CN114836504A - 一种利用蛋壳膜制备多肽的方法及其制备得到的多肽和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用蛋壳膜制备多肽的方法及其制备得到的多肽和应用，包括如下步骤S1、蒸汽爆破处理：将蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力1.0～1.4MPa下保压处理1～5min，然后瞬间泄压，收集汽爆样品；S2、蛋白酶酶解处理：将经汽爆处理后的蛋壳膜以料液比1：(10～30)加入到pH为7～10的氢氧化钠水溶液中，然后按照加酶量2000～14000U/g加入碱性蛋白酶，在35～65℃下酶解2～14h，于90～100℃下灭酶5～15min，将酶解液过滤，取滤液离心，取上清液冷冻干燥得到多肽。基于本发明的方法，制备效率高且制备得到的多肽抗氧化活性高。
Description
技术领域
本发明属于蛋副产品加工领域，具体涉及一种利用蛋壳膜制备多肽的方法及其制备得到的多肽和应用。
背景技术
我国是世界上养禽最多的国家，随着禽蛋生产与消费的日益增加，鸡蛋壳也随之大量产生并被丢弃，这不仅对环境造成了严重的污染，也是资源上的极度浪费。蛋壳膜是位于鸡蛋壳内表面的一层薄膜，厚度约为100μm，主要由角蛋白、唾液蛋白、骨桥蛋白和胶原蛋白(包括I型，V型和X型)等蛋白质构成等，还含有透明质酸、硫酸软骨素等生物活性物质，可被广泛应用于医药和化妆品行业。然而蛋壳膜由两层致密的蛋白纤维网组成，因此蛋壳膜结构稳定且不溶于水，从而限制了它的开发利用。
抗氧化肽类是指具有一定抗氧化活性的多肽物质，分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，一般分子量小于6000道尔顿。抗氧化肽能有效清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生，减轻机体所受损伤，从而避免了因氧化损伤引起的人类疾病如癌症、衰老、慢性损伤性肺疾病和动脉硬化等症的发生。目前关于蛋壳膜蛋白及多肽的研究大多是通过酶解制备蛋壳膜酶解物，然后进行抗氧化活性研究，酶法水解蛋壳膜反应条件温和，理化性质稳定，且无环境污染，对人体无毒害作用，是目前较为常用的一种方法，但酶解法耗时长，效率低。
发明内容
本发明解决的技术问题为：提供一种利用蛋壳膜制备多肽的方法及其制备得到的多肽和应用，制备效率高且制备得到的多肽抗氧化活性高。
本发明提供的具体解决方案如下：
本发明提供了一种利用蛋壳膜制备多肽的方法，包括如下步骤：
S01、蒸汽爆破处理：将蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力1.0～1.4MPa下保压处理1～5min，然后瞬间泄压，收集汽爆样品；
S02、蛋白酶酶解处理：将经汽爆处理后的蛋壳膜以料液比1：(10～30)加入到pH为7～10的氢氧化钠水溶液中，然后按照加酶量2000～14000U/g加入碱性蛋白酶，在35～65℃下酶解2～14h，于90～100℃下灭酶5～15min，将酶解液过滤，取滤液离心，取上清液冷冻干燥得到多肽。
在上述方案的基础上，本发明还可以进行如下改进：
进一步，所述离心过程的转速为6000～10000rpm，离心时间为5～15min。
进一步，所述蒸汽爆破的压力为1.2～1.4MPa，保压时间为3min。
进一步，所述氢氧化钠水溶液的pH值为8～9，所述加酶量为4000～8000U/g，所述酶解温度为55℃。
本发明还提供了一种多肽，采用如上所述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种面膜，包括如下质量百分比的各组分：泊洛沙姆407 7～9％、聚乙烯醇7～9％、甘油6～12％、多肽0.1～0.4％、水70％～79％，多肽采用如权利要求1-4任一项所述的利用蛋壳膜制备多肽的方法制备得到。
进一步，还包括协同抗氧化剂没食子酸，所述多肽与所述没食子酸的质量比为(1～4)：(0.02～0.08)。
进一步，所述聚乙烯醇和所述泊洛沙姆407的质量百分比为(1～1.5)：(1～1.5)。
本发明还提供了如上所述的面膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S11、按照所述质量百分比准备各组分；
S12、取所述泊洛沙姆407和部分水配置泊洛沙姆407水溶液，取所述聚乙烯醇和余量的水配置聚乙烯醇溶液，将泊洛沙姆407水溶液和聚乙烯醇溶液在1～6℃下混合均匀，然后加入所述甘油混合均匀，再加入所述多肽混合均匀得到所述面膜。
进一步，所述泊洛沙姆407水溶液制备过程如下：将泊洛沙姆407与所述部分水混合均匀后，于1～6℃下放置过夜使其充分溶胀。
进一步，所述聚乙烯醇溶液的制备过程如下：将聚乙烯醇与所述余量水混合后，于70～90℃下搅拌1～3h，然后冷却至室温。
基于本发明的技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明将绿色环保的蛋壳膜预处理方式-蒸汽爆破，避免了化学试剂的添加，对人体和环境均无不良影响，将其与传统酶解结合，制备得到了高抗氧化活性的多肽，同时，蒸汽爆破技术处理时间短、效率高且无需添加任何化学物质，适用于工业化生产，改善了传统酶解法酶解蛋壳膜耗时长、酶解效率低的问题，有利于进行工业化生产。
(2)本发明充分利用了壳膜多肽优良的抗氧化活性，实现了“变废为宝”，所制备的壳膜多肽分子量小、抗氧化活性高，易于皮肤吸收，可用于制备面膜且该款壳膜多肽面膜生物相容性良好，安全无毒害。
(3)本发明发现聚乙烯醇的加入能够增加本发明中含泊洛沙姆407体系胶凝时间，增加成膜时间，使含泊洛沙姆407体系满足面膜成膜以及使用要求，本发明结合了聚乙烯醇的成膜性能及泊洛沙姆407的温敏性，制备得到了一款温敏型可撕拉面膜，其成膜效果良好，成膜时间在15-20min，可满足实际需要，无需借助乙醇等易挥发性溶剂，温和无刺激，且成膜完整易剥离，免于清洗，使用方便。
(4)本发明发现没食子酸与多肽具有良好的协同抗氧化作用，对细胞内的活性氧协同去除效果极佳。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为不同汽爆压力下壳膜溶解率和抗氧化活性。
图2为不同汽爆条件处理后壳膜的微观结构：(a)原始壳膜；(b)0.4MPa下；(c)1.2MPa下；(d)1.8MPa下。
图3为不同处理条件下壳膜多肽的电泳图：(a)标准蛋白样品；(b)对比例1制备得到的壳膜多肽产物；(c)0.4MPa下制备得到的壳膜多肽产物；(d)1.2MPa下制备得到的壳膜多肽产物；(e)1.8MPa下制备得到的壳膜多肽产物。
图4为甘油添加量对面膜保湿及透气性能的影响。
图5为甘油添加量对面膜拉伸性能的影响。
图6为面膜随温度变化的弹性模量G’和粘性模量G”变化图。
图7为不同壳膜多肽添加量对L929细胞活力的影响。
图8面膜中没食子酸添加量对细胞存活率的影响。
图9不同面膜下细胞内ROS相对水平。
图10为苹果表观色度图，(A)苹果的新鲜切面；(B)对照组(右)和面膜组(左)。
图11受试者使用前后皮肤参数图，(A)涂抹前，(B)涂抹后。
图12受试者前臂内侧皮肤上面膜的成膜过程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
如无特别说明，本发明所用试剂和材料均市购得到。
具体的，实施例中所用的MEM培养基(PM150410)购买于武汉普诺赛生命科技有限公司；完全培养基为购买于武汉普诺赛生命科技有限公司的细胞专用培养基CM-0137；Hank’s溶液(SH30030.02)购买于美国HyClone公司；SDS-PAGE试剂盒(P1200)购买于北京索莱宝科技有限公司；活性氧检测试剂盒(S0033S)购买于碧云天生物技术有限公司；CCK-8试剂盒(C0037)购买于碧云天生物技术有限公司。
基于本发明的利用蛋壳膜制备多肽的方法，包括如下步骤：S01、蒸汽爆破处理：将蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力1.0～1.4MPa下保压处理1～5min，然后瞬间泄压，收集汽爆样品；S02、蛋白酶酶解处理：将经汽爆处理后的蛋壳膜以料液比1：(10～30)加入到pH为7～10的氢氧化钠水溶液中，然后按照加酶量2000～14000U/g加入碱性蛋白酶，在35～65℃下酶解2～14h，于90～100℃下灭酶5～15min，将酶解液过滤，取滤液离心，取上清液冷冻干燥得到多肽。
蒸汽爆破技术的原理是在高压容器内将高压蒸汽压入物料内部间隙，保压后瞬间泄压，使得容器内的蒸汽通过膨胀对外做功，从而产生冲击波对物料进行机械剪切，本发明采用绿色环保的蛋壳膜预处理方式-蒸汽爆破，避免了化学试剂的添加，对人体和环境均无不良影响，将其与传统酶解结合，最终制备得到了高抗氧化活性的多肽，同时改善了传统酶解法酶解蛋壳膜耗时长、酶解效率低的问题，有利于抗氧化活性多肽的工业化生产以及壳膜的有效利用。
基于本发明的实施例的利用蛋壳膜制备多肽的方法，所述离心过程的转速为6000～10000rpm。
基于本发明的实施例的利用蛋壳膜制备多肽的方法，所述蒸汽爆破的压力为1.2～1.4MPa，保压时间为3min。
基于本发明的实施例的利用蛋壳膜制备多肽的方法，所述氢氧化钠水溶液的pH值为8～9，所述加酶量为4000～8000U/g，所述酶解温度为55℃。
本发明还提供了一种多肽，采用如上所述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种面膜，包括如下质量百分比的各组分：泊洛沙姆407 7～9％、聚乙烯醇7～9％、甘油6～12％、多肽0.1～0.4％、水70％～79％，所述多肽采用如上所述的利用蛋壳膜制备多肽的方法制备得到。
泊洛沙姆407(poloxamer 407，P407)是一种对温度变化敏感的高分子聚合物，其毒性低，生物相容性好，作为辅料已被广泛应用于食品加工和制药行业，一定浓度下的P407水溶液具有独特的反向热胶凝性质，即在低温(4～5℃)下溶液呈溶胶状，而当温度升高即转变成凝胶状态。聚乙烯醇(PVA)是一种分子主链为碳链、侧链含有大量羟基的亲水性聚合物，具有优良的成膜性，由PVA制得的薄膜具有无毒无味、透明度高、生物相容性好和力学性能良好等特点，在食品、医药、生物材料等行业具有广泛的应用。本发明发现聚乙烯醇的加入能够增加本发明中含泊洛沙姆407体系胶凝时间，增加成膜时间，使含泊洛沙姆407体系满足面膜成膜以及使用要求。基于本发明的面膜，结合了聚乙烯醇优良的成膜性能及泊洛沙姆407独特的温敏性，制备得到了一款温敏型可撕拉面膜，其成膜效果良好，可在短时间内成膜，无需借助乙醇等易挥发性溶剂，温和无刺激，且成膜完整易剥离，免于清洗，使用方便；且本发明充分利用壳膜多肽优良的抗氧化活性，实现了“变废为宝”，所制备的壳膜多肽分子量小、抗氧化活性高，易于皮肤吸收，可用于制备抗氧化面膜且该款壳膜多肽面膜生物相容性良好，安全无毒害。
基于本发明的实施例的面膜，还包括协同抗氧化剂没食子酸，所述多肽与所述没食子酸的质量比为(1～4)：(0.02～0.08)。没食子酸与多肽具有良好的协同抗氧化作用，对细胞内的自由基协同去除效果极佳。
基于本发明的实施例的面膜，所述聚乙烯醇和所述泊洛沙姆407的质量百分比为(1～1.5)：(1～1.5)。
本发明还提供了如上所述的面膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S11、按照所述质量百分比准备各组分；
S12、取所述泊洛沙姆407和部分水配置泊洛沙姆407水溶液，取所述聚乙烯醇和余量的水配置聚乙烯醇溶液，将泊洛沙姆407水溶液和聚乙烯醇溶液在1～6℃下混合均匀，然后加入所述甘油混合均匀，再加入所述多肽混合均匀得到所述面膜。
基于本发明实施例的面膜的制备方法，所述泊洛沙姆407水溶液制备过程如下：将泊洛沙姆407与所述部分水混合均匀后，于1～6℃下放置过夜使其充分溶胀。
基于本发明实施例的面膜的制备方法，所述聚乙烯醇溶液的制备过程如下：将聚乙烯醇与所述余量水混合后，于70～90℃下搅拌1～3h，然后冷却至室温。
实施例1
(1)称取300克蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力为1.2MPa条件下保压处理3min，然后瞬间泄压，收集汽爆样品，-20℃保存备用；
(2)称取3克经汽爆处理的蛋壳膜于100mL锥形瓶中，以1：20的料液比加入pH分别为8.5的氢氧化钠水溶液60mL，以加酶量6000U/g加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解时间为5h，酶解温度为56℃，酶解反应结束后90℃灭酶10min，将酶解液过滤，滤液在8000rpm转速下离心10min，取上清液冷冻干燥得壳膜多肽产物，-20℃保存备用。
(3)配置质量分数为15％的泊洛沙姆407水溶液，于4℃冰箱中放置过夜使其充分溶胀，配置质量分数为15％的聚乙烯醇溶液，于80℃磁力搅拌水浴锅中搅拌反应2h，取出冷却至室温，将泊洛沙姆407水溶液与同浓度的泊洛沙姆407水溶液按1：1的配比等体积混合，置于4℃冰箱中磁力搅拌1h使其充分混匀。
(4)加入所述甘油混合均匀，再加入所述蛋壳膜活性多肽混合均匀得到所述液体状面膜，面膜中甘油的加质量分数为12％，蛋壳膜活性多肽的质量分数为0.4％。
实施例2
(1)称取300克蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力为1.4MPa条件下保压处理3min，然后瞬间泄压，收集汽爆样品，-20℃保存备用；
(2)称取3克经汽爆处理的蛋壳膜于100mL锥形瓶中，以1：30的料液比加入pH分别为7的氢氧化钠水溶液60mL，以加酶量2000U/g加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解时间为2h，酶解温度为35℃，酶解反应结束后90℃灭酶10min，将酶解液过滤，滤液在8000rpm转速下离心10min，取上清液冷冻干燥得壳膜多肽产物，-20℃保存备用。
(3)首先，配置质量分数为14％的泊洛沙姆407水溶液，于4℃冰箱中放置过夜使其充分溶胀，配置浓度为14％的聚乙烯醇溶液，于80℃磁力搅拌水浴锅中搅拌反应2h，取出冷却至室温，将泊洛沙姆407水溶液与同浓度的泊洛沙姆407水溶液按1：1的配比等体积混合，置于4℃冰箱中磁力搅拌1h使其充分混匀。
(4)加入所述甘油混合均匀，再加入所述蛋壳膜活性多肽混合均匀得到所述液体状面膜，面膜中甘油的加质量分数为9％，蛋壳膜活性多肽的质量分数为0.3％。
实施例3
(1)称取300克蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力为1.0MPa条件下保压处理3min，然后瞬间泄压，收集汽爆样品，-20℃保存备用；
(2)称取3克经汽爆处理的蛋壳膜于100mL锥形瓶中，以1：10的料液比加入pH分别为10的氢氧化钠水溶液60mL，以加酶量14000U/g加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解时间为14h，酶解温度为65℃，酶解反应结束后90℃灭酶10min，将酶解液过滤，滤液在8000rpm转速下离心10min，取上清液冷冻干燥得壳膜多肽产物，-20℃保存备用。
(3)首先，配置质量分数为18％的泊洛沙姆407水溶液，于4℃冰箱中放置过夜使其充分溶胀，配置浓度为18％的聚乙烯醇溶液，于80℃磁力搅拌水浴锅中搅拌反应2h，取出冷却至室温，将泊洛沙姆407水溶液与同浓度的泊洛沙姆407水溶液按1：1的配比等体积混合，置于4℃冰箱中磁力搅拌1h使其充分混匀。
(4)加入所述甘油混合均匀，再加入所述蛋壳膜活性多肽混合均匀得到所述液体状面膜，面膜中甘油的加质量分数为6％，蛋壳膜活性多肽的质量分数为0.2％。
实施例4
同实施例1，不同之处在于，在步骤(4)中还加入没食子酸，面膜中没食子酸的质量分数为0.008％(即80ug/g，每g面膜中含80微克没食子酸)。
对比例1(超微粉碎+酶解)
(1)分离出的蛋壳膜用清水洗涤，再沥干水分，于55℃恒温干燥8h左右，然后用行星式球磨仪将蛋壳膜研磨成平均粒径约100μm的蛋壳膜粉末。
(2)称取3克研磨而成的蛋壳膜粉末于100mL锥形瓶中，以1：20的料液比加入pH分别为8.5的氢氧化钠水溶液60mL，以加酶量6000U/g加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解时间为5h，酶解温度为56℃，酶解反应结束后90℃灭酶10min，将酶解液过滤，滤液在8000rpm转速下离心10min，取上清液冷冻干燥得壳膜多肽产物，-20℃保存备用。
(3)配置质量分数为15％的泊洛沙姆407水溶液，于4℃冰箱中放置过夜使其充分溶胀，配置质量分数为15％的聚乙烯醇溶液，于80℃磁力搅拌水浴锅中搅拌反应2h，取出冷却至室温，将泊洛沙姆407水溶液与同浓度的泊洛沙姆407水溶液按1：1的配比等体积混合，置于4℃冰箱中磁力搅拌1h使其充分混匀。
(4)加入所述甘油混合均匀，再加入所述蛋壳膜活性多肽混合均匀得到所述液体状面膜，面膜中甘油的加质量分数为12％，蛋壳膜活性多肽的质量分数为0.4％。
对比例2(比如超声处理+酶解)
(1)称取10克蛋壳膜置于烧杯中，加入100mL蒸馏水浸湿壳膜，将烧杯置于超声波细胞粉碎机探头下，120W超声30min，收集经超声处理壳膜于55℃恒温干燥8h左右，保存备用；
(2)称取3克经汽爆处理的蛋壳膜于100mL锥形瓶中，以1：20的料液比加入pH分别为8.5的氢氧化钠水溶液60mL，以加酶量6000U/g加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解时间为5h，酶解温度为56℃，酶解反应结束后90℃灭酶10min，将酶解液过滤，滤液在8000rpm转速下离心10min，取上清液冷冻干燥得壳膜多肽产物，-20℃保存备用。
(3)配置质量分数为15％的泊洛沙姆407水溶液，于4℃冰箱中放置过夜使其充分溶胀，配置浓度为15％的聚乙烯醇溶液，于80℃磁力搅拌水浴锅中搅拌反应2h，取出冷却至室温，将泊洛沙姆407水溶液与同浓度的泊洛沙姆407水溶液按1：1的配比等体积混合，置于4℃冰箱中磁力搅拌1h使其充分混匀。
(4)加入所述甘油混合均匀，再加入所述蛋壳膜活性多肽混合均匀得到所述液体状面膜，面膜中甘油的加质量分数为12％，蛋壳膜活性多肽的质量分数为0.4％。
对比例3(两种蛋白酶复合酶解)
(1)称取3克蛋壳膜于100mL锥形瓶中，以1：20的料液比加入蒸馏水60mL，以6000U/g的加酶量加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解时间为5h，酶解温度为56℃，酶解反应结束后90℃灭酶10min。以12000U/g的加酶量加入角蛋白酶进行二次酶解，酶解时间为5h，酶解温度为56℃，酶解反应结束后90℃灭酶10min。将酶解液过滤，滤液在8000rpm转速下离心10min，取上清液冷冻干燥得壳膜多肽产物，-20℃保存备用。
(2)配置质量分数为15％的泊洛沙姆407水溶液，于4℃冰箱中放置过夜使其充分溶胀，配置质量分数为15％的聚乙烯醇溶液，于80℃磁力搅拌水浴锅中搅拌反应2h，取出冷却至室温，将泊洛沙姆407水溶液与同浓度的泊洛沙姆407水溶液按1：1的配比等体积混合，置于4℃冰箱中磁力搅拌1h使其充分混匀。
(3)加入所述甘油混合均匀，再加入所述蛋壳膜活性多肽混合均匀得到所述液体状面膜，面膜中甘油的加质量分数为12％，蛋壳膜活性多肽的质量分数为0.4％。
对比例4
同实施例1，不同之处在于，在步骤(4)中还加入维生素C，面膜中维生素C的质量分数为0.008％。
对比例5
同实施例1，不同之处在于，在步骤(4)中还加入维生素E，面膜中维生素E的质量分数为0.008％。
对比例6
同实施例1，不同之处在于，在步骤(4)中还加入茶多酚，面膜中茶多酚的质量分数为0.008％。
对实施例1-3以及对比例1-3中得到的壳膜多肽产物进行DPPH自由基清除能力的测定、膜液特性参数、面膜拉伸性能、温敏面膜流变性能等进行测试，结构如表1所示。由表1可知，基于本发明的成膜时间可控制在10～20min，且成膜性能好，可满足面膜成膜以及使用要求，同时面膜的自由基清除效果强、抗氧化性能优异。
表1实施例1-3以及对比例1-3中制备的壳膜多肽产物以及面膜的性能参数
本发明研究的部分理论依据
1.1、蒸汽爆破压力选择
制备一系列面膜，制备方法同实施例1，不同之处仅在于，控制爆破压力分别为0MPa、0.4MPa、1.0MPa、1.2MPa、1.4MPa、1.6MPa、1.8MPa，对不同爆破压力下的蛋壳膜溶解率进行计算以及对冻干得到的壳膜多肽(EMPs)进行DPPH自由基清除能力的测定。
其中，溶解率计算方法如下：对初始蛋壳膜进行称重得到初始壳膜质量，对步骤(2)中酶解液过滤后的滤渣水洗三次、干燥、称重得到滤渣干态质量，然后计算蛋壳膜溶解率，溶解率计算公式为：
其中，DPPH自由基清除能力的测定方法如下：取冻干得到的壳膜多肽产物0.1g溶解于10mL蒸馏水中配置1％的壳膜多肽溶液，取2mL 1％的壳膜多肽溶液于比色管中，加入2mL 2mmol/L的DPPH乙醇溶液，充分混匀后在室温下避光反应30min，反应结束后在517nm处测定其吸光度，记为As。空白组为2mL DPPH溶液与2mL蒸馏水混合液的吸光度，记为A0，DPPH自由基清除能力的计算公式如下：
溶解率和DPPH自由基清除能力的测定结果如图1所示，可知，随着汽爆压力增大，蛋壳膜溶解率逐渐增加，而壳膜酶解产物壳膜多肽的抗氧化活性呈先升高后降低的趋势，在爆破压力1.0～1.4MPa下可以从蛋壳膜中得到高抗氧化性的多肽，尤其是在1.2MPa下，其DPPH自由基清除率高达69％。可能是由于在汽爆处理的高温高压强剪切力的条件下，蛋壳膜内部存在二硫键等化学键的断裂，蛋壳膜的致密蛋白纤维网遭到破坏，使得壳膜蛋白的网络结构更加舒展，从而增大了底物与蛋白酶的接触，提高了壳膜溶解程度与酶解效率，较高的汽爆压力能够提高蛋壳膜的酶解效率，酶解可以产生更多的抗氧化活性肽，而随着压力持续增大，蛋壳膜水解程度亦增加，蛋白逐渐被降解为更小分子的肽段或者氨基酸，从而失去抗氧化活性。
1.2、结构表征
对1.1中不同汽爆压力处理后的壳膜微观结构进行扫描电子显微镜表征，具体表征方法如下：将原始蛋壳膜和汽爆后分离的蛋壳膜进行喷金处理，喷金时间为60s，使用扫描电镜观察汽爆处理蛋壳膜表面的微观结构变化，工作距离为17mm，在2000×下进行观察。结果如图2所示，其中，图2中的a为未处理的壳膜微观结构，图2中的b、c和d分别为0.4MPa、1.2MPa和1.8MPa处理后的壳膜微观结构，可知，未处理壳膜由纤细的蛋白纤维交联构成网状结构，结构完整且致密，随着汽爆压力增大，壳膜内部分纤维出现断裂，纤维网被破坏，结构趋于无序。
1.3、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
对标准蛋白样品、对比例1制备得到的壳膜多肽产物、以及1.1中0.4MPa、1.2MPa、1.8MPa下制备得到的壳膜多肽产物分别进行电泳测试。具体的，使用SDS-PAGE试剂盒对不同处理条件下壳膜多肽进行电泳测试，测试方法可按照SDS-PAGE试剂盒说明书操作。电泳结果如图3所示，图3中的a、b、c、d、e分别为标准蛋白样品、对比例1制备得到的壳膜多肽产物、以及1.1中0.4MPa、1.2MPa、1.8MPa下制备得到的壳膜多肽产物的电泳结果，可知，相比于a和b，经汽爆处理及碱性蛋白酶酶解过后的壳膜肽段(c-e)呈现为连续的背景条带，这是由汽爆处理过程中蛋白质发生随机断裂导致的，且由于碱性蛋白酶对水解过程中的肽键具有广泛的特异性，其水解产物可分布于各分子量，造成电泳条带呈弥散状，且汽爆压力越大，壳膜溶解率增加，酶解液中的蛋白浓度也随之增大，分离胶中条带颜色越深，其中，在1.2MPa下，25kDa以下的肽段含量明显多于各条带中的高分子肽段含量，多数蛋白都被酶解成了小分子肽，有利于后续的生产应用。
1.4、面膜浓度条件选择
制备一系列面膜，制备方法同实施例1，不同之处仅在于，泊洛沙姆407溶液质量分数分别为5％、10％、15％、17％、18％、20％、25％(即面膜中泊洛沙姆407的质量分数分别为2.5％、5％、7.5％、8.5％、9％、10％、12.5％)，对制备得到的液体状的面膜立刻进行粘度测试、成膜时间以及性能进行测试。
其中，粘度测定采用NDJ-5S数字旋转粘度计测定；
其中，成膜时间和性能测定步骤如下：取0.5g面膜均匀涂布于人手背处皮肤(3cm×3cm)，直至形成不黏手、可剥离的薄膜，记录成膜时间，膜性能评价包括膜剥离完整性、膜厚是否均匀以及剥离难易程度。
粘度测定结果如表2所示，可知，当泊洛沙姆407的质量分数为7.5～9％时，其粘度适宜、易于涂抹均匀且膜性质佳。当泊洛沙姆407水溶液的浓度过低时(比如泊洛沙姆407浓度为2.5％时)，面膜中水分含量较多，膜内分子间相互作用弱，膜液无法在皮肤表面停留，因此出现难以成膜或者成膜较慢的情况；而随着质量分数的增加，单位体积的成膜物质的量增多，成膜剂高分子物质间的相互作用增强，内部联系更紧密，在高质量分数下发生组分聚集，膜整体柔韧性变差，另一方面，随浓度增大，膜液流动性减小，不易均匀涂抹，且粘度过大，造成面部有紧绷感，揭膜效果差，膜整体性能降低。
表2不同泊洛沙姆407质量分数下面膜特性参数
1.5、聚乙烯醇溶液与泊洛沙姆407的不同配比对面膜性能影响
制备一系列面膜，制备方法同实施例1，不同之处仅在于，聚乙烯醇溶液与泊洛沙姆407水溶液的体积比分别为0：1(即只加入与实施例1相同体积的泊洛沙姆407水溶液)、1：3、1:2、2：3、1:1、2:1、3:2、3：1、1：0(即只加入与实施例1相同体积的聚乙烯醇溶液)，对制备得到的初始液体状面膜分别进行粘度测试、成膜时间以及性能进行测试。测试结果如表3所示，结果表明，因其具有独特的温度敏感性，泊洛沙姆407在接触到人体皮肤后在体温触发下转变为凝胶状，可快速成膜，但成膜后机械性能较差；单独的聚乙烯醇具有良好的成膜性能且成膜后机械性能较强，但成膜时间慢，可能是由于其分子侧链含有大量羟基，易与水分子结合形成氢键交联，水分子难以挥发，因此成膜时间慢，聚乙烯醇的加入可增加泊洛沙姆407成膜时间，使成膜时间控制在10～20min，目前市售可剥离面膜成膜时间一般在15-20min，由表可知，体积比分别为2：3～3：2时，其成膜时间适宜且膜性质优良，含泊洛沙姆407体系能够较好地满足成膜以及使用要求，适用于制备适用于人脸敷用的面膜。
表3不同聚乙烯醇/泊洛沙姆质量比下面膜特性参数
1.6、甘油添加量选择
制备一系列面膜，制备方法同实施例1，甘油的浓度分别为0、3％、6％、9％、12％、15％，对制备得到的面膜分别进行保湿率测试、水蒸气透过率测定以及面膜拉伸性能测定。
其中，保湿率测定方法如下：精确称取制备得到的5g面膜于50mm×30mm的称量瓶中，记录称量瓶与面膜总重，记为W1，将称量瓶放置于相对湿度为43％(饱和硫酸钠溶液)的干燥器中，24h后取出称量瓶，精确称取称量瓶质量记为W2，保湿率按照下式计算：
其中，水蒸气透过率测定方法如下：水蒸气透过率参照YY/T 0471.2-2004《接触性创面敷料试验方法第2部分-透气膜敷料水蒸气透过率》进行测定。
其中，面膜拉伸性能测定方法如下：将5g面膜倒入培养皿(10×10cm)中，37℃烘干至可剥离，剥离后的薄膜用数显千分尺随机选取膜5个不同部位的点测定薄膜厚度，取平均值，将薄膜剪成20×50mm的长条，采用质构仪进行拉伸实验测试，记录最大拉力以及断裂时的位移，拉伸强度(TS)和断裂伸长率(EAB)的计算公式如下：
式中，F为膜断裂时的最大力，单位为N；B为膜的宽度，单位mm；H为膜的厚度，单位mm；D为膜断裂时的总长度，单位mm；L为膜的初始长度，单位mm。
保湿率测试和水蒸气透过率测试结果如图4所示，由图可知，甘油添加量显著提高了面膜的保湿率和水蒸气透过率，甘油添加量为6％～15％时，面膜保湿率均在85％以上，尤其是当甘油添加量为12％时，面膜保湿率高达90.2％，具有极佳的保湿效果，且与添加量15％相比无显著差异(p＞0.05)，甘油的添加了提升面膜体系保留水分的能力。同时，由图4可知，甘油的添加也增大了面膜成膜后的水蒸气透过率，在6％～15％时，水蒸气透过率均在70％以上，有利于保障面膜敷于面部干燥成膜后拥有良好的透气性。面膜拉伸性能测定测定结果如图5所示，由图可知，随着甘油添加量增大，面膜断裂强度显著降低，断裂伸长率逐渐增大，甘油的添加可改善面膜的柔韧性，提升面膜敷于面部成膜后的舒适性和贴肤性，当甘油浓度为6％～12％，可同时兼顾舒适、贴服、成膜完整和容易揭膜。
1.7、面膜流变性能测试
采用TA流变仪对温敏型面膜随温度变化的流变特性进行了表征。具体方法如下：取实施例1中适量面膜置于钢平板(直径40mm)之间，间隙为1000μm，在应变和频率分别为1％和1Hz的条下，研究了10-50℃范围内不同配比面膜的温度效应，评估了不同配比面膜弹性模量G’和粘性模量G”的变化件。结果如图6所示，随着温度升高，面膜的弹性模量(G’)和粘性模量(G”)也逐渐增大，其中临界溶胶-凝胶转变温度发生在36.93℃时。在36.93℃之前，面膜的粘性模量大于弹性模量，二者之比损耗角正切tanδ大于1，面膜呈液态溶胶状；36.93℃后，面膜状态发生转变，其弹性模量大于粘性模量，损耗角正切tanδ小于1，面膜呈固态凝胶状，这样的临界转变温度正适用于人体体温，基于本发明的面膜敷于面部时可在体温的触发下发生溶胶-凝胶转变，在短时间内(10～20min)可形成一层固态薄膜贴合面部皮肤。
1.8、面膜生物相容性评价
1.8.1、壳膜多肽添加量对细胞活力的影响：
(1)制备一系列含不同浓度壳膜多肽(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％)的面膜，制备方法同实施例1。
(2)各取1g面膜于灭菌离心管中，加入完全培养基至10mL，吹打混合均匀，经0.45μm滤膜过滤以除菌，得到含面膜的完全培养基，备用；取1mLHank’s溶液，加入完全培养基至10ml，混合后得到含Hank’s溶液的完全培养基，备用。
(3)采用CCK-8试剂盒进行细胞毒性测定。具体测定方法如下：取处于对数期的L929小鼠成纤维细胞用完全培养基制备细胞悬浮液，细胞密度为5×104个/mL，吸取0.1mL的细胞接种于96孔板上，在5％CO2和37℃孵育条件下培养24h，使细胞完全贴壁于孔板，待细胞贴壁后，弃去完全培养基，将孔板各孔分为两组，A、B；向孔板A组孔中加入0.1mL含面膜的完全培养基，记为实验组，向孔板B组孔中加入0.1ml含Hank’s溶液的完全培养基作为对照组；将实验组和对照组分别在5％CO2和37℃孵育条件下培养24h，24h后，弃去原培养液，各孔分别用PBS清洗3次，向每孔中加入0.1mLMEM培养基和10μL的CCK-8试剂，在5％CO2和37℃条件下培养3h，并用酶标仪测定波长为450nm时各孔吸光值，实验组吸光度平均值为An，对照组吸光度平均值为A0。
细胞活力计算公式如下：
测试结果如图7所示，与对照组(细胞活力为100％)相比，壳膜多肽浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的面膜，L929细胞活力分别为98.87％、98.12％、93.36％、94.20％，表明较低浓度壳膜多肽的加入并未引起细胞活力的显著降低，对细胞无明显毒害作用，当面膜中壳膜多肽的浓度为0.5％时，细胞活力下降至84.49％，变化较为显著(p<0.01)。
1.8.2、没食子酸添加量对细胞活力的影响
(1)制备一系列含不同浓度没食子酸的面膜，制备方法同实施例1，不同之处仅在于，面膜中没食子酸的质量分数为0.002％、0.005％、0.008％、0.01％、0.02％。
(2)各取1g面膜于灭菌离心管中，加入完全培养基至10mL，吹打混合均匀，经0.45μm滤膜过滤以除菌，得到含面膜的完全培养基，备用；取1mLHank’s溶液，加入完全培养基至10ml，混合后得到含Hank’s溶液的完全培养基，备用。
(3)采用CCK-8试剂盒进行细胞毒性测定。细胞毒性测定方法和细胞活力计算方法分别参照1.8.1。
细胞毒性测试结果如图8所示，与对照组(细胞相对存活率为100％)相比，没食子酸添加量为20、50、80μg/g时面膜的L929细胞存活率分别为93.59％、91.18％、88.32％，表明较低浓度没食子酸的加入并未引起细胞活力的显著降低(p＞0.05)，对细胞无明显毒害作用；当没食子酸添加量增加到为100、200μg/g时，细胞存活率分别下降至76.86％和64.27％，对L929细胞的生长有明显抑制作用。
1.9、面膜抗氧化活性测试
(1)制备一系列面膜，制备方法同实施例4，不同之处在于，面膜中不含EMPs，且面膜中没食子酸的质量分数为20μg/g、50μg/g、80μg/g，分别标记为20GA、50GA、80GA；制备一系列含不同浓度没食子酸的面膜，制备方法同实施例4，不同之处在于，面膜中没食子酸的质量分数为20μg/g、50μg/g、80μg/g，分别标记为EMPs+20GA、EMPs+50GA、EMPs+80GA；实施例1中的面膜记为EMPs。
(2)取处于对数期的L929小鼠成纤维细胞用完全培养基制备细胞悬浮液，细胞密度为1×105个/mL，吸取0.1mL的细胞悬液接种于96孔板上，每组设置5个复孔，在5％CO2和37℃孵育条件下培养24h，将96孔板各孔随机分别分三组，对照组A、对照组B和实验组，各孔分别吸去完全培养基，然后加入Hank’s溶液100μL覆盖细胞；将UVB紫外灯开灯预热15min后，将实验组以及对照组A置于UVB灯管垂直距离15cm处，紫外照射12min，对照组B用铝箔纸覆盖；实验组细胞经紫外照射后吸净Hank’s溶液，用干净Hank’s溶液洗涤两次，实验组各孔分别加入100μL含面膜EMPs、20GA、50GA、80GA、EMPs+20GA、EMPs+50GA、EMPs+80GA的培养液，然后将对照组A、对照组B、实验组分别放入培养箱中37℃，5％CO2孵育24h。
(3)使用活性氧检测试剂盒测定L929小鼠成纤维细胞内的活性氧(ROS)浓度：用MEM培养基按1:1000比例稀释试剂盒中荧光探针(DCFH-DA)以使工作浓度为10μM，然后将96孔板中的原培养基小心吸除，加入100μL稀释好的DCFH-DA以完全盖住细胞，将孔板置于细胞培养箱内静置孵育，以使探针可充分进入细胞；20min后，用MEM培养基洗去游离的探针，重复该步骤2-3次，从而减少背景干扰，然后向各孔加入100μLMEM培养基，使用多功能酶标仪检测荧光强度，激发和发射波长分别设定在488nm和523nm，计算对照组A(UVB)、对照组B(control)、实验组细胞内ROS相对水平。
如图9所示，UVB辐射可诱导皮肤表面形成自由基，刺激细胞产生过量ROS，导致皮肤受损、老化，相比于无紫外照射的对照组A(ROS相对水平为100％)，经UVB紫外照射12min后的对照组B，L929细胞内ROS相对含量提高至268.89％，约为对照组A的2.7倍；添加壳膜多肽EMPs后，细胞内ROS相对水平显著下降(p<0.01)，减少至203.92％，EMPs可有效缓解紫外照射后引起的细胞内氧化应激；当EMPs与不同浓度GA(20、50、80μg/g)复配后，细胞内ROS相对水平不断降低，其中，在GA添加量分别为50μg/g和80μg/g时，细胞内ROS相对水平分别下降至121.43％和114.29％，达到了与无紫外照射细胞基本相当的水平，无论是单独的EMPs，还是单独的GA均不能达到如此，二者同时加入具有协同抗氧化作用。
进一步对对比例4、对比例5以及对比例6进行ROS活性氧清除试验，细胞内ROS相对水平分别下降至182.59％、194.81％、167.74％，具有氧化还原活性的维生素C、维生素E以及茶多酚，也很难达到与无紫外照射细胞基本相当的水平。
1.10、面膜表观评价
1.10.1、将新鲜苹果对半切开，一瓣敷上实施例4中制备的面膜(面膜组)，一瓣暴露于空气(对照组)中，在室温下放置20min后观察两瓣苹果表观变化，并使用色差仪测定敷面膜和未敷面膜的苹果表面色度变化。
由于苹果中的酚酶在接触氧气后会催化酚类物质形成醌及其聚合物，发生氧化褐变，因此新鲜苹果切开暴露于空气后其外观色度均会发生改变，苹果的新鲜切面表面湿润且色泽为淡黄偏白(如图10中的A所示)，如图10中的B所示，将涂敷面膜擦去，表面仍较为平整湿润，暴露于空气中的一瓣颜色变为黄褐色，且由于失水造成切面干燥无光泽；如表1所示，与新鲜切面的L值相比，面膜组L值略微下降，对照组L值显著下降(p<0.05)，说明对照组色泽变暗；与新鲜切面的b值相比，面膜组略微变黄，b值稍有增加，对照组b值显著增大(p<0.05)，向黄色转变程度较大，对照组表观颜色呈现黄褐色。本研究制备的面膜可抑制苹果切面发生的氧化褐变，有效缓解苹果切面的褐变程度及水分流失情况。
表4、新鲜切面、面膜组、对照组苹果表面色度
其中，L代表明暗度(黑白)，a代表红绿色，b代表黄蓝色。
1.10.2、用肌肤测试仪测试未涂抹面膜的人前臂内侧平整处皮肤，记下各项参数，取实施例4中制备的面膜均匀涂抹于手前臂内侧平整处皮肤，观察成膜过程，待形成可剥离的薄膜后将膜揭下，用肌肤测试仪在同一位置进行测试，对比使用前后皮肤各项参数变化，未涂抹面膜的皮肤测试结果如图11中的A所示，使用面膜后的皮肤测试结果如图11中的B所示，可知，涂抹面膜后，受试者皮肤白皙度由36提高至40、水分活度由23％提升至33％、含油量由55％降低至52％、皮肤弹性由42提高至49，面膜可改善皮肤各项指标，起到美白、补水等功效；图12所示为面膜前臂上的成膜过程，由图可知，面膜成膜完整且易剥离，适用于制备适用于人脸敷用的抗氧化面膜。
尽管上面已经详细描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种利用蛋壳膜制备多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S01、蒸汽爆破处理：将蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力1.0～1.4MPa下保压处理1～5min，然后瞬间泄压，收集汽爆样品；
S02、蛋白酶酶解处理：将经汽爆处理后的蛋壳膜以料液比1：(10～30)加入到pH为7～10的氢氧化钠水溶液中，然后按照加酶量2000～14000U/g加入碱性蛋白酶，在35～65℃下酶解2～14h，于90～100℃下灭酶5～15min，将酶解液过滤，取滤液离心，取上清液冷冻干燥得到多肽。
2.根据权利要求1所述的利用蛋壳膜制备多肽的方法，其特征在于，所述离心过程的转速为6000～10000rpm，离心时间为5～15min。
3.根据权利要求1所述的利用蛋壳膜制备多肽的方法，其特征在于，所述蒸汽爆破的压力为1.2～1.4MPa，保压时间为3min。
4.根据权利要求1所述的利用蛋壳膜制备多肽的方法，其特征在于，所述氢氧化钠水溶液的pH值为8～9，所述加酶量为4000～8000U/g，所述酶解温度为55℃。
5.一种多肽，其特征在于，采用如权利要求1-4任一项所述的利用蛋壳膜制备多肽的方法制备得到。
6.一种面膜，其特征在于，包括如下质量百分比的各组分：泊洛沙姆407 7～9％、聚乙烯醇7～9％、甘油6～12％、多肽0.1～0.4％、水70％～79％，多肽采用如权利要求1-4任一项所述的利用蛋壳膜制备多肽的方法制备得到。
7.根据权利要求6所述的面膜，其特征在于，还包括协同抗氧化剂没食子酸，所述多肽与所述没食子酸的质量比为(1～4)：(0.02～0.08)。
8.根据权利要求6所述的面膜，其特征在于，所述聚乙烯醇和所述泊洛沙姆407的质量百分比为(1～1.5)：(1～1.5)。
9.如权利要求6所述的面膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S11、按照所述质量百分比比准备各组分；
S12、取所述泊洛沙姆407和部分水配置泊洛沙姆407水溶液，取所述聚乙烯醇和余量的水配置聚乙烯醇溶液，将泊洛沙姆407水溶液和聚乙烯醇溶液在1～6℃下混合均匀，然后加入所述甘油混合均匀，再加入所述多肽混合均匀得到所述面膜。
10.根据权利要求9所述的面膜的制备方法，其特征在于，所述泊洛沙姆407水溶液制备过程如下：将泊洛沙姆407与所述部分水混合均匀后，于1～6℃下放置过夜使其充分溶胀。
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