CN114848580A - 一种微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料、其制备方法及其应用。本发明的纳米复合材料通过在聚合物纳米凝胶(PAD)上负载氯氧化铁纳米点(FeOCl NDs)、阿霉素(DOX)、牛血清蛋白(BSA),制备了PAD@FeOCl/DOX‑BSA纳米复合材料,简称PFDB。该材料可以在肿瘤微环境中过量谷胱甘肽(GSH)的作用下发生降解,释放出FeOCl NDs和DOX。FeOCl NDs可以催化H2O2产生强氧化性的羟基自由基(•OH)损伤肿瘤细胞;DOX可以实现肿瘤的化疗,协同增强治疗效果。本发明所提供的PFDB不仅能有效地抑制和清除肿瘤细胞,还具有良好的胶体稳定性和生物安全性。综上,本发明提供了一种肿瘤微环境响应型纳米复合材料,能够实现肿瘤细胞的高效清除。
Description
技术领域
本发明涉及纳米抗肿瘤技术领域,具体涉及一种微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料、其制备方法及其应用。
背景技术
癌症至今仍然是全世界最难攻克的疾病之一,2020年全球新诊断癌症1930万例,癌症死亡人数也突破了千万大关。随着现代医学的发展,科学家们已经开发出一系列的肿瘤治疗方法,包括手术切除、化学疗法、放射治疗等。由于肿瘤疾病的复杂性,这些常规治疗手段通常难以彻底清除肿瘤细胞,并且还有一定的副作用。因此,急需开发新型高效低毒的肿瘤治疗方法。
随着纳米生物医学的不断发展,新型的抗肿瘤纳米材料应运而生。活性氧物种(Reactive oxygen species,ROS)是一类具有强氧化性的含氧物种的统称,当ROS在生物体内浓度过高时,其强氧化特性会对细胞中的蛋白质、核酸、磷脂等重要生物活性分子造成损伤,引起细胞氧化应激,进而诱导细胞凋亡和坏死。因此,基于ROS的疾病治疗策略已经成为了一个新的研究热点(Nature Reviews Drug Discovery,2009,8(7):579-591)。化学动力学疗法(chemodynamic therapy,CDT)就是基于这种思路的新型肿瘤治疗策略,其原理是在肿瘤组织内部引入(类)Fenton催化剂,在肿瘤组织的弱酸性环境下,引发(类)Fenton反应,将H2O2催化为高毒性的·OH,造成蛋白质、DNA、脂质等生物分子的氧化损伤并最终导致肿瘤细胞凋亡(Nature Reviews Immunology,2013,13(5):349-361)。相对于传统抗肿瘤手段,CDT具有诸多优点,如能够通过产生ROS促进肿瘤细胞死亡,作用的区域具有局域性,肿瘤细胞不易产生耐药性。然而,铁氧化物、铁硫化物等传统Fenton催化剂的催化活性具有pH依赖性,最适pH为2-4(Journal of Hazardous Materials,2014,275:121-135),而肿瘤组织是一种弱酸性环境,pH为6.5左右,无法高效催化产生足够的ROS。因此开发新型高效的Fenton催化剂是极其重要的。
当前,肿瘤的化学疗法主要依赖于小分子化疗药物,在临床治疗中存在副作用大、体内循环时间短、易产生耐药性等诸多问题(Journal of Controlled Release,2016,244:108-121)。因此,如何提高化疗药物在肿瘤组织处的富集、减小副作用是亟待解决的问题。肿瘤组织的生长速度明显快于正常组织,肿瘤血管内皮细胞之间的致密性较差,存在缺陷、排列不紧密的现象,且肿瘤内部淋巴引流不足,血液流速较低,蛋白质、大分子、脂质体、胶束或纳米粒子一旦进入,便会被滞留在肿瘤部位,这种现象称为EPR(enhancedpermeability and retention)效应。研究表明,20-200nm的纳米材料易于在大多数缺乏功能性淋巴血管的肿瘤中滞留和富集(Biomaterials,2021,275:120910)。
综上,从CDT结合化疗的角度出发,需要设计出具有高催化活性的纳米材料用于CDT催化治疗的同时将其作为小分子化疗药物的载体并实现可控的药物释放,以增强药物的肿瘤富集能力、减小副作用以及提高治疗效果。
发明内容
本发明针对目前CDT疗法中Fenton催化剂活性低和化学疗法中药物富集效果差、副作用大、治疗效果不够好等问题,提供能够用于CDT-化疗联合治疗的微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料、其制备方法及其应用。
本发明选取具有GSH响应型的纳米凝胶PAD作为载体,同时负载高催化活性Fenton试剂FeOCl NDs、化疗药物DOX剂和稳定剂BSA,制备出PFDB纳米复合材料。PFDB中的载体PAD在肿瘤组织过表达的GSH作用下降解,释放出FeOCl NDs和DOX。FeOCl NDs可以催化H2O2产生强氧化性的·OH损伤肿瘤细胞,DOX可以实现肿瘤细胞的化疗,从而实现肿瘤的CDT-化疗联合治疗。FeOCl是一种二维层状晶体材料,在催化领域一直有着广泛的应用,文献Journalof the American Chemical Society,2013,135(43):16058-16061公开了FeOCl是一种高效的Fenton催化剂。FeOCl中具有独特的铁原子结构构型和可还原电子,催化产生·OH的速率比其他铁基催化剂高1-3个数量级,且pH响应范围为2-8,在弱酸性的肿瘤组织中能够产生足量的ROS。另外,PAD作为一种纳米凝胶,具有良好的稳定性、较高的载药效率、较长的药物释放周期,且内部交联的双硫键可以在肿瘤组织过表达的GSH作用下断裂,实现肿瘤组织响应性的药物释放,增强了化疗药物DOX的肿瘤富集能力,减小了其对正常细胞和组织的毒性。发明人发现,上述纳米复合材料实现CDT-化疗联合治疗,具有更好的抗肿瘤效果。
本发明的第一个目的是提供一种微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料。
本发明的第二个目的是提供上述微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料的制备方法。
本发明的第三个目的是提供微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料在制备治疗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案如下:
本发明的微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料PFDB,其主要包括如下组分:纳米凝胶PAD、FeOCl纳米材料、DOX和BSA,其中,所述的纳米凝胶PAD、FeOCl纳米材料、DOX和BSA的质量比为2-6:0.5-2:1-2:10-30。
进一步地,所述的纳米凝胶PAD、FeOCl纳米材料、DOX的质量比为4:1.45:1,BSA含量足以使PFDB在生理环境中稳定。
本发明中,
所述的PAD纳米材料为聚合物纳米凝胶,所述的纳米凝胶粒径为50~200nm。PAD纳米材料在本发明的纳米复合材料PFDB中主要起载体作用。
所述的FeOCl纳米材料为FeOCl NDs,所述的纳米点粒径为3~23nm。FeOCl纳米材料在本发明的纳米复合材料PFDB中主要起Fenton催化作用。
所述的DOX为一种典型的抗癌药物。DOX在本发明的纳米复合材料PFDB中主要起化疗药物作用。
所述的BSA为一种血清蛋白,分子量为66KDa。BSA在本发明的纳米复合材料PFDB中主要起稳定材料的作用。
本发明的微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料的制备方法如下,是由纳米凝胶PAD经过负载FeOCl NDs、DOX和BSA后制备而成的,具体包括如下步骤:
1)PAD@FeOCl/DOX(PFD)的制备:取纳米凝胶PAD的PBS分散液、FeOCl NDs的水分散液和DOX的水溶液混合,除氧后搅拌,此步骤可得到PAD@FeOCl/DOX(PFD)的分散液;
2)PAD@FeOCl/DOX-BSA(PFDB)的制备:取步骤1)的PFD水分散液和BSA水溶液进行混合并反应,此步骤可得到PAD@FeOCl/DOX-BSA纳米复合材料(PFDB)。
进一步地,所述步骤1)中,FeOCl NDs的制备方法如下:取FeOCl粉末0.1~1份、NaCl粉末1~10份,置于球磨机中以400~700rpm球磨12~48h;球磨结束后,将产物分散于水中,选择离心转速为2000~21000rpm、离心时间为1~4h的条件进行梯度离心纯化,最后用10~100KDa超滤管纯化FeOCl纳米材料,此步骤可得到FeOCl NDs。更优选地,所述梯度离心,转速和时间分别为(a)5000rpm,10min、(b)10000rpm,20min、(c)15000rpm,30min、(d)21000rpm,1h,其中每一步都取上清液,沉淀丢弃,重复离心纯化三次。
进一步地,所述步骤1)中,除氧方式为:通入N2 30min左右,除去反应体系中的溶解氧;搅拌方式为:室温下磁力搅拌12h。
进一步地,所述步骤1)中,纳米凝胶PAD的PBS分散液的浓度为10~1000μg/mL,所述FeOCl NDs的水分散液的浓度为5~500μg/mL,所述DOX水溶液的浓度为5~500μg/mL。更优选地,纳米凝胶PAD的PBS分散液的浓度为500μg/mL,所述FeOCl NDs的水分散液的浓度为250μg/mL,所述DOX水溶液的浓度为250μg/mL。
进一步地,所述步骤2)中,反应方式为:置于摇床上在25℃,220rpm的条件下反应过夜。
进一步地,所述步骤2)中,所述PFD水分散液的浓度为1~100μg/mL,所述BSA水溶液的浓度为10~1000μg/mL。更优选地,PFD水分散液的浓度为50μg/mL,所述BSA水溶液的浓度为500μg/mL。
在本发明的一个优选实施例中,所述的制备方法中,所述的纳米凝胶PAD、FeOCl纳米材料、DOX和BSA的投料质量比为2:1:1:20。
本发明还提供了微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料在制备治疗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤包括但不限于乳腺癌、结直肠癌、肝癌、胃癌和黑色素癌等。更优选地,所述的肿瘤为乳腺癌。
本发明相对于现有技术,具有如下技术效果:
1)肿瘤微环境响应的释放性能。纳米凝胶PAD可在肿瘤组织中高浓度GSH的条件下降解,而在正常组织环境中不会降解,实现FeOCl NDs和DOX的可控释放,对于肿瘤组织杀伤具有区域选择性,有助于减小清除肿瘤细胞过程中对正常细胞和组织的毒副作用。
2)降低肿瘤中GSH对ROS的清除作用。PAD中的聚合物链通过双硫键进行交联,能够在游离硫醇的作用下降解,并氧化硫醇,从而消耗肿瘤组织内的GSH,降低其对·OH的猝灭作用。
3)不易产生耐药性。本发明可以通过Fenton反应产生的·OH清除肿瘤细胞,肿瘤不易产生耐药性。
4)良好的生物相容性。本发明采用FeOCl NDs作为Fenton试剂,经酸降解后产生的Fe离子毒性较小,且容易从体内排出。
5)抗肿瘤效果更好。PFDB纳米复合材料具有化学动力治疗与化疗双重治疗模式,两种治疗模式协同作用下,可以在低剂量下展现出高效的肿瘤细胞清除效果。本发明通过具体实施方式的效果试验验证了上述技术效果。如图3(a)所示,PFB组、PDB组和PFDB组的4T1细胞在正常条件(Normal)下分别死亡21.7%、33.5%和47.0%,而在肿瘤微环境条件(TME)下的细胞死亡率分别升高至42.7%、63.9%和83.7%,表明PFDB具有TME响应性的药物释放和治疗功能,并且CDT与化疗联合治疗具有比单一治疗更好的肿瘤细胞杀伤效果。如图3(b)所示,PFB组、PDB组都出现红色荧光,表明PAD负载FeOCl NDs、DOX后均具有肿瘤细胞杀伤作用;PFDB组的红色荧光信号显著强于PFB组和PDB组,说明联合治疗效果要强于单一模式治疗;同时,TME条件下各组的红色荧光信号更强,表明PAD负载治疗试剂后能实现TME激活的治疗效果,同MTT法的结果类似。如图3(c)所示,在TME条件下,PAD组的4T1细胞约10%发生凋亡与坏死,PFB组、PDB组、PFDB组的4T1细胞中分别有30%、60%、95%以上发生凋亡和坏死。如图4(a)和(b)所示,PDB组的肿瘤相对于DOX组具有显著减小,而PFB组的肿瘤也显著小于PAD组,证实PAD负载Fenton催化剂和化疗药物均具有良好的抗肿瘤效果。此外,PFDB组小鼠的肿瘤比其它组更小,具有最好的抑瘤效果,证明基于PFDB的CDT-化疗联合治疗具有优异的肿瘤清除效果。
附图说明
图1是本发明实施例1中合成的FeOCl NDs、PAD和PFDB的TEM测试图;
图2是本发明实施例3验证PFDB纳米复合材料细胞毒性的效果图;
图3(a)、(b)、(c)分别是本发明实施例4验证PFDB纳米复合材料体外抗肿瘤性能的MTT、活/死细胞染色以及流式检测细胞凋亡坏死效果图;
图4(a)、(b)分别是是本发明实施例5验证PFDB纳米复合材料体内抗肿瘤性能的小鼠肿瘤体积变化效果图以及离体肿瘤照片;
其中,PFB为PAD@FeOCl-BSA纳米材料,PDB为PAD@DOX-BSA纳米材料,TME为模拟肿瘤微环境的PBS溶液,其中pH为6.5,H2O2和GSH的浓度分别为100μM和10mM;Normal为模拟正常组织环境的PBS溶液,其中pH为7.4。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案,下面结合附图1~4和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述,但本发明的保护范围并不局限于此。
以上所述显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例,本发明的技术特征并不局限于此,任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。
本发明中,
FeOCl的制备可以参考文献:Journal of Hazardous Materials,2019,
384:121494
纳米凝胶PAD的制备可以参考文献:Biomaterials Science,2018,7(1):247-261DOX可以购自阿拉丁试剂公司
BSA可以购自Sigma-Aldrich公司,分子量为66KDa
人正常肝细胞(L-O2)购自江苏凯基生物技术公司
达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基购自江苏凯基生物技术公司
小鼠乳腺癌细胞(4T1)购自江苏凯基生物技术公司
RPMI 1640培养基购自江苏凯基生物技术公司
实施例1PAD@FeOCl/DOX-BSA的制备
1.块体FeOCl的制备
称取6g FeCl3·6H2O粉末置于坩埚中,在微波炉(700W)中加热1h。冷却后取出烧结产物并充分研磨至粉末状,随后用丙酮分散,超声15min,在8000rpm下离心5min,除去上清中未反应的FeCl3,收集沉淀并用丙酮重新分散。在同样的条件下重复离心3次,直至上清无颜色,收集最终沉淀产物,置于真空干燥箱中过夜,得到块状红棕色材料,充分研磨得到FeOCl粉末。
2.FeOCl NDs的制备
称取0.1g FeOCl粉末和1.0g NaCl粉末,加入到干燥的球磨罐中。设置球磨机运行时间为12h,转速为650rpm,正反转间隔时间为60s。球磨结束后,每个球磨罐中加入8mL超纯水,以400rpm的转速继续运行10min,取出溶液,继续加入8mL超纯水重复上述步骤,直至溶液基本呈无色。将上述溶液超声10min,在2000rpm下离心5min,丢弃上清液,收集沉淀并用H2O重新分散,随后进行梯度离心,转速和时间分别为(a)5000rpm,10min、(b)10000rpm,20min、(c)15000rpm,30min、(d)21000rpm,1h,其中每一步都取上清液,沉淀丢弃,重复离心纯化三次。取最后一次离心产物的上清液,用30KDa的超滤管纯化,将截留的产物分散在超纯水中,得到FeOCl NDs分散液。
3.纳米凝胶PAD的制备
将144.1μL丙烯酸(AA,2.1mmol)、198.9mg 3-甲基丙烯酰胺基多巴胺(DMA,0.9mmol)、22.9μL双(2-甲基丙烯)乙氧基二硫(BMOD,0.09mmol)、7mg偶氮二异丁腈(AIBN,0.043)加入到装有40mL乙腈的两口圆底烧瓶中,放入磁子。烧瓶中先通N2 30min以除去体系的溶解氧。随后加热直至乙腈沸腾,冷凝管中有液体连续下滴。反应1h后停止加热,冷却后取出产物并在10000rpm下离心5min,丢弃上清液,并用乙腈重新将沉淀分散,再以同样的条件离心2次,保留最后的沉淀。将得到的最终产物放入真空干燥箱中过夜,得到纳米凝胶PAD。
4.PAD@FeOCl/DOX的制备
将PAD分散在PBS(10mM,pH 7.4)中制成PAD的PBS分散液,浓度为500μg/mL,FeOClNDs和DOX分散在H2O中,制成FeOCl NDs水分散液和DOX水溶液,浓度均为250μg/mL。各取2mL的PAD的PBS分散液、2mL的FeOCl NDs水分散液和2mL的DOX水溶液进行混合,加入到34mLH2O中,通入N2 30min左右,除去反应体系中的溶解氧。保持反应体系密闭,室温下磁力搅拌12h,取出反应液并超声30min,在10000rpm下离心15min,保留沉淀并用超纯水重新分散,同样条件下离心纯化3次。最后将产物重新分散在超纯水中,得到PAD@FeOCl/DOX(PFD)的分散液。FeOCl NDs负载量通过电感耦合等离子(ICP)光谱发生仪测定。DOX的负载量用紫外分光光度计测定上清液在476nm处的吸光度(OD476),并根据公式计算:y=0.01579x。其中,y代表样品的OD476,x代表测试样品中DOX浓度(单位:μg/mL)。
PAD@FeOCl和PAD@DOX的制备条件与PFD的类似。
5.PAD@FeOCl/DOX-BSA的制备
浓度分别为50μg/mL和500μg/mL的PFD水分散液和BSA水溶液,各取2mL加入到6mLH2O中,充分混合后置于摇床上在25℃,220rpm的条件下反应过夜。12h后取出反应混合物,并在12000rpm下离心15min,重复离心三次,收集沉淀并分散在H2O中,得到终产物PAD@FeOCl/DOX-BSA(PFDB)。
参考上述方法制备PAD@FeOCl-BSA(PFB)、PAD@DOX-BSA(PDB)作为对照。PAD@FeOCl-BSA(PFB)、PAD@DOX-BSA(PDB)的制备过程同上,其中PFB制备过程中不加入DOX,PDB制备过程中不加入FeOCl NDs。
如图1(a)所示,通过NaCl辅助球磨法制备的FeOCl NDs呈颗粒状,平均尺寸为10.84nm。图1(b)表明回流沉淀法制备的PAD为粒径均一的球形,平均尺寸为179.16nm。如图1(c)所示,将FeOCl NDs、DOX负载到PAD上并修饰BSA后,PFDB仍然呈球形,平均尺寸增大为200.73nm,并且可以看出表面负载有小尺寸的FeOCl NDs。
实施例2实施例1制备的PFDB纳米复合材料中FeOCl NDs和DOX负载量测定
PFDB经硝酸消解后用电感耦合等离子(ICP)光谱发生仪测定其中Fe含量。PFD制备过程中保留离心上清液转移至截留分子量为100KDa的超滤管中,在4000rpm的转速下离心10min,并测试滤液在476nm处的吸光度,根据根据公式计算:y=0.01579x。其中,y代表样品的OD476,x代表测试样品中DOX浓度(单位:μg/mL)。
测定结果显示,1mg PAD上分别负载0.3625mg FeOCl NDs和0.25mg DOX。
实施例3实施例1制备的PFDB纳米复合材料的生物安全性
向96孔板的每孔接种104个人正常肝细胞(L-O2),边缘孔使用无菌PBS填充,置于培养箱中避光培养。24h后吸出上层培养基,加入含有不同浓度PAD、PFB、PFDB、DOX的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基(PAD:0、20、40、80、160μg/mL;DOX:0、5、10、20、40μg/mL),每个浓度设置5个复孔。将细胞避光培养24h后,吸出上层培养基,用PBS洗涤两遍,向每个孔中加入50μL MTT溶液(5mg/mL),继续将细胞培养4h。吸出孔中的培养基,向每个孔中加入150μL二甲亚砜(DMSO),随后在摇床上低速振荡30min,使结晶物充分溶解,使用酶标仪检测490nm处的吸光度,并根据公式S=(C/C0)×100%计算细胞存活率。其中,S代表细胞活力,C代表测试样品的OD490值,C0代表空白对照的OD490值。
如图2所示,与L-O2细胞孵育24h后,PAD、PFB和PFDB在浓度为0~160μg/mL的范围内对L-O2的存活率影响都较小,细胞活性都维持在80%以上。相比以上对比组,在相同浓度的游离DOX存在下进行孵育后,L-O2的细胞活力明显下降。以上结果表明,负载DOX的PFDB对正常细胞的毒性小于游离DOX,具有更好的生物相容性。
实施例4实施例1制备的PFDB纳米复合材料的体外抗肿瘤性能
(a)MTT法检测PFDB对肿瘤细胞的毒性
向96孔板的每孔接种104个小鼠乳腺癌细胞(4T1),边缘孔使用无菌PBS缓冲液填充,置于培养箱中避光培养24h后吸出上层培养基,PBS洗三次。将细胞分为10组,每组5个平行。第1组细胞中加入150μL的RPMI 1640培养基(pH 7.4),第2组细胞中加入150μL含有10mMGSH的RPMI 1640培养基(pH6.5),第3组细胞中加入150μL含有40μg/mL PAD的RPMI 1640培养基(pH 7.4)分散液,第4组细胞中加入150μL含有10mM GSH和40μg/mL PAD的RPMI1640培养基(pH 6.5),第5组细胞中加入150μL含有40μg/mL PFB的RPMI1640培养基(pH 7.4),第6组细胞中加入150μL含有10mM GSH和40μg/mL PFB的RPMI 1640培养基(pH 6.5),第7组细胞中加入150μL含有40μg/mL PDB的RPMI 1640培养基(pH 7.4),第8组细胞中加入150μL含有10mM GSH和40μg/mL PDB的RPMI 1640培养基(pH 6.5),第9组细胞中加入150μL含有40μg/mL PFDB的RPMI 1640培养基(pH 7.4),第10组细胞中加入150μL含有10mM GSH和40μg/mLPFDB的RPMI 1640培养基(pH 6.5)。将以上十组细胞孵育12h后,向第2、4、6、8、10组细胞中再加入H2O2(终浓度100μM),混合均匀后继续将这十组细胞孵育12h。孵育结束后,吸出上层培养基,用PBS洗涤两遍。随后,向每个孔中加入50μL MTT溶液(5mg/mL),继续将细胞置于培养箱中培养4h,小心吸出孔中的培养基,向每个孔中加入150μL DMSO,随后在摇床上低速振荡30min,使结晶物充分溶解,使用酶标仪检测490nm处的吸光度,并根据公式S=(C/C0)×100%计算细胞存活率。其中,S代表细胞活力,C代表测试样品的OD490值,C0代表空白对照的OD490值。
如图3(a)所示,与4T1细胞孵育24h后,PAD组的细胞活力相比于PBS组基本没有降低,表明纳米凝胶PAD对肿瘤细胞无显著的杀伤能力;PFB组、PDB组和PFDB组的4T1细胞在正常条件(Normal)下分别死亡21.7%、33.5%和47%,而在肿瘤微环境条件(TME)下的细胞死亡率分别升高至42.7%、63.9%和83.7%,表明PFDB具有TME响应性的药物释放和治疗功能,并且CDT与化疗联合治疗具有比单一治疗更好的肿瘤细胞杀伤效果。
(b)活/死细胞染色法检测PFDB对肿瘤细胞的毒性
实验分组及处理方法同上,与上述不同的是将细胞培养在有10mm直径玻璃底的共聚焦皿中,材料孵育之后,向各个共聚焦皿中分别加入1mL含有2μM钙黄绿素(Calcein~AM,活细胞指示剂)和8μM碘化丙啶(PI,死细胞指示剂)的PBS缓冲液,室温孵育30min后,吸出染色工作液终止孵育,用纯PBS缓冲液洗三次细胞后,向各组细胞中分别加入1mL RPMI 1640培养基,将细胞置于Olympus FV1000激光共聚焦显微镜下进行荧光成像。使用488nm的激光激发Calcein-AM的绿色荧光,接收波段为500-560nm;使用515nm的激光器激发PI的红色荧光,接收波段为580-640nm。
如图3(b)所示,PAD组的4T1细胞具有显著的绿色荧光,而没有显著的红色荧光表明细胞仍保持良好的活性;PFB组、PDB组都出现红色荧光,表明PAD负载FeOCl NDs、DOX后均具有肿瘤细胞杀伤作用;PFDB组的红色荧光信号显著强于PFB组和PDB组,说明联合治疗效果要强于单一模式治疗;同时,TME条件下各组的红色荧光信号更强,表明PAD负载治疗试剂后能实现TME激活的治疗效果,同MTT法的结果类似。
(c)流式细胞检测PFDB对肿瘤细胞的杀伤
细胞凋亡坏死实验分组及处理方法同上,与上述不同的是将4T1细胞培养在六孔板中,加入材料并孵育之后,用不含EDTA的胰蛋白酶将肿瘤细胞全部消化下来收集在离心管里。分别用5μL Annexin V-FITC试剂和5μL PI试剂在室温下暗场染色,15min后用流式细胞仪检测。
如图3(c)所示,在TME条件下,PAD组的4T1细胞约10%发生凋亡与坏死,PFB组、PDB组、PFDB组的4T1细胞中分别有30%、60%、95%以上发生凋亡和坏死,证明基于PFDB的CDT-化疗联合治疗具有更好的抗肿瘤效果;同时,TME条件下各组细胞的凋亡与死亡比例也显著高于Normal条件下各组细胞,表明PFDB能够有效实现TME响应的药物释放与治疗。
实施例5实施例1制备的PFDB纳米复合材料的体内抗肿瘤性能
将36只4T1肿瘤尺寸达到80mm3的6~8周龄的雌性Balb/c小白鼠随机分为6组:1.PBS;2.PAD;3.DOX;4.PFB;5.PDB;6.PFDB,每组6只。第1组小鼠尾静脉注射100μL无菌PBS缓冲液,第2组小鼠尾静脉注射20mg/kg的PAD的无菌PBS分散液(4mg/mL,100μL),第3组小鼠尾静脉注射5mg/kg的DOX的无菌PBS分散液(1mg/mL,100μL),第4组小鼠尾静脉注射20mg/kg的PFB的无菌PBS分散液(4mg/mL,100μL),第5组小鼠尾静脉注射20mg/kg的PDB的无菌PBS分散液(4mg/mL,100μL),第6组小鼠尾静脉注射20mg/kg的PFDB的无菌PBS分散液(4mg/mL,100μL)。之后每隔一天使用游标卡尺测定肿瘤尺寸,计算肿瘤的体积(V=长*宽/2),并计算相对肿瘤体积(V/V0)。在第16天将小鼠处死,取出肿瘤组织并进行拍照。
如图4(a)和(b)所示,PAD组的小鼠肿瘤体积和体重与PBS组相比没有明显差异,PDB组的肿瘤相对于DOX组具有显著减小,而PFB组的肿瘤也显著小于PAD组,证实PAD负载Fenton催化剂和化疗药物均具有良好的抗肿瘤效果。此外,PFDB组小鼠的肿瘤比其它组更小,具有最好的抑瘤效果,证明基于PFDB的CDT-化疗联合治疗具有优异的肿瘤清除效果。
以上仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换,或直接或间接运用在其它相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料,其特征在于,其主要包括如下组分:纳米凝胶PAD、FeOCl纳米材料、DOX和BSA,其中,纳米凝胶PAD、FeOCl纳米材料、DOX和BSA的质量比为2-6:0.5-2:1-2:10-30。
2.根据权利要求1所述的微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料,其特征在于,所述的纳米凝胶PAD、FeOCl纳米材料、DOX的质量比为4:1.45:1,BSA含量足以使PFDB在生理环境中稳定。
3.根据权利要求1所述的微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料,其特征在于,所述的PAD纳米材料粒径为50~200 nm。
4.根据权利要求1所述的微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料,其特征在于,所述的FeOCl纳米材料为FeOCl NDs,所述的纳米点粒径为3~23 nm。
5.如权利要求1-4任意一项所述的微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料的制备方法,其特征在于,由纳米凝胶PAD经过负载FeOCl NDs、DOX和BSA后制备而成的,具体包括如下步骤:
1)PAD@FeOCl/DOX的制备:取纳米凝胶PAD的PBS分散液、FeOCl NDs的水分散液和DOX的水溶液混合,除氧后搅拌,此步骤可得到PAD@FeOCl/DOX的分散液;
2)PAD@FeOCl/DOX-BSA的制备:取步骤1)的PAD@FeOCl/DOX的分散液和BSA水溶液进行混合并反应,此步骤可得到PAD@FeOCl/DOX-BSA纳米复合材料。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中,FeOCl NDs的制备方法如下:取FeOCl粉末0.1~1份、NaCl粉末1~10份,置于球磨机中以400~700 rpm球磨12~48 h;球磨结束后,将产物分散于水中,选择离心转速为2000~21000 rpm、离心时间为1~4 h的条件进行梯度离心纯化,最后用10~100 KDa超滤管纯化FeOCl纳米材料,此步骤可得到FeOClNDs。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述梯度离心,转速和时间分别为(a)5000 rpm, 10 min、(b)10000 rpm, 20 min、(c)15000 rpm, 30 min、(d)21000 rpm, 1 h,其中每一步都取上清液,沉淀丢弃,重复离心纯化三次。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,
所述步骤1)中,除氧方式为:通入N2 30 min,除去反应体系中的溶解氧;搅拌方式为:室温下磁力搅拌12 h;
所述步骤2)中,反应方式为:置于摇床上在25℃,220 rpm的条件下反应过夜。
9.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,
所述步骤1)中,纳米凝胶PAD的PBS分散液的浓度为10~1000 μg/mL,所述FeOCl NDs的水分散液的浓度为5~500 μg/mL,所述DOX水溶液的浓度为5~500 μg/mL;
所述步骤2)中,所述PFD水分散液的浓度为1~100 μg/mL,所述BSA水溶液的浓度为10~1000 μg/mL。
10.如权利要求1-4任意一项所述的微环境响应型高效清除肿瘤细胞的纳米复合材料在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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