CN114854718B - 扩展青霉脂肪酶及其突变体在催化Aldol反应中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明首次发现扩展青霉脂肪酶及其突变体(S132A、H241A、S132A/H241A)作为催化剂在催化无环酮和芳香醛的Aldol反应中的应用。该应用具有催化活性好、环保、经济等优点。本发明还提供了扩展青霉脂肪酶及其突变体S132A、H241A、S132A/H241A催化丙酮和2‑硝基苯甲醛的Aldol反应的优化工艺；该工艺产率高，不仅拓展了催化剂的应用范围，而且为有机合成反应提供了一种优良的催化剂，其在有机合成领域具有潜在、广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种扩展青霉脂肪酶及其突变体的应用，属于催化剂技术领域。
背景技术
在有机化合物的合成过程中，由于酶催化具有高选择性、反应条件温和及潜在的可再生性，因此成为一类高效、绿色的有机合成工具。此外，酶催化还具有多功能性，主要表现为一种天然酶分子可以催化除天然反应之外的其它化学反应，而这种反应可以与天然反应毫无关联。近年来，酶催化的多功能性受到极大关注，通过研究其非天然活性，不仅可以优化已知酶催化的方法，还可以提供一些全新的有机合成途径。
碳-碳键的形成是有机合成中最基本的方法，而Aldol反应是目前形成碳-碳键最有效的方法之一，因此，Aldol反应成为有机化学中建立碳-碳键的重要反应，是有机合成的关键步骤。Aldol反应是一种天然的合成方法，因为生物体代谢的某些物质是可通过Aldol反应来实现的，如部分碳水化合物是以Aldol反应为基础合成的。Aldol反应在化工行业和制药工业中得到了相对广泛的应用。现有技术中，除了醛缩酶自然催化的Aldol反应外，一些脂肪酶也曾被报道了具有催化Aldol反应的能力，2008年，余孝其课题组首次报道了猪胰脂肪酶(Porcine pancreatic lipase，PPL)在存在水的情况下催化丙酮和芳香醛之间的不对称Aldol反应，在随后的十年，更多的研究目的转为寻找反应的可持续发展条件。
深度共晶溶剂(DES)近年来被认为是一种很有前途的可生物降解和环境友好的溶剂。DES通常是在加热条件下通过简单地混合廉价的氢键受体和供体得到的均相溶液。DES的高沸点和极性可以增加许多不同的产品的溶解度，这使它们作为绿色溶剂的应用成为可能。在2016年和2019年，Gotor和Milker先后报道了猪胰脂肪酶在深度共晶溶剂中可高产率地生成羟醛产物------为碳-碳键形成反应的发展寻找了一种合适的温和的反应条件，并研究了其催化系统的循环利用。但是，迄今为止，除了猪胰脂肪酶之外，并没有更多的脂肪酶被发现具有催化无环酮和芳香醛的较高的活性。
发明内容
本发明的目的在于将扩展青霉脂肪酶及其突变体作为催化剂用于催化无环酮和芳香醛发生Aldol反应，且该催化工艺操作简单、产品收率高、纯度好、环境友好，在有机合成领域中具有潜在、广阔的应用前景。
本发明目的之一在将扩展青霉脂肪酶及其突变体作为催化剂用于催化无环酮和芳香醛发生Aldol反应。
进一步的，所述突变体为S132A、H241A或S132A/H241。
进一步的，所述芳香醛为硝基苯甲醛、氰基苯甲醛或氟苯甲醛中的一种。
进一步的，所述无环酮为丙酮。
本发明还提供一种2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)的制备方法，将扩展青霉脂肪酶及其突变体作为催化剂用于催化无环酮和芳香醛发生Aldol反应，进而制得2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)。
进一步的，所述2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将扩展青霉脂肪酶溶液及其突变体、芳香醛和丙酮的混合物置于反应溶剂中，振荡至反应结束后加入乙酸乙酯终止反应；
(2)将萃取后的乙酸乙酯相用无水Na2SO4干燥，并在减压下旋蒸得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到产物2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)。
进一步的，所述步骤(1)中芳香醛和丙酮的投料摩尔比为1:20～1:40。
进一步的，所述步骤(1)中反应溶剂为深度共晶溶剂氯化胆碱和甘油混合溶剂，氯化胆碱与甘油的体积比为1:1～1:3。
进一步的，所述步骤(1)反应体系中酶载量为0.4～1.6mg。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明首次发现扩展青霉脂肪酶及其突变体S132A、H241A、S132A/H241A能够作为丙酮和芳香醛的Aldol反应催化剂应用将扩展青霉脂肪酶及其突变体作为催化剂具有催化活性好、环保、经济等优点；
2、本发明将扩展青霉脂肪酶及其突变体S132A、H241A、S132A/H241A作为催化剂催化丙酮和芳香醛的Aldol反应，进而对Aldol反应进行工艺优化，提高该工艺的产率，不仅拓展催化剂的应用范围，而且为有机合成反应提供了一种优良的催化剂，其在有机合成领域具有潜在、广阔的应用前景。
附图说明
图1为不同酶在丙酮和2-硝基苯甲醛的Aldol反应中的催化效率；
图2为本发明实施例3中醛酮比对PEL-S132A/H241催化Aldol反应的影响；
图3为本发明实施例3中ChCl/Gly比例对PEL-S132A/H241A催化Aldol反应的影响；
图4为本发明实施例3中含水量对PEL-S132A/H241A催化Aldol反应的影响；
图5为本发明实施例3中酶载量对PEL-S132A/H241A催化Aldol反应的影响。
具体实施方式
下面结合较佳实施例对本发明做进一步的说明，在本发明中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值；对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；
惰性气氛均使用氩气作为保护气体；
1H谱在JEOL ECZ600S(600MHz)光谱仪上记录，使用CDCl3或DMSO-D6作为溶剂；
根据内部TMS(三甲基硅烷)参考数据，报告了前场化学位移的百万分之一；
耦合常数(J)以赫兹(Hz)表示，自旋重态用s(单线态)、d(双线态)、t(三重态)和m(多重态)表示；
柱层析采用厚壁玻璃柱和硅胶(300-400目)；采用市售0.25mm硅胶板进行薄层色谱(TLC)，手持紫外灯(254nm)下显示层析结果；
使用HPLC进行色谱分析和产物测定；质谱在ThermoFisher高效液相色谱-质谱联用仪上记录。
实施例1扩展青霉脂肪酶催化2-硝基苯甲醛和丙酮的Aldol反应
参见图1，选择2-硝基苯甲醛和丙酮作为反应底物，加入扩展青霉脂肪酶发酵液作为催化剂，发生Aldol反应；其中，扩展青霉脂肪酶发酵液(200μL，1.38mg/mL)，2-硝基苯甲醛(1.51mg，0.01M)，丙酮(15μL，0.2M)的混合物，在氯化胆碱/甘油的深度共晶溶剂(800μL)中，氯化胆碱/甘油的摩尔比为1:2，在35℃，220rpm条件下振荡12h至反应结束，加入乙酸乙酯终止反应；
将有机相用无水Na2SO4干燥，并在减压下旋蒸，使用乙酸乙酯和石油醚的混合液为洗脱液进行硅胶柱分离，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:3，纯化所得产物，通过HPLC、1HNMR和13C NMR确定产量并表征产品；
最终，扩展青霉脂肪酶作为催化剂的Aldol反应制得的产物2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)，产率为27％，与同等条件下PPL催化获得产物的产率相当。
Aldol产物2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)的结构表征如下：
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.96(d,J＝8.2Hz,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,1H),7.69–7.62(m,1H),7.47–7.39(m,1H),5.67(dd,J＝9.5,2.1Hz,1H),3.25–2.56(m,2H),2.23(s,3H).13C NMR(151MHz,Chloroform-d)δ209.02,138.44,133.95,128.29,124.57,65.74,51.11,30.57.C10H11NO4:MS(ESI)m/z＝208.07(M-H+)；
实施例2扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A催化2-硝基苯甲醛和丙酮的Aldol反应
参见图1，选择2-硝基苯甲醛和丙酮作为反应底物，加入扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A发酵液作为催化剂，发生Aldol反应；其中，扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A发酵液(200μL，1.38mg/mL)，2-硝基苯甲醛(1.51mg，0.01M)，丙酮(15μL，0.2M)的混合物，在氯化胆碱/甘油的深度共晶溶剂(800μL)中，氯化胆碱/甘油的摩尔比为1:2，在35℃，220rpm条件下振荡12h至反应结束，加入乙酸乙酯终止反应；
将有机相用无水Na2SO4干燥，并在减压下旋蒸，使用乙酸乙酯和石油醚的混合液为洗脱液进行硅胶柱分离，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:3，纯化所得产物；
最终，扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A作为催化剂的Aldol反应制得的产物2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)，产率为64％，是同等条件下PPL催化获得的产率的2倍。
除了实施例1和实施例2选用扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A作为催化剂外，图1还显示了以扩展青霉脂肪酶突变体S132A、扩展青霉脂肪酶突变体H241A等作为Aldol反应催化剂的催化效果，从图中也可以看出扩展青霉脂肪酶及其突变体对于Aldol反应的催化作用。
实施例3扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A催化2-硝基苯甲醛和丙酮Aldol反应性能研究
本实施例中对扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A催化2-硝基苯甲醛和丙酮的Aldol反应的主要影响因素(酮醛比、ChCl/Gly比例、含水量、酶载量)进行了系统研究；
选择2-硝基苯甲醛和丙酮作为反应底物，加入扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A发酵液作为催化剂，发生Aldol反应；其中，扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A发酵液(200μL，1.38mg/mL)，反应体系中酶载量为0.8mg，2-硝基苯甲醛(1.51mg，0.01M)，丙酮(15μL，0.2M)的混合物，在氯化胆碱/甘油的深度共晶溶剂(800μL)中，氯化胆碱/甘油的摩尔比为1:2，在35℃，220rpm条件下振荡12h至反应结束，加入乙酸乙酯终止反应，反应时间和反应结束后的处理与实施例1相同，结果如表1至表4所示；
表1醛酮比对本发明Aldol反应制备产物产率的影响
从表1和图2中可以看出，当2-硝基苯甲醛与丙酮的摩尔比从1：1到1：20变化时，产率从13％提高到65％。当2-硝基苯甲醛与丙酮的摩尔比从1：25增加到1：30后，产率变化不大，是因为当4-硝基苯甲醛与环己酮的摩尔比为1：20时，反应达到平衡。
表2氯化胆碱与甘油比例对本发明Aldol反应制备产物产率的影响
从表2和图3中可以看出，不同氯化胆碱和甘油比例对催化效率的影响并不显著，当ChCl/Gly比例为1:0.5时，获得产率最低，这可能是因为这个比例的溶液混合不均一，过量的氯化胆碱使溶液无法清澈透明，不符合催化的要求；当ChCl/Gly比例分别为1:1，1:1.5和1:2时，产率随着甘油比例的增加而增加，直到1:2时获得该优化条件下的最优产率，而当ChCl/Gly＝1：3时，产率相应下降，造成的原因可能是超过一定量的甘油会使溶液的粘度增加，限制底物和产物进出酶活性口袋的速度。
表3含水量对本发明Aldol反应制备产物产率的影响
从表3和图4中可以看出，当含水量处于20％时仅获得了20％的产率，而随着水的含量升高，反应的产率也得到了提升，直到含水量为50％时获得最高产率，而当体系中存在70％以上的水时，产率骤降；以上结果的产生原因可能有两点，一是低含水量时DEs体系粘度大，不利于底物溶解，也不利于底物和产物与酶活性部位的相互作用；二是，脂肪酶在水溶液中可以保持良好的状态，但是从有机合成的角度来说，过多的水不利于Aldol反应的进行。
表4酶载量对本发明Aldol反应制备产物产率的影响
从表4和图5中可以看出，低酶载量(0.2mg)时获得了中等产率(64％)，,当我们将酶载量提高0.8mg甚至更多，产率并不随着酶量的增加而产生较大的攀升(达到88％左右)；这个结果出乎意料，理论上更多的酶分子应该带来更大的催化效益，但事实上，在反应过程中加入较多的酶(1.6mg-4.0mg)后，可以明显观察到酶因聚集现象而使反应液变浑浊，而这种聚集行为可能是由于DEs的粘度，阻止了酶在反应体系中的有效分散，因此，将酶载量设为0.6～1.4mg便可获得较高的收率。
除了上述实施例1-3中记载的以丙酮和2-硝基苯甲醛为Aldol反应的底物外，扩展青霉脂肪酶及其突变体催化的底物并不限于丙酮和2-硝基苯甲醛，当把底物中的2-硝基苯甲醛分别更换为3-硝基苯甲醛、4-硝基苯甲醛、4-氰基苯甲醛和3-氟苯甲醛时，上述扩展青霉脂肪酶突变体也能催化它们和丙酮之间的Aldol反应。
在优化的反应条件下，以扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A作为催化剂，催化2-硝基苯甲醛和丙酮的Aldol反应，获得产物的产率达到了88％，实现了较为高效、绿色的转化。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.扩展青霉脂肪酶突变体作为催化剂在催化无环酮和芳香醛发生Aldol反应中的应用；所述突变体为S132A/H241A；所述芳香醛为2-硝基苯甲醛；所述无环酮为丙酮。
2.一种2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)的制备方法，其特征在于：将扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A作为催化剂用于催化丙酮和2-硝基苯甲醛发生Aldol反应，进而制得2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)。
3.如权利要求2所述的一种2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）将扩展青霉脂肪酶突变体S132A/H241A、2-硝基苯甲醛和丙酮的混合物置于反应溶剂中，振荡至反应结束后加入乙酸乙酯终止反应；
（2）将萃取后的乙酸乙酯相用无水Na2SO4干燥，并在减压下旋蒸得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到产物2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)。
4.如权利要求3所述的一种2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中2-硝基苯甲醛和丙酮的投料摩尔比为1:20~1:40。
5.如权利要求3所述的一种2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中反应溶剂为深度共晶溶剂氯化胆碱和甘油混合溶剂，氯化胆碱与甘油的体积比为1:1~1:3。
6.如权利要求3所述的一种2-丁酮,4-羟基-4-(2-硝基苯基)的制方法，其特征在于：所述步骤（1）反应体系中酶载量为0.4~1.6 mg。
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