CN114867844A - 鉴定适合麸质降解的益生菌菌株聚生体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定益生菌菌株聚生体的方法，所述益生菌菌株属于例如乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)，可用于食品补充剂的制备、食品生产以及旨在将麸质安全快速降解为无毒、无免疫原性消化物的药物应用。

Description

鉴定适合麸质降解的益生菌菌株聚生体的方法
本发明涉及鉴定益生菌菌株聚生体的方法，所述益生菌菌株属于例如乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属 (Pediococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)，可用于食品或宠物食品补充剂的制备、食品或宠物食品的生产，以及旨在将麸质(gluten) 安全快速降解为无毒、无免疫原性消化物的药物应用。
麸质是小麦、黑麦、燕麦和大麦等谷物的主要蛋白质网络。麸质包括单体α-麦醇溶蛋白、γ-麦醇溶蛋白、Ω-麦醇溶蛋白，它们携带具有免疫原性和/或毒性潜力的肽序列(最突出的实例列于表1)。
表1：免疫原性麦醇溶蛋白肽
Figure BDA0003706784020000011
因此，当麦醇溶蛋白或麦谷蛋白的不完全消化在易感个体中释放有毒肽时，膳食摄入麸质会导致健康损害。麸质相关疾病谱包括乳糜泻(CD)、小麦过敏(WA)、非乳糜泻麸质敏感性(NCGS)和麸质敏感性肠易激综合征[1]。目前，这些疾病尚无治愈方法——唯一有效的解决方案是避免摄入麸质，尤其是对于患有CD的人。有趣的是，已经建议各种其他健康状况(例如精神分裂症、特应性、纤维肌痛、子宫内膜异位症、肥胖、非特异性胃肠道症状)从避免麸质中受益[2]。这些事实解释了无麸质饮食(GFD)的兴起；并且这种做法也延伸到大量并且越来越多的健康、无症状的人。例如，据报道33％的美国人口希望避免麸质，41％的运动员人口报告在超过50％的时间内吃 GFD[3]。然而，实施GFD会带来挑战和不利影响，需要在风险和收益评估中加以考虑。患有CD的人需要严格遵守GFD，这很难实现，因为即使是被认为或声称无麸质的食品通常也含有(微量)超过麸质摄入安全限值(通常CD患者为<20ppm)的麸质量。为了确保CD 患者和有关麸质相关疾病的食品安全，需要可靠和有效的策略来支持避免麸质或解毒。
在没有明确指示维持GFD的情况下，即避免麸质是一种生活方式选择而不是医疗必需品，则需要考虑这种饮食的不良副作用。GFD 通常是不平衡的，例如由于避免食用谷类产品，这些产品缺乏微量营养素和纤维，同时在许多麸质替代食品中发现过多的卡路里以及糖和饱和脂肪的含量增加[4-6]。因此，GFD的潜在危害包括儿童和青少年的生长/发育迟缓、各种营养不良相关疾病、高脂血症、高血糖和冠状动脉疾病[6]。此外，长期坚持使用GFD会导致肠道微生物群失调，进而对健康产生不利影响[7]。
肠道微生物群是麸质肠道命运以及对其的生理反应的一个关键决定因素，正如对不同定植小鼠的实验[8]以及CD患者与健康个体的微生物群比较[9、10]所揭示的那样。因此，已经开发了几种针对微生物群的方法来寻找麸质相关疾病的治疗选择。这些方法可分为：1.乳杆菌属(Lactobacillus spp.)或双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)的口服应用，以纠正与GFD或麸质相关疾病相关的生态失调，2.乳杆菌属或双歧杆菌属的口服应用，作为通过未定义机制对麸质相关疾病的非特异性支持，3.乳杆菌属或双歧杆菌属的口服应用，以支持麸质的降解，4.从真菌或细菌中分离的肽水解酶口服应用，以支持麸质的降解(“麸质酶”)。到目前为止，所有这些尝试都未能为有需要的人带来持续的好处。此外，肽水解酶的应用已被讨论为可能的健康风险，因为它们可能导致麸质消化不完全，引发有毒表位的释放，这将加剧而不是改善麸质毒性[11]。CD患者的酶治疗效果还受到蛋白水解耐受性差以及胃肠道转运过程中酶活性的有限程度和持续时间的限制[12]。
最近，根据Zheng J,Wittouck S,Salvetti E,Cmap Franz HMB, Harris P,Mattarelli PW,O’Toole B,Pot P,Vandamme J,Walter K, Watanabe S,Wuyts GE,FelisMG,Ganzle A and Lebeer S,2020.A taxonomic note on the genus lactobacillus:description of 23novel genera,emended description of the genus lactobacillusBeijerinck 1901,and Union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. https:// doi.org/10.1099/ijsem.0.004107更新了乳杆菌属的几个种的分类学分类。在本发明的上下文中特别相关的是以下的种：
Figure BDA0003706784020000031
我们认为，益生菌干预缺乏益处是由于益生菌菌株的选择和混合不当造成的。一种有意义和有力的选择方法是识别促进快速和完全消化麸质的协同相互作用的益生细菌的聚生体的先决条件。这种方法迄今尚未被描述并且是本发明的主题。
Rashmi等人公开了四种对pH 2和胆酸表现出耐受性的水解麸质的芽孢杆菌菌株[13]。然而，没有评估消化物的推定免疫原性和免疫原性肽的出现。同样，没有评估单独或组合菌株的特异性肽酶活性。没有评估聚生体水解麸质的潜力。
Phromraksa等人从泰国传统发酵食品中分离出九株芽孢杆菌菌株。使用粗细菌提取物通过蛋白质印迹评估了菌株的麦醇溶蛋白水解。但是，无论是消化产物还是消化物的免疫原性潜力均未得到表征[14]。
Clark等人通过选择性培养从猪回肠中分离出50株细菌菌株并筛查了它们的PepN、PepI和PEP活性(对应于步骤4的部分内容) (Journal of Allergy and ClinicalImmunology,(February 2011)Vol. 127,No.2,Supp.SUPPL.1,pp.AB243.AbstractNumber:942. Meeting Info:2011American Academy of Allergy,Asthma andImmunology,AAAAI Annual Meeting.San Francisco,CA,United States.18Mar 2011-22Mar 2011ISSN:0091-6749)。
类似地，Fernandez等人使用选择性培养从人唾液中获得150株分离物[15]。评估了菌株的麦醇溶蛋白、三肽和33聚体水解。
US2013/0121976A1要求保护一种选择用于治疗乳糜泻的乳酸菌菌株的方法，包括选择具有能够降解33聚体、20聚体肽 QQLPQPQQPQQSPFQQQRPF、13聚体肽LGQQQPFPPQQPY和18聚体肽PQLPYPQPQLPYPQPQPF的菌株的步骤，并且其中所述菌株可以在4至6的pH值和在溶菌酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶存在下降解所述肽。
Francavilla等人评估了乳酸杆菌菌株的体外肽酶活性，以下种的菌株：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum(Lactiplantibacillus plantarum))、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei(Lacticaseibacillus paracasei))和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei(Lacticaseibacillus casei))显示出对PepN最多10mU/mg、对PepI10mU/mg、对PEP 5mU/mg和对PepQ 25mU/mg的活性[16]。这些菌株中的十株的联合应用导致在孵育24小时后水解表1中列出的麦醇溶蛋白表位。没有确定菌株在胃和小肠条件下的存活率，因此无法预测这些菌株对人胃肠道中麸质消化的有效性。
Herran等人从人小肠分离出27株属于以下种的菌株：唾液乳杆菌(L.salivarius)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、罗伊氏乳杆菌 (L.reuteri(Limosilactobacillus reuteri))、干酪乳杆菌(L.casei (Lacticaseibacilluscasei))、口乳杆菌(L.oris)、加氏乳杆菌(L. gasseri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、短乳杆菌(L.brevis(Levilactobacillus brevis))、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌 (B.pumilus)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，其仅在24小时的非常长的孵育时间后才显示出针对33聚体而不是针对其他肽的蛋白水解活性[17]。类似地，对于其他人小肠来源菌株，也发现了对该表位的弱活性，同样包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种[18]。
本发明公开了一种鉴定属于乳杆菌属、芽孢杆菌属、片球菌属和魏斯氏菌属的益生菌菌株聚生体的方法，其可用于促进麸质的完全和快速降解，例如，在食品和制药的应用。
来源于麸质暴露生态位(例如土壤、谷物加工、酸面团、粪便、人/动物胃肠道标本)的细菌菌株文库经过由以下组成的连续筛查步骤：对模拟胃肠道条件的耐受性、对麸质的足够的蛋白酶活性、对合成的含脯氨酸肽底物的足够的肽酶活性。通过这些筛查步骤的菌株与具有互补肽酶活性的(活细胞或其提取物的)聚生体组合，并测试来源于麸质的相关免疫原性肽的水解。然后在模拟胃肠道条件下将促进快速和完全去除这些肽的聚生体应用于麸质水解实验，然后探测消化物中是否存在麸质、麸质衍生的免疫原性肽和来自乳糜泻患者十二指肠外植体的免疫原性潜力(参见图1)。最后，在人体麸质挑战试验中对聚生体进行测试，评估粪便样本的麸质、麸质衍生的免疫原性肽的含量和微生物群组成分析，包括引入菌株的含量。
如下公开的筛查步骤提供了一种漏斗型分析(funnel)，其产生了可用于食品生产(无麸质食品)以及膳食补充剂和制药应用(有助于安全清除肠道中的麸质)的益生菌菌株聚生体。
因此，本发明的主题是鉴定促进麸质和麸质衍生的肽(表位)降解的益生菌菌株聚生体的方法，其至少包括以下步骤：
1)提供至少10种益生菌细菌菌株的文库；
2)将步骤1)的益生菌细菌菌株在模拟胃条件(pH 1-4)下孵育至少30分钟并在肠条件(pH 5.5-8.5)下孵育至少30分钟，并且在模拟胃条件和肠条件之后选择小于2log CFU损失的菌株；
3)确定步骤2)中选择的菌株对麸质的蛋白酶活性，并且选择能够将至少5000ppm的初始麸质水平降低10％至70％的菌株；
4)确定步骤3)中选择的菌株的N型肽酶氨肽酶(PepN)；PepI、 PepO、脯氨酰内肽基肽酶(PEP)；PepX和PepQ肽水解酶的活性，并且选择具有对于这些肽酶中至少一种肽酶而言至少1U/g的肽酶活性的菌株；
5)将步骤4)中选择的至少2种菌株组合成具有对于肽酶PepN、 PepI、PepO、PepX和PepQ中每一种而言至少1U/g的活性的益生菌菌株聚生体；
6)确定步骤5)中的具有针对以下肽的肽酶活性的聚生体的肽酶活性：12聚体肽QLQPFPQPQLPY(Seq-ID No 1)、14聚体肽 PQPQLPYPQPQSFP(Seq-ID No 2)、20聚体肽QQLPQPQQPQQSFPQQQRPF(Seq-ID No 3)和33聚体肽 LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(Seq-ID No 4)，并且选择具有将所有四种表位降解超过50％的肽酶活性的聚生体；
7)确定步骤6)中选择的聚生体在模拟胃条件(pH 1-4)下孵育至少30分钟并在肠条件(pH 5.5-8.5)下孵育至少30分钟水解具有至少5000ppm麸质的起始浓度的麸质的肽酶活性，并且选择将至少5000 ppm的初始麸质水平降低至水解和残留麸质浓度小于200ppm的聚生体。
优选使用更多的益生菌菌株并筛查更大量的不同菌株。因此，在一个有利的配置中，所提供的文库包含至少20种、优选至少30种、更优选至少40种、最优选至少50种益生菌菌株。
在步骤6)中，优选选择具有降解超过70％，优选超过90％的所有四种表位的肽酶活性的菌株。
在一个优选实施方案中，N型肽酶氨肽酶(PepN)；PepI、PepO、脯氨酰内肽基肽酶(PEP)；PepX和PepQ肽水解酶的酶活性对于这些肽酶中至少一种肽酶而言为至少3U/g(PepP)、5U/g(PepO)、20U/g (PepX)、17U/g(PepI)、20U/g(PepN)。
可以通过例如使用针对富含Pro的肽序列的适当抗体进行ELISA 来确定步骤7)中的肽酶活性。
在一个优选的配置中，该方法还包括以下步骤中的一个或多个步骤：
8)确定步骤6)中选择的菌株混合物在模拟胃肠条件下消化小麦面包(1-100gr的小麦面包)过程中麸质的水解，并且选择能够在6-24 小时期间在模拟肠消化180分钟后将麸质含量降解至小于20ppm和不存在麸质衍生的表位(12聚体肽、14聚体肽、20聚体肽和33聚体肽)的菌株；
9)使用来自CD患者的小肠组织外植体通过确定在胃肠条件下孵育6-48小时后的细胞因子白介素2(IL-2)、白介素10(IL-10)和干扰素γ(IFN-γ)的表达来确定步骤7)中选择的菌株混合物的免疫原性，并且选择免疫原性不超过阴性对照的菌株。
步骤1)和7)的胃条件可包括菌株在含有胃蛋白酶(0.5–6g/l) 的模拟胃液中在35℃至39℃的温度下在pH 1-4孵育30分钟至300 分钟的时间，并且步骤1)的肠条件包括菌株在含有胰液素(0.02– 0.6％w/v)和胆盐(0.05–0.6％)的模拟肠液中在35℃至39℃的温度下在pH 5.5–pH 8.5孵育30分钟至300分钟的时间。
可使用活细胞或其胞质提取物形式、密度为7.0至11.0log CFU/ml的菌株与具有适合于检测N型肽酶氨肽酶(PepN)；PepI、 PepO、脯氨酰内肽基肽酶(PEP)；PepX和PepQ肽水解酶的活性的氨基酸序列的肽底物，确定步骤4)中N型肽酶氨肽酶(PepN)； PepI、PepO、脯氨酰内肽基肽酶(PEP)；PepX和PepQ肽水解酶的活性。
可使用活细胞或其胞质提取物在35℃-39℃在缓冲培养基(pH 6.0–9.0)中1-12小时确定步骤6)中的肽酶活性，并且选择能够降解超过95％、优选超过98％的所有四种表位的菌株。
步骤8)中模拟胃肠条件可包括密度为7.0至11.0log CFU/ml的步骤7)中选择的菌株、它们的胞质和/或芽孢杆菌蛋白酶在含有胃蛋白酶(0.5–6g/l)的模拟胃液中在36.5℃至37℃的温度下在pH 2-4 孵育30分钟至300分钟的时间，和步骤7)中选择的菌株、它们的胞质和/或芽孢杆菌蛋白酶在含有胰液素(0.02–0.6％w/v)和胆盐(0.05 –0.6％)的模拟肠液中在36.5℃至37℃的温度下在pH 7.0–pH 8.5 孵育30分钟至48小时的时间。
在一个优选配置中，细菌菌株来源于以下来源中的一种或多种：土壤、谷物(小麦、黑麦、大麦)、谷物加工、酸面团、来自人、猪、狗、猫、大鼠或小鼠的粪便、来自人、猪、狗、猫、大鼠或小鼠的胃肠道标本。
在一个有利的配置中，细菌菌株选自以下属中的一种或多种：乳杆菌属、芽孢杆菌属、片球菌属和魏斯氏菌属。
根据本发明的方法产生益生菌菌株聚生体，其基于以下考虑提供用于消化麸质的技术方案：
■人消化过程中的麸质/麦醇溶蛋白/麦谷蛋白降解本身是无益的，因为不完全降解会导致有毒和/或免疫原性肽的形成
■对目前可用的引发麸质在体内降解的方法的安全性表示担忧，因为这些方法可能只是部分地这样做，从而可能诱发或加重麸质毒性
■任何引发麸质在体内降解的尝试都需要确保这种降解是完全的并导致安全的降解产物
■鉴于具有免疫原性潜力的麸质固有肽序列的多样性，需要组合来自不同微生物的肽水解酶以确保所有肽的完全降解
■这种组合最好由益生菌微生物聚生体提供，这些益生菌微生物在胃肠道的相关部位(即胃和十二指肠)具有代谢活性并相互协同作用，以促进将来自相关部位的麸质蛋白安全、快速和完全消化成无毒、无免疫原性小肽或氨基酸的食品基质
■我们认为，这种协同作用可以通过将耐酸和耐胆汁的细菌菌株与合适的蛋白质/肽底物特异性组合来实现，并发现来自特定生态位的某种乳杆菌属(Lactobacillussp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(包括它们的胞质提取物)的组合对此特别有用。
根据我们的方法选择的益生菌聚生体如何能够为有需要的人带来好处的方式如下：
(i)作为用于CD、WA和NCGS患者的治愈或补充疗法，安全清除有意或意外摄入的麸质。回到传统的含麸质饮食的可能性。
(ii)作为用于因摄入麸质而导致非特异性肠道或肠外症状的人的治愈或补充疗法，安全清除有意或意外摄入的麸质。回到传统的含麸质饮食的可能性。
(iii)作为坚持GFD的替代方案，为希望尽量减少麸质暴露的无症状的人提供解决方案。
工作实施例
方法步骤的说明
方法的概述如图6所示。
步骤1：搜集(compiling)细菌菌株文库
以下包含细菌菌株的文库可有资格作为本发明的出发点。例如，搜集了来自乳杆菌属(文库1)、芽孢杆菌属(文库2)、片球菌属(文库3)和魏斯氏菌属(文库4)的四种菌株文库。每个文库至少含有十种不同的菌株。菌株来源于以下来源：土壤、谷物(小麦、黑麦、大麦)、谷物加工、酸面团、来自人、猪、狗、猫、大鼠或小鼠的粪便、来自人、猪、狗、猫、大鼠或小鼠的胃肠道标本。菌株属于以下属：
文库1＝乳杆菌属
菌株可属于例如植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳杆菌属、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis(Fructilactobacillus sanfranciscensis))、短乳杆菌(Lactobacillus brevis(Levilactobacillus brevis))、干酪乳杆菌、玫瑰乳杆菌(Lactobacillus rossiae)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、约氏乳杆菌 (Lactobacillus johnsonii)、克菲里乳杆菌(Lactobacillus kefirii)、黏膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri(Limosilactobacillus reuteri))、鼠李糖乳杆菌、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)或唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。优选地，菌株属于植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、旧金山乳杆菌、短乳杆菌或干酪乳杆菌的种。
文库2＝芽孢杆菌属
菌株可属于例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)群、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、梭状芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)或巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)。优选地，菌株属于枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的种。
文库3＝片球菌属(Pediococcus sp.)
菌株可属于例如嗜酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、糊精片球菌(Pediococcus dextrinicus)、小片球菌(Pediococcus parvulus) 或戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。
文库4＝魏斯氏菌属(Weissella sp.)
菌株可属于例如融合魏斯氏菌(Weissella confusa)、食窦魏斯氏菌(Weissellacibaria)、耐卤魏斯氏菌(Weissella halotolerans)、坎氏魏斯氏菌(Weissellakandleri)或副肠系膜魏氏菌(Weissella paramesenteroides)。
步骤2：菌株对模拟胃和肠道条件的耐受性
如Fernández等人[19]所述制备和使用模拟胃液和肠液。在8000g 离心10分钟收获静止期生长的细胞，用生理溶液洗涤，并悬浮在50ml 含有NaCl(125mM/l)、KCl(7mM/l)、NaHCO3(45mM/l)和胃蛋白酶(3g/l)的模拟胃液中(细胞密度为10log CFU/ml)[20]。将最终的pH调节至2.0、3.0和8.0。除了低pH的作用外，pH 8.0的值用于研究模拟胃液成分的影响[19]。将悬浮液在厌氧条件和搅拌下在 37℃下孵育以模拟蠕动。在0、90和180分钟取此悬浮液的等分试样，并测定活菌数。在接种pH 2.0的模拟胃液之前，还通过将细胞悬浮在重组脱脂牛奶(RSM)(11％固体，w/v)中来确定胃消化的作用。添加 RSM后的最终pH约为3.0。对这种情况进行了测定，以模拟胃转运过程中食物基质的作用[20]。胃消化180分钟后，收获细胞并悬浮在模拟肠液中，模拟肠液含有0.1％(w/v)胰液素和0.15％(w/v)Oxgall 胆盐(pH 8.0。将悬浮液在搅拌下在37℃下孵育，并在0、90和180 分钟时取出等分试样[21]。
选择标准＝小于2log CFU损失。
步骤3：菌株对麸质的蛋白酶活性
通过离心(12,400×g，4℃ 10分钟)收获24小时大的细菌菌株细胞，用无菌0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗涤，重新悬浮在相同缓冲液中，吸光度620nm(A620)为2.5，这对应于细胞密度约为9.0 log CFU/ml，并用于酶测定。使用小麦粉蛋白作为底物测量蛋白酶(细胞包膜相关蛋白酶)活性。按照Weiss等人的方法从小麦粉中单独提取小麦粉蛋白[22]。含有在0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的4mg/ml 白蛋白/球蛋白、麦醇溶蛋白或麦谷蛋白和0.1ml细胞悬液(约9.0log CFU/ml)的测定混合物在搅拌条件(150rpm)下在37℃下孵育180分钟。在12.5％丙烯酰胺凝胶上进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并用B10生物安全考马斯蓝对凝胶进行染色。使用低范围SDS-PAGE分子量标准。通过QuantityOne软件包分析每种测定的三个凝胶的蛋白质条带强度。将麦醇溶蛋白(4mg/ml)悬浮在pH2.0的胃液中，并在搅拌条件下(150rpm)在37℃下孵育180 分钟。胃消化后，水解的麦醇溶蛋白以10,000rpm离心10分钟，然后将含有(经处理)或不含(对照)0.1ml细胞悬浮液(约9.0log CFU/ml)的肠液分别添加到上清液(含有可溶性肽)中和沉淀(其中包含不溶性肽和蛋白质)中。将测定混合物在搅拌条件(150rpm) 下在37℃下孵育180分钟。将一等分试样的肠悬浮液在搅拌条件(150 rpm)下在37℃下孵育30小时。
采用Bradford法测定蛋白质浓度[23]。通过邻苯二甲醛(OPA) 方法测定肽浓度(Church FC,Swaisgood HE,Porter DH,Catignani GL.1983.Spectrophotometric assayusing o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk andisolated milk proteins.J. Dairy Sci.66:1219–1227)。使用胰蛋白胨(0.25至1.5mg/ml)制备的标准曲线用作参考。蛋白胨的使用给出了类似的标准曲线。通过使用基于R5抗体的夹心和竞争ELISA(R5-ELISA)进行免疫学分析。根据Valdes等人[24]的R5-ELISA使用
Figure BDA0003706784020000121
Gliadin竞争检测试剂盒根据制造商(R-Biopharm AG，Germany)的说明进行。
选择标准：与其他菌株相比，麸质降解率非常高。
步骤4：菌株对合成底物的肽酶活性
使用来自指数生长期后期的每种菌株的培养物(约9.0log CFU/ml)测定胞质肽酶活性。将洗涤过的细胞沉淀的等分试样(0.3g [干重])重新悬浮在50mM Tris-HCl(pH 7.0)中，在30℃下孵育30分钟，并以13,000×g离心10分钟以去除与细胞表面松散地缔合的酶。通过在搅拌条件(约160rpm)下在37℃下将细菌悬浮液与溶菌酶在含有24％蔗糖的50mMTris-HCl(pH 7.5)缓冲液中孵育60分钟来制备胞质提取物。将去壁细菌细胞重新悬浮在等渗缓冲液中并以 16A/s声波处理40秒(Sony Prep型号150；Sanyo,United Kingdom)。通过冷冻干燥将胞质提取物浓缩至十分之一，重新悬浮在5mM Tris-HCl(pH 7.0)中，并在4℃下透析24小时。
使用Leu-对硝基苯胺(p-NA)、Pro-p-NA和Gly-Pro-p-NA底物分别测量乳杆菌的胞质提取物的N型一般氨肽酶(PepN)、脯氨酸亚氨肽酶(PepI)、X-脯氨酰二肽基氨肽酶(PepX)活性。测定混合物含有900μl溶于pH 7.0的0.05M磷酸钾缓冲液中的2.0mM底物和100μl胞质提取物。将混合物在37℃下孵育180分钟，并在410nm 处测量吸光度。将数据与使用对硝基苯胺建立的标准曲线进行比较。一个活性单位定义为在测定条件下释放1μmol对硝基苯胺1分钟所需的酶量。
选择标准＝至少一种酶具有与其他菌株相比的非常高的活性。
步骤6：菌株聚生体对富含Pro的合成麸质衍生表位的肽酶活性
使用各种菌株混合物(聚生体)测定它们体外降解导致麸质不耐受的免疫原性表位的能力。化学合成了对应于α9-麦醇溶蛋白的片段 57-68(Q-L-Q-P-F-P-Q-P-Q-L-P-Y)、A-麦醇溶蛋白的62-75 (P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-S-F-P)、γ-麦醇溶蛋白的134-153 (Q-Q-L-P-Q-P-Q-Q-P-Q-Q-S-F-P-Q-Q-Q-R-P-F)和α2-麦醇溶蛋白的 57-89(L-Q-L-Q-P-F-P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-L-P-Y -P-Q-P-Q-P-F)(33聚体)的免疫原性表位。使用先前选择的细菌菌株的细胞质提取物进行肽的水解。将在1ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5) 中含有100μl胞质提取物和2mM合成肽的混合物在37℃下同时搅拌(150rpm)下孵育180分钟。监测肽的水解，通过HPLC分析分别寻找释放的肽。与电喷雾电离(ESI)-离子阱质谱(MS)偶联的液相色谱用于完成分析。
选择标准＝降解所有四种表位。
步骤7：在模拟胃肠条件下通过菌株聚生体水解麸质
我们使用市售麦醇溶蛋白来测试水解麸质的能力，这与 Francavilla等人描述的程序有关[16]。将麦醇溶蛋白(4mg/ml)悬浮在含有NaCl(125mM/L)、KCl(7mM/L)、NaHCO3(45mM/L)和胃蛋白酶(3g/L)的模拟胃液中。用HCl将最终的pH调节至2.0。将悬浮液在厌氧条件和搅拌下在37℃下孵育以模拟蠕动。胃消化180 分钟后，水解麦醇溶蛋白以10,000rpm离心10分钟，将pH 8.0的含有0.1％(w/v)胰酶和0.15％(w/v)Oxgall胆盐(Sigma–AldrichCo.) 的模拟肠液分别添加到上清液(含有可溶性肽)中和沉淀(含有不溶性肽和蛋白质)中。将含有(经处理)或不含(对照)0.1ml悬浮液 (约9.0log CFU/ml)的模拟肠液在搅拌条件下(150rpm)在37℃下孵育180分钟。采用Bradford法测定蛋白质浓度[23]。通过邻苯二甲醛(OPA)方法测定肽浓度(Church FC,Swaisgood HE,Porter DH, CatignaniGL.1983.Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determinationof proteolysis in milk and isolated milk proteins.J.Dairy Sci.66:1219–1227)。使用胰蛋白胨 (0.25至1.5mg/ml)制备的标准曲线用作参考。蛋白胨的使用给出了类似的标准曲线。通过使用基于R5抗体的夹心和竞争ELISA (R5-ELISA)进行免疫学分析。R5-ELISA[24]使用
Figure BDA0003706784020000141
Gliadin竞争检测试剂盒根据制造商(R-BiopharmAG，Germany) 的说明进行。
选择标准：孵育过程中麸质的相关水解。
步骤9：使用来自CD患者的小肠组织外植体的菌株聚生体评估麸质水解的安全性
在GFD后从10个CD患者(年龄范围，19至30岁)获得十二指肠活检标本。所有CD患者均表达HLA-DQ2表型。根据European Society for Paediatric Gastroenterology,Hepatology,and Nutrition的标准(European Society of PaediatricGastroenterology and Nutrition. 1990.Revised criteria for diagnosis ofcoeliac disease.Report of working group of European Society of PaediatricGastroenterology and Nutrition.Arch Dis Child 65:909–911)诊断CD。切除后立即将所有活检标本置于冰冷培养基(RPMI 1640；Gibco-Invitrogen，UK) 中，并在30分钟内运送至实验室。使用最初由Browning和Trier[25] 描述的器官组织培养方法将十二指肠活检标本培养4小时。简而言之，活检标本的绒毛面朝上放在不锈钢网上，并放置在器官组织培养皿 (Falcon，USA)的中央孔上方。该孔含有补充有15％胎牛血清 (Gibco-Invitrogen)和1％青霉素-链霉素的RPMI。将培养皿置于厌氧罐中并在37℃下孵育。
每个CD患者的四个活检标本在四种条件下用培养基培养：(i) 用含有细菌菌株混合物和酶混合物(E1、E2、Veron PS、Veron HPP) 的面团消化48小时；(ii)用含有不同细菌菌株混合物和酶混合物(E1、 E2、Veron PS、Veron HPP)的面团消化48小时；(iii)用对照面团消化48小时(对照)；和(iv)用培养基(RPMI 1640+胃液和肠液，阴性对照)。
冲洗每个患者的活检标本，然后在-80℃下将其储存在RNA later 中以保存RNA。根据制造商的说明，使用RNeasy minikit(Qiagen GmbH)从组织中提取总RNA。通过测定260nm处的UV吸光度来估计mRNA的浓度。使用随机六聚体、TaqMan逆转录试剂和3.125 U/μlMultiScribe逆转录酶将总RNA的等分试样(500ng)逆转录至最终体积为50μl。cDNA样品储存在-20℃。
IFN-γ、IL-2和IL-10基因的RT-PCR：使用ABI Prism 7500HT 快速序列检测系统(Applied Biosystems)在96孔板中进行RT-PCR。使用机器软件进行数据收集和分析。购买用于靶基因(IFN-γ、IL-2 和IL-10)和内源对照(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH]的基因) 的PCR引物和荧光探针分别作为TaqMan基因表达测定和预开发的 TaqMan测定。这些测定以PCR引物和在探针的3'端带有非荧光猝灭剂的TaqMan Minor Groove Binder 6-羧基荧光素染料标记探针的20x 混合物形式提供。使用其中最终浓度为1x TaqMan基因表达测定混合物和1x TaqMan通用PCR预混液的第一链cDNA进行两步逆转录 PCR。最终反应体积为25μl。一式三份分析每个样品，并且所有实验重复两次。每个板都包括一个非模板对照(不含RNase的水)。使用以下热循环仪条件：50℃下2分钟(尿嘧啶DNA糖基化酶活化)， 95℃下10分钟，40个循环的95℃下15秒和60℃下1分钟。最初，对每个引物/探针组进行标准曲线和验证实验。使用IFN-γ、IL-2或 IL-10cDNA的六个连续稀释液(20至0.1ng/μl)作为每个引物/探针组的模板。通过将阈值循环(CT)值针对输入cDNA量的对数作图来生成标准曲线。CT值是第一次检测到高于基线水平的报告荧光增加的PCR循环。使用内源性参考基因(GAPDH基因)对靶基因的平均值进行标准化。使用健康的十二指肠活检标本来校准所有实验。根据制造商的建议，在96孔圆底板(Tema Ricerca，Milan，Italy)中通过ELISA定量分泌到上清液中的IFN-γ、IL-2和IL-10蛋白的水平。
选择标准＝消化物无免疫原性。
实施例1.耐受胃肠条件的益生菌微生物
如Fernández等人[19]所述使用模拟胃液和肠液。在8000g离心 10分钟收获静止期生长的细胞，用生理溶液洗涤，并悬浮在50ml含有NaCl(125mM/l)、KCl(7mM/l)、NaHCO3(45mM/l)和胃蛋白酶 (3g/l)的模拟胃液(Sigma-Aldrich CO.,St.Louis,MO,USA)中(细胞密度为10log CFU/ml)[20]。将最终的pH调节至2.0、3.0和8.0。除了低pH的作用外，pH 8.0的值用于研究模拟胃液成分的影响。将悬浮液在厌氧条件和搅拌下在37℃下孵育以模拟蠕动。在0、90和180 分钟取此悬浮液的等分试样，并测定活菌数。在接种pH 2.0的模拟胃液之前，还通过将细胞悬浮在重组脱脂牛奶(RSM)(11％固体，w/v) 中来确定胃消化的作用。添加RSM后的最终pH约为3.0。对这种情况进行了分析，以模拟胃转运过程中食物基质的作用[20]。胃消化180 分钟后，收获细胞并悬浮在模拟肠液中，模拟肠液含有0.1％(w/v)胰液素和0.15％(w/v)Oxgall胆盐(Sigma-Aldrich Co.)，pH 8.0。将悬浮液在搅拌下在37℃下孵育，并在0、90和180分钟时取出等分试样[21]。在<400个所测试的菌株中，有119个菌株显示出小于2log 初始1x1010 CFU/ml的降低，并被定义为耐受模拟胃肠条件。
实施例2.耐受胃肠条件的单一菌株的蛋白酶和肽酶活性
测试了显示出对模拟胃肠条件具有耐受性的所有119个菌株(乳杆菌属63个菌株；魏斯氏菌属3个菌株；片球菌属1个菌株；和芽孢杆菌属51个菌株)针对合成底物的肽酶和蛋白酶活性。使用来自指数生长期后期的每种菌株的培养物(约9.0log CFU/ml)测定肽酶活性。将洗涤过的细胞沉淀的等分试样(0.3g[干重])重新悬浮在50mM Tris-HCl(pH 7.0)中，在30℃下孵育30分钟，并以13,000×g离心10分钟以去除与细胞壁松散地缔合的酶。通过在搅拌条件(约160 rpm)下在37℃下将细菌悬浮液与溶菌酶在含有24％蔗糖的50mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中孵育60分钟来制备胞质提取物。将去壁细菌细胞重新悬浮在等渗缓冲液中并以16A/s声波处理40秒(Sony Prep型号150；Sanyo,United Kingdom)。通过冷冻干燥将提取物浓缩至十分之一，重新悬浮在5mM Tris-HCl(pH 7.0)中，并在4℃下透析24小时。使用Leu-对硝基苯胺(p-NA)、Pro-p-NA、Gly-Pro-p-NA、 Z-Gly-Gly-Leu-p-NA和Z-Gly-Pro-4-硝基苯胺底物(Sigma Chemical Co)分别测量乳杆菌的胞质提取物的N型一般氨肽酶(PepN)、脯氨酸亚氨肽酶(PepI)、X-脯氨酰二肽基氨肽酶(PepX)内肽酶(PepO) 和脯氨酰内肽酶(PepP)活性。测定混合物含有900μl溶于pH 7.0 的0.05M磷酸钾缓冲液中的2.0mM底物和100μl胞质提取物。将混合物在37℃下孵育180分钟，并在410nm处测量吸光度。将数据与使用对硝基苯胺设置的标准曲线进行比较。一个活性单位定义为在测定条件下释放1μmol对硝基苯胺1分钟所需的酶量。根据上述肽酶活性的主成分分析(PCA)数据，一些菌株与其他菌株明显分开(图1)。图2报告了表现出非常高的肽酶活性(至少对于一种肽酶活性)的菌株。PepN活性范围为0.0(U002-C04；U541-C05；U776-C02；DSM 33301；U021-C01；DSM32540；U567-C04)至31.400±0.09U(DSM 33362)(中值3.08)。没有进一步评估具有低肽酶活性的菌株(内部编号/或保藏于DSMZ：U002-C04；U541-C05；U776-C02；DSM 33301；U021-C01；DSM32540；U567-C04)。其他活性最高的菌株是DSM 33367,DSM 33374,DSM33370,DSM 33371,DSM 33377,DSM 33373, 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)DSM 33297,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DSM 33298,DSM 33376,DSM 33375,DSM 33363,地衣芽孢杆菌DSM 33354和巨大芽孢杆菌DSM 33356(图1、图2)。PepI的中值为1.66。活性最高的菌株(PepI活性>18U)是DSM 33375,DSM 33373。PepX活性范围为0.0至约24U。活性最高的菌株是DSM 33379, DSM 33371,DSM 33370,DSM 33369,DSM 33374,DSM 33373和DSM 33363(图1和图2)(中值1.81)。PepO的中值为0.54。活性最高的菌株(PepO活性>5U)是DSM 33353,DSM33355和DSM 33301。 PepP活性范围为0.0至6.23U(DSM 33368)(中值0.22)。其他活性最高的菌株(PepP活性>3U)是巨大芽孢杆菌DSM 33300,DSM 33378, DSM 33371,DSM 33377,DSM33367,DSM 33374,DSM 33366,DSM 33373和DSM 33364。
图1显示了基于119个芽孢杆菌属、乳杆菌属、片球菌属和魏斯氏菌属菌株的胞质提取物的N型一般氨肽酶(PepN)、脯氨酸亚氨肽酶(PepI)、X-脯氨酰二肽基氨肽酶(PepX)、内肽酶(PepO)和脯氨酰内肽酶(PepP)活性的主成分分析(PCA)后第一和第二主成分的分数(A)和负荷(B)。使用Leu-对硝基苯胺(p-NA)、Pro-p-NA、 Gly-Pro-p-NA、Z-Gly-Gly-Leu-p-NA和Z-Gly-Pro-4-硝基苯胺底物 (Sigma Chemical Co)分别测量PepN、PepI、PepX、PepP。以红色报告了显示出非常高的肽酶活性(至少针对一种肽酶)的菌株。
图2显示了选择的单一芽孢杆菌属(B.)、乳杆菌属(L.)和片球菌属(P.)菌株的肽酶活性(PepN、PepI、PepX、PepO和PepP)。一个活性单位(U)定义为在测定条件下每分钟释放1μmol对硝基苯胺所需的酶量。
实施例3.菌株混合物对免疫原性表位的肽酶活性
表现出非常高的肽酶活性(至少对于一种肽酶)的芽孢杆菌属、乳杆菌属和片球菌属菌株被评估为组合强烈和互补的酶活性的混合菌株。使用各种混合物来测定它们在体外降解导致麸质不耐受的免疫原性表位的能力。
使用先前选择的细菌菌株的胞质提取物的组合进行肽的水解。化学合成了对应于α9-麦醇溶蛋白的片段57-68 (Q-L-Q-P-F-P-Q-P-Q-L-P-Y)、A-麦醇溶蛋白的62-75 (P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-S-F-P)、γ-麦醇溶蛋白的134-153 (Q-Q-L-P-Q-P-Q-Q-P-Q-Q-S-F-P-Q-Q-Q-R-P-F)和α2-麦醇溶蛋白的57-89(L-Q-L-Q-P-F-P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-L-P-Y -P-Q-P-Q-P-F)(33聚体)的免疫原性表位，并以1mM的初始浓度使用。通过RP-HPLC监测水解。通过纳米-ESI串联质谱 (nano-ESI-MS/MS)分析来自RP-HPLC的单峰。显示合成免疫原性表位水解效果最好的菌株混合物是第3、4和5号(图3)，它们完全水解了所有有毒肽(90％水解或更多)。图3显示了菌株混合物对免疫原性表位的肽酶活性。
菌株混合物如下：
1.植物乳杆菌DSM 33362,DSM 33363,DSM 33364,DSM 33366；旧金山乳杆菌DSM33379；短小芽孢杆菌DSM 33297, DSM 33355,地衣芽孢杆菌DSM 33354,巨大芽孢杆菌DSM33300,枯草芽孢杆菌DSM 33353。
2.副干酪乳杆菌DSM 33375,DSM 33376；植物乳杆菌DSM 33369,DSM 33368；旧金山乳杆菌DSM 33378；地衣芽孢杆菌 DSM 33354,巨大芽孢杆菌DSM 33300,DSM 33356,短小芽孢杆菌DSM 33297,DSM 33301。
3.植物乳杆菌DSM 33370,DSM 33363,DSM 33364；副干酪乳杆菌DSM 33373,短乳杆菌DSM 33377；短小芽孢杆菌 DSM 33297,DSM 33355,地衣芽孢杆菌DSM 33354,巨大芽孢杆菌DSM 33300,枯草芽孢杆菌DSM 33353。
4.植物乳杆菌DSM 33362,DSM 33367,DSM 33368；副干酪乳杆菌DSM 33375；旧金山乳杆菌DSM 33379；短小芽孢杆菌DSM 33301,巨大芽孢杆菌DSM 33300,DSM 33356,和枯草芽孢杆菌DSM 33298,DSM 33353。
5.植物乳杆菌DSM 33366,DSM 33369,罗伊氏乳杆菌DSM 33374；副干酪乳杆菌DSM33376；戊糖片球菌DSM 33371,旧金山乳杆菌DSM 33378；地衣芽孢杆菌DSM 33354,短小芽孢杆菌DSM 33301,巨大芽孢杆菌DSM 33300,DSM 33356,枯草芽孢杆菌DSM 33298。
6.植物乳杆菌DSM 33370,DSM 33367,罗伊氏乳杆菌DSM 33374；短乳杆菌DSM33377；短小芽孢杆菌DSM 33301,巨大芽孢杆菌DSM 33300,DSM 33356,枯草芽孢杆菌DSM33298。
实施例4.不同聚生体在模拟胃肠条件下对麸质的降解
评估了模拟胃肠消化下的麸质降解。为了开发一种在体内完全降解麸质的可行技术解决方案，我们寻找了包含尽可能少菌株和尽可能多菌株的最小组合。
使用实施例3的混合物1-6作为出发点，制备了选自总共22个菌株(植物乳杆菌DSM33370,DSM 33362,DSM 33363,DSM 33364, DSM 33366,DSM 33368,DSM 33369和DSM33367；罗伊氏乳杆菌 DSM 33374；副干酪乳杆菌DSM 33376,副干酪乳杆菌DSM 33373, DSM33375；短乳杆菌DSM 33377,戊糖片球菌DSM 33371；短小芽孢杆菌DSM 33297,DSM 33355,DSM 33301,DSM 33355,地衣芽孢杆菌DSM 33354,巨大芽孢杆菌DSM 33300,DSM 33356和枯草芽孢杆菌DSM 33298,DSM 33353)的以下聚生体：
1.植物乳杆菌DSM 33370,DSM 33363和DSM 33364,副干酪乳杆菌DSM 33373短乳杆菌DSM 33377,短小芽孢杆菌DSM 33297,DSM 33355,DSM 33301；
2.植物乳杆菌DSM 33362和DSM 33367,DSM 33368,副干酪乳杆菌DSM 33375,枯草芽孢杆菌DSM 33298,地衣芽孢杆菌 DSM 33354和巨大芽孢杆菌DSM 33300；
3.植物乳杆菌DSM 33366,DSM 33369,罗伊氏乳杆菌DSM 33374,副干酪乳杆菌DSM33376,戊糖片球菌DSM 33371,巨大芽孢杆菌DSM 33356和枯草芽孢杆菌DSM 33353；
4.植物乳杆菌DSM 33363和DSM 33364,副干酪乳杆菌 DSM 33373,枯草芽孢杆菌DSM 33298和短小芽孢杆菌DSM 33301；
5.短乳杆菌DSM 33377,戊糖片球菌DSM 33371,植物乳杆菌DSM 33369,短小芽孢杆菌DSM 33297和巨大芽孢杆菌DSM 33300；
6.副干酪乳杆菌DSM 33375,植物乳杆菌DSM 33367,DSM 33368；短小芽孢杆菌DSM33355和地衣芽孢杆菌DSM 33354；
7.植物乳杆菌DSM 33370,DSM 33362和DSM 33366,罗伊氏乳杆菌DSM 33374,巨大芽孢杆菌DSM 33356和枯草芽孢杆菌DSM 33353.
8.植物乳杆菌DSM 33363,DSM 33364,副干酪乳杆菌DSM 33375,罗伊氏乳杆菌DSM33374,巨大芽孢杆菌DSM 33300, 短小芽孢杆菌DSM 33297；
9.副干酪乳杆菌DSM 33375,植物乳杆菌DSM 33367,罗伊氏乳杆菌DSM 33374,巨大芽孢杆菌DSM 33300,短小芽孢杆菌 DSM 33297,地衣芽孢杆菌DSM 33354；
10.植物乳杆菌DSM 33363,DSM 33364,DSM 33370,短乳杆菌DSM 33377,短小芽孢杆菌DSM 33297,巨大芽孢杆菌 DSM 33356；
11.植物乳杆菌DSM 33362,DSM 33367,DSM 33368,副干酪乳杆菌DSM 33375,巨大芽孢杆菌DSM 33300,枯草芽孢杆菌DSM 33353；
12.植物乳杆菌DSM 33366,DSM 33369,罗伊氏乳杆菌 DSM 33374,副干酪乳杆菌DSM 33376,戊糖片球菌DSM 33371, 短小芽孢杆菌DSM 33297,DSM 33355；
13.短乳杆菌DSM 33377,戊糖片球菌DSM 33371,旧金山乳杆菌DSM 33379,巨大芽孢杆菌DSM 33300,短小芽孢杆菌 DSM 33297；
14.植物乳杆菌DSM 33368,副干酪乳杆菌DSM 33375, 旧金山乳杆菌DSM 33378,巨大芽孢杆菌DSM 33300,短小芽孢杆菌DSM 33297,地衣芽孢杆菌DSM 33354；
15.植物乳杆菌DSM 33362,DSM 33366,DSM 33370,罗伊氏乳杆菌DSM 33374,旧金山乳杆菌DSM 33378,DSM 33379, 地衣芽孢杆菌DSM 33354,枯草芽孢杆菌DSM 33353；
16.植物乳杆菌DSM 33363,DSM 33364,副干酪乳杆菌 DSM 33373,罗伊氏乳杆菌DSM 33374,巨大芽孢杆菌DSM 33300,短小芽孢杆菌DSM 33297,DSM 33355。
将5克小麦面包(咀嚼30秒并收集在装有10mL0.05 M磷酸钠钾，pH 6.9的烧杯中)或相关面团悬浮在含有NaCl(125mM)、KCl(7 mM)、NaHCO3(45mM)和胃蛋白酶(3g/L)的模拟胃液 (Sigma-Aldrich CO.,St.Louis,MO,USA)中。将合并的选定活菌株(最终细胞密度约为9.0log CFU/mL)和裂解细菌(对应于9.0log细胞 /mL)加入悬浮液。计算出的反应混合物中麸质的初始量为7,000ppm。未添加细菌混合物的对照面团也进行模拟消化。在搅拌下将悬浮液在 37℃孵育以模拟蠕动。胃消化180分钟后，在悬浮液中加入模拟肠液，模拟肠液含有0.1％(w/v)胰液素和0.15％(w/v)Oxgall胆盐 (Sigma-Aldrich Co.)，pH 8.0。除了胰液素和胆盐外，液体还含有酶制剂E1、E2(各0.2g/kg)、Veron HPP(10g/100kg蛋白质)和VeronPS(25g/100kg蛋白质)酶。米曲霉(Aspergillus oryzae)(500,000 个基于酪氨酸的血红蛋白单位/g；酶1[E1])和黑曲霉(Aspergillus niger)(3,000个分光光度法酸性蛋白酶单位/g；酶2[E2])的蛋白酶 (通常用于烘焙应用)由BIO-CAT Inc.(Troy,VA)提供。Veron HPP 和Veron PS是来自枯草芽孢杆菌(AB Enzymes)的细菌蛋白酶。对照面团中未添加酶混合物(E1、E2、Veron PS、Veron HPP)。在搅拌条件下(约200rpm)在37℃下进行肠消化48小时。消化后，将样品置于冰上并根据AOAC(Association of Official Agricultural Chemists)International Official Method of Analysis(OMA)(方法编号AACCI 38-55.01)使基于用R5抗体夹心法和竞争性 ELISA(R5-ELISA)测定水解麸质的浓度[22]。根据制造商 (R-Biopharm AG,Germany)的说明，使用
Figure BDA0003706784020000221
Gliadin 竞争性检测试剂盒进行R5-ELISA分析。此外，ELISA Systems Gluten Residue Detection Kit(Windsor,Australia)用于残留麸质的定量。在孵育6、16、24、36和48小时后，通过HPLC分析监测消化样品中表位的存在。还使用与纳米电喷雾电离-离子阱串联质谱 (nano-ESI-MS/MS)偶联的液相色谱来确认麸质的水解和不存在有毒表位。
根据R5-ELISA(AOAC Official Method of Analysis，方法编号 AACCI 38-55.01)估计，消化6小时后，水解麸质的浓度在对照的810 ±0.02ppm和混合物3的310±0.06ppm的范围内(表2)。在消化 16和24小时后，大多数混合物的麸质含量≥100ppm。重要的是，用混合物4和16消化36小时后，麸质片段水平低于20ppm；而对于混合物4、5、6、8和16，在孵育结束(48小时)时完全不存在麸质片段。
关于残留麸质，大多数混合物(MC1-9、16)在消化24小时内将其降低到20ppm的临界阈值以下。此外，混合物4-9和16能够在16 小时内将残留麸质减少到≤20ppm。最重要的是，混合物4在消化16 小时后显示完全(图5)。MC8和MC16已经在消化的前6小时内导致麸质完全降解。总体而言，MC4、MC8和MC16能够最有效地去除完整以及片段化的麸质(表2)。
表2.通过特定的ELISA测试估计，模拟胃肠消化6、16、24、 36和48小时后残留麸质和谷醇溶蛋白的肽片段的浓度(ppm)。对照：没有细菌细胞和市售酶消化的面团；MC1-MC16：使用选定的乳酸杆菌(L.)和芽孢杆菌(B.)菌株的活细胞和裂解细胞以及E1、E2、 VeronPS、Veron HPP市售酶构建的微生物聚生体。数据是三个独立分析的平均值。a-j同一行不同上标字母的值差异显著(P<0.05)。
Figure BDA0003706784020000241
Figure BDA0003706784020000251
根据计算的7,000ppm反应混合物中的初始麸质量，关于残留麸质，其被所有混合物在6小时后减少了至少94％(与对照减少约84％相比)，在16小时后减少了至少98％，在48小时后减少了至少99.1％。关于麸质片段，其被所有混合物在6小时后减少了至少91％(与对照减少约88％相比)，在16小时后减少了至少95％，在48小时后减少了至少97％。
关于残留麸质，其能够被最有效的菌株MC4、MC8和MC16在 6小时后减少了至少97％，在16小时后减少了至少99.8％，在24小时后减少了最多到100％。关于麸质片段，其被最有效的菌株MC4、 MC8和MC16在6小时后减少了至少94％，在16小时后减少了至少 97％，在36小时后减少了至少98％，在48小时后减少了100％。图 4显示对照(图A)、混合物4(图B)和混合物7(图C)消化的小麦面包样品的RP-HPLC肽谱。M4和M7与E1、E2、Veron PS、VeronHPP市售酶组合。混合物4导致所有免疫原性肽完全(93％)水解，而混合物7仅实现部分(56％)水解。总之，与实施例3中公开的更广泛的混合物相比，我们发现了仅包含4-7个选定菌株的全功能混合物。
对于示例性微生物聚生体，我们在添加和不添加市售酶的情况下进行了实验。单独的聚生体导致残留麸质和水解麸质的强烈减少，并且通过添加酶进一步增强了这一点。
实施例5.通过使用来自乳糜泻患者的十二指肠外植体评估麸质消化物的免疫原性
通过检测来自乳糜泻(CD)患者的十二指肠活检标本中的细胞因子表达，离体估计消化物的免疫原性。所有CD患者均表达 HLA-DQ2表型。根据European Society forPaediatric Gastroenterology,Hepatology,and Nutrition的标准诊断CD[23]。切除后立即将所有活检标本置于冰冷培养基(RPMI 1640； Gibco-Invitrogen，UK)中，并在30分钟内运送至实验室。使用最初由Browning和Trier[24]描述的器官组织培养方法将十二指肠活检标本培养4小时。简而言之，活检标本的绒毛面朝上放在不锈钢网上，并放置在器官组织培养皿(Falcon，USA)的中央孔上方。该孔含有补充有15％胎牛血清(Gibco-Invitrogen)和1％青霉素-链霉素 (Gibco-Invitrogen,UK)的RPMI。将培养皿置于厌氧罐中并在37℃下孵育。
对照面团(阳性对照)(在没有添加细菌细胞和微生物酶的情况下消化的小麦面包)、混合物4(在添加植物乳杆菌DSM 33363和 DSM 33364、副干酪乳杆菌DSM 33373、枯草芽孢杆菌DSM 33298 和短小芽孢杆菌DSM 33301的活细胞和裂解细胞以及E1、E2、VeronPS、Veron HPP市售酶的情况下消化的小麦面包)和混合物7(在添加植物乳杆菌DSM 33362和DSM 33366、罗伊氏乳杆菌DSM 33374、植物乳杆菌DSM 33370、巨大芽孢杆菌DSM 33356和枯草芽孢杆菌 DSM 33353的活细胞和裂解细胞以及E1、E2、Veron PS、Veron HPP 市售酶的情况下消化的小麦面包)的消化样品进行麦醇溶蛋白和麦谷蛋白多肽提取并用于评估它们在来自CD患者的十二指肠活检标本中诱导细胞因子表达的能力。每个CD患者的四个活检标本在五种条件下用培养基培养：(i)用含有混合物4(在添加植物乳杆菌DSM 33363 和DSM33364、副干酪乳杆菌DSM 33373、枯草芽孢杆菌DSM 33298 和短小芽孢杆菌DSM 33301的活细胞和裂解细胞以及E1、E2、Veron PS、Veron HPP市售酶的情况下消化的小麦面包)的面团消化48小时；(ii)用含有混合物7(在添加植物乳杆菌DSM 33370、DSM 33362 和DSM 33366、罗伊氏乳杆菌DSM 33374、巨大芽孢杆菌DSM 33356 和枯草芽孢杆菌DSM 33353的活细胞和裂解细胞以及E1、E2、Veron PS、Veron HPP市售酶的情况下消化的小麦面包)的面团消化48小时；(iii)用含有混合物16(在添加植物乳杆菌DSM 33363和DSM 33364、罗伊氏乳杆菌DSM33374、巨大芽孢杆菌DSM 33330和短小芽孢杆菌DSM 33297和DSM 33355的活细胞和裂解细胞以及E1、E2、 Veron PS、Veron HPP市售酶的情况下消化的小麦面包)的面团消化48小时；(iv)用对照面团消化48小时(对照)；和(v)用培养基 (RPMI 1640+胃液和肠液，阴性对照)。冲洗每位患者的活检标本，并在-80℃下将其储存在RNAlater(Qiagen GmbH，Germany)中以保存RNA。根据制造商的说明，使用RNeasy minikit(Qiagen GmbH) 从组织中提取总RNA。通过测定260nm处的UV吸光度来估计mRNA 的浓度。使用随机六聚体、TaqMan逆转录试剂和3.125U/μl MultiScribe逆转录酶将总RNA的等分试样(500ng)逆转录至最终体积为50μl。cDNA样品储存在-20℃。使用ABI Prism 7500HT快速序列检测系统(Applied Biosystems)在96孔板中进行RT-PCR。使用机器软件进行数据收集和分析。购买用于靶基因(IFN-γ、IL-2和 IL-10)和内源对照(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH]的基因)的 PCR引物和荧光探针分别作为TaqMan基因表达测定和预开发的 TaqMan测定(Applied Biosystems)。这些测定以PCR引物和在探针的3'端带有非荧光猝灭剂的TaqMan Minor Groove Binder 6-羧基荧光素染料标记探针的20x混合物形式提供。使用第一链cDNA进行两步逆转录PCR，最终浓度为1x TaqMan基因表达测定混合物和1x TaqMan通用PCR预混液。最终反应体积为25μl。一式三份分析每个样品，并且所有实验重复两次。每个板都包括一个非模板对照(不含RNase的水)。使用以下热循环仪条件：50℃下2分钟(尿嘧啶 DNA糖基化酶活化)，95℃下10分钟，40个循环的95℃下15秒和60℃下1分钟。最初，对每个引物/探针组进行标准曲线和验证实验。使用IFN-γ、IL-2或IL-10cDNA的六个连续稀释液(20至0.1 ng/μl)作为每个引物/探针组的模板。通过将阈值循环(CT)值针对输入cDNA量的对数作图来生成标准曲线。CT值是第一次检测到高于基线水平的报告荧光增加的PCR循环。使用内源性参考基因 (GAPDH基因)对靶基因的平均值进行标准化。使用健康的十二指肠活检标本来校准所有实验。根据制造商的建议，在96孔圆底板 (Tema Ricerca，Milan，Italy)中通过ELISA定量分泌到上清液中的IFN-γ、IL-2和IL-10蛋白的水平。
正如预期的那样，用阳性对照孵育的十二指肠活检标本的白介素 2(IL-2)、白介素10(IL-10)(B)和干扰素γ(IFN-γ)mRNA的表达显著高于(P<0.05)阴性对照(RPMI 1640+胃液和肠液)(图5)。与阴性对照相比，用混合物4和16消化的样品显示出相同(P＞0.05)水平的IL-2、IL-10和IFN-γ。混合物7的特征在于IL-2的合成低于阳性对照，但与阴性对照以及混合物4和16相比，IL-2的合成更高。IL-10 和IFN-γ也发现了类似的趋势。如图4A-C所示，这些结果分别与混合物4和7对免疫原性肽的全部和部分清除很好地相关。
图5A显示了CD患者十二指肠活检标本中白介素2(IL-2)的浓度(ng/μl)。对照：在没有添加细菌细胞和微生物酶的情况下消化的小麦面包；RPMI+胃液和肠液：阴性对照；微生物聚生体4：在添加植物乳杆菌DSM 33363和DSM 33364、副干酪乳杆菌DSM 33373、枯草芽孢杆菌DSM 33298和短小芽孢杆菌DSM 33301的活细胞和裂解细胞以及E1、E2、Veron PS、Veron HPP市售酶的情况下消化的小麦面包；微生物聚生体7：在添加植物乳杆菌DSM33362、DSM 33366 和DSM 33370、罗伊氏乳杆菌DSM 33374、巨大芽孢杆菌DSM 33356 和枯草芽孢杆菌DSM 33353的活细胞和裂解细胞以及E1、E2、Veron PS、Veron HPP市售酶的情况下消化的小麦面包；和微生物聚生体16：在添加植物乳杆菌DSM 33363、DSM 33364、副干酪乳杆菌DSM 33373、罗伊氏乳杆菌DSM 33374、巨大芽孢杆菌DSM 33330、短小芽孢杆菌DSM33297、DSM 33355的活细胞和裂解细胞的情况下消化的小麦面包。CD1至CD10，来自乳糜泻患者的十二指肠活检标本。
图5B显示了CD患者十二指肠活检标本中白介素10(IL-10)的浓度(ng/μl)。样品和微生物聚生体等同于图5A。
图5C显示了CD患者十二指肠活检标本中干扰素γ(IFN-γ)的浓度(ng/μl)。样品和微生物聚生体等同于图5A。
本发明的发现提供的证据表明，所选择的益生菌菌株组合具有改善对麸质敏感的患者的麸质消化和在胃肠消化期间水解免疫原性肽的潜力，这总体上降低了对麸质敏感的患者的麸质毒性，尤其是对于CD 患者。
根据本发明的筛查方法鉴定了以下菌株混合物：
植物乳杆菌DSM 33370,DSM 33363,DSM 33364,DSM 33365；副干酪乳杆菌DSM33373；短乳杆菌DSM 33377；短小芽孢杆菌 DSM 33297,DSM 33355,地衣芽孢杆菌DSM33354,巨大芽孢杆菌DSM 33300和枯草芽孢杆菌DSM 33353,或
植物乳杆菌DSM 33362,DSM 33367,DSM 33368；副干酪乳杆菌 DSM 33375；旧金山乳杆菌DSM 33379；短小芽孢杆菌DSM 33301,巨大芽孢杆菌DSM 33300,DSM 33356,枯草芽孢杆菌 DSM 33298和DSM 33353,或
植物乳杆菌DSM 33366和DSM 33369,罗伊氏乳杆菌DSM 33374；副干酪乳杆菌DSM33376；戊糖片球菌DSM 33371；旧金山乳杆菌DSM 33378；地衣芽孢杆菌DSM 33354,短小芽孢杆菌DSM 33301,巨大芽孢杆菌DSM 33300,DSM 33356和枯草芽孢杆菌DSM 33298。
植物乳杆菌DSM 33370,DSM 33363和DSM 33364,副干酪乳杆菌DSM 33373短乳杆菌DSM 33377,短小芽孢杆菌DSM 33297, DSM 33355,DSM 33301；
植物乳杆菌DSM 33362和DSM 33367,DSM 33368,副干酪乳杆菌DSM 33375,枯草芽孢杆菌DSM 33298,地衣芽孢杆菌DSM 33354和巨大芽孢杆菌DSM 33300；
植物乳杆菌DSM 33366,DSM 33369,罗伊氏乳杆菌DSM 33374, 副干酪乳杆菌DSM33376,戊糖片球菌DSM 33371,巨大芽孢杆菌DSM 33356和枯草芽孢杆菌DSM 33353；
植物乳杆菌DSM 33363和DSM 33364,副干酪乳杆菌DSM 33373, 枯草芽孢杆菌DSM33298和短小芽孢杆菌DSM 33301；
短乳杆菌DSM 33377,戊糖片球菌DSM 33371,植物乳杆菌DSM 33369,短小芽孢杆菌DSM 33297和巨大芽孢杆菌DSM 33300；副干酪乳杆菌DSM 33375,植物乳杆菌DSM 33367,DSM 33368；短小芽孢杆菌DSM 33355和地衣芽孢杆菌DSM 33354；
植物乳杆菌DSM 33370,DSM 33362和DSM 33366,罗伊氏乳杆菌DSM 33374,巨大芽孢杆菌DSM 33356和枯草芽孢杆菌DSM 33353。
植物乳杆菌DSM 33363,DSM 33364,副干酪乳杆菌DSM 33375, 罗伊氏乳杆菌DSM33374,巨大芽孢杆菌DSM 33300,短小芽孢杆菌DSM 33297；
副干酪乳杆菌DSM 33375,植物乳杆菌DSM 33367,罗伊氏乳杆菌DSM 33374,巨大芽孢杆菌DSM 33300,短小芽孢杆菌DSM 33297,地衣芽孢杆菌DSM 33354；
植物乳杆菌DSM 33363,DSM 33364,DSM 33370,短乳杆菌DSM 33377,短小芽孢杆菌DSM 33297,巨大芽孢杆菌DSM 33356；
植物乳杆菌DSM 33362,DSM 33367,DSM 33368,副干酪乳杆菌 DSM 33375,巨大芽孢杆菌DSM 33300,枯草芽孢杆菌DSM 33353；
植物乳杆菌DSM 33366,DSM 33369,罗伊氏乳杆菌DSM 33374, 副干酪乳杆菌DSM33376,戊糖片球菌DSM 33371,短小芽孢杆菌DSM 33297,DSM 33355；
短乳杆菌DSM 33377,戊糖片球菌DSM 33371,旧金山乳杆菌 DSM 33379,巨大芽孢杆菌DSM 33300,短小芽孢杆菌DSM 33297；
植物乳杆菌DSM 33368,副干酪乳杆菌DSM 33375,旧金山乳杆菌DSM 33378,巨大芽孢杆菌DSM 33300,短小芽孢杆菌DSM 33297,地衣芽孢杆菌DSM 33354；
植物乳杆菌DSM 33362,DSM 33366,DSM 33370,罗伊氏乳杆菌 DSM 33374,旧金山乳杆菌DSM 33378,DSM 33379,地衣芽孢杆菌DSM 33354,枯草芽孢杆菌DSM 33353；
植物乳杆菌DSM 33363,DSM 33364,副干酪乳杆菌DSM 33373, 罗伊氏乳杆菌DSM33374,巨大芽孢杆菌DSM 33300,短小芽孢杆菌DSM 33297,DSM 33355。
优选组合是：
植物乳杆菌DSM 33363和DSM 33364,副干酪乳杆菌DSM 33373, 枯草芽孢杆菌DSM33298和短小芽孢杆菌DSM 33301,或
植物乳杆菌DSM 33363和DSM 33364,副干酪乳杆菌DSM 33375, 罗伊氏乳杆菌DSM33374,巨大芽孢杆菌DSM 33300和短小芽孢杆菌DSM 33297,或
植物乳杆菌DSM 33363和DSM 33364,副干酪乳杆菌DSM 33373, 罗伊氏乳杆菌DSM33374,巨大芽孢杆菌DSM 33300,枯草芽孢杆菌DSM 33297,短小芽孢杆菌DSM 33355。
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Claims (8)

1.鉴定促进麸质和麸质衍生的肽(表位)降解的益生菌菌株聚生体的方法，其至少包括以下步骤：
1)提供至少10种益生菌细菌菌株的文库；
2)将步骤1)的益生菌细菌菌株在模拟胃条件(pH 1-4)下孵育至少30分钟并在肠条件(pH 5.5-8.5)下孵育至少30分钟，并且在模拟胃条件和肠条件之后选择小于2log CFU损失的菌株；
3)确定步骤2)中选择的菌株对麸质的蛋白酶活性，并且选择能够将至少5000ppm的初始麸质水平降低10％至70％的菌株；
4)确定步骤3)中选择的菌株的N型肽酶氨肽酶(PepN)；PepI、PepO、脯氨酰内肽基肽酶(PEP)；PepX和PepQ肽水解酶的活性，并且选择具有对于这些肽酶中至少一种肽酶而言至少1U/g的肽酶活性的菌株；
5)将步骤4)中选择的至少2种菌株组合成具有对于肽酶PepN、PepI、PepO、PepX和PepQ中每一种而言至少1U/g的活性的益生菌菌株聚生体；
6)确定步骤5)中的具有针对以下肽的肽酶活性的聚生体的肽酶活性：12聚体肽QLQPFPQPQLPY(Seq-ID No 1)、14聚体肽PQPQLPYPQPQSFP(Seq-ID No 2)、20聚体肽QQLPQPQQPQQSFPQQQRPF(Seq-ID No 3)和33聚体肽LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(Seq-ID No 4)，并且选择具有将所有四种表位降解超过50％的肽酶活性的聚生体；
7)确定步骤6)中选择的聚生体在模拟胃条件(pH 1-4)下孵育至少30分钟并在肠条件(pH 5.5-8.5)下孵育至少30分钟水解具有至少5000ppm麸质的起始浓度的麸质的肽酶活性，并且选择将至少5000ppm的初始麸质水平降低至水解和残留麸质浓度小于200ppm的聚生体。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤中的一个或多个步骤：
8)确定步骤6)中选择的菌株混合物在模拟胃肠条件下消化小麦面包(1-100gr的小麦面包)过程中麸质的水解，并且选择能够在6-24小时期间在模拟肠消化180分钟后将麸质含量降解至小于20ppm和不存在麸质衍生的表位(12聚体肽、14聚体肽、20聚体肽和33聚体肽)的菌株；
9)使用来自CD患者的小肠组织外植体通过确定在胃肠条件下孵育6-48小时后的细胞因子白介素2(IL-2)、白介素10(IL-10)和干扰素γ(IFN-γ)的表达来确定步骤7)中选择的菌株混合物的免疫原性，并且选择免疫原性不超过阴性对照的菌株。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤1)和7)的胃条件包括菌株在含有胃蛋白酶(0.5–6g/l)的模拟胃液中在35℃至39℃的温度下在pH 1-4孵育30分钟至300分钟的时间，并且步骤1)的肠条件包括菌株在含有胰液素(0.02–0.6％w/v)和胆盐(0.05–0.6％)的模拟肠液中在35℃至39℃的温度下在pH 5.5–pH 8.5孵育30分钟至300分钟的时间。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用活细胞或其胞质提取物形式、密度为7.0至11.0log CFU/ml的菌株与具有适合于检测N型肽酶氨肽酶(PepN)；PepI、PepO、脯氨酰内肽基肽酶(PEP)；PepX和PepQ肽水解酶的活性的氨基酸序列的肽底物，确定步骤4)中N型肽酶氨肽酶(PepN)；PepI、PepO、脯氨酰内肽基肽酶(PEP)；PepX和PepQ肽水解酶的活性。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用活细胞或其胞质提取物在35℃-39℃在缓冲培养基(pH 6.0–9.0)中1-12小时确定步骤5)中的肽酶活性，并且选择能够降解超过95％、优选超过98％的所有四种表位的菌株。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤8)中模拟胃肠条件包括密度为7.0至11.0log CFU/ml的步骤6)中选择的菌株、它们的胞质和/或芽孢杆菌蛋白酶在含有胃蛋白酶(0.5–6g/l)的模拟胃液中在36.5℃至37℃的温度下在pH 2-4孵育30分钟至300分钟的时间，和步骤6)中选择的菌株、它们的胞质和/或芽孢杆菌蛋白酶在含有胰液素(0.02–0.6％w/v)和胆盐(0.05–0.6％)的模拟肠液中在36.5℃至37℃的温度下在pH 7.0–pH 8.5孵育30分钟至48小时的时间。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中细菌菌株来源于以下来源中的一种或多种：土壤、谷物(小麦、黑麦、大麦)、谷物加工、酸面团、来自人、猪、狗、猫、大鼠或小鼠的粪便、来自人、猪、狗、猫、大鼠或小鼠的胃肠道标本。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中细菌菌株选自以下属中的一种或多种：乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)。
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