CN114761581A - 用于选择体外受精的供体和受体的组合物、方法和套件 - Google Patents

用于选择体外受精的供体和受体的组合物、方法和套件 Download PDF

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Abstract

本公开尤其提供了用于使用微生物组谱来提高小型反刍动物的体外受精的成功率的组合物、方法和套件。根据一些方面，本公开提供了一种用于将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对以及用于选择雌性供体受试者的方法和套件。根据其他方面，本公开提供了一种产生微生物组数据库的方法。

Description

用于选择体外受精的供体和受体的组合物、方法和套件
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月4日提交的美国临时专利申请序列号62/910,802的权益，该临时专利申请以引用的方式整体并入本文。
背景技术
体外受精(IVF)和胚胎移植技术常用于生产小型反刍动物后代，诸如牛犊生产。由于可以进行IVF抽吸的频率和增加遗传多样性的能力，IVF与其他生产方法相比具有一些优点。例如，供体母牛的IVF抽吸可以每两周进行一次，来自几头不同公牛的精液可用于使收获的卵母细胞受精，从而从一头母牛中产生大量后代。虽然胚胎移植技术每六十天每次收集可产生约五或六个胚胎，但是IVF收集每两周可产生每次抽吸约20个卵母细胞，其中约30％发育成有活力的胚胎。在某些情况下，IVF可用于在一年内从一头奶牛中生产50多头小牛。此外，妊娠供体母牛仍可用于收集卵母细胞，直到妊娠约100天至120天，这使得在收集卵母细胞的同时仍能从高价值母牛生产后代。
然而，使用IVF技术生产小型反刍动物后代存在一些缺点。IVF程序可以很昂贵，并且用于收集卵母细胞的卵泡抽吸方法是需要熟练技术人员的侵入性程序。此外，即使执行得当，新移植的IVF胚胎对于管理良好的受体母牛来说，平均妊娠率也只有50％左右。在导致妊娠的移植中，约6％至约16％的妊娠是失败的。因此，需要在使用IVF时提高妊娠起始和妊娠维持的成功率以最大限度地提高后代生产效率的组合物、方法和套件。
发明内容
根据一些方面，本公开提供了一种将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对以进行体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者中的每一者获得微生物样品，其中所述微生物样品从阴道、子宫和卵泡液和/或表面中的一者或多者获得；(2)鉴定来自所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者中的每一者的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品的微生物组谱；以及(3)从所述雌性供体受试者获得一个或多个卵母细胞或卵子，通过体外受精使所述一个或多个卵母细胞或卵子受精，并且如果所述雌性供体受试者的所述微生物组谱和所述雌性受体受试者的所述微生物组谱指示高妊娠起始率和高妊娠至足月维持率，则将受精的胚胎移植到所述雌性受体受试者中。
在一些实施方案中，所述雌性供体受试者的卵泡微生物组谱指示卵母细胞在体外产生胚胎的质量和能力。在一些实施方案中，所述雌性受体受试者的阴道微生物组谱和子宫微生物组谱指示在胚胎移植到所述雌性受体受试者后妊娠高度成功。在一些实施方案中，所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。在一些实施方案中，所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。在一些实施方案中，所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者是小型反刍动物。在一些实施方案中，所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。在一些实施方案中，所述雌性供体受试者的所述微生物组谱和所述雌性受体受试者的所述微生物组谱指示妊娠起始率大于75％以及妊娠维持率大于90％。
根据一些方面，本公开提供了一种产生用于将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对以进行体外受精的微生物组数据库的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从雌性供体受试者群体和雌性受体受试者群体收集微生物样品，其中所述微生物样品从阴道、子宫和卵泡液和/或表面中的一者或多者获得；(2)鉴定来自所述雌性供体受试者群体和所述雌性受体受试者群体中的每个受试者的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱；(3)从所述雌性供体受试者群体中的一个或多个受试者获得一个或多个卵母细胞或卵子，通过体外受精使所述一个或多个卵母细胞或卵子受精，并且将受精的胚胎移植到所述雌性受体受试者群体中的一个或多个受试者中；以及(4)鉴定来自所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者中的一者或多者的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的所述微生物组谱与高体外受精成功率的关联。
在一些实施方案中，所述雌性供体受试者的卵泡微生物组谱指示卵母细胞在体外产生胚胎的质量和能力。在一些实施方案中，所述雌性受体受试者的阴道微生物组谱和子宫微生物组谱指示在胚胎移植到所述雌性受体受试者后妊娠高度成功。在一些实施方案中，所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。在一些实施方案中，所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。在一些实施方案中，针对至少300个雌性供体受试者和至少300个雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱。在一些实施方案中，针对分层成一个或多个年龄范围的雌性供体受试者和雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的所述微生物组谱。在一些实施方案中，所述雌性供体受试者群体和所述雌性受体受试者群体是小型反刍动物。在一些实施方案中，所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
根据一些方面，本公开提供了一种提高体外受精妊娠的成功率的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从雌性供体受试者和雌性受体受试者中的一者或多者获得微生物样品，其中所述微生物样品从阴道、子宫和卵泡液和/或表面中的一者或多者获得；(2)鉴定来自所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者中的一者或多者的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱；以及(3)对所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者中的一者或多者实施干预，其中所述干预有效地为一个或多个雌性供体受试者和雌性受体受试者提供与高体外受精成功率关联的微生物组谱。
在一些实施方案中，将所述干预施用于所述雌性供体受试者，并且有效地提供与卵母细胞在体外产生胚胎的高质量和能力关联的卵泡液和/或表面的微生物组谱。在一些实施方案中，将所述干预施用于所述雌性受体受试者并且有效地提供与胚胎移植后的高妊娠成功率关联的阴道和子宫液和/或表面的微生物组谱。在一些实施方案中，所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。在一些实施方案中，所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。在一些实施方案中，所述雌性供体受试者和/或所述雌性受体受试者是小型反刍动物。在一些实施方案中，所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。在一些实施方案中，所述干预是抗生素。在一些实施方案中，所述干预是一种或多种微生物(例如，益生菌)。在一些实施方案中，所述干预是选择性刺激一种或多种宿主有益微生物(例如，益生元)的生长和活性的难消化的营养组合物。在一些实施方案中，将干预施用于所述雌性供体受试者或所述雌性受体受试者的阴道或子宫腔。
根据一些方面，本公开提供了一种用于将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对以进行体外受精的套件，所述套件包括(1)一种或多种分析工具，其用于确定来自所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者的卵泡、阴道和子宫液和/或表面中的一者或多者的微生物组谱；(2)发射器，其用于通信传输/连接卵泡、阴道和子宫液和/或表面中的一者或多者的一个或多个微生物组谱的数据库；(3)装置，其用于将来自所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者的卵泡、阴道和子宫液和/或表面中的一者或多者的所述微生物组谱与所述一个或多个微生物组谱的数据库进行比较以鉴定哪些雌性供体受试者和哪些雌性受体受试者具有指示高体外受精的成功率的微生物组谱；以及(4)使用说明。
在一些实施方案中，用于确定微生物组谱的所述一种或多种分析工具包括用于核糖体RNA的扩增和测序的试剂。在一些实施方案中，所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。在一些实施方案中，所述雌性供体受试者和/或所述雌性受体受试者是小型反刍动物。在一些实施方案中，所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。在一些实施方案中，所述一种或多种分析工具包括比色测定装置。在一些实施方案中，所述一种或多种分析工具包括测序装置。
在一些实施方案中，一种选择雌性供体受试者以进行体外受精的方法包括以下步骤：(1)从所述雌性供体受试者获得阴道微生物样品；(2)鉴定来自所述雌性供体受试者的所述阴道微生物样品的微生物组谱；以及(3)当所述阴道微生物样品的所述微生物组谱指示所述雌性供体受试者将产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者时，从所述雌性供体受试者获得一个或多个卵母细胞或卵子以进行体外受精。
一种产生用于选择雌性供体受试者以进行体外受精的微生物组数据库的方法包括以下步骤：(1)从雌性供体受试者群体收集阴道微生物样品；(2)鉴定来自所述雌性供体受试者群体中的每个受试者的所述阴道微生物样品的微生物组谱；(3)从所述雌性供体受试者群体中的每个受试者获得卵母细胞或卵子，以及对选自由所产生的卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的数量进行计数；以及(4)鉴定所述阴道微生物样品的所述微生物组谱与产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的关联。
一种提高体外受精妊娠的成功率的方法包括以下步骤：(1)从雌性供体受试者获得阴道微生物样品；(2)鉴定所述阴道微生物样品的微生物组谱；以及(3)对所述雌性供体受试者实施干预，其中所述干预有效地为所述雌性供体受试者提供与选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的高生产率关联的微生物组谱。
一种用于选择雌性供体受试者以进行体外受精的套件包括：(1)一种或多种分析工具，其用于确定来自所述雌性供体受试者的阴道微生物样品的微生物组谱；(2)发射器，其用于通信传输/连接阴道微生物样品的一个或多个微生物组谱的数据库；(3)装置，其用于将来自所述雌性供体受试者的所述阴道微生物样品的微生物组谱与所述一个或多个微生物组谱的数据库进行比较以鉴定哪些雌性供体受试者具有指示选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的高生产率的微生物组谱；以及(4)使用说明。
附图说明
专利或申请文件含有至少一个以彩色绘制的附图。美国专利及商标局将根据要求和必要费用的支付来提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1显示了物种水平的LEfSe。线性判别分析(LDA)结合效应大小测量(LEfSe)显示了能够区分阴道拭子样品中被分类为低或高的供体的一系列细菌。在Kruskal-Wallis和成对Wilcoxon检验中，p值＜0.05和分数≥2.0分别被认为是显著的。
图2A-2D显示了另外的物种水平的LEfSe。在阴道拭子样品中发现的细菌群落相对丰度的直方图显示，与高雌性相比，在归类为低的供体组中数量较多。在Kruskal-Wallis和成对Wilcoxon检验中，p值＜0.05和分数≥2.0分别被认为是显著的。图中的水平直线指示组平均值，虚线指示组中位数。低组的代表性细菌菌种显示出在统计上显著高于高组的雌性，在直方图图2A-2D中分别是未分类的艰难杆菌属(Mogibacterium)、未分类的移动杆菌属(Mobilibacterium)、未分类的动性球菌属(Planococcus)和未分类的盐水球菌属(Salinicoccus)。
图3A-3D显示了另外的物种水平的LEfSe。在阴道拭子样品中发现的细菌群落相对丰度的直方图显示，与低雌性相比，在归类为高的供体组中数量较多。在Kruskal-Wallis和成对Wilcoxon检验中，p值＜0.05和分数≥2.0分别被认为是显著的。图中的水平直线指示组平均值，虚线指示组中位数。高组的代表性细菌菌种显示出在统计上显著高于低组的雌性，在直方图图3A-3D中分别是未分类的厌氧棒形菌属(Anaerofustis)、未分类的拟杆菌科(Bacteriodaceae)、未分类的乏养菌属(Abiotrophia)和未分类的阿克曼氏菌科(Akkermansiaceae)。
图4A-4D显示了另外的物种水平的LEfSe。在阴道拭子样品中发现的细菌群落相对丰度的直方图显示，与低雌性相比，在归类为高的供体组中数量较多。在Kruskal-Wallis和成对Wilcoxon检验中，p值＜0.05和分数≥2.0分别被认为是显著的。图中的水平直线指示组平均值，虚线指示组中位数。高组的代表性细菌菌种显示出在统计上显著高于低组的雌性，在直方图图4A-4D中分别是未分类的韧皮杆菌属(Liberibacter)、未分类的盐单胞菌属(Halomonas)、未分类的微小杆菌属(Exiguobacterium)和未分类的芽单胞菌属(Gemmatirosa)。
图5A-5D显示了另外的物种水平的LEfSe。在阴道拭子样品中发现的细菌群落相对丰度的直方图显示，与低雌性相比，在归类为高的供体组中数量较多。在Kruskal-Wallis和成对Wilcoxon检验中，p值＜0.05和分数≥2.0分别被认为是显著的。图中的水平直线指示组平均值，虚线指示组中位数。高组的代表性细菌菌种显示出在统计上显著高于低组的雌性，在直方图图5A-5D中分别是海滨假单胞菌(Pseudomonas litoralis)、Prodoshia spD12、未分类的颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)和马赛分枝杆菌(Negativibacillusmassiliensis)。
图6A-6C显示了另外的物种水平的LEfSe。在阴道拭子样品中发现的细菌群落相对丰度的直方图显示，与低雌性相比，在归类为高的供体组中数量较多。在Kruskal-Wallis和成对Wilcoxon检验中，p值＜0.05和分数≥2.0分别被认为是显著的。图中的水平直线指示组平均值，虚线指示组中位数。高组的代表性细菌菌种显示出在统计上显著高于低组的雌性，在直方图图6A-6C中分别是未分类的瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)、未分类的Suicoccus、沙特马赛假单胞菌(Pseudomonas saudimassiliensis)。
图7显示了根据本文公开的一些实施方案的收集卵泡液样品的一系列步骤。
图8显示了根据本文公开的一些实施方案的收集子宫/阴道样品的一系列步骤。
图9显示了分析卵泡、阴道和/或子宫样品的工作流程。
具体实施方式
本公开提供了用于选择供体受试者和受体受试者以进行体外受精的组合物、方法和套件。根据一些方面，本公开提供了一种利用来自卵泡液、阴道组织和子宫组织的微生物组谱的数据库来互补选择雌性供体和雌性受体以提高体外受精效率的方法。
根据一些方面，本公开提供了一种将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对以进行体外受精的方法，所述方法包括从雌性供体受试者和雌性受体受试者中的每个获得微生物样品的步骤。在一些实施方案中，微生物样品从阴道、子宫和卵泡液和/或表面中的一者或多者获得。在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定来自雌性供体受试者和雌性受体受试者中的每个的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品的微生物组谱的步骤。在一些实施方案中，微生物组谱通过对来自微生物样品的核糖体RNA(rRNA)进行测序来产生。例如，微生物谱可以通过对16S核糖体RNA基因进行测序来产生。在一些实施方案中，测序的rRNA用于分类，诸如门、目、纲、科、属和种。在一些实施方案中，对测序的rRNA进行定量以确定微生物样品中存在的微生物的相对丰度。在一些实施方案中，rRNA在测序之前被PCR扩增。
根据一些实施方案，将从供体和/或受体受试者获得的微生物组谱与微生物组谱的数据库进行比较。在一些实施方案中，如果供体受试者和受体受试者的微生物组谱与高妊娠起始率和高妊娠至足月维持率关联，则从供体受试者获得一个或多个卵母细胞或卵子，通过体外受精进行受精，并且移植到受体受试者中。
在一些实施方案中，所述雌性供体受试者的卵泡微生物组谱指示卵母细胞在体外产生胚胎的质量和能力。在一些实施方案中，所述雌性受体受试者的阴道微生物组谱和子宫微生物组谱指示在胚胎移植到所述雌性受体受试者后妊娠高度成功。
在一些实施方案中，所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者是小型反刍动物。如本文所用，“反刍动物”是指从其瘤胃反刍的任何哺乳动物，诸如奶牛、鹿、羚羊、绵羊、山羊和水牛以及它们的亲属。在一些实施方案中，所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、羚羊、绵羊、山羊和水牛。在一些实施方案中，所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者是有蹄类动物。如本文所用，“有蹄类动物”是指任何有蹄的哺乳动物。作为非限制性实例，有蹄类动物包括奇蹄类诸如马和犀牛，以及偶蹄类诸如牛、猪、长颈鹿、骆驼、鹿和河马，以及亚有蹄类诸如象。在一些实施例中，雌性供体受试者和雌性受体受试者可以具有任何年龄。
在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠起始率大于50％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠起始率大于55％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠起始率大于60％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠起始率大于65％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠起始率大于70％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠起始率大于75％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠起始率大于80％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠起始率大于85％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠起始率大于90％。
在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于50％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于55％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于60％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于65％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于70％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于75％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于80％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于85％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于90％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于95％。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱和雌性受体受试者的微生物组谱指示妊娠维持率大于99％。
在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱指示雌性供体受试者将在卵母细胞受精后产生更多数量的胚胎。在一些实施方案中，雌性供体受试者的微生物组谱指示雌性供体受试者将产生每轮IVF平均至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、或至少100个胚胎。
根据一些方面，本公开还提供了一种产生用于将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对以进行体外受精的微生物组数据库的方法。在一些实施方案中，数据库是序列信息(例如，rRNA序列信息)的集合，它被组织成可以容易地访问、更新和与其他序列进行比较，诸如计算机数据库。在一些实施方案中，数据库中的序列信息通过收集来自雌性供体受试者群体和雌性受体受试者群体的微生物样品来获得，其中所述微生物样品从阴道、子宫和卵泡液和/或表面中的一者或多者获得。在一些实施方案中，序列信息与来自微生物样品的微生物关联并且被组织成微生物组谱。
在一些实施方案中，产生用于将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对的微生物组数据库的方法还包括鉴定来自雌性供体受试者群体和雌性受体受试者群体中的每个受试者的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱的步骤。在一些实施方案中，针对至少25个雌性供体受试者和至少25个雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱。在一些实施方案中，针对至少50个雌性供体受试者和至少50个雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱。在一些实施方案中，针对至少75个雌性供体受试者和至少75个雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱。在一些实施方案中，针对至少100个雌性供体受试者和至少100个雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱。在一些实施方案中，针对至少150个雌性供体受试者和至少150个雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱。在一些实施方案中，针对至少200个雌性供体受试者和至少200个雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱。在一些实施方案中，针对至少300个雌性供体受试者和至少300个雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱。
在一些实施方案中，产生用于将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对的微生物组数据库的方法还包括以下步骤：从雌性供体受试者群体中的一个或多个受试者获得一个或多个卵母细胞或卵子，通过体外受精使所述一个或多个卵母细胞或卵子受精，并且将受精的胚胎移植到雌性受体受试者群体中的一个或多个受试者中，然后鉴定微生物组谱与高体外受精成功率的关联。
在一些实施方案中，所述雌性供体受试者的卵泡微生物组谱指示卵母细胞在体外产生胚胎的质量和能力。在一些实施方案中，所述雌性受体受试者的阴道微生物组谱和子宫微生物组谱指示在胚胎移植到所述雌性受体受试者后妊娠高度成功。在一些实施方案中，针对分层成一个或多个年龄范围的雌性供体受试者和雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的所述微生物组谱。
根据一些方面，本发明提供一种提高体外受精妊娠的成功率的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：从雌性供体受试者和雌性受体受试者中的一者或多者获得微生物样品，其中所述微生物样品从阴道、子宫和卵泡液和/或表面中的一者或多者获得，鉴定来自雌性供体受试者和雌性受体受试者中的一者或多者的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱，以及对雌性供体受试者和雌性受体受试者中的一者或多者实施干预，其中所述干预有效地为一个或多个雌性供体受试者和雌性受体受试者提供与高体外受精的成功率关联的微生物组谱。
在一些实施方案中，体外受精妊娠的成功率通过妊娠起始来度量。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于50％的妊娠起始率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于55％的妊娠起始率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于60％的妊娠起始率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于65％的妊娠起始率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于70％的妊娠起始率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于75％的妊娠起始率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于80％的妊娠起始率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于85％的妊娠起始率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于90％的妊娠起始率。
在一些实施方案中，体外受精的成功率通过维持妊娠至足月来度量。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于50％的妊娠至足月维持率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于55％的妊娠至足月维持率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于60％的妊娠至足月维持率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于65％的妊娠至足月维持率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于70％的妊娠至足月维持率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于75％的妊娠至足月维持率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于80％的妊娠至足月维持率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于85％的妊娠至足月维持率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于90％的妊娠至足月维持率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于95％的妊娠至足月维持率。在一些实施方案中，体外受精的成功率是大于99％的妊娠至足月维持率。
在一些实施方案中，用于增加体外受精成功率的干预是益生菌、益生元或抗生素中的一者或多者。在一些实施方案中，将干预直接施用于供体和/或受体受试者的卵泡、阴道和子宫中的一者或多者。在一些实施方案中，将所述干预施用于所述雌性供体受试者，并且有效地提供与卵母细胞在体外产生胚胎的高质量和能力关联的卵泡液和/或表面的微生物组谱。在一些实施方案中，将所述干预施用于所述雌性受体受试者并且有效地提供与胚胎移植后的高妊娠成功率关联的阴道和子宫液和/或表面的微生物组谱。
根据一些方面，本公开还提供了一种用于将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对以进行体外受精的套件。在一些实施方案中，套件包括用于确定来自雌性供体受试者和雌性受体受试者的卵泡、阴道和子宫液和/或表面中的一者或多者的微生物组谱的一种或多种分析工具。在一些实施方案中，用于确定微生物组谱的所述一种或多种分析工具包括用于核糖体RNA的扩增和/或测序的设备和/或试剂。在一些实施方案中，所述一种或多种分析工具包括用于核苷酸测序的便携式实时装置和使用的试剂。
在一些实施方案中，套件还包括发射器，所述发射器用于将一个或多个微生物组谱的数据库通信传输/连接至装置，所述装置用于将雌性供体受试者和雌性受体受试者的微生物组谱与所述一个或多个微生物组谱的数据库进行比较，以鉴定哪些雌性供体受试者和哪些雌性受体受试者具有指示高体外受精成功率的微生物组谱。
在一些实施方案中，套件包括具有序列信息(例如，rRNA序列信息)的集合的数据库，所述数据库被组织成可以容易地访问、更新和与其他序列进行比较，诸如计算机数据库。在一些实施方案中，数据库中的序列信息通过收集来自雌性供体受试者群体和雌性受体受试者群体的微生物样品来获得，其中所述微生物样品从阴道、子宫和卵泡液和/或表面中的一者或多者获得。在一些实施方案中，序列信息与来自微生物样品的微生物关联并且被组织成微生物组谱。在一些实施方案中，用于与数据库通信/连接的发射器是有线的或无线的。在一些实施方案中，套件还包括使用说明。
根据一些方面，本公开提供了一种选择雌性供体受试者以进行体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从雌性供体受试者获得阴道微生物样品；(2)鉴定来自雌性供体受试者的阴道微生物样品的微生物组谱；以及(3)当阴道微生物样品的微生物组谱指示雌性供体受试者将产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者时，从雌性供体受试者获得一个或多个卵母细胞或卵子以进行体外受精。
在一些实施方案中，雌性供体受试者的阴道微生物组谱与平均产生大于2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者关联。在一些实施方案中，所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。在一些实施方案中，所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。在一些实施方案中，雌性供体受试者是小型反刍动物。在一些实施方案中，所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
在一些实施方案中，指示雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的微生物组谱包含较低相对丰度的以下属的一个或多个成员：艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或较高相对丰度的以下属的一个或多个成员：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、假单胞菌属、Prodoshia、颤藻亚纲、分枝杆菌属(Negativibacillus)、瘤胃梭菌属、Suicoccus和假单胞菌属。根据某些实施方案，微生物的相对丰度可以通过线性判别分析(LDA)结合效应大小测量(LEfSe)来确定，如本文所述。例如，在一个实施方案中，指示雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的微生物组谱是以下属的一个或多个成员不存在的微生物组谱：艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或以下属中的一者或多者存在的微生物组谱：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、假单胞菌属、Prodoshia、颤藻亚纲、分枝杆菌属、瘤胃梭菌属、Suicoccus和假单胞菌属。
在一些实施方案中，指示雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的微生物组谱包含较低相对丰度的以下中的一者或多者：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或较高相对丰度的以下中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia sp D12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。例如，在一些实施方案中，指示雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的微生物组谱是以下一者或多者不存在的微生物组谱：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或以下一者或多者存在的微生物组谱：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia sp D12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
根据一些方面，本公开提供了一种产生用于选择雌性供体受试者以进行体外受精的微生物组数据库的方法，所述方法包括以下步骤(1)从雌性供体受试者群体收集阴道微生物样品；(2)鉴定来自所述雌性供体受试者群体中的每个受试者的所述阴道微生物样品的微生物组谱；(3)从所述雌性供体受试者群体中的每个受试者获得卵母细胞或卵子，以及对选自由所产生的卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的数量进行计数；以及(4)鉴定所述阴道微生物样品的所述微生物组谱与产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的关联。在一些实施方案中，雌性供体受试者的阴道微生物组谱与平均产生大于2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者关联。在一些实施方案中，所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。在一些实施方案中，所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。在一些实施方案中，雌性供体受试者是小型反刍动物。在一些实施方案中，所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。在一些实施方案中，指示雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的微生物组谱包含较低相对丰度的以下属的一个或多个成员：艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或较高相对丰度的以下属的一个或多个成员：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、假单胞菌属、Prodoshia、颤藻亚纲、分枝杆菌属、瘤胃梭菌属、Suicoccus和假单胞菌属。在一些实施方案中，指示雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的微生物组谱包含较低相对丰度的以下中的一者或多者：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或较高相对丰度的以下中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia sp D12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
根据一些方面，本发明提供一种提高体外受精妊娠的成功率的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从雌性供体受试者获得阴道微生物样品；(2)鉴定阴道微生物样品的微生物组谱；以及(3)对雌性供体受试者实施干预，其中所述干预有效地为雌性供体受试者提供与选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的高生产率关联的微生物组谱。
在一些实施方案中，雌性供体受试者的阴道微生物组谱与平均产生大于2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者关联。在一些实施方案中，所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。在一些实施方案中，所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。在一些实施方案中，雌性供体受试者是小型反刍动物。在一些实施方案中，所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
在一些实施方案中，指示雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的微生物组谱包含较低相对丰度的以下属的一个或多个成员：艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或较高相对丰度的以下属中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、假单胞菌属、Prodoshia、颤藻亚纲、分枝杆菌属、瘤胃梭菌属、Suicoccus和假单胞菌属。在一些实施方案中，指示雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的微生物组谱包含较低相对丰度的以下中的一者或多者：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或较高相对丰度的以下中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia sp D12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
在一些实施方案中，所述干预是抗生素。在一些实施方案中，干预是一种或多种微生物。在一些实施方案中，干预是益生元。在一些实施方案中，将干预施用于雌性供体受试者的阴道腔。在一些实施方案中，干预是一种或多种微生物，所述微生物包括以下中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia sp D12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus知沙特马赛假单胞菌。在一些实施方案中，干预有效地降低以下中的一者或多者的相对丰度：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属，并且有效地增加以下中的一者或多者的相对丰度：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia spD12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
根据一些方面，本公开提供了一种用于选择雌性供体受试者以进行体外受精的套件，所述套件包括：(1)一种或多种分析工具，其用于确定来自雌性供体受试者的阴道微生物样品的微生物组谱；(2)发射器，其用于通信传输/连接阴道微生物样品的一个或多个微生物组谱的数据库；(3)装置，其用于将来自所述雌性供体受试者的所述阴道微生物样品的微生物组谱与所述一个或多个微生物组谱的数据库进行比较以鉴定哪些雌性供体受试者具有指示卵母细胞或卵子的高生产率的微生物组谱；以及(4)使用说明。在一些实施方案中，雌性供体受试者的阴道微生物组谱与平均产生大于2、3、4、5、6、7、8、9或10个选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者关联。在一些实施方案中，所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。在一些实施方案中，所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。在一些实施方案中，雌性供体受试者是小型反刍动物。在一些实施方案中，所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
在一些实施方案中，指示雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的微生物组谱包含较低相对丰度的以下属的一个或多个成员：艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或较高相对丰度的以下属中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、假单胞菌属、Prodoshia、颤藻亚纲、分枝杆菌属、瘤胃梭菌属、Suicoccus和假单胞菌属。在一些实施方案中，指示雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的微生物组谱包含较低相对丰度的以下中的一者或多者：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或较高相对丰度的以下中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia sp D12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
在一些实施方案中，一种或多种分析工具包括比色测定装置。在一些实施方案中，一种或多种分析工具包括测序装置。
提供以下实施例以进一步说明本发明的某些方面。这些实施例仅仅是示例性的，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
材料和方法
供体雌性动物和分类
在本研究中，使用47头雌性泽西牛(Bos taurus taurus)，年龄在8至15个月之间，来自美国俄勒冈州的庄园。对雌性进行取卵-OPU，回收的卵母细胞用于体外胚胎生产(IVEP)。每头雌性至少进行3次OPU程序。然后，根据每次OPU期间获得的胚胎数量，当所有程序中获得的平均胚胎在0-1.9之间时，雌性被归类为低供体，或者当所有程序中获得的平均胚胎>4.0时，雌性被归类为高供体。
阴道拭子的收集
仅在收集时才从包装中取出拭子。在对动物进行适当节欲后，用纸巾清洁雌性的外生殖器，以除去所有污物和粪便，以防止拭子受到污染。将拭子插入阴道中4至5cm，沿着阴道壁进行完整画图20秒。然后，切断拭子，放入正确标识的冷冻管中，并立即储存在液氮中，直到进行DNA提取。
从阴道拭子样品中提取DNA
根据制造商的方案，在使用打珠匀浆器(Mini-Beadbeater-8，Biospec Products)破碎样品后，使用PowerSoil DNA分离套件(MO BIO Laboratory Inc.，Carlsbad，CA)提取阴道拭子的基因组DNA。使用
Figure BDA0003579991640000201
ND-2000(NanoDrop Technologies)测量样品的DNA浓度和纯度。
长读段DNA测序和生物信息学分析
16S rRNA基因片段的靶向PCR扩增和高通量测序(扩增子测序)广泛用于分析微生物群落。然而，目前的16S分析方法不能提供足够的分类分辨率和准确性来针对特定条件进行物种水平关联研究。这是由于仅对16S rRNA基因的短区域进行扩增和测序，通常仅提供科或属水平的分类。然而，细菌16S rRNA基因的较长序列可以提供更大的系统发育和分类分辨率，并提高复杂自然群落中的群体动态的知识，此外，提供物种水平的微生物组数据。在这种情况下，使用的测序方法是基于DNA聚合的Pacific Biosciences(PacBio)单分子实时(SMRT)测序，这是一种很有前途的第3代高通量技术。
最初，从基因组DNA中产生重复和合并的V1-V9扩增子，以用于PacBio RS SMRT芯片分析。使样品变性(95℃，5分钟)，然后进行28个循环的变性(95℃，45秒)、退火(55℃，1分钟)和延伸(68℃，2分钟)，最后延伸(68℃，7分钟)。在琼脂糖凝胶上显示PCR扩增子，使用QIAquick PCR纯化套件(Qiagen，Valencia，CA)对PCR扩增子进行纯化。通过Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)进行扩增后质量控制。然后将来自阴道拭子样品的扩增DNA以等摩尔浓度合并。
根据制造商的说明(Pacific Biosciences)，通过平端连接从扩增的DNA制备SMRTbell文库。在单个PacBio Sequel杯上对来自合并和条形码标记的阴道样品的纯化SMRTbell文库进行测序。样品在Sequel II系统中进行测序。
对于生物信息学分析，根据Kozich等人(2013)[1]描述的方法使用Mothur软件将读段与SILVA数据库比对。然后，使用核糖体数据库项目(RDP)11.1进行分类。
线性判别分析(LDA)结合效应大小测量(LEfSe)
在分类之后，数据在LEfSe中进行分析，LEfSe是一种用于发现和解释高维生物标志物的算法，可以鉴定表征两个或更多个生物地位(或类别)之间差异的基因组特征(例如，分类单元)[2]。这种方法可以强调统计显著性、生物学一致性和效应相关性，并鉴定与生物学显著类别一致的差异丰富特征。
LEfSe首先稳健地鉴定生物学类别之间在统计上不同的特征。然后它进行另外的测试来评估这些差异是否与预期的生物学行为一致。最初，进行Kruskal-Wallis(KW)秩检验[3]非参数因子总和，以检测与所关注的类别相关的具有显著参考丰度的特征；随后使用Wilcoxon秩和检验(未配对)[4，5]通过一组子类之间的对等检验来研究生物学一致性。最后，LEfSe使用LDA[6]来估计每个差异丰富特征的效应大小。在Kruskal-Wallis和成对Wilcoxon检验中，p值＜0.05和分数≥2.0分别被认为是显著的。
结果
通过线性判别分析(LDA)结合效应大小测量(LEfSe)，可以从阴道拭子样品中找到含有19种细菌的列表，从而可以区分被归类为低胚胎生产者和高胚胎生产者的雌性供体(图1)。
图2描述了代表被归类为低(共4个细菌群落)的雌性组的细菌菌种，与被归类为高供体的雌性相比，它们的相对丰度显著较高。
相比之下，在总共15个细菌群落中，与属于低组的雌性相比，代表被归类为高的雌性组的细菌菌种，相对丰度显著更高，如图3-6所示。
根据所得的结果，可以观察到体外产生胚胎的卵母细胞低或高供体的雌牛阴道微生物群中存在的细菌菌种的不同特征。通过这种方式，以后可以在更多的雌性中更好地研究和分析这些细菌群落，作为干预或甚至选择在体外胚胎生产中获得更好结果的卵母细胞供体雌性的可能目标。
实施例2
方法
动物和采样
从供体收集卵泡液：从青春期前和青春期荷斯坦奶牛供体收集卵泡液。在OPU(尽可能无菌)之后，回收卵母细胞，然后将剩余的卵泡液储存在15mL(一式两份)正确标识(卵泡液-FL、动物代码、年龄和农场)的无菌falcon管中。立即将试管储存在液氮中和/或储存在-80℃的冰箱中，直到DNA提取。
从受体收集阴道和子宫拭子：在胚胎移植过程中(Vytelle常规)，从50个受体收集阴道和子宫拭子。此步骤的拭子可以是最简单的，只要无菌即可。仅在收集时才从包装中取出拭子。首先，用纸巾清洁外阴外部。兽医将戴手套打开阴唇并将拭子插入阴道中，注意不要接触污物或粪便，进行涂抹运动约20秒。然后取出拭子，再次注意不要污染。切下拭子杆(借助干净的剪刀)并放入1.5mL(一式两份)正确标识(阴道拭子-VS、动物代码、年龄和农场)的微管中。立即将微管储存于液氮中和/或储存在-80℃的冰箱中，直到DNA提取。或者，将拭子杆切断并放入溶液中用于样品收集和核酸稳定，以进行微生物组谱分析，诸如能够裂解收集的细胞并稳定样品以供进一步分析和评估的体系。可能合适的收集体系类型的非限制性实例可以是类似于商购获得的Omnigene-Vaginal收集和稳定套件(产品目录#：OMR-130)的那些，以及其他可能的微生物收集和稳定套件。在相同的动物中，还将收集引入颅阴道的子宫拭子(例如Har-VetTM 86 87 McCullough Double-Guarded Uterine CultureSwab，Spring Valley，WI)。为避免拭子污染阴道，将覆盖塑料片的移液器直接插入子宫颈中。在子宫颈内，塑料护套(第一层保护)将被破坏，移液器将通过子宫颈进入子宫中。一旦进入子宫，拭子将被推进通过密封的塑料移液器(第二层保护)，使无菌棉拭子暴露于子宫分泌物，进行涂抹运动约20秒。将拭子拉入移液器内并取出，同时将移液器保持在子宫内以避免被阴道液污染。在取出子宫拭子之后，将杆切断并放入1.5mL(一式两份)正确识别(子宫拭子-UTS、动物代码、年龄和农场)的微管中。立即将微管储存于液氮中和/或储存在-80℃的冰箱中，直到DNA提取。或者，将拭子杆切断并放入用于样品收集和核酸稳定的商购获得的溶液中，例如类似于上述Omnigene-Vaginal收集和稳定套件(产品目录#：OMR-130)的体系。
DNA提取
来自卵泡液样品和子宫拭子的基因组DNA将使用QIAamp DNA Mini套件(Qiagen)进行提取。在使用打珠匀浆器(Mini-Beadbeater-8，Biospec Products)破碎样品后，使用PowerSoil DNA分离套件(MO BIO Laboratory Inc.，Carlsbad，CA)提取阴道拭子的基因组DNA。使用
Figure BDA0003579991640000241
ND-2000(NanoDrop Technologies)测量样品的DNA浓度。
细菌16S rRNA基因的V4高变区的PCR扩增
为了检查细菌群落，将对细菌16S核糖体RNA(rRNA)基因的V4区域进行PCR扩增，并在Illumina MiSeq平台上进行测序。质量控制不合格的样品将被排除在分类之外。
数据分析
细菌分类(门、目、纲、科、属和种)和相对丰度将从产生的数据序列进行评估。最后，此处产生的所有结果将组成一个不同年龄范围的供体和受体雌性的微生物组谱数据库。然后，研究细菌谱与卵母细胞生产之间的关联，从而研究胚胎移植后妊娠的供体或受体的胚胎质量(通过评估在胚胎体外生产中获得的比率)。
本公开中描述的实施方案可以以各种方式组合。针对一个实施方案描述的任何方面或特征可以并入本公开中提及的任何其他实施方案中。虽然本发明原理的各种新特征已进有所显示、描述和指出应用于它们的特定实施方案，但是应当理解，本领域的技术人员可以在不背离本公开的精神的情况下进行各种省略、替换和改变。本领域的技术人员将理解，本发明原理可以在所描述的实施方案之外的其他实施方案中实践，这些实施方案是出于展示而非限制的目的而提供的。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均以引用的方式整体明确并入。
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Claims (72)

1.一种将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对以进行体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者中的每一者获得微生物样品，其中所述微生物样品从阴道、子宫和卵泡液和/或表面中的一者或多者获得；
(2)鉴定来自所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者中的每一者的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品的微生物组谱；以及
(3)从所述雌性供体受试者获得一个或多个卵母细胞或卵子，通过体外受精使所述一个或多个卵母细胞或卵子受精，并且如果所述雌性供体受试者的所述微生物组谱和所述雌性受体受试者的所述微生物组谱指示高妊娠起始率和高妊娠至足月维持率，则将受精的胚胎移植到所述雌性受体受试者中。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述雌性供体受试者的卵泡微生物组谱指示卵母细胞在体外产生胚胎的质量和能力，或指示由所述雌性供体受试者产生的胚胎数量增加。
3.如实施方案1所述的方法，其中所述雌性受体受试者的阴道微生物组谱和子宫微生物组谱指示在胚胎移植到所述雌性受体受试者后妊娠高度成功。
4.如实施方案1所述的方法，其中所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。
5.如实施方案1所述的方法，其中所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。
6.如实施方案1所述的方法，其中所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者是小型反刍动物。
7.如实施方案6所述的方法，其中所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
8.如实施方案1所述的方法，其中所述雌性供体受试者的所述微生物组谱和所述雌性受体受试者的所述微生物组谱指示妊娠起始率大于75％以及妊娠维持率大于90％。
9.一种产生用于将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对以进行体外受精的微生物组数据库的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从雌性供体受试者群体和雌性受体受试者群体收集微生物样品，其中所述微生物样品从阴道、子宫和卵泡液和/或表面中的一者或多者获得；
(2)鉴定来自所述雌性供体受试者群体和所述雌性受体受试者群体中的每个受试者的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱；
(3)从所述雌性供体受试者群体中的一个或多个受试者获得一个或多个卵母细胞或卵子，通过体外受精使所述一个或多个卵母细胞或卵子受精，并且将受精的胚胎移植到所述雌性受体受试者群体中的一个或多个受试者中；以及
(4)鉴定来自所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者中的一者或多者的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的所述微生物组谱与高体外受精成功率的关联。
10.如实施方案9所述的方法，其中所述雌性供体受试者的卵泡微生物组谱指示卵母细胞在体外产生胚胎的质量和能力，或指示由所述雌性供体受试者产生的胚胎数量增加。
11.如实施方案9所述的方法，其中所述雌性受体受试者的阴道微生物组谱和子宫微生物组谱指示在胚胎移植到所述雌性受体受试者后妊娠高度成功。
12.如实施方案9所述的方法，其中所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。
13.如实施方案9所述的方法，其中所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。
14.如实施方案9所述的方法，其中针对至少300个雌性供体受试者和至少300个雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱。
15.如实施方案9所述的方法，其中针对分层成一个或多个年龄范围的雌性供体受试者和雌性受体受试者鉴定阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的所述微生物组谱。
16.如实施方案9所述的方法，其中所述雌性供体受试者群体和所述雌性受体受试者群体是小型反刍动物。
17.如实施方案16所述的方法，其中所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
18.一种提高体外受精妊娠的成功率的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从雌性供体受试者和雌性受体受试者中的一者或多者获得微生物样品，其中所述微生物样品从阴道、子宫和卵泡液和/或表面中的一者或多者获得；
(2)鉴定来自所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者中的一者或多者的阴道微生物样品、子宫微生物样品和卵泡微生物样品中的一个或多个微生物样品的微生物组谱；以及
(3)对所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者中的一者或多者实施干预，其中所述干预有效地为一个或多个雌性供体受试者和雌性受体受试者提供与高体外受精成功率关联的微生物组谱。
19.如实施方案18所述的方法，其中将所述干预施用于所述雌性供体受试者，并且有效地提供与卵母细胞在体外产生胚胎的高质量和能力或者由所述雌性供体受试者产生的胚胎数量增加关联的卵泡液和/或表面的微生物组谱。
20.如实施方案18所述的方法，其中将所述干预施用于所述雌性受体受试者并且有效地提供与胚胎移植后的高妊娠成功率关联的阴道和子宫液和/或表面的微生物组谱。
21.如实施方案18所述的方法，其中所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。
22.如实施方案18所述的方法，其中所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。
23.如实施方案18所述的方法，其中所述雌性供体受试者和/或所述雌性受体受试者是小型反刍动物。
24.如实施方案23所述的方法，其中所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
25.如实施方案15所述的方法，其中所述干预是抗生素。
26.如实施方案15所述的方法，其中所述干预是一种或多种微生物。
27.如实施方案15所述的方法，其中所述干预是益生元。
28.如实施方案15所述的方法，其中将所述干预施用于所述雌性供体受试者或所述雌性受体受试者的阴道腔。
29.一种用于将雌性供体受试者与雌性受体受试者配对以进行体外受精的套件，所述套件包括：
(1)一种或多种分析工具，其用于确定来自所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者的卵泡、阴道和子宫液和/或表面中的一者或多者的微生物组谱；
(2)发射器，其用于通信传输/连接卵泡、阴道和子宫液和/或表面中的一者或多者的一个或多个微生物组谱的数据库；
(3)装置，其用于将来自所述雌性供体受试者和所述雌性受体受试者的卵泡、阴道和子宫液和/或表面中的一者或多者的所述微生物组谱与所述一个或多个微生物组谱的数据库进行比较以鉴定哪些雌性供体受试者和哪些雌性受体受试者具有指示高体外受精的成功率的微生物组谱；以及
(4)使用说明。
30.如实施方案29所述的套件，其中用于确定微生物组谱的所述一种或多种分析工具包括用于核糖体RNA的扩增和测序的试剂。
31.如实施方案29所述的套件，其中所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。
32.如实施方案29所述的套件，其中所述雌性供体受试者和/或所述雌性受体受试者是小型反刍动物。
33.如实施方案32所述的套件，其中所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
34.如实施方案29所述的套件，其中所述一种或多种分析工具包括比色测定装置。
35.如实施方案29所述的套件，其中所述一种或多种分析工具包括测序装置。
36.一种选择雌性供体受试者以进行体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从所述雌性供体受试者获得阴道微生物样品；
(2)鉴定来自所述雌性供体受试者的所述阴道微生物样品的微生物组谱；以及
(3)当所述阴道微生物样品的所述微生物组谱指示所述雌性供体受试者将产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者时，从所述雌性供体受试者获得一个或多个卵母细胞或卵子以进行体外受精。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述雌性供体受试者的阴道微生物组谱与平均产生大于4个选自由卵母细胞、卵子、和胚胎组成的组中的任一者关联。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。
40.如权利要求36所述的方法，其中所述雌性供体受试者是小型反刍动物。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
42.如权利要求36所述的方法，其中指示所述雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的所述微生物组谱包含：
较低相对丰度的以下中的一者或多者：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或
较高相对丰度的以下中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia spD12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
43.一种产生用于选择雌性供体受试者以进行体外受精的微生物组数据库的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从雌性供体受试者群体收集阴道微生物样品；
(2)鉴定来自所述雌性供体受试者群体中的每个受试者的所述阴道微生物样品的微生物组谱；
(3)从所述雌性供体受试者群体中的每个受试者获得卵母细胞或卵子，以及对选自由所产生的卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的数量进行计数；以及
(4)鉴定所述阴道微生物样品的所述微生物组谱与产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的关联。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述雌性供体受试者的阴道微生物组谱与平均产生大于4个选自由卵母细胞、卵子、和胚胎组成的组中的任一者关联。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。
47.如权利要求43所述的方法，其中所述雌性供体受试者是小型反刍动物。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
49.如权利要求43所述的方法，其中指示所述雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的所述微生物组谱包含：
较低相对丰度的以下中的一者或多者：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或
较高相对丰度的以下中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia spD12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
50.一种提高体外受精妊娠的成功率的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从雌性供体受试者获得阴道微生物样品；
(2)鉴定所述阴道微生物样品的微生物组谱；以及
(3)对所述雌性供体受试者实施干预，其中所述干预有效地为所述雌性供体受试者提供与选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的高生产率关联的微生物组谱。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述雌性供体受试者的阴道微生物组谱与平均产生大于4个选自由卵母细胞、卵子、和胚胎组成的组中的任一者关联。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。
53.如权利要求50所述的方法，其中所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。
54.如权利要求50所述的方法，其中所述雌性供体受试者是小型反刍动物。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
56.如权利要求50所述的方法，其中指示所述雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的所述微生物组谱包含：
较低相对丰度的以下中的一者或多者：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或
较高相对丰度的以下中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia spD12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
57.如权利要求50所述的方法，其中所述干预是抗生素。
58.如权利要求50所述的方法，其中所述干预是一种或多种微生物。
59.如权利要求50所述的方法，其中所述干预是益生元。
60.如权利要求50所述的方法，其中将所述干预施用于所述雌性供体受试者的阴道腔。
61.如权利要求50所述的方法，其中所述干预是一种或多种微生物，所述微生物包括以下中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia sp D12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
62.如权利要求50所述的方法，其中所述干预有效地降低以下中的一者或多者的相对丰度：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属，并且有效地增加以下中的一者或多者的相对丰度：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia sp D12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
63.一种用于选择雌性供体受试者以进行体外受精的套件，所述套件包括：
(1)一种或多种分析工具，其用于确定来自所述雌性供体受试者的阴道微生物样品的微生物组谱；
(2)发射器，其用于通信传输/连接阴道微生物样品的一个或多个微生物组谱的数据库；
(3)装置，其用于将来自所述雌性供体受试者的所述阴道微生物样品的所述微生物组谱与所述一个或多个微生物组谱的数据库进行比较以鉴定哪些雌性供体受试者具有指示选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的高生产率的微生物组谱；以及
(4)使用说明。
64.如权利要求63所述的套件，其中所述雌性供体受试者的阴道微生物组谱与平均产生大于4个选自由卵母细胞、卵子、和胚胎组成的组中的任一者关联。
65.如权利要求63所述的套件，其中所述微生物组谱通过核糖体RNA的扩增和测序来产生。
66.如权利要求63所述的套件，其中所述微生物组谱包括微生物分类和相对微生物丰度。
67.如权利要求63所述的套件，其中所述雌性供体受试者是小型反刍动物。
68.如权利要求67所述的套件，其中所述小型反刍动物选自由以下组成的组：奶牛、鹿、绵羊、山羊和水牛。
69.如权利要求63所述的方法，其中指示所述雌性供体受试者产生大量选自由卵母细胞、卵子和胚胎组成的组中的任一者的所述微生物组谱包含：
较低相对丰度的以下中的一者或多者：未分类的艰难杆菌属、移动杆菌属、动性球菌属和盐水球菌属；和/或
较高相对丰度的以下中的一者或多者：厌氧棒形菌属、拟杆菌科、乏养菌属、阿克曼氏菌科、韧皮杆菌属、盐单胞菌属、微小杆菌属、芽单胞菌属、海滨假单胞菌、Prodoshia spD12、颤藻亚纲、马塞分枝杆菌、瘤胃梭菌属、Suicoccus和沙特马赛假单胞菌。
70.如权利要求63所述的套件，其中所述一种或多种分析工具包括比色测定装置。
71.如权利要求73所述的套件，其中所述一种或多种分析工具包括测序装置。
72.如权利要求36-71中任一项所述的方法或套件，其中所述较高或较低相对丰度是通过线性判别分析(LDA)结合效应大小测量(LEfSe)来确定的相对丰度。
CN202080069971.5A 2019-10-04 2020-10-05 用于选择体外受精的供体和受体的组合物、方法和套件 Pending CN114761581A (zh)

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