第一收获的上清液并储存于-80℃下直至多重ELISA分析。将细胞沉淀重新悬浮于DPBS/培养基/最终配方缓冲液中(取决于后续分析)。在通过NC-200确定两个级分的总细胞数和活力之后，将其合并或仅将收获1级分用于进一步研究。这些“常规配制的”Mreg-bc细胞被分配用于通过流式细胞术进行的表型表征、qPCR和用于进一步的功能测定(见下文)。收获的和“常规配制的”Mreg-bc的活力>85%，回收率高达70%。

分化成Mreg-sc

使单核细胞在Xuri™细胞扩增系统(GE Healthcare)中分化。这是一波浪种式生物反应器，最初是为扩展基于T细胞的细胞免疫疗法而开发和验证的，并且其机械原理为细胞培养始终处于运动状态。Mreg-sc细胞在2 L Xuri Cellbags™ (目录号29-1054-92；GEHealthcare)中分化。对于这种大小的袋，可使用的培养基的最终体积范围为300-1000 mL。在以上表1中列出的培养基中接种密度为1.0 x 10⁶个细胞/ml (用双倍细胞量进行一次测试运行)。最终确定的最终过程参数如以下表2所示。已经按照这些参数制造了多于10个批次的Mreg-sc细胞。

表2：Xuri™分化过程的参数

在过程开发阶段期间和确定最终参数之后，收获1和收获2保持分开用于确定细胞活力和回收率，以更好地了解过程并确保低质量细胞不会进行进一步分析。另外，在开始时，对这两者分别进行免疫表型分型，因为不知道易于悬浮的Mreg (收获1)是否会与粘附于袋表面并且需要与冷缓冲液一起温育和增加摇晃参数的那些(收获2)的细胞外标志物表达表现出差异模式。对于分泌组分析，从收获1中收集培养基样品。最终分析(见Mreg-sc和下文)从离心、重新悬浮和合并的收获物中进行。

从制造的角度来看，Xuri生物反应器解决了许多与在数个单独的细胞分化袋中制造相关的瓶颈。表3显示来自基于袋和基于Xuri的分化过程的结果。计算基于以下假设：理论上可从一个0.541-3.55 x 10⁹个单核细胞的白细胞分离产物中获得进一步的Mreg分化(数据来自我们实验室通过Prodigy处理的>30个LP)；平均单核细胞产量为0.850 x 10⁹。在确定Xuri的最终过程参数之后，从2019年制造的批次(n=6；现今在2020年，>10批次)计算过程回收率和活力。值得注意的是，在这种比较中，Mreg-bc的数量仅得自有经验的操作员收获的一个3L分化袋。因此，从这些“小规模和亚批次”来源的Mreg中获得的数据并不能完全代表真正的“全尺度临床Mreg-bc批次”。对于两种Mreg类型，回收率和活力均已从收获的、离心的和缓冲液配制的样品计算得到。

表3：Mreg-sc和Mreg-bc过程的比较

可见与基于袋的方法相比较，基于Xuri™生物反应器的方法与较低的Mreg细胞回收率相关。基于袋的方法的主要优点为回收的Mreg的回收量。另一方面，基于Xuri™生物反应器的方法产生相对高质量的Mreg。进一步地，该过程具有更高程度的自动化，并且因此不依赖于特异个体操作员的技能。基于悬浮而不是基于粘附，使得可在一个隔室(即一个袋)中产生整个批次。

实施例3：比较巨噬细胞的制备

M1和M2a巨噬细胞为在以上与Mreg-bc的上下文中描述的相同的气体渗透性MACSGMP分化袋中伴随对[11]中描述的方案进行轻微修改产生的。细胞在与Mreg-bc相同的培养基中分化6天，但用5 ng/ml M-CSF和20%胎牛血清(FBS; Gibco)替代HABS。第6天，进行完全培养基更换，并且血清浓度降至5% FBS。同时，M1细胞用100 ng/ml来自大肠杆菌的脂多糖(LPS) (Sigma-Aldrich)和25 ng/ml IFN-γ极化，而M2a细胞用20 ng/ml重组人类IL-4(R&D Systems)极化。与Mreg-bc类似，在第7天收获细胞。

实施例4：细胞外和细胞内标志物的分析

对吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)进行细胞内染色。简言之，细胞用Fixable Live-Dead染料染色并用FcR封闭试剂封闭。然后，用CD33-PE将细胞染色。温育之后，将细胞固定并透化，且然后再次用10% FcR封闭试剂封闭。最后，将细胞分成3种反应混合物并如下添加细胞内抗体：管1：IDO1-PerCP/eFluor710，管2：IgG1-PerCP/eFluor710同种型对照或管3：无抗体，并在温育和清洗之后进行分析。

对于细胞外标志物，用CytoFLEX S分析至少2 x 10⁴个活细胞(定义为CD45阳性、SYTOX Green阴性事件)。设置初始SSC/FSC门以排除大部分碎片和垂死细胞。然后将活细胞绘制于直方图上，每个直方图描绘一种表型标志物。背景水平基于CD45+/SYTOX Green+双染色细胞设置，以说明背景自体荧光。最初，使用同种型和荧光染料匹配的非特异性抗体(同种型对照)估计非特异性mAb结合的水平。在每次分析运行之前通过质量控制(QC)运行。而且，使用相同的测定参数和Beckman-Coulter Daily QC Beads在外部分析布局上设置目标MFI值，以验证仪器性能。

然后基本上通过与图1D中描绘的相同的门控策略，通过流式细胞术分析排除碎片之后来自至少1 x 10⁴个CD33阳性、Fixable Live-Dead染色阴性事件的IDO1信号。CD33和活体/死体染色的同种型对照用于确定背景和非特异性荧光的水平。在每次分析运行之前，在CytoFLEX S流式细胞仪上通过QC运行。

用FCS Express 6 Flow Research Edition (DeNovo Software, Glendale, CA,US)分析流式细胞术数据。中值荧光强度(MFI)用作描述表型标志物表达强度的主要参数。对于细胞外标志物，从染色样品中减去对照样品的MFI，以获得每个样品的背景调整的MFI值。对于IDO1，使用特异性MFI/同种型MFI指数。

所有CD45+白细胞中CD14+单核细胞和CD3+淋巴细胞的百分比通过流式细胞术从初始白细胞分离样品中测定，并且然后在Prodigy中的单核细胞富集之后再次进行纯度检查。对于表型分析，根据制造商的说明用SYTOX Green死细胞染料对细胞进行染色。然后将细胞分成7种反应混合物并用以下表4中描述的标志物染色。根据试剂盒说明，在所有流式细胞术实验中，用FcR封闭试剂(Miltenyi Biotec)封闭细胞。

BV421：Brilliant Violet 421，BV510：Brilliant Violet 510，FITC：异硫氰酸荧光素，PE：R-藻红蛋白，APC：别藻蓝蛋白，Sytox Gr.：SYTOX Green死细胞染料(ThermoFisher Scientific)。(*)用于评价产物中的T细胞污染。HGNC名称带有下划线。

表4：调节性巨噬细胞的细胞外表型标志物的染色方案

用于流式细胞术和细胞内染色的抗体描绘于以下表5中。上表中描绘的所有抗体均用于CD14+单核细胞纯度的细胞外染色或调节性巨噬细胞的表型表征，除了用于细胞内染色的最后3种抗体之外。

表5：用于流式细胞术和细胞内染色的抗体

结果：从标志物分析获得的结果如图1所示。可见两个Mreg过程始终产生相对均质的巨噬细胞群，在两个过程之间存在某些明显差异。Mreg-bc细胞显示出通过流式细胞术测定的多种活化相关标志物(比如CD38、CD40和CD80)的显著下调以及标志物CD86和CD71的水平升高。Mreg-sc过程的显著因素为高水平的CD11c、CD14、CD16、CD51、CD163和多配体聚糖-3。因此，多种标志物允许可靠区分两种巨噬细胞产物。此外，这两个过程由于IDO1的差异表达而分离，在Mreg-sc中可见明显更高的水平(图2B)。观察到在IDO1 mRNA上调程度与IDO1蛋白表达之间存在直接相关性(图2C)，尽管在蛋白水平上检测到IDO1之前需要一定水平的mRNA累积。结果，并非所有批次的Mreg-bc均显示IDO1在蛋白水平上的表达，即使mRNA上调至与CD14+的至少50倍。因此，IDO1表达水平可潜在地用于区分不同类型的巨噬细胞，并且甚至区分Mreg-sc与Mreg-bc。

实施例5：通过RT-qPCR进行的基因表达表征

对于RT-qPCR，将5x10⁶个细胞重新悬浮于500 µl RNAprotect细胞试剂(Qiagen)中，并在-20℃下冷冻。使用RNeasy Protect Cell Mini Kit (#74624, Qiagen)和QIAshredder一次性细胞裂解匀浆器(#79654, Qiagen)从细胞中提取总RNA。通过NanoDropOD260测量来量化RNA量。根据制造商的说明，用DNAse I (#DNASE-50 PrimerDesign或 #18068015 Invitrogen)处理来自每个样品的4 µg RNA。在将样品浓度调整至50 ng/µl并使用Qubit^TM RNA HS Assay Kit (#Q32855, Invitrogen)通过Qubit^TM荧光计(Invitrogen)测量进行验证。根据制造商的说明，使用TaqPath 1-Step Multiplex Master Mix Kit (#A28526 Applied Biosystems)和QuantStudio 5实时PCR系统(Applied Biosystems)通过RT-qPCR测量DHRS9和IDO1 mRNA的相对表达。Taqman测定购自Applied Biosystems：用于人类IDO1的测定编号 Hs00984148_m1 (FAM-MGB)、用于人类DHRS9的Hs00608375_m1 (FAM-MGB)和用于人类GAPDH的Hs03929097_g1 (VIC-MGB)。GAPDH mRNA的表达用作数据归一化的内源性对照基因。每个扩增反应含有50 ng RNA并且一式三份进行。用QuantStudio设计和分析桌面软件(QuantStudio Design and Analysis desktop Software) (AppliedBiosystems)分析获得的扩增数据。相对于起始材料(即CD14+单核细胞)中相应mRNA的表达计算表达的变化。

结果：DHRS9表达在Mreg-bc、Mreg-sc和M2a细胞中显著增加(图2D)。对于M1细胞，与起始CD14+单核细胞群相比较，DHRS9的表达显著降低，一些M1批次显示DHRS9 mRNA的下调。因此，IDO1和DHRS9两个基因的集合可助于识别来自M1和M2a表型的调节性巨噬细胞。调节性巨噬细胞表现出IDO1和DHRS9两者的表达升高，而M1促炎性巨噬细胞仅增加IDO1的表达，而M2a抗炎巨噬细胞仅表达DHRS9 (图3)。

实施例6：细胞因子和生长因子分泌谱

对于分泌组分析，在收获期间收集细胞培养基样品。所有样品均在-80℃下储存，脂直至Bio-Plex ProTM Human Cytokine 27-plex Assay试剂盒(Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA, USA; #M500KCAF0Y)进行分析。提供试剂盒用于检测抗炎因子IL-1ra、IL-4、IL-10、IL-13，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1 [MCAF]、INF-γ、IP-10，和生长因子PDGF bb、VEGF、G-CSF、GM-CSF和bFGF。尽管存在先前的分类，但其中数种因素为多效的，并且因此其功能取决于受影响的细胞类型和其中表达它们的微环境。

实验程序根据制造商的说明进行。简言之，将包被有捕获抗体的磁珠与预混合标准品或样品上清液一起在摇床上温育30分钟。然后，加入检测抗体并如上进行温育。清洗之后，加入链霉亲和素-PE并温育10分钟。清洗之后，将珠粒重新悬浮于测定缓冲液中，并在Bio-Plex® 200系统上读取结果。用Bio-Plex Manager™软件版本4.1.1分析数据。测定来自收获时收集的培养基样品的非刺激(基础水平) Mreg-sc和Mreg-bc细胞的分泌谱，即分泌组。

结果：通过BioRad多重酶联免疫测定(multiplex enzyme-linked immunoassay)分析了Mreg-sc (n=3；2019年产生，具有最终Xuri过程参数)和Mreg-bc (n=11，从2018-2019年批次收集的样品)的分泌组谱。在分析的27个因子中，当在R中使用Welch双样本方法时，发现8个从Mreg-bc和Mreg-sc中不同地释放(数据未显示)。然而，进一步检查并与M1和M2a巨噬细胞的分泌组进行平行比较，可发现仅有IP-10 (图5) (IFN-γ诱导的蛋白10[13])的分泌从Mreg-sc而不是从Mreg-bc中显著分泌。作为结论，这两种Mreg产物的基础分泌谱似乎彼此非常相似。

实施例7：吞噬作用测定

用Mreg-sc (悬浮培养)和Mreg-bc (袋中培养)进行基于流式细胞术的吞噬作用测定，以评估巨噬细胞的功能性能力。使用用于基于流式细胞术的pHrodo GreenEscherichia coli (E. coli) BioParticles Phagocytosis Kit(Invitrogen，ThermoFisher Scientific, #P35381)根据制造商的方案伴随轻微修改，对收获的巨噬细胞以及冷冻保存和解冻的CD14+单核细胞和CD3+T细胞进行测定。简言之，允许在收获后粘附至少1小时的一百万巨噬细胞/单核细胞以及50万T细胞与pHrodo Green E.coliBioParticles Conjugate (在培养基中1:20稀释)在+37℃下以及在冰上一起温育1小时以抑制颗粒吸收。清洗之后，收获细胞并悬浮于100 μl FACS 缓冲液中。用5 μl 7-AAD活力染料(BD Biosciences, #559925)和1 μl CD45-PE/Cy7 (Biolegend, #304015)以及另外1 μl CD3-BV421 (Biolegend, #317344)(对于T细胞样品)对细胞进行染色。在室温下于黑暗中温育15分钟之后，在CytoFLEX S流式细胞仪(Beckman Coulter, US)上获取之前，通过用2.5 ml FACS缓冲液清洗去除未结合的抗体。获得至少4 x 10⁴个活细胞(双重区分CD45阳性、7-AAD阴性)。以FlowJo软件(TreeStar, US)分析流式细胞术数据。吞噬作用被确定为pHrodo™ Green荧光相对于在冰上温育的对照样品观察到的荧光的增加，并计算为吞噬颗粒的pHrodo™ Green阳性细胞的频率(阳性百分比)。

结果：结果如图6所示。流式细胞术分析表明，两种Mreg类型(和单核细胞)均在积极吞噬大肠杆菌(图6A)。吞噬作用事件的检测由含有目标颗粒并在冰上温育从而防止吞噬作用的阴性对照证实(图6A)。1小时之后，85±4%的Mreg-sc和75±7%的Mreg-bc巨噬细胞(83±4%单核细胞)具有内化颗粒(图6B)。

实施例8：T细胞抑制测定

IDO1的表达被鉴定为对T细胞增殖的Mreg抑制作用的主要致因[6][11]，可能是由于诱导的色氨酸剥夺。如上所示，在mRNA和蛋白两者水平上，Mreg-sc比Mreg-bc表达更高水平的吲哚胺IDO1。因此，研究了Mreg-sc是否发挥更强的Mreg介导的T细胞增殖抑制。抑制测试为根据[11]中描述的方案伴随轻微修改进行。根据制造商的方案，在Mreg收获之前一天，同种异体供体的CD3+ T细胞用CytoTell Green (22253, AAT Bioquest)进行荧光标记。使用MACS珠粒(以每2个细胞1个珠粒；130-091-441，Miltenyi Biotec)活化CytoTell标记和未标记的对照T细胞。将细胞与非活化的对照CytoTell™标记的T细胞一起在补充有5%HABS、1% Glutamax和100 IU/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI生长培养基中培养过夜(+37℃, 5% CO₂)。第二天，将新鲜收获的巨噬细胞和解冻的冷冻保存的单核细胞在上述培养基中铺板到48孔板的孔中。允许细胞在添加T细胞之前粘附2小时(+37℃, 5% CO₂)。接种的单核细胞/巨噬细胞的总量从6.25x10⁴至3.75x10⁵个细胞/孔不等，使得在向孔中添加1.25x10⁵个T细胞后，所得共培养物的比率为3:1、2:1、1:1和1:2效应细胞:T细胞。为了研究IDO1在Mreg介导的T细胞增殖抑制中的作用，将IDO1抑制剂(1-甲基DL-色氨酸, 860646,Sigma Aldrich)添加至单独指定的3:1共培养物中。在共培养(+37℃, 5% CO₂) 72小时之后，收获非粘附细胞(主要是T细胞)并用抗CD3-APC (300312, BioLegend)标记以识别T细胞。对于活体/死体区分，使用了7-AAD (559925, BD Biosciences)排除。在CytoFLEX S上通过流式细胞术评价T细胞增殖的程度。流式细胞术数据作为FCS 3.0文件导出，并在FCSExpress 6 Flow Research Edition中进行增殖分析以计算活T细胞群(CD3阳性细胞，7-AAD阴性)的增殖指数(PI)。FCS表达中的增殖指数代表培养期间的倍数扩增(最终细胞计数与起始细胞计数的比率)，并根据以下公式计算：

其中i为细胞世代和N为在该世代中观察到的细胞数量。

结果：在与Mreg-sc、Mreg-bc或单核细胞的1:2和1:1共培养物中未观察到T细胞增殖的显著差异。然而，在较高的细胞比率(2:1和3:1)下，与Mreg-sc和Mreg-bc两者共培养的T细胞的增殖程度低于单独培养的T细胞(数据未显示)或与单核细胞共培养的T细胞(图7)。Mreg-sc加剧了观察到的T细胞增殖的抑制。向3:1共培养物中添加IDO1抑制剂(1 mM 1-甲基DL-色氨酸)可减轻抑制作用，并将T细胞的增殖恢复至用非抑制性单核细胞观察到的水平。这证实了在T细胞增殖中可见的抑制作用与调节性巨噬细胞的IDO1表达水平有关而不是与共培养物中的非特异性营养限制有关。

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Claims (21)

1.一种用于制备免疫调节性巨噬细胞的方法，所述方法包括：

(a) 从受试者的血液样品中分离CD14阳性单核细胞；

(b) 在含有(i) M-CSF和/或GM-CSF，和(ii) CD16配体的培养基中培养单核细胞；

(c) 使所述单核细胞或单核细胞衍生的细胞与IFN-γ接触；和

(d) 从所述培养基中获得所述免疫调节性巨噬细胞，

其中步骤(b)和(c)在容器中进行，所述容器经搅动以避免所述细胞粘附于所述容器的表面。

2.权利要求1的方法，其中步骤(d)不包括将细胞从所述容器的表面机械分离。

3.权利要求1-2中任何一项的方法，其中进行步骤(b)和(c)使得不超过10%，和优选地不超过5%的细胞粘附于所述容器的表面。

4.权利要求1-3中任何一项的方法，其中步骤(b)中的培养基包含人类血清，比如人类AB血清。

5.权利要求1-4中任何一项的方法，其中步骤(b)中M-CSF和/或GM-CSF的浓度在5-100ng/ml的范围内，优选地为20-25 ng/ml。

6.权利要求1-5中任何一项的方法，其中步骤(b)中的单核细胞在与IFN-γ接触之前培养至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天。

7.权利要求1-6中任何一项的方法，其中所述容器由塑料制成，优选地由乙烯乙烯醇(EVOH)、乙烯醋酸乙烯酯共聚物(EVA)或聚烯烃制成。

8.权利要求1-7中任何一项的方法，其中步骤(c)中IFN-γ的浓度在5-100 ng/ml的范围内，优选地为20-25 ng/ml。

9.可通过权利要求1-8的方法获得的免疫调节性巨噬细胞。

10.免疫调节性巨噬细胞，其中所述细胞表达以下标志物：CD16、CD163和多配体聚糖-3。

11.权利要求10的免疫调节性巨噬细胞，其中所述细胞进一步表达以下标志物中的至少一种：CD51、CD11c、CD72、IDO1。

12.包含权利要求9-11中任何一项的免疫调节性巨噬细胞或其亚细胞级分的药用组合物。

13.权利要求12的药用组合物，其中所述组合物中细胞的至少70%、优选地至少80%和更优选地至少90%为权利要求9-11中任何一项的免疫调节性巨噬细胞。

14.用于在于接受移植的受试者中抑制移植排斥和/或延长移植存活的方法中使用的权利要求9-11中任何一项的免疫调节性巨噬细胞或其亚细胞级分或权利要求12-13中任何一项的药用组合物。

15.权利要求14的用于在方法中使用的免疫调节性巨噬细胞或其亚细胞级分或药用组合物，其中所述移植为同种异体移植。

16.用于在促进或维持基于调节性T细胞的医药产品的植入或作用的方法中使用的权利要求9-11中任何一项的免疫调节性巨噬细胞或其亚细胞级分或权利要求12-13中任何一项的药用组合物。

17.用于在治疗或预防自身免疫性疾病、炎症性疾病或超敏反应的方法中使用的权利要求9-11中任何一项的免疫调节性巨噬细胞或其亚细胞级分或权利要求12-13中任何一项的药用组合物。

18.权利要求17的用于在方法中使用的免疫调节性巨噬细胞或其亚细胞级分或药用组合物，其中所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、干燥综合征、多发性肌炎、皮肌炎和其他系统性自身免疫性病症；类风湿性关节炎(RA)、幼年型类风湿性关节炎和其他炎症性关节炎；溃疡性结肠炎、克罗恩病和其他炎症性肠病；自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和其他自身免疫性肝病；皮肤小血管炎、肉芽肿性多血管炎、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、贝塞病、血栓闭塞性血管炎、川崎病和其他自身免疫性病因的大、中或小血管炎；多发性硬化(MS)和神经免疫障碍；I型糖尿病、自身免疫性甲状腺功能障碍、自身免疫性垂体功能障碍及其他自身免疫性内分泌障碍；溶血性贫血、血小板减少性紫癜及其他血液和骨髓的自身免疫性障碍；牛皮癣、寻常型天疱疮、类天疱疮及其他自身免疫性皮肤病症。

19.权利要求17的用于在方法中使用的免疫调节性巨噬细胞或其亚细胞级分或药用组合物，其中所述炎症性疾病选自动脉闭塞性疾病，比如外周动脉闭塞性疾病(pAOD)、严重肢体缺血、动脉硬化、脑梗塞、心肌梗塞、肾梗塞、肠梗塞、心绞痛和其他由动脉闭塞或收缩引起的病症；微血管心绞痛，也称为心脏X综合征；与代谢障碍相关的全身性炎症，包括II型糖尿病和肥胖相关的代谢综合征；皮肤病，包括湿疹。

20.权利要求17的用于在方法中使用的免疫调节性巨噬细胞或其亚细胞级分或药用组合物，其中所述超敏反应选自哮喘、湿疹、过敏性鼻炎、血管性水肿、药物超敏反应和肥大细胞增多症。

21.用于在通过参与组织重塑、组织再生、血管生成、血管发生或预防/限制纤维化来促进组织修复过程的方法中使用的权利要求9-11中任何一项的免疫调节性巨噬细胞或其亚细胞级分或权利要求12-13中任何一项的药用组合物。

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