CN114788873A - 肉桂醛-叶酸自组装水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肉桂醛‑叶酸自组装水凝胶，原料包括含有锌离子的肉桂醛溶液和叶酸溶液，所述肉桂醛‑叶酸自组装水凝胶以肉桂醛和叶酸为凝胶因子形成席夫碱键，以锌离子为配位键，通过非共价键作用自组装而成。本发明还公开了一种肉桂醛‑叶酸自组装水凝胶的制备方法，包括以下步骤：在震荡或搅拌的条件下，将叶酸、锌盐、肉桂醛在溶液中混合，静置，得到肉桂醛‑叶酸自组装水凝胶。本发明的水凝胶不仅解决了肉桂醛溶解率低、稳定性差的问题，而且保留了肉桂醛的生物活性，制备方法简单可行。

Description

肉桂醛-叶酸自组装水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种肉桂醛-叶酸自组装水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
肉桂醛是源于中药肉桂的一种苯丙烯类含醛物质，分子式是C9H8O。肉桂醛是一种来源于天然的抗菌、抗炎和促血管新生的物质，毒副作用小，因此在抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血糖和调脂等方面具有较高生物活性。叶酸是一种天然的维生素，对细菌具有优秀的靶向性。
皮肤伤口的病理变化主要包括皮肤组织的破损和血管的缺失。此外，开放、湿润和渗出的皮肤伤口为细菌定植提供了一个完美的环境，细菌感染是导致皮肤伤口难以愈合的主要因素。因此，抗菌、促血管和皮肤组织再生对治疗皮肤伤口发挥着重要的作用。
可注射水凝胶被广泛应用于皮肤伤口的治疗中，因为它们的结构与生物软组织相似。它们可以覆盖不规则的伤口，为皮肤组织的再生创造了一个理想的环境，并提供了一个防止水分流失和伤口感染的屏障，是一种非常理想的给药系统。
肉桂醛通过多种药理作用对皮肤伤口的愈合起到良好的疗效，但是，肉桂醛的疏水性使其溶解度差，在复杂的外部环境下容易被降解，导致其稳定性不理想，这些都降低了肉桂醛的生物利用度。另一方面，由于传统的中药剂型在人体有一定的药物半衰期，并且在病变部位作用的时间较短，难以起到应有的疗效，因此需要一种新的剂型来提高肉桂醛的生物利用率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有抗菌、促血管生成和促皮肤伤口愈合等特性的可注射的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，解决了肉桂醛溶解度低，稳定性差的问题，并保留肉桂醛的生物活性。本发明还提供了上述肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的制备方法和应用，制备工艺简单，用于抗菌领域和治疗皮肤伤口药物中。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，以肉桂醛和叶酸为凝胶因子，将肉桂醛的醛基和叶酸的氨基形成席夫碱键，以金属离子为配位键，通过非共价键作用自组装而成。
作为对上述技术方案的进一步改进：
所述肉桂醛-叶酸自组装水凝胶中，所述肉桂醛的浓度小于等于30mg/mL，叶酸的浓度范围为8mg/mL至15mg/mL。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将锌盐溶液和肉桂醛溶液混合，得到含有锌离子的肉桂醛溶液；
S2、在震荡或搅拌的条件下，将叶酸溶液和含有锌离子的肉桂醛溶液混合，静置，得到肉桂醛-叶酸自组装水凝胶。
作为对上述技术方案的进一步改进：
所述步骤S1中，所述锌盐溶液的浓度为0.08mol/L至0.10mol/L：所述含有锌离子的肉桂醛溶液中肉桂醛的浓度小于等于88mg/mL。优选地，所述锌盐溶液为乙酸锌溶液或硝酸锌溶液。
所述步骤S2中，所述叶酸溶液包括以下制备步骤：将叶酸溶于氢氧化纳溶液中，得到叶酸溶液。
所述氢氧化钠溶液的浓度范围为0.10mol/L至0.15mol/L，所述叶酸溶液中叶酸的浓度范围为13mg/mL至15mg/mL。
所述静置时间为5min以上。优选地，静置时间为5min～48h。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种前述的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将叶酸溶液和肉桂醛混合，得到的叶酸肉桂醛溶液；
S2、在震荡或搅拌的条件下，将锌盐溶液和叶酸肉桂醛溶液混合，静置，得到肉桂醛-叶酸自组装水凝胶。
作为对上述技术方案的进一步改进：
所述步骤S2中，所述锌盐溶液的浓度为0.08mol/L至0.10mol/L：优选地，所述锌盐溶液为乙酸锌溶液或硝酸锌溶液。
所述步骤S1中，所述叶酸溶液包括以下制备步骤：将叶酸溶于氢氧化纳溶液中，得到叶酸溶液。
所述氢氧化钠溶液的浓度范围为0.10mol/L至0.15mol/L，所述叶酸溶液中叶酸的浓度范围为13mg/mL至15mg/mL。
所述静置时间为5min以上。优选地，静置时间为5min～48h。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种前述肉桂醛-叶酸自组装水凝胶在抗菌药物中的应用。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种前述肉桂醛-叶酸自组装水凝胶在治疗皮肤伤口药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明公开的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，其有自缓释的，不仅解决了肉桂醛溶解率低、稳定性差的问题，而且保留了肉桂醛的生物活性。以肉桂醛和叶酸作为凝胶因子，将肉桂醛的醛基和叶酸的氨基形成席夫碱键，以锌离子作为配位键(羧基和锌离子形成配位)，利用席夫碱键、氢键、π-π键等非共价键作用通过自组装成具有三维网络结构的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶。
(2)本发明公开的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，肉桂醛具有抗菌和促血管生成作用，叶酸对细菌具有靶向性。肉桂醛和叶酸通过自组装形成水凝胶，该水凝胶不仅增强了肉桂醛的药理作用，还具有优秀的自我修复性能。该水凝胶易于注射，可以填充不规则的伤口，并实现良好的组织粘附，然后缓慢释放药物，延长药物作用时间。因此，肉桂醛-叶酸自组装水凝胶运用于皮肤创伤中，可以发挥协同作用，通过抗菌，促皮肤上皮和血管再生，从而发挥多功能治疗皮肤创伤的疗效，对促进肉桂醛应用于临床，成为临床新药具有积极意义。
(3)本发明公开的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的制备方法，制备过程简单，成本低，绿色环保，可商品化，适用于大规模生产，有望运用在组织工程，药物缓释和伤口愈合等生物医药领域。即保留了肉桂醛的生物活性，又延长肉桂醛在病变位置的作用时间，增强了药物的治疗效果，在生物医学方面具有良好的运用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1中的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶电镜扫描图。
图2是本发明实施例1、实施例2和实施例3的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的外观照片。
图3为本发明实施例1中肉桂醛单体、叶酸溶液和肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的傅里叶红外光谱图。
图4是本发明实施例1中肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的X射线衍射谱图。
图5是本发明实施例1中肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的步态扫描曲线。
图6是本发明实施例1中肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的缓释曲线。
图7是本发明对比例1和对比例2成品的外观照片。
图8是本发明对比例3成品的外观照片。
图9是本发明实施例4中肉桂醛-叶酸自组装水凝胶用于抑制金黄色葡萄球菌生长实验的照片。
图10是本发明实施例5中肉桂醛-叶酸自组装水凝胶用于制备治疗皮肤创伤药物实验的照片。
图11是本发明实施例5中肉桂醛-叶酸自组装水凝胶用于治疗大鼠皮肤伤口后对皮肤伤口产生血管内皮细胞生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor-A,VEGF-A)表达水平的影响图。
具体实施方式
以下将对本发明做进一步详细说明。除非特殊说明，本发明采用的仪器或材料为市售。
实施例1
本发明的一种肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，原料包括含有乙酸锌的肉桂醛溶液和叶酸溶液，叶酸溶液由叶酸溶解于氢氧化钠溶液中制备而成，采用以下制备方法制备得到：
取0.50mL叶酸溶液于2个螺口瓶中，边震荡边加入0.258mL浓度为8.80mg/mL的含有锌离子的肉桂醛溶液，静置5分钟可得到肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，在肉桂醛-叶酸自组装水凝胶中，肉桂醛的浓度为3.00mg/mL，叶酸的最终浓度为9.30mg/mL。
叶酸溶液采用以下制备方法制备而成：
氢氧化纳溶液的制备：称取0.50g氢氧化钠于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.125mol/L的氢氧化纳溶液。
叶酸溶液的制备：称取14.12mg叶酸于离心管中，加入1mL浓度为0.125mol/L的氢氧化钠溶液，震荡溶解，配置浓度为14.12mg/mL的叶酸溶液。
含有锌离子的肉桂醛溶液的制备：
乙酸锌溶液的制备：称取1.98g乙酸锌于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.09mol/L的乙酸锌溶液。本实施例中，采用乙酸锌溶液作为溶解肉桂醛的溶液，在其他实施例中，可采用硝酸锌溶液，也可取得相同或相似的技术效果。
肉桂醛溶液的制备：取8.80mg的肉桂醛于相应的螺口瓶中，向螺口瓶中边震荡边加入1mL浓度为0.09mol/L的乙酸锌溶液，配置成8.80mg/mL的含有锌离子的肉桂醛溶液。
本实施例中，将乙酸锌和肉桂醛溶液先配置成含有乙酸锌的肉桂醛溶液，再与叶酸溶液混合，有利于将肉桂醛的醛基和叶酸的氨基形成席夫碱键，再与乙酸锌配位呈凝胶，便于肉桂醛加入到自组装过程中(如果将叶酸和乙酸锌混合再加入肉桂醛溶液，叶酸将直接与乙酸锌形成配位，导致肉桂醛无法加入到自组装过程中，最终凝胶成分将不存在肉桂醛)。
实施例2
本发明的一种肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，原料包括含有乙酸锌的肉桂醛溶液和叶酸溶液，叶酸溶液由叶酸溶解于氢氧化钠溶液中制备而成，采用以下制备方法制备得到：
取0.50mL叶酸溶液于2个螺口瓶中，边震荡边加入0.258mL浓度为88mg/mL的含有锌离子的肉桂醛溶液，静置5分钟后可得到肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，在肉桂醛-叶酸自组装水凝胶中，肉桂醛的浓度为30mg/mL，叶酸的最终浓度为9.30mg/mL。
叶酸溶液采用以下制备方法制备而成：
氢氧化纳溶液的制备：称取0.50g氢氧化钠于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.125mol/L的氢氧化纳溶液。
叶酸溶液的制备：称取14.12mg叶酸于离心管中，加入1mL浓度为0.125mol/L的氢氧化钠溶液，震荡溶解，配置浓度为14.12mg/mL的叶酸溶液。
含有锌离子的肉桂醛溶液的制备
乙酸锌溶液的制备：称取1.98g乙酸锌于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.09mol/L的乙酸锌溶液。
肉桂醛溶液的制备：取88.00mg的肉桂醛于相应的螺口瓶中，向每个螺口瓶中边震荡边加入1mL浓度为0.09mol/L的乙酸锌溶液，配置成88mg/mL的肉桂醛溶液。
实施例3
本发明的一种肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，原料包括肉桂醛单体、叶酸溶液和乙酸锌溶液，叶酸溶液由叶酸溶解于氢氧化钠溶液中制备而成，采用以下制备方法制备得到：
取0.50mL叶酸溶液于1个螺口瓶中，加入2.34μL肉桂醛单体，再边震荡边加入0.258mL乙酸锌溶液，静置5分钟可得到肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，在肉桂醛-叶酸自组装水凝胶中，肉桂醛的浓度为3.00mg/mL，叶酸的最终浓度为9.30mg/mL。
叶酸溶液采用以下制备方法制备而成：
氢氧化纳溶液的制备：称取0.50g氢氧化钠于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.125mol/L的氢氧化纳溶液。
叶酸溶液的制备：称取14.12mg叶酸于离心管中，加入1mL浓度为0.125mol/L的氢氧化钠溶液，震荡溶解，配置浓度为14.12mg/mL的叶酸溶液。
乙酸锌溶液的制备：称取1.98g乙酸锌于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.09mol/L的乙酸锌溶液。本实施例中，采用乙酸锌溶液，在其他实施例中，可采用硝酸锌溶液，也可取得相同或相似的技术效果。
将实施例1得到的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶进行电镜扫描。电镜扫描的试验步骤：
1.硅片的清洗：先用水虎(浓硫酸(v)：双氧水(v)＝7：3)超声清洗15分钟，然后用乙醇超声清洗15分钟，最后用蒸馏水超声清洗15分钟(2次)，用氮气把硅片吹干。
2.将实施例1中肉桂醛浓度为3mg/mL的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶取10μL于吹干净的硅片上，在-80℃冷冻3h，放入冷冻干燥机中干燥24h，然后进行电镜扫描，由于生物样品的导电性差，扫描之前要喷金处理。
图1为实施例1的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶电镜扫描图。如图所示：肉桂醛-叶酸自组装水凝胶是由纳米纤维组成的三维网络空间结构。
用数码相机记录实施例1、实施例2和实施例3的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的外观。图2a是实施例1肉桂醛浓度为3mg/mL肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的数码照片图，图2b是实施例2肉桂醛浓度为30mg/mL肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的数码照片图，图2c是实施例3中肉桂醛的浓度为3.00mg/mL肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的数码照片图，肉桂醛-叶酸自组装水凝胶都为橘黄色，均一稳定的。
分别将实施例1中肉桂醛单体、叶酸溶液和肉桂醛-叶酸自组装水凝胶进行傅里叶红外测试。傅里叶红外测试实验步骤：把叶酸溶液和肉桂醛浓度为3mg/mL肉桂醛-叶酸自组装水凝胶冷冻干燥得到冻干样品，然后分别称取等质量的冻干样品与一定质量的溴化钾压片，得到片状的样品，将等质量的肉桂醛单体与一定质量的溴化钾高温烘干后，混合压片，得到片状的样品，进行红外测试。
图3为肉桂醛单体，叶酸溶液和肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的傅里叶红外光谱图。图3中曲线a是肉桂醛单体；曲线b是叶酸溶液；曲线c是肉桂醛-叶酸自组装水凝胶。肉桂醛中1680cm-1处属于醛基的伸缩振动吸收峰；叶酸中的3268cm-1处属于氨基的吸收峰，但这两个峰在肉桂醛-叶酸自组装水凝胶曲线中消失，在1630cm-1处出现了新的峰，说明在自组装形成肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的过程中肉桂醛的醛基与叶酸的氨基发生希夫碱键反应。而且，在3444cm-1处是叶酸O-H的伸缩振动吸收，在肉桂醛-叶酸自组装水凝胶曲线中O-H的伸缩振动吸收峰移动到34437cm-1处，这表明肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的形成是通过氢键相互作用的。此外，叶酸曲线中羟基对称和不对称振动分别发生在1405cm-1和1516cm-1，而在肉桂醛-叶酸自组装水凝胶曲线中，羟基对称和不对称振动峰出现在1415cm-1和1570cm-1，证明肉桂醛-叶酸自组装水凝胶在自组装过程中羧基和锌离子之间发生了配位。
分别将实施例1肉桂醛-叶酸自组装水凝胶进行X射线衍射测试。X射线衍射测试实验步骤：把肉桂醛浓度为3mg/mL肉桂醛-叶酸自组装水凝胶(实施例1)冷冻干燥得到冻干样品，然后取冻干样品压片，得到片状的样品，进行X射线衍射测试。
图4为实施例1肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的X射线衍射谱图。测试结果如图所示，
Figure BDA0003641168870000072
Figure BDA0003641168870000071
的发射峰是π-π堆积的典型距离，说明在自组装形成肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的过程中发生了π-π堆积。
测试实施例1中肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的自我修复性能，具体方法包括以下步骤：
(1)实验仪器：旋转流变仪TA(AR200EX)。
(2)操作步骤：
将肉桂醛-叶酸自组装水凝胶放入旋转流变仪上，第一步，肉桂醛-叶酸自组装水凝胶以0.5％的应变振幅进行测试。然后，应变振幅从0.5％增加至50％，保持30秒。第二步，应变振幅再次从50％降低到0.5％，保持30秒。将上述步骤重复测试5次。在整个测试过程中，频率保持在1Hz，温度保持在25℃。
图5为实施例1中肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的步态扫描曲线。据观察，当应变从0.5％增加到50％时，肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的粘性模量(G″)值大于弹性模量(G′)值，说明肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的三维网络结构已经被破坏，凝胶已坍塌。当应变从50％减小至0.5％时，G′大于G″，说明肉桂醛-叶酸自组装水凝胶快速重构了三维纤维网络，重新恢复水凝胶状态。该步骤重复5次，结果不变，证明肉桂醛-叶酸自组装水凝胶具有稳定的自我修复性能。
测试实施例1中肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的缓释性能，具体方法包括以下步骤：
(1)实验仪器：全温震荡培养箱华恰(HZQ-F160)；紫外分光光度计赛默飞(GENESYS180)；干净离心管；系列可调节的移液枪及枪头。
(2)操作步骤：
首先将758μL肉桂醛-叶酸自组装水凝胶(实施例1)装在2mL的离心管中，同时将1mL磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.4，0.01M)加入EP管内。然后将该离心管转移到恒温水浴振荡器内，并以100rpm的速度摇动，温度设置为37℃。按预先设定好的时间间隔，每次收集500μL的上清液，用紫外分光光度计测量释放的肉桂醛和叶酸的量，然后添加500μL PBS。计算固定时间点内肉桂醛和叶酸的累积释放量，并用百分比表示，以时间-累积释放率为横纵坐标绘制释放曲线。实验结果见图6。
图6为实施例1中肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的缓释曲线。肉桂醛和叶酸在第一天都表现出了快速的释放行为，然后在5天内稳定释放。叶酸累计释放量达总剂量的80.47％，肉桂醛为100.00％，表明肉桂醛和叶酸可以连续和稳定地从肉桂醛-叶酸自组装水凝胶中释放到外界。
对比例1
本对比例的肉桂醛-叶酸溶液，其制备方法与实施例1大致相同，不同之处在于：肉桂醛溶液制备时采用的乙酸锌溶液中锌离子浓度为0.07mol/L。
对比例2
本对比例的肉桂醛-叶酸溶液，其制备方法与实施例1大致相同，不同之处在于：肉桂醛溶液制备时采用的乙酸锌溶液中锌离子浓度为0.11mol/L。
如图7所示，图7a为对比例1成品的外观照片，图7b为对比例2成品的外观照片，对比例1和对比例2分别由于肉桂醛溶液中锌离子浓度过低或过高，无法形成水凝胶。
对比例3
本对比例的肉桂醛-叶酸溶液，其制备方法与实施例1大致相同，不同之处在于：含有锌离子的肉桂醛溶液制备采用的肉桂醛为96.80mg(含有锌离子的肉桂醛溶液中肉桂醛的浓度为96.80mg/mL)，肉桂醛-叶酸溶液中肉桂醛的浓度为31mg/mL。
如图8所示，本对比例由于肉桂醛溶液中肉桂醛浓度过高，无法形成水凝胶。
实施例4
本实施例的一种肉桂醛-叶酸自组装水凝胶在杀菌药物领域的应用，本实施例所针对的细菌为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，具体方法包括以下步骤：
1.细菌菌落计数实验测试细菌生长的情况：
(1)实验仪器：超净工作台AIRTECH(SW-CJ-1FD)；全温震荡培养箱华恰(HZQ-F160)；多功能酶标分析仪汇松(MB-530)；干净试管和离心管；L型无菌涂菌棒；系列可调节的移液枪及枪头。
(2)实验试剂的配制：本实施例中，金黄色葡萄球菌为河南省工业微生物菌种工程技术研究中心生产的，批号为Lot:133264；铜绿假单胞菌为北京生物保藏中心生产的，批号为Lot：20210218。
LB液体培养基的配制：称取2.50g LB液体培养基粉末于250mL的锥形瓶中，加入100mL超纯水，使用牛皮纸对锥形瓶封口，放入高压灭菌锅121℃，灭菌15分钟，获得LB液体培养基，放置4°保存。
LB琼脂培养皿的配制：分别称取2.50g LB液体培养基粉末和2.00g琼脂糖于250mL的锥形瓶中，加入100mL超纯水，使用牛皮纸对锥形瓶封口，放入高压灭菌锅121℃，灭菌15分钟，获得LB琼脂培养皿，放置4°保存。
金黄色葡萄球菌的复苏：打开含有金黄色葡萄球菌冻干粉的冻干管，将0.50mL LB液体培养基注入冻干管中，用移液枪轻轻吹打，充分溶解成菌悬液。取200μL菌悬液于LB琼脂培养皿上，用L型无菌涂菌棒涂布均匀，放置于全温震荡培养箱37℃孵育过夜。第二天取3mL LB液体培养基加入到50mL无菌离心管中，用10μL的枪头挑取培养皿上单个菌落于离心管中，放置于全温震荡培养箱37℃，250rpm培养9～10h，使用多功能酶标分析仪测金黄色葡萄球菌的OD600，取OD600值为0.4～0.6时处于对数生长期的金黄色葡萄球菌。使用LB液体培养基将金黄色葡萄球菌浓度稀释至5×103CFU/mL。
铜绿假单胞菌的复苏：取3mL LB液体培养基加入到50mL无菌离心管中，使用200μL枪头挑取琼脂斜面上的铜绿假单胞菌，打入离心管中，将离心管放置于全温震荡培养箱37℃，250rpm培养4h。取200μL菌悬液于LB琼脂培养皿上，用L型无菌涂菌棒涂布均匀，放置于全温震荡培养箱37℃孵育过夜。第二天取3mL LB液体培养基加入到50mL无菌离心管中，用10μL的枪头挑取培养皿上单个菌落于离心管中，放置于全温震荡培养箱37℃，250rpm培养9～10h，使用多功能酶标分析仪测铜绿假单胞菌的OD600，取OD600值为0.4～0.6时处于对数生长期的铜绿假单胞菌。使用LB液体培养基将铜绿假单胞菌浓度稀释至5×104CFU/mL。
(3)操作步骤：
3.1按上述方法配置试剂，备用。
3.2分别取3mL浓度为5×103CFU/mL金黄色葡萄球菌于两管50mL无菌离心管中，分别加入100μL的pH＝7.4，浓度为0.01mol/L的无菌磷酸缓冲盐溶液和100μL的肉桂醛浓度为30mg/mL的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶制成含药菌悬液，无菌磷酸缓冲盐溶液作为空白对照。将两管离心管放置于全温震荡培养箱37℃，250rpm培养3h，然后在两个离心管中分别取10μL含药菌悬液于两个LB琼脂培养皿上。将两个LB琼脂培养皿放置于全温震荡培养箱37℃，250rpm培养24h。用数码相机记录每个LB琼脂培养皿上的金黄色葡萄球菌，实验结果见图9a和图9b。
3.3分别取3mL浓度为5×104CFU/mL铜绿假单胞菌于两管50mL无菌离心管中，分别加入100μL的pH＝7.4，浓度为0.01mol/L的无菌磷酸缓冲盐溶液和100μL肉桂醛浓度为30mg/mL的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶制成含药菌悬液，无菌磷酸缓冲盐溶液作为空白对照。将两管离心管放置于全温震荡培养箱37℃，250rpm培养3h，然后在两个离心管中分别取10μL含药菌悬液于两个LB琼脂培养皿上。将两个LB琼脂平板放置于全温震荡培养箱37℃，250rpm培养24h。用数码相机记录每个LB琼脂平板上的铜绿假单胞菌,实验结果见图9c和图9d。
图9为本实施例肉桂醛-叶酸自组装水凝胶对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生长的影响试验照片。图9a和图9b为肉桂醛-叶酸自组装水凝胶对金黄色葡萄球菌生长的影响；图9c和图9d为肉桂醛-叶酸自组装水凝胶对铜绿假单胞菌生长的影响。从图9a和图9b可以看出，与空白对照比，含有肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的LB琼脂培养皿上几乎没有金黄色葡萄球菌生长，说明肉桂醛-叶酸自组装水凝胶可以抑制金黄色葡萄球菌的生长；从图9c和图9d可以看出，于空白对照比，含有肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的LB琼脂培养皿上几乎没有铜绿假单胞菌生长，说明肉桂醛-叶酸自组装水凝胶对铜绿假单胞菌的生长有抑制作用。
实施例5
本实施例的一种肉桂醛-叶酸自组装水凝胶在治疗皮肤伤口药物中的应用，具体方法包括以下步骤：
1.实验动物：清洁级成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠12只，体重220～250g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物质量合格证编号：No.430727221100083837。所有实验由中南大学实验动物伦理委员会批准，中南大学实验动物福利伦理审查受理编号：2021sydw0259，并根据《实验动物的饲养和使用指南(2012版)》实施。所有大鼠分笼喂养在标准条件下(50±10％相对湿度，12/12h昼夜循环，22±2℃)，并提供自由采食的食物和水。所有大鼠适应环境至少1周，造模前禁食12小时。
2.实验试剂的配制：
戊巴比妥钠溶液：称取15mg戊巴比妥钠于50mL离心管中，加入50mL生理盐水，充分溶解，获得浓度为3mg/mL的戊巴比妥钠溶液。
3.动物分组：12只SD大鼠，自由饮水、进食，适应性饲养一周，称重，编号，采用随机数字表法随机分为两组，分别为空白对照组、肉桂醛浓度为3mg/mL的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶治疗组，每组6只大鼠。
4.SD大鼠皮肤伤口模型制备与给药：
空白对照组：用3％戊巴比妥钠(0.21mL/100g)腹腔注射麻醉后，使用剃毛器除去大鼠背部皮毛，然后用碘伏对皮肤进行消毒，用外科手术剪在大鼠背部皮肤上剪一个直径为1cm的圆形伤口。损伤当天记为0天，损伤第二天记为伤后1天，以此类推。待大鼠苏醒后，用注射器注射200μL的pH＝7.4，浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，每天1次。在伤后0天、7天、14天，使用数码相机记录伤口修复情况。在伤后14天收集皮肤伤口组织，-80℃保存，进行后续检测。
肉桂醛-叶酸自组装水凝胶治疗组：用3％戊巴比妥钠(0.21mL/100g)腹腔注射麻醉后，使用剃毛器除去大鼠背部皮毛，然后用碘伏皮肤消毒，用外科手术剪在大鼠背部皮肤上剪一个直径为1cm的圆形伤口。损伤当天记为0天，损伤第二天记为伤后1天，以此类推。待大鼠苏醒后，用注射器在伤口区域注射200μL肉桂醛浓度为3mg/mL的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，每天1次。在伤后0天、7天、14天，使用数码相机记录伤口愈合情况。在伤后14天收集皮肤伤口组织，-80℃保存，进行后续检测。
5.用数码相机记录使用PBS和肉桂醛-叶酸自组装水凝胶治疗后大鼠皮肤伤口在伤后0天、7天、14天的修复情况。
图10为使用空白对照和肉桂醛-叶酸自组装水凝胶治疗后大鼠皮肤伤口上皮在伤后0天、7天、14天的再生情况。从图10可以看出，与空白对照组相比，肉桂醛-叶酸自组装水凝胶治疗组的皮肤伤口再生情况更佳，在伤后14天，肉桂醛-叶酸自组装水凝胶治疗组的皮肤伤口几乎消失，再生出新生皮肤组织。这说明肉桂醛-叶酸自组装水凝胶可以促进大鼠皮肤伤口的上皮再生，使皮肤伤口修复。
6.ELISA法测定大鼠皮肤伤口中血管内皮生长因子A的表达水平
(1)实验仪器：台式离心机力恒(H1-16KR)；自动洗板机优利特(670)；多功能酶标分析仪汇松(MB-530)；恒温培养箱力辰(303-1B)；干净试管和离心管；容量瓶；系列可调节移液枪及枪头。
(2)样本采集：分别收集皮肤伤口组织，加入等量的pH＝7.4，浓度为0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液，用匀浆器将皮肤伤口组织匀浆充分。于12000rpm离心20min仔细收集上清，-20℃冰箱保存留作实验的样本，实验之前从冰箱取出，自然解冻。
(3)实验试剂的配制：
本实施例中，试剂盒为湖南艾方生物科技有限公司生产的ELISA法试剂盒，其中各试剂盒的批号如下：血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)的试剂盒为Lot:20210728-J40076。
洗涤工作液：将浓洗涤液(本实施例为0.02mol/L PBS(pH＝7.4)加上0.05％吐温-20)按1：20倍用去离子水进行稀释，具体为：用量筒量取190mL去离子水，倒入烧杯或其他洁净容器中，再量取10mL浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
(4)操作步骤：
4.1将各种试剂移至室温(18～25℃)平衡至少30min，按前述方法配置试剂，备用。
4.2加样：分别设(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔和待测样品孔。待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL，标准孔每孔加不同标准品100μL，轻轻晃动混匀。
4.3加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。
4.4温育：用封板膜封板后置37℃温育1h。
4.5洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
4.6显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
4.7终止：每孔加终止液50μL，终止反应。
4.8测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，计算血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)的含量。实验结果见图11。
图11为肉桂醛-叶酸自组装水凝胶治疗大鼠皮肤伤口后对皮肤伤口产生血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)表达水平的影响，从图11可以看出：与空白对照组相比(#p<0.01)，肉桂醛-叶酸自组装水凝胶治疗组VEGF-A的水平显著增加，说明肉桂醛-叶酸自组装水凝胶能够通过提高皮肤伤口VEGF-A的表达水平，促进皮肤伤口的血管新生。
综上所述，本发明的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶能抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长，促进大鼠皮肤伤口上皮再生和显著提高血管内皮细胞生长因子A的表达水平。这表明，肉桂醛-叶酸自组装水凝胶可以用于治疗皮肤伤口，在制备治疗皮肤伤口药物中发挥着重要的作用。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，其特征在于：所述肉桂醛-叶酸自组装水凝胶以肉桂醛和叶酸为凝胶因子，将肉桂醛的醛基和叶酸的氨基形成席夫碱键，以锌离子为配位键，通过非共价键作用自组装而成。
2.根据权利要求1所述的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶，其特征在于：所述肉桂醛-叶酸自组装水凝胶中，所述肉桂醛的浓度小于等于30mg/mL，叶酸的浓度范围为8mg/mL至15mg/mL。
3.一种根据权利要求1或2所述肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将锌盐溶液和肉桂醛溶液混合，得到含有锌离子的肉桂醛溶液；
S2、在震荡或搅拌的条件下，将叶酸溶液和含有锌离子的肉桂醛溶液混合，静置，得到肉桂醛-叶酸自组装水凝胶。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述锌盐溶液的浓度为0.08mol/L至0.10mol/L：所述含有锌离子的肉桂醛溶液中肉桂醛的浓度小于等于88mg/mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述叶酸溶液包括以下制备步骤：将叶酸溶于氢氧化纳溶液中，得到叶酸溶液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述氢氧化钠溶液的浓度范围为0.10mol/L至0.15mol/L；所述叶酸溶液中叶酸的浓度范围为13mg/mL至15mg/mL。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述静置时间为5min以上。
8.一种根据权利要求1或2所述的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将叶酸溶液和肉桂醛混合，得到的叶酸肉桂醛溶液；
S2、在震荡或搅拌的条件下，将锌盐溶液和叶酸肉桂醛溶液混合，静置，得到肉桂醛-叶酸自组装水凝胶。
9.一种根据权利要求1或2所述肉桂醛-叶酸自组装水凝胶或根据权利要求3至8中任一项制备方法制备得到的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶在抗菌药物中的应用。
10.一种根据权利要求1或2所述肉桂醛-叶酸自组装水凝胶或根据权利要求3至8中任一项制备方法制备得到的肉桂醛-叶酸自组装水凝胶在治疗皮肤伤口药物中的应用。
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XINYU SUN ET AL: "Green Regenerative Hydrogel Wound Dressing Functionalized by Natural Drug-Food Homologous Small Molecule Self-Assembled Nanospheres" *

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