CN114807262B - 一种二氢杨梅素酰化衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二氢杨梅素酰化衍生物及其制备方法，属于天然产物化学领域。本发明的二氢杨梅素酰化衍生物制备方法是将二氢杨梅素与乙烯酯在甲基叔丁基醚体系中经脂肪酶Lipozyme TL IM催化，发生酰化反应，即生成二氢杨梅酰化衍生物。该方法区域选择性高，反应产物单一，反应介质易去除，产品分离相对简单，反应转化率高(能够达到90％以上)；并且制备出的二氢杨梅素酰化衍生物由于脂溶性的提高，其穿透细胞膜的能力加强，从而提高了二氢杨梅素在细胞内生物利用度。
Description
技术领域
本发明涉及一种二氢杨梅素酰化衍生物及其制备方法，属于天然产物化学领域。
背景技术
二氢杨梅素(DHM)是一种天然的苷元类类黄酮，主要是从葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄叶中提取得到，具有抗氧化、肝保护、抗炎、调节糖代谢等多种生理功能。二氢杨梅素的多羟基结构使其亲脂性差，导致二氢杨梅素在脂溶性体系中的溶解度差且在生物体系中通过亲脂性膜屏障的穿透力较差，进而影响其抗氧化活性和生物利用度，限制了二氢杨梅素在脂质体系和生物体系中的应用。
基于上述问题，研究人员尝试使用不同的策略来提高二氢杨梅素在脂相中的溶解度和生物利用度，最有效的方法是酰化修饰。目前对二氢杨梅素酰基化修饰研究较多的是化学法修饰，但是化学法酰化并不能控制酰化位点，区域选择性低且反应过程繁琐。相反，酶法酰化因其高效、绿色环保、高区域选择性和条件温和而受到越来越多的关注，然而目前有报道酶法酰化二氢杨梅素的研究都只能催化二氢杨梅素酰化生成乙酰化衍生物，无法实现催化二氢杨梅素与其他碳链长度的酰基供体反应。另外，酰化过程是通过取代一个活性羟基来提高亲脂性，这会对其抗氧化活性产生一定的影响，因此有必要研究不同碳链酰基供体修饰的二氢杨梅素酰化衍生物的亲脂性与抗氧化活性及生物利用度之间的关系。目前，对二氢杨梅素衍生物抗氧化活性的研究仅限于化学法，在生物模型中的抗氧化活性研究很少。
发明内容
为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种二氢杨梅素酰化衍生物及其制备方法，采用该方法在制备二氢杨梅素酰化衍生物过程中，反应条件温和，反应转化率高，区域选择性高，产物容易分离，而且制备出的二氢杨梅素酰化衍生物在具备较强亲脂性的同时，还具备较强的抗氧化性，有效提高了二氢杨梅素在细胞内的生物利用度。
本发明的目的是提供一种二氢杨梅素酰化衍生物的制备方法，具体是将二氢杨梅素与乙烯酯在甲基叔丁基醚体系中经脂肪酶Lipozyme TL IM催化，发生酰化反应，即得到二氢杨梅素酰化衍生物；具体反应过程为：
在本发明一种实施方式中，所述乙烯酯为丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯。
二氢杨梅素酰化衍生物在细胞中的抗氧化活性随着取代碳链的变化而受到影响，为了进一步提高二氢杨梅素酰化衍生物的抗氧化活性，在本发明的一种实施方式中，所述乙烯酯为辛酸乙烯酯；所述产物为3-O-辛酰化二氢杨梅素。
在本发明的一种实施方式中，所述二氢杨梅素与乙烯酯的摩尔比为1:5～1:25。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶Lipozyme TL IM相对于二氢杨梅素的添加量为0.2～0.6U/mg。
在本发明的一种实施方式中，所述酰化反应的温度为40～60℃。
在本发明的一种实施方式中，所述酰化反应的时间为24～72h。
本发明的第二个目的是提供一种由上述所述的二氢杨梅素酰化衍生物的制备方法制备的二氢杨梅素酰化衍生物；所述二氢杨梅素酰化衍生物为丁酰化二氢杨梅素、己酰化二氢杨梅素、辛酰化二氢杨梅素中任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述二氢杨梅素酰化衍生物为辛酰化二氢杨梅素。
本发明的另一目的是提供一种由上述制备的二氢杨梅素酰化衍生物在食品中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明的二氢杨梅素酰化衍生物的制备具有反应条件温和，区域选择性高，反应产物单一，反应介质易去除，产品分离相对简单，反应转化率高(达到90％以上)，相比较化学法具有显著的优势，符合绿色化学的要求，具有很大的应用前景。
(2)本发明的二氢杨梅素酰化衍生物相比较于二氢杨梅素和其他碳链修饰的二氢杨梅素衍生物，C4-DHM、C6-DHM和C8-DHM在细胞内具有更好的生物利用度，尤其是C8-DHM(3-O-辛酰化二氢杨梅素)在细胞内的生物利用度更优。
附图说明
图1为二氢杨梅素及其衍生物的CAA值；
图2为不同脂肪酶对二氢杨梅素转化率的效果比对图；
图3为不同溶剂体系对二氢杨梅素转化率的效果比对图；
图4为3-O-辛酰化二氢杨梅素质谱图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，下面结合具体实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好的解释本发明，但不用于限制本发明。
实施例1
在反应瓶中加入0.18mmol DHM，0.4U/mg DHM的lipozyme TL IM和10mL甲基叔丁基醚，再加入3.6mmol丁酸乙烯酯(C4)，上述反应体系在50℃、200rpm下反应72h，即得到丁酰化二氢杨梅素(C4-DHM)，产率为96.3％。
实施例2
在反应瓶中加入0.18mmol DHM，0.4U/mg DHM的lipozyme TL IM和10mL甲基叔丁基醚，再加入3.6mmol己酸乙烯酯(C6)，上述反应体系在50℃、200rpm下反应72h，即得到己酰化二氢杨梅素(C6-DHM)，产率为94.7％。
实施例3
在反应瓶中加入0.18mmol DHM，0.4U/mg DHM的lipozyme TL IM和10mL甲基叔丁基醚，再加入3.6mmol辛酸乙烯酯(C8)，上述反应体系在50℃、200rpm下反应72h，即得到辛酰化二氢杨梅素(C8-DHM)，产率为91.5％。
实施例4
探究不同酰基供体制得二氢杨梅素衍生物在细胞中的抗氧化效果
在反应瓶中加入0.18mmol DHM，0.4U/mg DHM的lipozyme TL IM和10mL甲基叔丁基醚，再分别加入3.6mmol乙酸乙烯酯(C2)、丁酸乙烯酯(C4)、己酸乙烯酯(C6)、辛酸乙烯酯(C8)和月桂酸乙烯酯(C12)，上述反应体系在50℃、200rpm下反应72h，分别得到乙酰化二氢杨梅素(C2-DHM)、丁酰化二氢杨梅素(C4-DHM)、己酰化二氢杨梅素(C6-DHM)、辛酰化二氢杨梅素(C8-DHM)和月桂酰化二氢杨梅素(C12-DHM)。
在黑色96孔板中接种人肝正常细胞L-02细胞(6ⅹ104个/孔，100μL)，37℃下、5％CO2中孵育24h，移去培养基后用PBS清洗细胞；用含待测样品与25μmol/L DCFH-DA的培养基处理细胞1h，然后一部分用PBS清洗，另一部分不用PBS清洗细胞，随后加入100μL含600μmol/L的ABAP处理细胞，放置在荧光酶标仪，在538nm处的发射波长和485nm处的激发波长下每5min测量一次，测1h，设置3个对照孔和1个空白孔。对照孔为加ABAP但不加样品处理的细胞，空白为不加ABAP和样品处理的细胞，使用槲皮素做阳性对照。
CAA(unit)＝1-(∫SA/∫CA)×100式中，∫SA表示样品时间-荧光值曲线下的面积积分，∫CA表示对照时间-荧光值曲线下的面积积分。
表1二氢杨梅素及其衍生物细胞抗氧化的EC50值
(1)二氢杨梅素在细胞中的抗氧化活性如表1和附图1。结果显示：二氢杨梅素及其衍生物的CAA值与其浓度的对数曲线如附图1所示，相关系数R2都在0.9以上，表明L02细胞模型对于评价二氢杨梅素及其衍生物的抗氧化活性具有可行性。
根据CAA值与浓度的对数曲线可以计算EC50值，由表1可知，二氢杨梅素及其衍生物的EC50值随碳链的增长呈现先降低后升高的趋势，C12-DHM>DHM>C2-DHM>C4-DHM≈C6-DHM>C8-DHM(P<0.05)，且均大于槲皮素的EC50值。表明二氢杨梅素及其衍生物在细胞中的抗氧化活性随着取代碳链的增长呈现先升高后降低的趋势，其中C8-DHM在细胞中的抗氧化效果最好。
因此，随着取代碳链的增长，二氢杨梅素衍生物的亲脂性增加，使其更容易接近细胞膜，与细胞膜结合，从而进入细胞内部发挥活性，然而当取代碳链达到一定长度后，空间位阻增大，衍生物会在细胞外形成聚集物，不容易跨过细胞膜，抗氧化活性减弱，另外，空间位阻增大也限制了衍生物与细胞内自由基的接触，从而使其抗氧化活性降低。
(2)样品孵育后采用两种方式处理细胞，即不用PBS清洗和使用PBS清洗细胞，以此评估不同样品与细胞膜的结合程度以及被细胞吸收的情况。
由表1可知，加入二氢杨梅素和C2-DHM孵育后用PBS清洗细胞的EC50值大于未清洗的，C4-DHM、C6-DHM和C8-DHM与槲皮素相似，清洗与未清洗的EC50值没有很大差异。这是由于亲脂性增强，可有效跨过细胞膜或与细胞膜紧密结合；尤其是辛酰化二氢杨梅素在清洗前后抗氧化活性均最高，说明辛酰化二氢杨梅素在细胞中的生物利用度最好。
实施例5探究不同脂肪酶对制备二氢杨梅素衍生物的影响
在反应瓶中加入0.18mmol DHM，2.7mmol丁酸乙烯酯，10mL甲基叔丁基醚，分别加入Novozyme 435、Lipozyme RM、Lipozyme TL IM、Lipase G“Amano”50、Lipase AY“Amano”30SD、Lipase AY“Amano”400SD、Lipase MER“Amano”、Lipase DF“Amano”15各0.4U/mg DHM，上述反应体系在50℃下以200rpm磁力搅拌24h。结果如附图2和表2。
表2不同脂肪酶催化下二氢杨梅素的转化率结果
结果发现，相较于其他脂肪酶，Lipozyme TL IM催化反应时，二氢杨梅素的转化率最高，且具有绝对优势，因此选择此酶作为催化剂。
实施例6探究不同溶剂体系对制备二氢杨梅素衍生物的影响
在反应瓶中加入0.18mmol DHM，2.7mmol丁酸乙烯酯，0.4U/mg二氢杨梅素的lipozyme TL IM，再分别加入THF、正丁醇、乙腈、叔戊醇、甲基叔丁基醚、异丙醇、正己烷和甲苯各10mL，上述反应体系在50℃、200rpm下磁力搅拌24h。结果如附图3和表3表3不同溶剂体系下二氢杨梅素的转化率结果
结果发现，在甲基叔丁基醚中二氢杨梅素的转化率最高，且甲基叔丁醚沸点低，易除去，使得产物易制备，因此选择甲基叔丁基醚作为溶剂体系。
实施例7二氢杨梅素及其衍生物的结构鉴定
在反应瓶中加入0.18mmol二氢杨梅素、0.4U/mgDHM的脂肪酶、3.6mmol辛酸乙烯酯和10mL甲基叔丁基醚，在45℃，200rpm条件下反应，反应72h后；离心去除酶，制备液相分离纯化，真空冻干后得到二氢杨梅素酰化衍生物，经质谱、核磁鉴定该产物为3-O-辛酰化二氢杨梅素。
如附图4，从产物的质谱图上发现m/z 445.1的分子离子峰[M-H]-，与二氢杨梅素分子相差一个辛酰基(127)。为了确认单酰化产物的具体酰化位点，我们进一步进行了核磁分析。如表4，13C-NMR谱图上C-2和C-4的化学位移向高场发生了明显的移动，1H-NMR谱图上C2-H和C3-H的化学位移分别向低场移动了Δδ0.91和Δδ0.66，其他氢原子的化学位移未发生明显的变化，因此酰化取代发生在C环的3-OH处，具体结构是如下所示：
表4二氢杨梅素及其衍生物的1H和13C化学位移
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种二氢杨梅素酰化衍生物的制备方法，其特征在于，将二氢杨梅素与乙烯酯在甲基叔丁基醚体系中经脂肪酶Lipozyme TL IM催化，发生酰化反应，即得二氢杨梅素酰化衍生物；所述二氢杨梅素与乙烯酯的摩尔比为1:5~1:25；所述脂肪酶Lipozyme TL IM相对于二氢杨梅素的添加量为0.2~0.6 U/mg。
2.根据权利要求1所述的二氢杨梅素酰化衍生物的制备方法，其特征在于，所述乙烯酯为丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯中的任一种。
3.根据权利要求2所述的二氢杨梅素酰化衍生物的制备方法，其特征在于，所述乙烯酯为辛酸乙烯酯。
4.根据权利要求1所述的二氢杨梅素酰化衍生物的制备方法，其特征在于，所述酰化反应的温度为40~60℃。
5. 根据权利要求1所述的二氢杨梅素酰化衍生物的制备方法，其特征在于，所述酰化反应的时间为24~72 h。
6.由权利要求1~5任一所述的二氢杨梅素酰化衍生物的制备方法制备的二氢杨梅素酰化衍生物；其特征在于，所述二氢杨梅素酰化衍生物为丁酰化二氢杨梅素、己酰化二氢杨梅素、辛酰化二氢杨梅素中的任一种。
7.根据权利要求6所述的二氢杨梅素酰化衍生物，其特征在于，所述二氢杨梅素酰化衍生物为辛酰化二氢杨梅素。
8.由权利要求6所述的二氢杨梅素酰化衍生物在制备功能性食品中的应用。
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| 吴欢等.酶促合成二氢杨梅素酯化物及其纯化的研究.2016,第31卷(第4期),92-95、99. * |
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