CN114778500A - 一种高功率大视场多波段照明荧光成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高功率大视场多波段照明荧光成像系统，包括光源模块，用于产生照明光；混光匀光模块，用于将照明光变为均匀的平行光；探测成像模块，用于基于平行光对生物样品进行照明并提取信号光。系统采用宽场照明的方式进行荧光激发，用高通量介观显微物镜进行同轴探测成像，获得信息通量极大的大视场高分辨率荧光信号，探测端采用大靶面工业相机直接成像。本发明照明光路搭建简单，成本低廉，光能利用率高，能够实现可见光至近红外光的混合照明或单独照明，照明均匀性好。该系统成像速度快，远超点扫描成像速度。

Description

一种高功率大视场多波段照明荧光成像系统
技术领域
本发明属于光学显微成像技术领域，特别是大视场多波段照明荧光显微镜领域，尤其涉及一种高功率大视场多波段照明荧光成像系统。
背景技术
现代用于生物样本成像的需求逐渐向高通量方向发展，力图能在一张图中展示更多的生物细节，过去对于大视场照明成像，一般用两种方法：要么是采用点探测的方式，通过振镜扫描逐个点亮荧光团然后探测，但这样成像速度慢，并且会带来像差；要么是直接用卤素灯或者汞灯这类大功率照明器件来照明，而这种方法能耗高，光能利用率低。
最近一些相关研究采用特殊设计的物镜，可以在保持高分辨率的同时具有较大成像视场。在文章(McConnell G,
Figure BDA0003578343220000011
J,Amor R,et al.A novel optical microscopefor imaging large embryos and tissue volumes with sub-cellular resolutionthroughout[J].Elife,2016,5:e18659.)中，研究人员设计了一款特殊的物镜进行大视场高分辨率成像，该物镜采用共聚焦照明和落射式照明两种照明方式。共聚焦照明探测端为点探测器，最终成像图像为20000*20000像素，视场直径可达6mm，分辨率为0.6μm。然而采用点探测的方式，最终成像速度较慢，一帧图像需要200s；而落射式探测时使用短弧汞灯，光能损耗大。两种方式都存在一定短板。
文章(Thakur M M,Melnik D G,Barnett H,et al.Wide-field four-channelfluorescence imager for biological applications[J].Journal of BiomedicalOptics,2010,15(2):026016.)提出将四种波长激光的并成一束用于照明6mm×9mm的区域。其所用激光器波长分别为408nm、532nm、658nm和784nm，光功率分别为60mW、150mW、90mW和120mW。由于研究人员使用的是单模光纤，最大光照强度不超过1W，不适合用于高功率照明。并且他的照明方案为样品上方倾斜入射，而介观物镜的光学表面距离样品面通常只有3mm左右，倾斜入射方式不适用于介观物镜。
因此，现有的大视场荧光显微镜主要缺陷是：或使用大功率汞灯或卤素灯进行照明成像，光能利用率低，需要特定的滤光片镜组才能得到需要波长；或采用点扫描的方式对大视场进行逐点扫描，这样需要光功率低，但是一幅图成像需要数秒的时间；或使用激光照明，但其光功率低，无法有效激活荧光。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种高功率、大视场、多波段、均匀性好的激光照明成像系统。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种高功率大视场多波段照明荧光成像系统，所述系统包括光源模块、混光匀光模块和探测成像模块；
所述光源模块，用于产生照明光；
所述混光匀光模块，用于将照明光变为均匀的平行光；
所述探测成像模块，用于基于平行光对生物样品进行照明并提取信号光。
进一步地，所述光源模块包括激光器和光纤耦合器，所述激光器为非光纤类激光器或光纤激光器，激光器发出的光耦合进入光纤耦合器。
进一步地，所述混光匀光模块包括沿光轴依次设置的多模光纤合束器、匀光机、准直透镜、第二透镜、第三光阑和第三透镜，所述多模光纤合束器与光纤耦合器连接，其将多束激光混合成一束光，之后经过匀光机后输出均匀的混合光，所述准直透镜将发散光束准直为平行光出射，所述第二透镜、第三光阑和第三透镜构成4f光学系统，用于将平行光束调整到所需大小的光斑，滤除杂散光。
进一步地，所述探测成像模块对生物样品进行照明的方式包括但不限于使照明光直接穿过样品射入物镜中的透射式照明，或者利用物镜本身的聚光性质从物镜后方入射投射到样品上的落射式照明。
本发明与现有技术相比，其显著优点为：
1)照明光路搭建简单，成本低廉，光能利用率高，能够实现可见光至近红外光的混合照明或单独照明，照明均匀性好。
2)该系统成像速度快，远超点扫描成像速度。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1为本发明高功率大视场多波段照明荧光成像系统的方案一示意图。
图2为本发明高功率大视场多波段照明荧光成像系统的方案二示意图。
图3为匀光机结构示意图。
图4为二向色镜及色差补偿镜示意图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提出了一种高功率大视场多波段照明荧光成像系统，该系统采用宽场照明的方式进行荧光激发，用高通量介观显微物镜进行同轴探测成像，获得信息通量极大的大视场高分辨率荧光信号，探测端采用大靶面工业相机直接成像。
在一个实施例中，提供了一种高功率大视场多波段照明荧光成像系统，所述系统包括光源模块1、混光匀光模块2和探测成像模块3；
所述光源模块1，用于产生照明光；
所述混光匀光模块2，用于将照明光变为均匀的平行光；
所述探测成像模块3，用于基于平行光对生物样品进行照明并提取信号光。
进一步地，在其中一个实施例中，结合图1和图2，所述光源模块1包括激光器和光纤耦合器15，所述激光器为固体激光器或其他非光纤类激光器11或光纤激光器12，激光器发出的光耦合进入光纤耦合器15。激光器可选波段为300nm至1200nm，单个功率限制在20W以下。激光器可以选择同一波长以获得更大功率照明，也可以选择不同波长实现多种波段的光混合照明。
进一步地，在其中一个实施例中，结合图1和图2，所述激光器为非光纤类激光器11时，所述光源模块还包括与非光纤类激光器同光轴依次设置的第一光阑131、第二光阑132、第一透镜14，激光器发出的光经第一光阑131和第二光阑132准直为水平出射激光，之后经第一透镜14耦合进入光纤耦合器15。
进一步地，在其中一个实施例中，所述混光匀光模块2包括沿光轴依次设置的多模光纤合束器21、匀光机22、准直透镜231、第二透镜232、第三光阑24和第三透镜233，所述多模光纤合束器21与光纤耦合器15连接，其将多束激光混合成一束光，之后经过匀光机22后输出均匀的混合光，所述准直透镜231将发散光束准直为平行光出射，所述第二透镜232、第三光阑24和第三透镜233构成4f光学系统，用于将平行光束调整到所需大小的光斑，滤除杂散光。
这里，多模光纤合束器21选择为200μm多模光纤束，激光进入多模光纤后会在光纤内部发生多次反射和干涉现象形成一个个亮点样的散斑。晃动光纤时由于光路结构发生变化，散斑图样也会发生变化，当晃动剧烈时光照趋于均匀，据此原理设计如图3所示的匀光机22，包括壳体2213以及位于壳体2213内的电机221、载重块222、第一螺栓型滚轮223、摇杆224、第二螺栓型滚轮225、滑块连接器226、滑块227、振动L型块228、导轨2210、第一光纤卡扣2211和第二光纤卡扣2212，所述导轨2210固定在壳体2213内且与壳体2213底部平行设置，所述滑块227安装在导轨2210上，载重块222的底部与电机221的电机轴相连，上部通过第一螺栓型滚轮223与摇杆224的一端相连，摇杆224的另一端通过第二螺栓型滚轮225与固定在滑块227上的滑块连接器226相连，滑块连接器226上还固定安装振动L型块228，振动L型块228的一个臂伸出壳体2213顶部的开口且与壳体2213顶部表面相平行，所述第一光纤卡扣2211和第二光纤卡扣2212分别固定在壳体2213顶部表面、伸出壳体2213顶部开口的振动L型块228的一个臂上，用于固定多模光纤合束器21的两端；当电机221转动时，产生扭力带动载重块222转动，载重块222、摇杆224和滑块227组成曲柄连杆装置，带动振动L型块228沿导轨2210的轴向方向做线性运动，使得多模光纤合束器21发生快速形变从而产生均匀的照明光。通过控制电压能够实现转速调整，调节摇杆224长度能够调整振幅大小。
进一步地，在其中一个实施例中，所述探测成像模块3对生物样品35进行照明的方式包括但不限于使照明光直接穿过样品射入物镜中的透射式照明，或者利用物镜本身的聚光性质从物镜后方入射投射到样品上的落射式照明。
如图1所示，采用的是透射式照明方案，照明光经过反射镜32垂直射向生物样品35，激发荧光后照明光和荧光信号一起进入高通量介观物镜34，通过滤光片33时照明光被滤除，荧光信号通过滤光片33进入大靶面相机31成像。如图2所示，采用的是落射式照明方案，平行光经二向色镜32反射后通过与二向色镜同折射率同厚度的玻璃33，进入高通量介观物镜34，而后照射在样品上激发荧光。样品发出的荧光通过高通量介观物镜34被收集成像到大靶面相机31上，生物样品35和大靶面相机31的传感器面为共轭面，当少量照明光反射进入介观物镜34后被二向色镜32反射无法进入相机。由于二向色镜32存在，当荧光经过时会产生像差，需要增加一个同材质相同厚度的玻璃补偿像差，如图4所示，上面一块玻璃为二向色镜，下面一块玻璃为同尺寸同材料的不镀膜玻璃，二向色镜与xy平面沿x轴顺时针旋转45度平行，像差补偿玻璃与xy平面沿y轴顺时针旋转45度平行。
本发明光学照明系统搭配高通量介观物镜34和大靶面相机31进行设计，高通量介观物镜34兼具大视场和高分辨率的特点，信息容量大，物镜物方视场为8mm，数值孔径为0.5，优化波段为400nm至1000nm，镜头后方直径为91mm。大靶面相机31像素数为10640×14192，成像速度为6fps，同时内置像素位移模块，能够移动像素块，使总像素数达到原来的4倍，满足采样率需求。选用多模光纤照明，纤芯直径为200μm，在保持长时间使用的情况下能够承受约80W的照明功率，光纤内部对300nm至1200nm的透射光进行了优化处理，保持很高的透过率，合束部分长为2m，满足机械匀光器的需要。对于透射式照明，定制2英寸滤光片和相机安装架。对于落射式照明，定制70mm×90mm的二向色镜以及同材质同大小的不镀膜玻璃。
本发明照明光路搭建简单，成本低廉，光能利用率高，能够实现可见光至近红外光的混合照明或单独照明，照明均匀性好。该系统成像速度快，远超点扫描成像速度。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高功率大视场多波段照明荧光成像系统，其特征在于，所述系统包括光源模块(1)、混光匀光模块(2)和探测成像模块(3)；
所述光源模块(1)，用于产生照明光；
所述混光匀光模块(2)，用于将照明光变为均匀的平行光；
所述探测成像模块(3)，用于基于平行光对生物样品进行照明并提取信号光。
2.根据权利要求1所述的高功率大视场多波段照明荧光成像系统，其特征在于，所述光源模块(1)包括激光器和光纤耦合器(15)，所述激光器为非光纤类激光器(11)或光纤激光器(12)，激光器发出的光耦合进入光纤耦合器(15)。
3.根据权利要求2所述的高功率大视场多波段照明荧光成像系统，其特征在于，所述激光器为非光纤类激光器(11)时，所述光源模块还包括与非光纤类激光器同光轴依次设置的第一光阑(131)、第二光阑(132)、第一透镜(14)，激光器发出的光经第一光阑(131)和第二光阑(132)准直为水平出射激光，之后经第一透镜(14)耦合进入光纤耦合器(15)。
4.根据权利要求1或3所述的高功率大视场多波段照明荧光成像系统，其特征在于，所述混光匀光模块(2)包括沿光轴依次设置的多模光纤合束器(21)、匀光机(22)、准直透镜(231)、第二透镜(232)、第三光阑(24)和第三透镜(233)，所述多模光纤合束器(21)与光纤耦合器(15)连接，其将多束激光混合成一束光，之后经过匀光机(22)后输出均匀的混合光，所述准直透镜(231)将发散光束准直为平行光出射，所述第二透镜(232)、第三光阑(24)和第三透镜(233)构成4f光学系统，用于将平行光束调整到所需大小的光斑，滤除杂散光。
5.根据权利要求4所述的高功率大视场多波段照明荧光成像系统，其特征在于，所述匀光机(22)包括壳体(2213)以及位于壳体(2213)内的电机(221)、载重块(222)、第一螺栓型滚轮(223)、摇杆(224)、第二螺栓型滚轮(225)、滑块连接器(226)、滑块(227)、振动L型块(228)、导轨(2210)、第一光纤卡扣(2211)和第二光纤卡扣(2212)，所述导轨(2210)固定在壳体(2213)内且与壳体(2213)底部平行设置，所述滑块(227)安装在导轨(2210)上，载重块(222)的底部与电机(221)的电机轴相连，上部通过第一螺栓型滚轮(223)与摇杆(224)的一端相连，摇杆(224)的另一端通过第二螺栓型滚轮(225)与固定在滑块(227)上的滑块连接器(226)相连，滑块连接器(226)上还固定安装振动L型块(228)，振动L型块(228)的一个臂伸出壳体(2213)顶部的开口且与壳体(2213)顶部表面相平行，所述第一光纤卡扣(2211)和第二光纤卡扣(2212)分别固定在壳体(2213)顶部表面、伸出壳体(2213)顶部开口的振动L型块(228)的一个臂上，用于固定多模光纤合束器(21)的两端；当电机(221)转动时，产生扭力带动载重块(222)转动，载重块(222)、摇杆(224)和滑块(227)组成曲柄连杆装置，带动振动L型块(228)沿导轨(2210)的轴向方向做线性运动，使得多模光纤合束器(21)发生快速形变从而产生均匀的照明光。
6.根据权利要求5所述的高功率大视场多波段照明荧光成像系统，其特征在于，所述多模光纤合束器(21)发生形变的速度通过控制电机的电压实现调整。
7.根据权利要求5所述的高功率大视场多波段照明荧光成像系统，其特征在于，所述多模光纤合束器(21)产生的均匀照明光的振幅大小通过调节摇杆(224)的长度实现调整。
8.根据权利要求1所述的高功率大视场多波段照明荧光成像系统，其特征在于，所述探测成像模块(3)对生物样品(35)进行照明的方式包括但不限于使照明光直接穿过样品射入物镜中的透射式照明，或者利用物镜本身的聚光性质从物镜后方入射投射到样品上的落射式照明。
9.根据权利要求8所述的高功率大视场多波段照明荧光成像系统，其特征在于，对于透射式照明，所述探测成像模块(3)包括沿光轴依次设置的反射镜(32)、高通量介观物镜(34)、滤光片(33)和相机(31)，所述4f光学系统输出的光经反射镜(32)反射后垂直照射在生物样品(35)上激发荧光，照明光和生物样品(35)发出的荧光被高通量介观物镜(34)收集，之后荧光信号经滤光片(33)进入相机(31)成像。
10.根据权利要求8或9所述的高功率大视场多波段照明荧光成像系统，其特征在于，对于落射式照明，所述反射镜(32)替换为二向色镜(32)，所述滤光片(33)替换为与二向色镜同折射率同厚度的玻璃(33)，所述4f光学系统输出的光经二向色镜(32)反射后通过玻璃(33)进入高通量介观物镜(34)，之后照射在生物样品(35)上激发荧光，生物样品(35)发出的荧光被高通量介观物镜(34)收集，之后经二向色镜(32)透射后成像到相机(31)上。
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