CN114761425A - 用于免疫效应细胞工程化的增强的嵌合抗原受体和其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了用于获得功能上增强的衍生效应细胞的方法和组合物，所述功能上增强的衍生效应细胞通过分化经基因组工程化的iPSC获得。本文提供的所述衍生细胞具有递送改进的或增强的治疗效果的稳定且功能性的基因组编辑。还提供了治疗性组合物和其用途，所述治疗性组合物包括单独的所述功能上增强的衍生效应细胞或在组合疗法中所述功能上增强的衍生效应细胞与抗体或检查点抑制剂。

Description

用于免疫效应细胞工程化的增强的嵌合抗原受体和其用途
相关申请
本申请要求于2019年10月7日提交的美国临时申请序列号62/912,000和于2019年10月17日提交的美国临时申请序列号62/916,468的优先权，所述申请的公开内容通过引用以其整体在此并入。
以电子方式提交的序列表的引用
本申请通过引用并入与本申请一起提交的题为056932-521001WO_SEQUENCE_LISTING_ST25.txt的ASCII文本格式的序列表的计算机可读形式(CRF)，创建于2020年10月6日，并且大小为92,883字节。
技术领域
本公开广泛涉及现成的免疫细胞产物领域。更确切地说，本公开涉及研发能够活体内递送治疗相关特性的多功能效应细胞的策略。根据本公开研发的细胞产物解决了患者来源的细胞疗法的关键限制。
背景技术
过继性细胞疗法领域目前的重点是使用患者来源的细胞和供体来源的细胞，这使得实现癌症免疫疗法的持续制造以及向所有可能受益的患者递送疗法尤其困难。还需要改善过继转移的淋巴细胞的功效和持久性，以促进有利的患者结果。淋巴细胞(例如T细胞和自然杀伤(NK)细胞)是有效的抗肿瘤效应子，其在先天性和适应性免疫中起重要作用。然而，将这些免疫细胞用于过继性细胞疗法仍然具有挑战性，并且尚未满足改善的需求。因此，在过继性免疫疗法中，仍有大量机会来利用T细胞和NK细胞或其它免疫效应细胞的全部潜能。
发明内容
需要功能改善的效应细胞，其解决以下范围内的问题：从反应速率、细胞耗竭、输血细胞损失(存活率和/或持久性)、肿瘤通过标靶损失或谱系转换逃逸、肿瘤靶向精确度、脱靶毒性、肿瘤外效应到针对实体肿瘤的功效，即肿瘤微环境和相关免疫抑制、募集、贩运和浸润。
本发明的一个目的是提供用于产生由单一细胞源性iPSC(诱导多能干细胞)克隆系分化的衍生非多能细胞的方法和组合物，所述iPSC包括其基因组中的一种或几种基因修饰。所述一种或几种基因修饰包括DNA插入、缺失和取代，并且所述修饰在分化、扩增、传代和/或移植后在后续衍生细胞中保留并且保持功能性。
本申请的iPSC源性非多能细胞包含但不限于CD34细胞、造血内皮细胞、HSC(造血干细胞和祖细胞)、造血多能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞和具有一个或多个功能特征的原代NK、T和/或NKT细胞中不存在的免疫效应细胞。本申请的iPSC衍生的非多能细胞通过由包含相同基因修饰的iPSC分化而在其基因组中包含一种或几种基因修饰。用于获得经基因工程化的衍生细胞的经工程化的克隆iPSC分化策略要求iPSC在分化中的发育潜能不会受到iPSC中的经工程化的模态的不利影响，并且还要求经工程化的模态如预期一般在衍生细胞中起作用。进一步地，这一策略克服了对原代淋巴细胞(如从外周血获得的T细胞或NK细胞)进行工程化的现有障碍，因为此类细胞难以进行工程化，其中对这类细胞进行工程化通常缺乏再现性和均一性，使得细胞表现出伴随高细胞死亡和低细胞扩增的不良细胞持久性。此外，这种策略避免产生使用起始时为异源的原代细胞源另外获得的异源效应细胞群体。
本发明的一些方面提供使用包含(I)、(II)或(III)的方法获得的经基因组工程化的iPSC，分别反映了在重编程过程之后、同时和之前基因组工程化的策略：
(I)：通过(i)和(ii)中的一项或两项按任何次序对iPSC进行基因工程化：(i)将一个或多个构建体引入到iPSC中以允许在所选位点进行靶向整合；(ii)(a)使用能够进行所选位点识别的一种或多种核酸内切酶在所选位点处将一个或多个双链断裂引入到iPSC中；以及(b)培养步骤(I)(ii)(a)中的iPSC以允许进行内源性DNA修复，以在所述所选位点处产生靶向插入/缺失；由此获得能够分化为部分或完全分化的细胞的经基因组工程化的iPSC。
(II)：对重编程非多能细胞进行基因工程化，以获得经基因组工程化的iPSC，所述基因工程化包含：(i)使非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选的小分子组合物接触，以起始非多能细胞的重编程，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；以及(ii)按任何次序将(a)和(b)中的一种或两种引入步骤(II)(i)中的重编程非多能细胞中：(a)一个或多个构建体，以允许在所选位点进行靶向整合；(b)在所选位点使用至少一种能够进行所选位点识别的核酸内切酶的一个或多个双链断裂，然后培养步骤(II)(ii)(b)中的细胞以允许进行内源性DNA修复，从而在所选位点产生靶向插入/缺失；因此所获得的经基因组工程化的iPSC包含至少一种功能性靶向基因组编辑，并且所述经基因组工程化的iPSC能够分化成部分或完全分化细胞。
(III)：对重编程的非多能细胞进行基因工程化以获得经基因组工程化的iPSC，所述基因工程化包含(i)和(ii)：(i)按任何次序将(a)和(b)中的一种或两种引入非多能细胞中：(a)一个或多个构建体，以允许在所选位点进行靶向整合；(b)在所选位点使用至少一种能够进行所选位点识别的核酸内切酶的一个或多个双链断裂，其中培养步骤(III)(i)(b)中的细胞以允许进行内源性DNA修复，从而在所选位点产生靶向插入/缺失；和(ii)使步骤(III)(i)中的细胞与一种或多种重编程因子和任选的小分子组合物接触，以获得在所选位点包含靶向编辑的经基因组工程化的iPSC，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂；由此获得包含至少一种功能性靶向基因组编辑的经基因组工程化的iPSC，并且所述经基因组工程化的iPSC能够分化成部分分化的细胞或完全分化的细胞。
在以上方法的一个实施例中，一个或多个所选位点处的至少一种靶向基因组编辑包括插入一种或多种外源性多核苷酸，所述外源性多核苷酸编码安全开关蛋白、靶向模态、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白质和肽、药物靶点候选物或促进所述经基因组工程化的iPSC或其衍生细胞的移植、贩运、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活率的蛋白质。在一些实施例中，用于插入的外源性多核苷酸与以下可操作地连接：(1)一种或多种外源性启动子，所述一种或多种外源性启动子包括CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC或其它组成型、诱导性、时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性启动子；或者(2)所选位点中包括的一种或多种内源性启动子，所述一种或多种内源性启动子包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1或符合基因组安全港标准的其它基因座。在一些实施例中，使用以上方法产生的所述经基因组工程化的iPSC包括一种或多种不同的外源性多核苷酸，所述一种或多种不同的外源性多核苷酸编码包括胱天蛋白酶、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰的EGFR或B细胞CD20的蛋白质，其中当所述经基因组工程化的iPSC包括两个或更多个自杀基因时，所述自杀基因整合在不同的安全港基因座中，所述安全港基因座包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1。在一个实施例中，所述外源性多核苷酸编码IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和/或其相应受体的部分肽或全部肽。在一些实施例中，由外源性多核苷酸编码的IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和/或其相应受体的部分或全部肽呈融合蛋白形式。
在一些其它实施例中，使用本文所提供的方法产生的所述经基因组工程化的iPSC包括在一个或多个与以下相关联的内源性基因处的插入/缺失：靶向模态、受体、信号传导分子、转录因子、药物靶点候选物、免疫应答调控和调节或抑制iPSC或其衍生细胞的移植、贩运、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活率的蛋白质。在一些实施例中，用于破坏的内源性基因包括以下中的至少一种：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP，以及染色体6p21区中的任何基因。
在又一些其它实施例中，使用本文所提供的方法产生的经基因组工程化的iPSC包含位于AAVS1基因座的编码胱天蛋白酶的外源性多核苷酸和位于H11基因座的编码胸苷激酶的外源性多核苷酸。
在仍一些其它实施例中，方法(I)、(II)和/或(III)进一步包含：使经基因组工程化的iPSC与包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的小分子组合物接触，以维持经基因组工程化的iPSC的多能性。在一个实施例中，包括至少一个靶向基因组编辑的所获得的经基因组工程化的iPSC是功能性的、有分化潜能并且能够分化为包括同一功能性基因组编辑的非多能细胞。
本申请的一个方面提供了一种嵌合抗原受体，其包括：胞外结构域，所述胞外结构域包括至少一个抗原识别结构域；跨膜结构域；以及胞内结构域，所述胞内结构域包括至少一个信号传导结构域，其中所述至少一个信号传导结构域可以源自对T和/或NK细胞激活或功能化具有特异性的信号转导蛋白的细胞质结构域，其中所述嵌合抗原受体在包括在诱导多能干细胞(iPSC)中时促进将所述iPSC的分化定向为期望的衍生效应细胞，并且其中从所述iPSC分化的所述iPSC源性效应细胞相比于从外周血、脐带血或任何其它供体组织获得的原代免疫细胞，具有以下特性中的至少一个特性，所述特性包含但不限于：(i)改善的持久性和/或存活率；(ii)改善的细胞扩增；(iii)增加的细胞毒性；(iv)增加的对同种异体排斥的抗性；(v)改善的肿瘤穿透性；(vi)增强的将旁观者免疫细胞迁移到肿瘤位点和/或激活或募集所述旁观者免疫细胞的能力；(vii)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力。在各个实施例中，(a)所述信号转导蛋白包括以下中的任一种：2B4(自然杀伤细胞受体2B4)、4-1BB(肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、CD16(IgG Fc区受体III-A)、CD2(T细胞表面抗原CD2)、CD28(T细胞特异性表面糖蛋白CD28)、CD28H(含跨膜结构域和免疫球蛋白结构域的蛋白2)、CD3ζ(T细胞表面糖蛋白CD3ζ链)、DAP10(造血细胞信号转导子)、DAP12(TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白)、DNAM1(CD226抗原)、FcERIγ(高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ)、IL21R(白介素-21受体)、IL-2Rβ/IL-15RB(白介素-2受体亚基β)、IL-2Rγ(细胞因子受体共有亚基γ)、IL-7R(白介素-7受体亚基α)、KIR2DS2(杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DS2)、NKG2D(NKG2-D II型整合膜蛋白)、NKp30(自然细胞毒性触发受体3)、NKp44(自然细胞毒性触发受体2)、NKp46(自然细胞毒性触发受体1)、CS1(SLAM家族成员7)和CD8(T细胞表面糖蛋白CD8α链)；和/或(b)所述至少一个信号传导结构域包括与分别由SEQ ID NO:21-41、54和56表示的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在特定实施例中，所述至少一个信号传导结构域包括与分别由SEQ ID NO:21-41、54和56表示的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列；并且其中所述细胞质结构域的所述部分包括ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)、YxxM基序、TxYxxV/I基序、FcRγ、半ITAM和/或ITT样基序。
在各个实施例中，所述胞内结构域包括第一信号传导结构域、第二信号传导结构域以及任选地第三信号传导结构域；并且其中所述第一信号传导结构域、所述第二信号传导结构域和所述第三信号传导结构域不同。在其中所述胞内结构域包括第二信号传导结构域以及任选地第三信号传导结构域的那些实施例中的一些实施例中，所述第二信号传导结构域或所述第三信号传导结构域包括与分别由SEQ ID NO:21-41、54和56表示的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在各个实施例中，所述胞内结构域包括两个不同的信号传导结构域，并且所述胞内结构域包括呈包含但不限于以下的形式中的任何一种形式的融合的细胞质结构域或其部分：2B4-CD3ζ/1XX、2B4-DNAM1、2B4-FcERIγ、2B4-DAP10、CD16-DNAM1、CD16-DAP10、CD16-DAP12、CD2-CD3ζ/1XX、CD2-DNAM1、CD2-FcERIγ、CD2-DAP10、CD28-DNAM1、CD28-FcERIγ、CD28-DAP10、CD28-DAP12、CD28H-CD3ζ/1XX、DAP10-CD3ζ/1XX、DAP10-DAP12、DAP12-CD3ζ/1XX、DAP12-DAP10、DNAM1-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-DAP10、KIR2DS2-2B4和NKp46-2B4。在各个实施例中，所述胞内结构域包括三个不同的信号传导结构域，并且所述胞内结构域进一步包括呈选自以下的形式中的任何一种形式的融合的细胞质结构域或其部分：2B4-DAP10-CD3ζ/1XX、2B4-IL21R-DAP10、2B4-IL2RB-DAP10、2B4-IL2RB-CD3ζ/1XX、2B4-41BB-DAP10、CD16-2B4-DAP10和KIR2DS2-2B4-CD3ζ/1XX。
在一些实施例中，所述胞内结构域包括仅一个信号传导结构域，其中所述胞内结构域包括与DNAM1、CD28H、KIR2DS2、DAP12或DAP10的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
在所述嵌合抗原受体的各个实施例中，所述跨膜结构域包括与CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1或T细胞受体多肽的跨膜区或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在各个实施例中，所述跨膜结构域包括与分别由SEQ ID NO:1-20、53和55表示的2B4、CD2、CD16、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1或CD8的跨膜区或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在各个实施例中，所述跨膜结构域和其立即连接的信号传导结构域来自同一蛋白质或来自不同的蛋白质。
在所述嵌合抗原受体的各个实施例中，所述嵌合抗原受体包括跨膜结构域和胞内结构域(TM-(胞内结构域))，其中所述嵌合抗原受体包括：(i)以下形式之一：NKG2D-(2B4-IL2RB-CD3ζ)、CD8-(41BB-CD3ζ1XX)、CD28-(CD28-2B4-CD3ζ)、CD28H-(CD28H-CD3ζ)、DNAM1-(DNAM1-CD3ζ)、DAP10-(DAP10-CD3ζ)、KIR2DS2-(KIR2DS2-CD3ζ)、KIR2DS2-(KIR2DS2-DAP10)、KIR2DS2-(KIR2DS2-2B4)、CD16-(CD16-2B4-DAP10)、CD16-(CD16-DNAM1)、NKp46-(NKp46-2B4)、NKp46-(NKp46-2B4-CD3ζ)、NKp46-(NKp46-CD2-Dap10)、CD2-(CD2-CD3ζ)、2B4-(2B4-CD3ζ)、2B4-(2B4-FcERIg)和CS1-(CS1-CD3ζ)；或(ii)与由SEQ ID NO:57-74中的每一个表示的序列具有约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同一性的氨基酸序列。
在所述嵌合抗原受体的各个实施例中，所述抗原识别结构域与和疾病、病原体、液体瘤或实体瘤相关的抗原特异性结合。在各个实施例中，所述抗原识别结构域可以对以下具有特异性：(i)CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1中的任一种：或(ii)ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAlX)、CCRI、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP 2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A 1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症睾丸抗原NY-ESO-1、瘤胎抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(Wilms tumor protein)(WT-1)和病原体抗原中的任一种。
在所述嵌合抗原受体的各个实施例中，所述胞外结构域包括以下中的一种或多种：(i)两个抗原识别结构域；(ii)信号肽；和/或(iii)间隔子/铰链。在一些实施例中，所述嵌合抗原受体可以包括在共表达细胞表面表达的外源性细胞因子或其受体的部分肽或全长肽的双顺反子构建体中，其中所述外源性细胞因子或其受体包括：(a)IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和其相应受体中的至少一种；或(b)以下中的至少一种：(i)通过使用自切割肽进行的IL15和IL15Rα的共表达；(ii)IL15与IL15Rα的融合蛋白；(iii)其中IL15Rα的细胞内结构域被截短或被消除的IL15/IL15Rα融合蛋白；(iv)IL15与IL15Rα的膜结合的Sushi结构域的融合蛋白；(v)IL15与IL15Rβ的融合蛋白；(vi)IL15与共有受体γC的融合蛋白，其中所述共有受体γC为天然的或经修饰的；以及(vii)IL15Rβ的同源二聚体。
在其中所述嵌合抗原受体包括在诱导多能干细胞(iPSC)中并促进将所述iPSC的分化定向为期望的衍生效应细胞的那些实施例中的一些实施例中，来自iPSC分化的所述衍生效应细胞包括以下中的一种或多种：衍生CD34细胞、衍生造血干细胞和祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生T细胞祖细胞、衍生NK细胞祖细胞、衍生T细胞、衍生NKT细胞、衍生NK细胞、衍生B细胞或衍生免疫效应细胞。在各个实施例中，iPSC源性免疫效应细胞表达所述嵌合抗原受体，并且所述iPSC源性免疫效应细胞包括原代T、NK和/或NKT细胞中不存在的至少一个功能特征。
在另一方面，本发明提供了一种细胞或其群体，其中：(i)所述细胞可以为免疫细胞、诱导多能细胞(iPSC)、克隆iPSC或iPS细胞系细胞；或者所述细胞可以为通过使所述iPSC分化获得的衍生效应细胞；并且(ii)所述细胞包括至少一种如本文提供的嵌合抗原受体(CAR)。在各个实施例中，所述细胞进一步包括以下中的一项或多项：(i)CD38敲除；(ii)与所述细胞的对应物原代细胞相比，B2M无效或低以及任选地CIITA无效或低；(iii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一种或两种的敲除；(iv)CD16或其变体；(v)具有不同靶向特异性的第二CAR；(vi)细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分肽或全部肽；(vii)表2中列出的基因型中的至少一种基因型；(viii)与所述细胞的对应物原代细胞相比，TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一种中的缺失或减少的表达；或(ix)与所述细胞的对应物原代细胞相比，HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、衔接子以及用于与激动剂偶联的表面触发受体中的至少一种中的所引入或增加的表达。
在各个实施例中，所述细胞进一步包括高亲和力不可切割的CD16(hnCD16)或其变体。在一些实施例中，所述CD16或其变体包括以下中的至少一种：(a)CD16的胞外结构域中的F176V和S197P；(b)源自CD64的全部或部分胞外结构域；(c)非天然(或非CD16)跨膜结构域；(d)非天然(或非CD16)细胞内结构域；(e)非天然(或非CD16)信号传导结构域；(f)非天然刺激性结构域；以及(g)并非源自CD16并且源自同一多肽或不同多肽的跨膜结构域、信号传导结构域和刺激性结构域。在特定实施例中，(a)所述非天然跨膜结构域可以源自CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1或T细胞受体(TCR)多肽；(b)所述非天然刺激性结构域可以源自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D多肽；(c)所述非天然信号传导结构域可以源自CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽；或者(d)所述非天然跨膜结构域可以源自NKG2D，所述非天然刺激性结构域可以源自2B4，并且所述非天然信号传导结构域可以源自CD3ζ。
在各个实施例中，所述细胞进一步包括第二CAR，其中所述第二CAR为：(i)T细胞特异性或NK细胞特异性的；(ii)双特异性抗原结合性CAR；(iii)可切换的CAR；(iv)二聚化的CAR；(v)分开的CAR；(vi)多链CAR；(vii)诱导型CAR；(viii)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中与细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分肽或全部肽共表达的；(xi)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中与检查点抑制剂共表达的；(xii)对CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1中的至少一种具有特异性；和/或(xiii)对以下中的任一种具有特异性：ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAlX)、CCRI、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP 2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A 1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症睾丸抗原NY-ESO-1、瘤胎抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(WT-1)和病原体抗原。
在各个实施例中，所述细胞包括细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分肽或全部肽，其中：(a)所述外源性细胞因子或其受体包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和其相应受体中的至少一种；或者(b)所述外源性细胞因子或其受体包括以下中的至少一种：(i)通过使用自切割肽进行的IL15和IL15Rα的共表达；(ii)IL15与IL15Rα的融合蛋白；(iii)其中IL15Rα的细胞内结构域被截短或被消除的IL15/IL15Rα融合蛋白；(iv)IL15与IL15Rα的膜结合的Sushi结构域的融合蛋白；(v)IL15与IL15Rβ的融合蛋白；(vi)IL15与共有受体γC的融合蛋白，其中所述共有受体γC为天然的或经修饰的；以及(vii)IL15Rβ的同源二聚体；其中(i)-(vii)中的任一项可以在单独构建体中或在双顺反子构建体中与CAR共表达；并且任选地，(c)所述外源性细胞因子或其受体为瞬时表达的。
在其中所述细胞或其群体为衍生效应细胞的那些实施例中的一些实施例中，所述衍生效应细胞可以为造血细胞，并且包括比从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的所述衍生细胞的对应物原代细胞的端粒更长的端粒；或者其中所述CAR具有以下特性中的至少一个特性：(i)为T或NK细胞特异性的；(ii)在抗原结合中为双特异性的；(iii)为可切换的CAR；(iv)为二聚化的CAR；(v)为分开的CAR；(vi)为多链CAR；(vii)为诱导型CAR；以及(viii)被插入在以下基因座之一处：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT，其中所述插入敲除或减少基因在所述基因座中的表达。在各个实施例中，所述衍生效应细胞能够募集T细胞和/或将T细胞迁移到肿瘤部位，并且其中所述衍生效应细胞能够在存在一种或多种检查点抑制剂的情况下降低肿瘤免疫抑制。在各个实施例中，所述衍生效应细胞包括衍生CD34细胞、衍生造血干细胞和祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生T细胞祖细胞、衍生NK细胞祖细胞、衍生T细胞、衍生NKT细胞、衍生NK细胞、衍生B细胞或衍生免疫效应细胞。
在其中所述细胞细胞进一步包括与检查点抑制剂共表达的第二CAR，或其中所述衍生效应细胞能够在一种或多种检查点抑制剂存在下减少肿瘤免疫抑制的那些实施例中的一些实施例中，所述检查点抑制剂可以是一种或多种检查点分子的拮抗剂，所述一种或多种检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR。在各个实施例中，所述检查点抑制剂包括：(a)阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐单抗(durvalumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗(lirimumab)、莫那利珠单抗(monalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、派立珠单抗(pembrolizumab)和其衍生物或功能等效物中的一种或多种；或(b)阿特珠单抗、纳武单抗和派立珠单抗中的至少一种。
在其中所述细胞或其群体为衍生效应细胞的那些实施例中的一些实施例中，所述衍生效应细胞相比于从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的所述衍生效应细胞的对应物原代细胞，具有以下特性中的至少一个特性：(i)改善的持久性和/或存活率；(ii)增加的对同种异体反应性受体免疫细胞的抗性；(iii)增加的细胞毒性；(iv)改善的肿瘤渗透性；(v)增强的或获取的ADCC；(vi)增强的将旁观者免疫细胞迁移到肿瘤位点和/或激活或募集所述旁观者免疫细胞的能力；(vii)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；(viii)改善的拯救肿瘤抗原逃逸的能力；(ix)稳定肿瘤抗原的能力；以及(x)避免互相杀伤的能力。
在所述细胞或其群体的一些实施例中，所述细胞包括：(i)整合在安全港基因座或所选基因座中的一种或多种外源性多核苷酸；(ii)整合在不同的安全港基因座或两个或更多个所选基因座中的多于两种外源性多核苷酸。在特定实施例中，安全港基因座可以为AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH或RUNX1中的至少一种；并且其中所述所选基因座可以为B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT之一；并且其中所述外源性多核苷酸的整合敲除了基因在基因座中表达。在其中所述基因座为TCR的实施例中，所述TCR基因座可以为TCRα或TCRβ的恒定区。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包括如本文所述的细胞或其群体。在相关方面，本发明提供了一种用于治疗用途的组合物，所述组合物包括本文提供的所述衍生效应细胞以及一种或多种治疗剂。在各个实施例中，所述一种或多种治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其替代因子、包括一种或多种所关注多核酸的载体、抗体或其功能变体或片段、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。在其中所述组合物包括检查点抑制剂的那些实施例中的一些实施例中，所述检查点抑制剂可以包括：(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂，所述检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR；(b)以下中的一种或多种：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、派姆单抗和其衍生物或功能等效物；或者(c)阿特珠单抗、纳武单抗和派姆单抗中的至少一种；或者所述一种或多种治疗剂包括维奈托克(venetoclax)、阿扎胞苷(azacitidine)和泊马度胺(pomalidomide)中的一种或多种。在其中所述组合物包括抗体的那些实施例中的一些实施例中，所述抗体可以包括：(a)抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1和/或抗CD38抗体；(b)雷妥昔单抗(rituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、乌布里图昔单抗(ublituximab)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)、奥比珠单抗(obinutuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、西妥昔单抗(certuximab)、迪努妥昔单抗(dinutuximab)、阿维鲁单抗、达土木单抗(daratumumab)、艾沙妥昔单抗(isatuximab)、MOR202、7G3、CSL362、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)和其人源化或经Fc修饰的变体或片段以及其功能等效物和生物仿制药中的一种或多种；或(c)达土木单抗，并且其中所述衍生效应细胞包括CD38敲除以及任选地CD16或其变体的表达。
在另一方面，本发明提供了本文提供的组合物的治疗用途，其通过将所述组合物引入到适于过继性细胞疗法的受试者中进行，其中所述受试者患有自身免疫性病症、恶性血液病、实体瘤、癌症或病毒感染。
在又另一方面，本发明提供了一种制造包括如本文所述的CAR的衍生效应细胞的方法，其中所述方法包括使经基因工程化的iPSC分化，其中所述iPSC包括编码所述CAR的多核苷酸，以及任选地引起以下的一种或多种编辑：(i)CD38敲除；(ii)与所述iPSC的对应物原代细胞相比，B2M无效或低以及任选地CIITA无效或低；(iii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一种或两种的敲除；(iv)CD16或其变体；(v)具有不同的靶向特异性的嵌合抗原受体(CAR)；(vi)细胞表面表达的外源性细胞因子或其受体的部分肽或全部肽；(vii)表2中列出的基因型中的至少一种基因型；(viii)与所述iPSC的对应物原代细胞相比，TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一种中的缺失或减少的表达；和/或(ix)与所述iPSC的对应物原代细胞相比，HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、衔接子以及用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一种中的所引入或增加的表达。在各个实施例中，所述方法进一步包括对克隆iPSC进行基因组工程化以敲入编码CAR的多核苷酸；以及任选地：(i)敲除CD38；(ii)敲除B2M和CIITA；(iii)敲除一种或两种CD58和CD54；和/或(iv)引入HLA-G或不可切割的HLA-G、高亲和力不可切割的CD16或其变体、第二CAR、和/或细胞表面表达的外源性细胞因子或其受体的部分肽或全部肽的表达。在一些实施例中，所述基因组工程化包括靶向编辑。在特定实施例中，所述靶向编辑包括缺失、插入或插入/缺失，并且其中所述靶向编辑可以通过CRISPR、ZFN、TALEN、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其它功能性变型执行。
在又另一方面，本发明提供了对克隆iPSC的CRISPR介导的编辑，其中所述编辑包括敲入编码如本文所述的CAR的多核苷酸。在各个实施例中，克隆iPSC的所述编辑进一步包括敲除CD38，或者所述CAR可以插入在包括以下的基因座之一：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT；并且其中所述插入敲除基因在所述基因座中的表达。
在又另一方面，本发明提供了一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包括如本文所述的CAR的细胞。在各个实施例中，所述细胞包括衍生效应细胞，所述衍生效应细胞包括CD38敲除、CD16或其变体，并且可以任选地包括：(i)B2M和CIITA敲除；(ii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一种或两种的敲除；(iii)第二CAR和/或细胞表面表达的外源性细胞因子或其受体的部分肽或全部肽的所引入表达；和/或(iii)表2中列出的基因型中的至少一种基因型。在各个实施例中，与使用不具有如本文所述的CAR的效应细胞进行的治疗相比，施用所述细胞引起以下中的一项或多项：(i)减少MICA/B抗原的肿瘤细胞表面脱落；(ii)增加肿瘤细胞表面MICA/B密度；(iii)防止肿瘤抗原逃逸；(iv)克服肿瘤微环境抑制；(v)增强效应细胞激活和杀伤功能；以及(vi)体内肿瘤进展控制、肿瘤细胞负荷降低、肿瘤清除和/或改善存活率。
通过结合附图进行的以下描述，如本文所提供的组合物和方法的各个目的和优势将变得显而易见，在所述附图中借助于说明和实例阐述本发明的某些实施例。
附图说明
图1是用于iPSC源性细胞中的细胞表面表达的细胞因子的几种构建体设计的图形表示。IL15用作说明性实例，其可以用其它所期望的细胞因子置换。
图2A-C例示了具有相同scFv和CD8铰链区并且仅在包括胞内结构域的信号传导组分方面不同的CAR构建体。
图3A-I示出了iPSC衍生细胞在使用Thy1.1表达的FACS分选和CAR抗体染色的慢病毒转导之后稳定表达靶特异性CAR。
图4是通过流式细胞术确定的端粒长度的图形表示，其示出了相比于成人外周血NK细胞，来自iPSC的成熟衍生NK细胞维持更长的端粒。
具体实施方式
iPSC(诱导性多能干细胞)的基因组修饰包括多核苷酸插入、缺失和取代。经基因组工程化的iPSC中的外源性基因表达通常遇到问题，例如在初始经基因组工程化的iPSC长期克隆扩增之后、在细胞分化之后和在来自衍生自经基因组工程化的iPSC的细胞的去分化细胞类型中基因沉默或基因表达减少。在另一方面，对如T细胞或NK细胞等原代免疫细胞进行直接工程化具有挑战性，并且对制备和递送用于过继性细胞疗法的经工程化的免疫细胞存在障碍。本发明提供了一种用于将包含自杀基因和其它功能性模态的提供与移植、贩运、归巢、迁移、细胞毒性、活力、维持、扩增、寿命、自我更新、持久性和/或存活率相关的改善的治疗性质的一种或多种外源性基因稳定地整合到iPSC衍生细胞，包含但不限于HSC(造血干细胞祖细胞)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞中的高效、可靠且靶向的方法。
定义
除非本文中另外定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有所属领域的普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
应理解，本发明不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，且因此可变化。本文所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的，并且并不意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书界定。
如本文所用，本文使用冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”来指代所述冠词的语法宾语中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一个要素”意指一个要素或超过一个要素。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。
术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一种或两种。
如本文中所使用，术语“约”或“大约”是指相较于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施例中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围。
如本文中所使用，术语“大体上”或“基本上”是指相较于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度，数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高。在一个实施例中，术语“基本上相同”或“大体上相同”是指与参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大约相同的数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
如本文中所使用，术语“大体上不含”和“基本上不含”可互换使用，且当用于描述组合物(例如细胞群体或培养基)时，是指不含所指定物质或其来源的组合物，例如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含所指定物质或其来源，或检测不到，如通过常规方式所测量。术语组合物中“不含”或“基本上不含”某种成分或物质也意指(1)所述组合物中不包括任何浓度的这类成分或物质，或(2)所述组合物中包括功能上呈惰性、但处于低浓度的这类成分或物质。类似含义可以应用于术语“不存在”，其中是指不存在组合物的特定物质或其来源。
在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise/comprises/comprising)”应理解成暗指包括所陈述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。在特定实施例中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义地使用。
“由…组成”意指包括并且限于短语“由…组成”之后的任何事物。因此，短语“由…组成”指示所列要素是需要或必需的，并且不能存在其它要素。
“基本上由……组成”意指包括短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响本公开中规定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”指示所列要素为需要或必需的，但其它要素不是任选的且可视其是否影响所列要素的活性或作用而存在或不存在。
贯穿本说明书提及“一个实施例”、“一实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某一实施例”、“额外实施例”或“另一实施例”或其组合意指结合实施例描述的特定特征、结构或特性包括于本发明的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书中的各处出现的前述短语不一定全部指代同一实施例。此外，特定特征、结构或特性可在一个或多个实施例中以任何合适方式组合。
术语“离体”一般是指在生物体外部发生的活动，例如在生物体外部的人工环境中的活组织中或活组织上进行的实验或测量，优选其中天然条件的改变最小。在特定实施例中，“离体”程序涉及从生物体中获取活细胞或组织并且通常在无菌条件下在实验室设备中培养，并且通常培养几小时或最多约24小时，但包括最多48小时或72小时或更长，这视情况而定。在某些实施例中，可以收集和冷冻这类组织或细胞，并且随后解冻以进行离体处理。持续时间长于几天的使用活细胞或组织的组织培养实验或程序典型地被视为“活体外”，但在某些实施例中，这个术语可与离体互换使用。
术语“活体内”一般是指在生物体内部发生的活动。
如本文中所使用，术语“重编程”或“去分化”或“提高细胞效能”或“提高发育效能”是指一种提高细胞效能或使细胞去分化成较低分化状态的方法。举例来说，相较于非重编程状态下的相同细胞，细胞效能增加的细胞具有更大的发育可塑性(即，可分化成更多细胞类型)。换句话说，重编程细胞为与非重编程状态下的相同细胞相比分化状态减少的细胞。
如本文中所使用，术语“分化”是未特化(“未专门化”)或弱特化细胞借以获得特化细胞(例如血细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化细胞或分化诱导的细胞是已处在细胞谱系内的更特化(“专门化”)位置的细胞。术语“专门化”在应用于分化过程时是指一种细胞，所述细胞在分化路径中已经行进到在正常情况下其将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的亚群并且在正常情况下其不能分化成不同细胞类型或恢复为更弱分化细胞类型的时刻。如本文中所使用，术语“多能”是指细胞形成身体或胞体(即，胚胎本身)的所有谱系的能力。举例来说，胚胎干细胞是一种类型的多能干细胞，其能够从三种胚层：外胚层、中胚层和内胚层中的每一种形成细胞。多能性是一种连续的发育效能，范围为不能产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如外胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整生物体的更原始、更多能细胞(例如胚胎干细胞)。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或iPSC意指所述干细胞由分化的成人、新生儿或胎儿细胞产生，已经被诱导或改变，即被重新编程为能够分化为如下全部三种胚层或真皮层的组织的细胞：中胚层、内胚层和外胚层。所产生的iPSC并非指如其在自然界中被发现的那样的细胞。
如本文中所使用，术语“胚胎干细胞”是指胚胎囊胚的内部细胞团块中的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的并且在发育期间产生三种原代胚层：外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生细胞。其对胚胎外膜或胎盘没有贡献，即，不是分化全能的。
如本文中所使用，术语“多能干细胞”是指具有分化成一种或多种胚层(外胚层、中胚层和内胚层)、但非全部三种胚层的细胞的发育潜能的细胞。因此，多能细胞也可以称为“部分分化的细胞”。多能细胞为所属领域中熟知的，并且多能细胞的实例包括成人干细胞，例如造血干细胞和神经干细胞。“多能”指示细胞可以形成既定谱系内的许多类型的细胞，而非其它谱系的细胞。举例来说，多能造血细胞可形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但其不能形成神经元。因此，术语“多能性”是指一种细胞状态，其发育潜能的程度低于分化全能和多能。
可部分地通过评定细胞的多能性特征确定多能性。多能性特征包含但不限于：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜能；(iii)多能干细胞标志物的表达，所述标志物包含但不限于SSEA1(仅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/凸素(prominin)、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化成所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；以及(vi)由来自三种体细胞谱系的细胞组成的类胚胎体的形成。
先前已描述两种类型的多能性：“激发”或“亚稳定”的多能性状态等效于后期囊胚的外胚层干细胞(EpiSC)，且“初始”或“基础”的多能性状态等效于早期/植入前囊胚的内部细胞团块。尽管两种多能状态都展现如上文所描述的特征，但所述初始或基础状态进一步展现；(i)雌性细胞中的X染色体的预先失活或再激活；(ii)在单一细胞培养期间，克隆性和存活率改善；(iii)DNA甲基化总体减少；(iv)发育调节基因启动子上的H3K27me3抑制性染色质标记沉积减少；以及(v)相对于激发状态的多能细胞，分化标志物的表达减少。通常发现细胞重编程标准方法(其中将外源性多能性基因引入体细胞中，表达，并且然后沉默或从所得多能细胞中去除)具有多能性激发状态的特征。在标准多能细胞培养条件下，除非维持外源性转基因表达(其中观察到基础状态的特征)，否则这类细胞保持激发状态。
如本文中所使用，术语“多能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态特征。正常胚胎干细胞形态的特征是小圆形形状，细胞核与细胞质比率高，明显存在核仁，和典型的细胞间间距。
如本文中所使用，术语“受试者”是指任何动物，优选为人类患者、家畜或其它驯养动物。
“多能性因子”或“重编程因子”是指能够单独或与其它药剂组合增加细胞的发育效能的药剂。多能性因子包含但不限于能够增加细胞的发育效能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性多能性因子包括例如转录因子和小分子重编程剂。
“培养”或“细胞培养”是指细胞在活体外环境中的维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基”(在各种情况下为单数“培养基(medium)”)、“补充剂”和“培养基补充剂”是指培养细胞培养物的营养组合物。
“培养”或“维持”是指细胞在组织或身体外部(例如在无菌塑料(或经涂布的塑料)细胞培养皿或烧瓶中)的维持、繁殖(生长)和/或分化。“培养”或“维持”可以利用培养基作为有助于繁殖和/或维持细胞的营养物、激素和/或其它因子来源。
如本文中所使用，术语“中胚层”是指三种胚层中的一种，其出现于早期胚胎发生期间且产生各种特化细胞类型，包括循环系统的血细胞、肌肉、心脏、真皮、骨骼和其它支持和结缔组织。
如本文中所使用，术语“永久造血内皮细胞”(HE)或“多能干细胞衍生的永久造血内皮细胞”(iHE)是指在称为内皮细胞向造血细胞转变的过程中产生造血干细胞和祖细胞的内皮细胞亚群。胚胎中的造血细胞发育依序进行：从侧板中胚层到成血管细胞到永久造血内皮细胞和造血祖细胞。
术语“造血干细胞和祖细胞”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前驱细胞”是指定型为造血谱系，但能够进一步造血分化的细胞，且包括多能造血干细胞(血胚细胞)、骨髓祖细胞、巨核细胞祖细胞、红细胞祖细胞和淋巴祖细胞。造血干细胞和祖细胞(HSC)是多能干细胞，其产生所有血细胞类型，包括骨髓(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。如本文所用，术语“永久造血干细胞”是指能够产生成熟骨髓细胞类型和淋巴细胞类型两者，包含T谱系细胞、NK谱系细胞和B谱系细胞的CD34+造血细胞。造血细胞还包括原始造血细胞的多种亚群，其产生原始红细胞、巨核细胞和巨噬细胞。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用并且是指白血细胞的主要类型，其在胸腺中完成成熟并且在免疫系统中具有多种作用，包含识别体内的特异性外来抗原和使其它免疫细胞以MHC I类限制的方式激活和失活。T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或获自哺乳动物的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以处于任何发育阶段，包含但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、初始T细胞、调控T细胞、γδT细胞(gamma delta T cell/γδTcell)等等。其它类型的辅助T细胞包括例如Th3(Treg)、Th17、Th9或Tfh细胞的细胞。其它类型的记忆T细胞包括例如中枢记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tem细胞和TEMRA细胞)的细胞。T细胞还可以指经基因工程化的T细胞，例如经修饰以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞或T细保养效应细胞还可以由干细胞或祖细胞分化。T细胞样衍生效应细胞在一些方面可以具有T细胞谱系，但同时具有原代T细胞中不存在的一种或多种功能特征。
“CD4+T细胞”是指在其表面上表达CD4且与细胞介导的免疫应答相关的T细胞的亚群。其特征在于刺激后的分泌概况，其可包括分泌细胞因子，例如IFN-γ、TNF-α、IL2、IL4和IL10。“CD4”是最初被定义为T淋巴细胞上的分化抗原，但也发现于包括单核细胞/巨噬细胞的其它细胞上的55-kD的糖蛋白。CD4抗原为免疫球蛋白超基因家族的成员，且表明为MHC(主要组织相容性复合物)II类限制的免疫应答中的相关识别元件。在T淋巴细胞上，其界定了辅助/诱导因子亚群。
“CD8+T细胞”是指在其表面上表达CD8，受限于MHC I类，且充当细胞毒性T细胞的T细胞的亚群。“CD8”分子是在胸腺细胞上和细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上发现的分化抗原。CD8抗原为免疫球蛋白超基因家族的成员，并且是主要组织相容性复合物I类限制的相互作用中的相关识别元件。
如本文中所使用，术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指由CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的不存在定义的外周血淋巴细胞的亚群。如本文中所使用，术语“适应性NK细胞”和“记忆NK细胞”可互换并且是指NK细胞的亚群，其表型为CD3-和CD56+，表达NKG2C和CD57和任选的CD16中的至少一种，但缺少以下中的一种或多种的表达：PLZF、SYK、FceRγ和EAT-2。在一些实施例中，分离的CD56+NK细胞亚群包含CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配体、NKp30、NKp40、NKp46、活化和抑制性KIR、NKG2A和/或DNAM-1的表达。CD56+可以是较弱或较强的表达。NK细胞或NK细胞样效应细胞可以从干细胞或祖细胞分化。NK细胞样衍生效应细胞在一些方面可以具有NK细胞谱系，但同时具有原代T细胞中不存在的一种或多种功能特征。
如本文所使用，术语“NKT细胞”或“自然杀伤T细胞”是指受限于CD1d的T细胞，其表达T细胞受体(TCR)。不同于检测由常规主要组织相容性(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞，NKT细胞识别由CD1d(一种非经典MHC分子)呈递的脂质抗原。识别两种类型的NKT细胞。恒定或I型NKT细胞表达非常有限的TCR库：典型α链(在人类中为Vα24-Jα18)与有限光谱的β链(在人类中为Vβ11)的结合。第二NKT细胞群体(称为非经典或非恒定II型NKT细胞)显示更不均匀的TCRαβ利用率。I型NKT细胞被视为适合于免疫疗法。适应性或恒定(I型)NKT细胞可以利用以下标志物中的至少一种或多种的表达来鉴别：TCR Va24-Ja18、Vb11、CD1d、CD3、CD4、CD8、aGalCer、CD161和CD56。
如本文中所使用，术语“分离”等是指细胞或细胞群体，其已从其原始环境中分离，即，所分离细胞的环境大体上不含如存在“未分离”参考细胞的环境中所发现的至少一种组分。所述术语包括从一些或所有组分去除的细胞，如同其在其自然环境中发现，例如从组织或活检样品分离。所述术语还包括从至少一种、一些或所有组分中去除的细胞，如同所述细胞在非天然存在的环境中发现，例如从细胞培养物或细胞悬浮液分离。因此，分离的细胞部分地或完全地与至少一种组分(包括其它物质、细胞或细胞群体)分离，如同其在自然界中发现或如同其在非天然存在的环境中生长、储存或生存。所分离细胞的特定实例包括部分纯的细胞组合物、大体上纯的细胞组合物和非天然存在的培养基中培养的细胞。可以通过将所期望的细胞或其群体与环境中的其它物质或细胞分离，或通过从环境中去除一个或多个其它细胞群体或亚群来获得分离的细胞。
如本文中所使用，术语“纯化”等是指增加的纯度。举例来说，纯度可以增加到至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
如本文中所使用，术语“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中的核苷酸的特异性序列的固有特性，以充当生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板，所述其它聚合物和大分子具有所定义的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或所定义的氨基酸序列和由其产生的生物特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和转译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，那么所述基因编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列一致且通常提供于序列表中)与非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)均可以称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
“构建体”是指包含待在活体外或活体内递送到宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。如本文所使用的“载体”是指能够引导外来遗传物质递送或转移到靶细胞的任何核酸构建体，在所述靶细胞中，所述核酸构建体能够复制和/或表达。如本文所使用的术语“载体”包含待递送的构建体。载体可以是线性或环状分子。载体可以是整合的或非整合的。载体的主要类型包含但不限于质粒、游离型载体、病毒载体、粘性质粒和人工染色体。病毒载体包含但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体(Sendai virus vector)等。
“整合”意指将构建体的一个或多个核苷酸稳定插入细胞基因组中，即，共价连接到细胞染色体DNA内的核酸序列。“靶向整合”意指将构建体的核苷酸在预选位点或“整合位点”处插入细胞染色体或线粒体DNA中。如本文所使用的术语“整合”进一步是指一种过程，其涉及在内源性序列或核苷酸缺失或不缺失的情况下在整合位点处插入构建体的一个或多个外源性序列或核苷酸。在插入位点存在缺失的情况下，“整合”可进一步包含用一个或多个所插入核苷酸置换缺失的内源性序列或核苷酸。
如本文中所使用，术语“外源性”欲意指参考分子或参考活性引入宿主细胞中，或对于宿主细胞是非原生的。可以例如通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，例如通过整合到宿主染色体中或作为非染色体遗传物质(例如质粒)来引入所述分子。因此，所述术语在关于编码核酸的表达使用时是指编码核酸以可表达形式引入细胞中。术语“内源性”是指存在于宿主细胞中的参考分子或活性。类似地，所述术语在关于编码核酸的表达使用时是指细胞内所含而非外源性引入的编码核酸的表达。
如本文中所使用，“所关注基因”或“所关注多核苷酸序列”是当放置在适当调控序列的控制下时活体内转录成RNA且在一些情况下转译成多肽的DNA序列。所关注的基因或多核苷酸可包含但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。举例来说，所关注基因可以编码miRNA、shRNA、天然多肽(即自然界中存在的多肽)或其片段；变异多肽(即，与天然多肽具有小于100％序列同一性的天然多肽的突变体)或其片段；经工程化的多肽或肽片段、治疗肽或多肽、成像标志物、可选标志物等等。
如本文中所使用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸的聚合物形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸的序列由四种核苷酸碱基构成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；和尿嘧啶(U)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶代替胸腺嘧啶)。多核苷酸可以包括基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖核酸酶、cDNA、重组多核苷酸、分支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸还指双链和单链分子。
如本文中所使用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指具有通过肽键共价连接的氨基酸残基的分子。多肽必须含有至少两种氨基酸，且多肽的氨基酸的最大数目不受限制。如本文中所使用，所述术语是指短链(在所属领域中通常也称为例如肽、寡肽和低聚物)和较长链(在所属领域中通常称为多肽或蛋白质)。“多肽”包括例如生物活性片段、大体上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然多肽、重组多肽、合成多肽或其组合。
“可操作地连接”是指单一核酸片段上的核酸序列的缔合，使得一种的功能受另一种影响。举例来说，当启动子能够影响编码序列或功能RNA表达(即，编码序列或功能RNA处于启动子的转录控制下)时，所述启动子与所述编码序列或功能RNA可操作地连接。编码序列可以在有义或反义定向上可操作地连接到调控序列。
如本文中所使用，术语“遗传印记”是指对源细胞或iPSC的优先治疗属性有贡献，并且可保留于源细胞衍生的iPSC和/或iPSC衍生的造血谱系细胞中的遗传或表观遗传信息。如本文中所使用，“源细胞”是一种可以用于通过重编程来产生iPSC的非多能细胞，并且源细胞衍生的iPSC可以进一步分化成特定细胞类型，包括任何造血谱系细胞。视上下文而定，源细胞衍生的iPSC和其分化细胞有时统称为“衍生的细胞”或“衍生细胞”。例如，如在整个本申请中所用，与其对应物原代细胞从如外周血、脐带血或其它供体组织天然(natural)/天然(native)来源获得相比，衍生效应细胞或衍生NK谱系细胞或衍生T谱系细胞是由iPSC分化的细胞。如本文中所使用，赋予优先治疗属性的遗传印记是通过使对供体、疾病或治疗反应具有特异性的所选源细胞重编程或通过使用基因组编辑将基因修饰模态引入iPSC来并入iPSC中。在从特别所选的供体、疾病或治疗背景中获得的源细胞的方面中，有助于优先治疗属性的基因印记可以包含任何背景特异性基因或表观遗传修饰，其显现可保留表型，即优先治疗属性，所述表型被传递到所选源细胞的衍生细胞，无论潜在分子事件是否得到鉴定都是如此。对供体、疾病或治疗反应具有特异性的源细胞可包含可保留于iPSC和衍生的造血谱系细胞中的遗传印记，所述遗传印记包含但不限于预排列的单特异性TCR，例如来自病毒特异性T细胞或恒定型自然杀伤T(iNKT)细胞；能追踪和所期望的遗传多态性，例如对编码所选供体中的高亲和力CD16受体的点突变来说为同型；和预定的HLA需求，即，所选HLA匹配供体细胞随着群体增大而展现单倍型。如本文中所使用，优先治疗属性包括衍生细胞的移植、贩运、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫应答调控和调节、存活率和细胞毒性改善。优先治疗属性还可以涉及靶向抗原的受体表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；靶上特异性改善，同时肿瘤外效应降低；对例如化学疗法等疗法的抗性。
如本文所使用的术语“增强的治疗特性”是指与相同一般细胞类型的典型免疫细胞相比增强的细胞的治疗特性。举例来说，与典型的、未修饰的和/或天然存在的NK细胞相比，具有“增强的治疗特性”的NK细胞将具有增强、改善和/或强化的治疗特性。免疫细胞的治疗特性可包含但不限于细胞移植、贩运、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫应答调控和调节、存活率和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性也通过以下来体现：靶向抗原的受体表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调节；靶上特异性改善，同时肿瘤外效应降低；对例如化学疗法等治疗的抗性。
如本文所用，术语“衔接子”是指一种分子，例如融合多肽，其能够在免疫细胞，例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞与肿瘤细胞之间形成连接；并且激活所述免疫细胞。衔接子的实例包含但不限于双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双特异性杀伤细胞衔接子(BiKE)、三特异性杀伤细胞衔接子或多特异性杀伤细胞衔接子，或与多种免疫细胞类型相容的通用衔接子。
如本文所用，术语“表面触发受体”是指一种能够触发或启动免疫应答，例如细胞毒性应答的受体。表面触发受体可以进行工程化，并且可以在效应细胞，例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞上表达。在一些实施例中，表面触发受体促进效应细胞与特定靶细胞，例如肿瘤细胞之间的双特异性或多特异性抗体接合，不依赖于效应细胞的天然受体和细胞类型。使用这种方法，人们可以产生包含通用表面触发受体的iPSC，并且然后使这类iPSC分化成表达通用表面触发受体的各种效应细胞类型的群体。“通用”意指表面触发受体可表达于任何效应细胞中并且活化任何效应细胞(不论细胞类型)，并且表达通用受体的所有效应细胞可与表面触发受体可识别的具有相同抗原决定基的衔接子偶联或连接(不论衔接子的肿瘤结合特异性)。在一些实施例中，具有相同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与通用表面触发受体偶联。在一些实施例中，具有不同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与通用表面触发受体偶联。因此，可使一种或多种效应细胞类型接合，以在一些情况下杀死一种特定类型的肿瘤细胞并且在一些其它情况下杀死两种或更多种类型的肿瘤。表面触发受体通常包括用于效应细胞激活的共刺激性结构域和对衔接子的表位具有特异性的表位结合区。双特异性衔接子对位于一端上的表面触发受体的表位结合区具有特异性，并且对位于另一端上的肿瘤抗原具有特异性。
如本文中所使用，术语“安全开关蛋白质”是指一种经工程化的蛋白质，其经设计以防止细胞疗法的潜在毒性或以其它方式防止副作用。在一些情况下，安全开关蛋白质表达受到有条件的控制，以解决所移植的经工程化的细胞的安全问题，所述细胞已经将编码安全开关蛋白质的基因永久地并入其基因组中。这种条件性调控可以是可变的并且可能包括通过小分子介导的转译后活化和组织特异性和/或时间转录调控进行控制。安全开关可以介导细胞凋亡的诱导、蛋白质合成的抑制、DNA复制、生长阻滞、转录和转录后基因调控，和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下，安全开关蛋白由外源性分子，例如前药激活，所述外源性分子在被激活时触发治疗细胞的凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白质的实例包含但不限于自杀基因，例如胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、经修饰EGFR和其任何组合。在这种策略中，在发生不良事件时给予的前药由自杀基因产物活化并且杀死转导的细胞。
如本文中所使用，术语“药物活性蛋白质或肽”是指能够对生物体实现生物学和/或医药作用的蛋白质或肽。药物活性蛋白质具有针对疾病的治愈性或姑息性特性，且可以给予以改善、减轻(relieve)、缓解、逆转或减轻(lessen)疾病的严重程度。药物活性蛋白质还具有防治性特性且用于防止疾病发作或减轻这类疾病或病理性病状在其显现时的严重程度。药物活性蛋白质包括完整蛋白质或肽或其药物活性片段。其还包括所述蛋白质或肽的药物活性类似物或所述蛋白质或肽的片段的类似物。术语药物活性蛋白质还指以协作或协同方式起作用以提供治疗效益的多种蛋白质或肽。药物活性蛋白质或肽的实例包含但不限于受体、结合蛋白、转录和转译因子、肿瘤生长抑制蛋白质、抗体或其片段、生长因子和/或细胞因子。
如本文中所使用，术语“信号传导分子”是指调节、参与、抑制、活化、减少或增加细胞信号转导的任何分子。信号转导是指通过沿着最终触发细胞中的生物化学事件的路径募集蛋白质复合物来以化学修饰的形式传递分子信号。信号转导路径为所属领域中熟知的，且包含但不限于G蛋白偶联受体信号传导、酪氨酸激酶受体信号传导、整合素信号传导、收费站信号传导、配体门控离子通道信号传导、ERK/MAPK信号传导路径、Wnt信号传导路径、cAMP依赖性路径和IP3/DAG信号传导路径。
如本文中所使用，术语“靶向模态”是指分子(例如多肽)以遗传方式并入细胞中以促进抗原和/或抗原决定基特异性，其包括但不限于i)抗原特异性(当其涉及独特的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)时)；ii)衔接子特异性(当其涉及单克隆抗体或双特异性衔接子时)；ⅲ)靶向转化细胞；iv)靶向癌症干细胞；和v)在不存在特异性抗原或表面分子的情况下的其它靶向策略。
如本文中所使用，与非特异性或非选择性结合相比，术语“特异性(specific/specificity)”可以用于指分子(例如受体或衔接子)选择性地结合到靶分子的能力。
如本文所使用的术语“过继性细胞疗法”是指基于细胞的免疫疗法，其在本文中使用时涉及自体或同种异体淋巴细胞的输注，所述淋巴细胞鉴别为经基因修饰或未经基因修饰的T细胞或B细胞，其在所述输注之前已离体扩增。
如本文中所使用，“治疗上足量”在其含义内包括无毒性、但足够和/或有效量的其所提及的特定治疗和/或医药组合物，以提供所期望的治疗效果。所需的精确量将随各受试者而变化，这取决于例如患者的一般健康状况、患者的年龄和病状的阶段和严重程度等因素。在特定实施例中，治疗上足够的量足以和/或有效减轻、减少和/或改善与所治疗的受试者的疾病或病状相关的至少一种症状。
多能干细胞的分化需要改变培养系统，例如改变培养基中的刺激剂或细胞的物理状态。大部分常规策略利用类胚胎体(EB)的形成作为共同和关键中间物来起始谱系特异性分化。“类胚胎体”是三维团簇，其已显示模拟胚胎发育，因为其在其三维区域内产生多种谱系。通过分化过程，通常为几小时到几天，简单的EB(例如经诱发以分化的聚集多能干细胞)继续成熟并且发育成囊性EB，此时，通常进一步将其处理数日到几周以继续分化。EB形成是通过使多能干细胞在三维多层细胞团簇中彼此紧密接近来起始的，这典型地是通过若干种方法中的一种来实现，包括允许多能细胞在液滴中沉降、使细胞沉降到“U”形底孔板中或通过机械搅拌。为了促进EB发育，多能干细胞聚集体需要进一步分化提示，因为多能培养维持性培养基中维持的聚集体不形成适当EB。因此，多能干细胞聚集体需要转移到分化培养基中，所述分化培养基向选定谱系提供诱发提示。随着在EB细胞团簇内适度增殖，多能干细胞的基于EB的培养通常会引起分化细胞群体(外胚层、中胚层和内胚层胚层)产生。虽然经证实促进细胞分化，但由于三维结构中的细胞不一致地暴露于来自环境的分化提示，EB产生了处于可变分化状态的异质细胞。另外，EB难以形成和维持。此外，通过EB进行的细胞分化伴随适度的细胞扩增，这也导致分化效率降低。
相比之下，与“EB形成”不同的“聚集体形成”可以用于扩增多能干细胞衍生的细胞群体。举例来说，在基于聚集体的多能干细胞扩增期间，选择培养基以维持增殖和多能性。细胞增殖通常增加聚集体的大小，从而形成更大聚集体，这些聚集体可用常规的机械或酶方式解离成较小聚集体，以维持培养物内的细胞增殖并且增加细胞数量。不同于EB培养，维持培养中的聚集体内所培养的细胞维持多能性的标记物。多能干细胞聚集体需要进一步分化提示来诱导分化。
如本文中所使用，“单层分化”是关于分化方法的术语，其不同于通过三维多层细胞团簇进行的分化，即，“EB形成”。除本文所公开的其它优势之外，单层分化避免了对用于分化起始的EB形成的需要。由于单层培养不模拟胚胎发育，例如EB形成，因此与EB中的所有三种胚层分化相比，朝向特定谱系的分化被认为是最少的。
如本文中所使用，“解离”细胞是指已与其它细胞或表面(例如培养板表面)大体上分离或纯化的细胞。举例来说，可通过机械或酶方法从动物或组织中解离细胞。替代地，活体外聚集的细胞可以彼此解离，例如通过以酶或机械方式解离到团簇、单一细胞或单一细胞与团簇的混合物的悬浮液中。在又一替代实施例中，从培养板或其它表面解离粘附细胞。因此，解离可涉及破坏细胞与细胞外基质(ECM)和衬底(例如培养表面)的相互作用，或破坏细胞之间的ECM。
如本文中所使用，“饲养细胞”或“饲养层”是描述与第二类型的细胞共培养以提供第二类型的细胞可生长、扩增或分化的环境的一种类型的细胞的术语，因为饲养细胞为支持第二细胞类型提供刺激、生长因子和营养物。饲养细胞任选地来自与其支持的细胞不同的物种。举例来说，某些类型的人类细胞，包括干细胞，可以由小鼠胚胎成纤维细胞和永生化小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物支持。在另一实例中，外周血衍生的细胞或转化的白血病细胞支持自然杀伤细胞的扩增和成熟。当与其它细胞共培养时，饲养细胞可以通常通过辐射或用如丝裂霉素等有丝分裂剂拮抗剂处理来激活，以防止其生长超出其支持的细胞。饲养细胞可以包括内皮细胞、基质细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)和白血病细胞。不限于前述，一种特定的饲养细胞类型可以是人类饲养层，例如人类皮肤成纤维细胞。另一饲养细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。一般来说，多种饲养细胞可部分地用于维持多能性、引导朝向某一谱系的分化，增强增殖能力并且促进向特化细胞类型(例如效应细胞)的成熟。
如本文中所使用，“无饲养层”(FF)环境是指一种环境，例如培养条件、细胞培养物或培养基，其基本上不含饲养层或基质细胞，和/或其尚未通过培养饲养细胞进行预调节。“预调节”培养基是指饲养细胞已在培养基内培养一段时间(例如至少一天)之后所收集的培养基。预调节培养基含有许多介体物质，包括由培养基中培养的饲养细胞分泌的生长因子和细胞因子。在一些实施例中，无饲养层环境不含饲养层或基质细胞，并且也不通过培养饲养细胞进行预调节。
如在iPSC和由其分化的衍生非多能细胞的基因组编辑或修饰，或非多能细胞和由其重编程的衍生iPSC的基因组编辑或修饰的背景下所使用的“功能”是指(1)在基因水平上--成功的基因敲入、基因敲除、降低基因表达、转基因或受控基因表达，例如在所期望的细胞发育阶段的诱导性或瞬时表达，这是通过直接的基因组编辑或修饰或通过“传递”经由最初进行经基因组工程化的起始细胞的分化或重编程来实现；或(2)在细胞水平上-成功的去除、添加或改变细胞功能/特征，这通过以下实现：(i)在所述细胞中通过直接的基因组编辑而获得的基因表达修饰；(ii)在所述细胞中通过“传递”经由最初进行经基因组工程化的起始细胞的分化或重编程而维持的基因表达修饰；(iii)在所述细胞中作为基因表达修饰的结果的下游基因调控，所述基因表达修饰仅出现于所述细胞的较早发育阶段或仅出现于经由分化或重编程而产生所述细胞的起始细胞中；或(iv)成熟细胞产物内所显示的增强的或新获得的细胞功能或属性，所述成熟细胞产物最初通过对祖细胞或脱分化细胞来源的iPSC进行基因组编辑或修饰而获得。
“HLA缺陷”，包括HLA-I类缺陷或HLA-II类缺陷，或两者，是指缺少或不再维持包含HLA I类蛋白质异二聚体和/或HLA II类异二聚体的完整MHC复合物的表面表达或所述表面表达的水平降低，使得减弱或降低的水平低于由其它细胞或合成方法可自然检测到的水平的细胞。
如本文所用，“经修饰的HLA缺陷型iPSC”是指通过引入基因表达蛋白而被进一步修饰的HLA缺陷型iPSC，所述基因表达蛋白与以下有关但不限于：改善的分化潜能、抗原靶向、抗原呈递、抗体识别、持久性、免疫逃避、对抑制的抗性、增殖、共刺激、细胞因子刺激、细胞因子产生(自分泌或旁分泌)、趋化性和细胞毒性，如非经典HLA I类蛋白(例如HLA-E和HLA-G)、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、CD16 Fc受体、BCL11b、NOTCH、RUNX1、IL15、41BB、DAP10、DAP12、CD24、CD3ζ、41BBL、CD47、CD113和PDL1。“经修饰的HLA缺陷型”细胞还包括除iPSC以外的细胞。
“Fc受体”(缩写为FcR)是基于其识别的抗体类型而分类。举例来说，结合最常见类别的抗体IgG的受体称为Fc-γ受体(FcγR)，结合IgA的受体称为Fc-α受体(FcαR)并且结合IgE的受体称为Fc-ε受体(FcεR)。FcR的类别也通过表达其的细胞(巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、T细胞和B细胞)和每种受体的信号传导特性来区分。Fc-γ受体(FcγR)包括若干成员：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)，它们的抗体亲和力因其分子结构不同而不同。
“嵌合Fc受体”(缩写为CFcR)是用于描述其天然跨膜和/或细胞内信号传导结构域被非天然跨膜和/或细胞内信号传导结构域修饰或置换的经工程化的Fc受体的术语。在嵌合Fc受体的一些实施例中，除非天然的跨膜和信号传导结构域中的一种或两种之外，可将一种或多种刺激结构域引入经工程化的Fc受体的细胞内部分中以在触发受体后增强细胞活化、扩增和功能。不同于含有与靶抗原的抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)，嵌合Fc受体结合于Fc片段、或抗体的Fc区、或包含于衔接子或结合分子中并且在使靶细胞接近或不接近附近的情况下活化细胞功能的Fc区。举例来说，可以对Fcγ受体进行工程化以将所选跨膜、刺激和/或信号传导结构域包含于对在细胞外结构域结合IgG有反应的细胞内区域中，从而产生CFcR。在一个实例中，CFcR由经工程化的CD16、Fcγ受体通过置换其跨膜结构域和/或细胞内结构域来产生。为了进一步提高基于CD16的CFcR的结合亲和力，可并入CD64或CD16的高亲和力变体(例如F176V)的细胞外结构域。在涉及高亲和力CD16细胞外结构域的CFcR的一些实施例中，在位置197处包含丝氨酸的蛋白水解裂解位点被消除或置换，使得受体的细胞外结构域不可裂解，即不经历脱落，从而获得基于hnCD16的CFcR。
CD16(一种FcγR受体)已鉴别为具有两种同功异构物：Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。CD16a为由NK细胞表达的跨膜蛋白，其结合附接到靶细胞的单体IgG以活化NK细胞且促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。如本文中所使用，“高亲和力CD16”、“不可裂解的CD16”或“高亲和力不可裂解的CD16(hnCD16)”是指天然或非天然的CD16变体。野生型CD16具有低亲和力并且经受胞外结构域脱落，这是在NK细胞激活时调控白细胞上的各种细胞表面分子的细胞表面密度的蛋白水解切割过程。F176V和F158V是具有高亲和力的示例性CD16多态变体。在接近膜的区域(位置189到212)中改变或消除裂解位点(位置195到198)的CD16变体不经历脱落。裂解位点和接近膜的区域详细地描述于WO2015148926中，其完整公开内容以引入的方式并入本文中。CD16 S197P变体是经工程化的CD16的不可裂解型式。包含F158V和S197P两者的CD16变体具有高亲和力，并且不可裂解。另一示例性高亲和力和不可裂解的CD16(hnCD16)变体是包含源自CD64胞外结构域的3个外显子中的一个或多个的胞外结构域的经工程化的CD16。
I.适用于具有增强特性的过继性细胞疗法的细胞和组合物
本文提供一种策略，其在不影响iPSC的分化效能以及iPSC和其衍生细胞的细胞发育生物学的情况下对克隆iPSC的调控回路进行系统工程化，同时增强衍生细胞的治疗特性。在选择性模态的组合通过基因组工程化以iPSC水平被引入到细胞中之后，衍生细胞在功能上得到改善并且适于过继性细胞疗法。在本发明之前，尚不清楚包含一种或多种所提供的基因编辑的改变的iPSC是否仍具有进入细胞发育和/或使功能分化细胞成熟和产生同时保留调节活性的能力。在iPSC的定向细胞分化期间的意外失败归因于包含但不限于以下的方面：发育阶段特定基因表达或缺乏基因表达、HLA复合物呈递的需求、所引入表面表达模态的蛋白质脱落和实现细胞中的表型和/或功能变化的分化方案重配置的需要。本申请已显示，如本文所提供的一种或多种所选基因组修饰不会对iPSC分化效能产生负面影响，并且衍生自经工程化的iPSC的功能性效应细胞具有增强的和/或获得的治疗特性，这可归因于在iPSC分化之后保留在效应细胞中的单独的或组合的基因组修饰。
1.具有新型胞内结构域的CAR
在实施例中，嵌合抗原受体(CAR)为通常包含包括抗原识别结构域的胞外结构域、跨膜结构域和包括一个或多个信号传导结构域的胞内结构域的融合蛋白。在实施例中，本文所述的CAR被设计为在诱导多能干细胞(iPSC)，以及从被工程化为包括CAR的iPSC中分化的衍生效应细胞中表达并起作用。在实施例中，本文所述的CAR被设计成使得其不会破坏iPSC分化，和/或其促进将iPSC的分化定向为期望的效应细胞类型。在实施例中，CAR增强效应细胞扩增、持久性、存活率、细胞毒性、对同种异体排斥的抗性、肿瘤穿透、迁移、激活和/或募集旁观者免疫细胞的能力，和/或克服肿瘤抑制的能力。在实施例中，本文提供的CAR也可以直接在细胞系细胞和来自初级来源(初级细胞)，即，天然/天然来源，如外周血、脐带血或其它供体组织的细胞中表达。
在一些实施例中，CAR适于激活表达所述CAR的T细胞、NK细胞或NKT细胞。在某些实施例中，所述T细胞源自表达CAR的iPSC，并且衍生T细胞可以包括T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调控T细胞、自然杀伤T细胞、αβT细胞、γδT细胞或其组合。在某些实施例中，所述NK细胞源自表达CAR的iPSC。在某些实施例中，所述NKT细胞源自表达CAR的iPSC。在一些实施例中，CAR为对包括NK细胞特异性信号传导组分具有特异性的NK细胞。在一些实施例中，包括NK细胞特异性信号传导组分的CAR也适于T细胞或其它细胞类型。在一些实施例中，CAR为对包括T细胞特异性信号传导组分具有特异性的T细胞。在一些实施例中，包括T细胞特异性信号传导组分的CAR也适于NK细胞或其它细胞类型。在一些实施例中，CAR为对包括NKT细胞特异性信号传导组分具有特异性的NKT细胞。在一些实施例中，包括NKT细胞特异性信号传导组分的CAR也适于NK细胞或T细胞或其它细胞类型。
在实施例中，本文所述的CAR包含至少一个胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞内结构域。CAR的胞内结构域影响表达CAR的细胞的增殖和功能，并且包括在抗原结合时激活表达CAR的效应细胞的至少一个信号传导结构域。在CAR胞内结构域的一些实施例中，进一步包含一个或多个共刺激结构域(通常也被称为额外信号传导结构域)以影响细胞的寿命、记忆分化和代谢特性。在此，使用了对T细胞和/或NK细胞具有特异性的信号转导蛋白以供应CAR融合蛋白的构建块，例如，跨膜结构域以及包括在CAR的胞内结构域中的一个或多个信号传导结构域。适于CAR设计的示例性信号转导蛋白包含但不限于2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1和CD8。示例性信号转导蛋白，包含蛋白质的跨膜和细胞质序列，的描述在以下提供并且进一步在表1A中提供。
2B4(自然杀伤细胞受体2B4)为CD48，即信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM)的受体。在与配体结合时，2B4调节多种免疫细胞的激活和分化，且因此参与先天性免疫应答和适应性免疫应答两者的调节和相互连接。起到激活NK细胞受体的作用，2B4刺激NK细胞的细胞毒性、IFN-γ的产生和颗粒胞吐。NK细胞的最优扩增和激活似乎取决于2B4与在邻近NK细胞上表达的CD48的接合。2B4还参与调节CD8+T细胞增殖。2B4在激活的T细胞上的表达以及其与CD48的结合为邻近的T细胞提供了类似共刺激的功能。另外，2B4参与白细胞迁移。
4-1BB(肿瘤坏死因子受体超家族成员9)为TNFSF9/4-1BBL的受体并且通过肿瘤坏死因子介导的信号传导通路参与T细胞激活。
CD16(IgG Fc区受体III-A)为IgG的Fc区的受体。其介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和其它抗体依赖性应答，并参与调节免疫应答。
CD2(T细胞表面抗原CD2)与淋巴细胞功能相关抗原CD58(LFA-3)和CD48/BCM1相互作用，以介导T细胞与其它细胞类型之间的粘附。CD2的细胞质结构域涉及触发T细胞激活的信号传导功能。CD2还涉及白细胞迁移、NK细胞激活、T细胞分化以及IFN-γ和IL8分泌的调节。
CD28(T细胞特异性表面糖蛋白CD28)参与T细胞受体信号传导通路，并影响T细胞激活和共刺激、细胞增殖的诱导、细胞因子产生和T细胞存活率的促进。CD28还调节调节性T细胞分化并与TCR/CD3连接和CD40L共刺激结合增强T细胞中IL4和IL10的产生。
CD28H(含跨膜结构域和免疫球蛋白结构域的蛋白2)在免疫应答、细胞-细胞相互作用、细胞迁移和血管生成中发挥作用。通过与HHLA2相互作用，CD28H在TCR介导的激活中共刺激T细胞。另外，CD28H通过AKT依赖性信号传导级联增强T细胞增殖和细胞因子产生。
CD3ζ(或CD3Z；T细胞表面糖蛋白CD3ζ链)是在T淋巴细胞细胞表面上呈递的TCR-CD3复合物的一部分，其在适应性免疫应答中起重要作用。当抗原呈递细胞(APC)激活T细胞受体(TCR)时，通过CD3链CD3D、CD3E、CD3G和CD3Z跨细胞膜传输TCR介导的信号。所有CD3链在其细胞质结构域中均含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在TCR接合时，这些基序变为被磷酸化并引起下游信号传导通路的激活。CD3Z在胸腺内T细胞分化中起重要作用。
DAP10(造血细胞信号转导子)为与KLRK1缔合以在淋巴细胞和骨髓细胞中形成激活受体KLRK1-HCST的跨膜衔接蛋白。KLRK1-HCST受体在针对肿瘤的免疫监视中发挥作用，并且通常是表达细胞表面配体(如MHC I类链相关的MICA和MICB)和UL16结合蛋白(ULBP)的肿瘤细胞的细胞溶解所必需的，所述结合蛋白的配体通过应激条件以及如病毒感染和肿瘤转化等病理状态而被上调。在NK细胞中，KLRK1-HCST信号传导直接诱导细胞毒性并增强细胞因子产生。在T细胞中，其提供了对TCR诱导的信号的共刺激。
DAP12(TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白)为与存在于多种免疫细胞的表面上的激活受体缔合以在通过受体进行配体结合之后介导信号传导和细胞激活的衔接蛋白。DAP12与如KIR2DS2和KLRD1/KLRC2异二聚体等自然杀伤(NK)细胞受体缔合以介导NK细胞激活。DAP12还增强NK细胞受体KIR2DS1、KIR2DS2和KIR2DS4的贩运和细胞表面表达，并确保其在细胞表面的稳定性。另外，DAP12负调节B细胞增殖。
DNAM1(CD226抗原)参与由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和NK细胞介导的免疫应答、细胞间粘附、淋巴细胞信号传导、细胞毒性和淋巴因子分泌。DNAM1还调节T细胞受体信号传导，并刺激T细胞增殖和细胞因子产生，包含IL2、IL5、IL10、IL13和IFNγ的产生。
FcERIγ(高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ)为转导来自各种免疫受体的激活信号的衔接蛋白。其通过MHC I类和II类参与抗原加工和外源性肽抗原的呈递、免疫球蛋白介导的免疫应答、先天性免疫应答、白细胞迁移、IL-10、IL-6、TNF的正调节和T细胞分化。
IL21R(白介素-21受体)参与IL21介导的信号传导通路，并在自然杀伤细胞激活中发挥作用。
IL-2Rβ/IL-15RB(白介素-2受体亚基β)为白介素-2受体的β亚基并且与IL15RA缔合，参与受体介导的内吞并转导IL2的信号。IL-2Rβ可以通过负调节凋亡过程影响细胞持久性。
IL-2Rγ(细胞因子受体共有亚基γ)为多种白介素的受体的共有亚基，并且参与IL15、IL21、IL2、IL4、IL7、IL9介导的信号传导通路。
IL-7R(白介素-7受体亚基α)为白介素-7的受体并且参与IL7介导的信号传导通路、细胞形态发生、T细胞分化、细胞数量稳态、细胞增殖、免疫应答和免疫球蛋白产生。
KIR2DS2(杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DS2)为自然杀伤(NK)细胞上的HLA-C等位基因的受体。KIR2DS2不抑制NK细胞的活性，并且参与先天性免疫应答和免疫应答的调节。
NKG2D(NKG2-D II型整合膜蛋白)在与自体肿瘤细胞和病毒感染的细胞的表面展示的各种细胞应激诱导型配体结合时，起到参与免疫监视的激活和共刺激受体的作用。例如，NKG2D与属于MHC I类相关糖蛋白的各个亚家族的配体结合，所述亚家族包含MICA、MICB、RAET1E、RAET1G、RAET1L/ULBP6、ULBP1、ULBP2、ULBP3(ULBP2>ULBP1>ULBP3)和ULBP4。NKG2D激活NK细胞并在激活的杀伤(NK)细胞上提供刺激性和共刺激性先天性免疫应答，从而导致细胞毒活性。NKG2D通过放大T细胞激活在CD8+T细胞介导的适应性免疫应答中充当T细胞受体(TCR)的共刺激受体。NKG2D刺激穿孔素介导的表达配体的肿瘤细胞的消除。NKG2D还涉及参与钙流入的信号传导、结束TNF-α表达、参与NK细胞介导的骨髓移植排斥。NKG2D也可以在NK细胞的细胞分化和存活中发挥调节作用。
NKp30(自然细胞毒性触发受体3)是通过包含BAG6和NCR3LG1在内的细胞外配体的结合而被激活的自然杀伤细胞的细胞膜受体。NKp30参与细胞识别、免疫应答和免疫应答的调节。进一步地，NKp30刺激NK细胞对邻近细胞，包含肿瘤细胞的细胞毒性，从而产生这些配体。例如，其控制NK细胞针对肿瘤细胞的细胞毒性。
NKp44(自然细胞毒性触发受体2)和NKp46(自然细胞毒性触发受体1)为可能有助于增加激活的自然杀伤(NK)细胞的功效以介导肿瘤细胞裂解的细胞毒性激活受体。NKp44和NKp46两者都参与细胞防御应答、先天性免疫应答和其调节。
CS1(SLAM家族成员7)是信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM)家族的自身配体受体。SLAM受体调节多种免疫细胞的激活和功能分化，并因此参与先天性免疫应答和适应性免疫应答两者的调节和相互连接。SLAM受体的活性通过小细胞质衔接蛋白、SH2D1A/SAP和/或SH2D1B/EAT-2的存在或不存在控制。SLAM受体通过依赖于磷酸化SH2D1B的机制正调节NK细胞激活和细胞毒性。SLAM受体也参与细胞粘附。
CD8(T细胞表面糖蛋白CD8α链)是在免疫应答中发挥重要作用并在针对外部攻击和内部攻击两者的应答时发挥多种功能的整合膜糖蛋白。在T细胞中，CD8主要起到MHC I类分子:肽复合物的辅助受体的作用。在NK细胞中，细胞表面CD8A存在同源二聚体提供了允许多个靶细胞缀合和裂解的存活机制。CD8A同源二聚体分子还促进激活的淋巴细胞存活并分化为记忆CD8 T细胞。
表1A：
Figure BDA0003659030370000331
Figure BDA0003659030370000341
Figure BDA0003659030370000351
Figure BDA0003659030370000361
在所提供的CAR的一些实施例中，CAR的胞内结构域包括至少一个第一信号传导结构域，所述第一信号传导结构域具有与分别由SEQ ID NO:21-41、54和56表示的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文公开的CAR的信号传导结构域仅包括2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的细胞质结构域的一部分。在一些实施例中，针对CAR信号传导结构域选择的细胞质结构域的一部分为与ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)、YxxM基序、TxYxxV/I基序、FcRγ、半ITAM和/或ITT样基序具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
在所提供的CAR的一些实施例中，CAR的包括第一信号传导结构域的胞内结构域进一步包括第二信号传导结构域，所述第二信号传导结构域包括与分别由SEQ ID NO:21-41、54和56表示的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ/1XX(即，CD3ζ或CD3ζ1XX)、CS1或CD8的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列，其中所述第二信号传导结构域与所述第一信号传导结构域不同。
在所提供的CAR的一些实施例中，CAR的包括第一信号传导结构域和第二信号传导结构域的胞内结构域进一步包括第三信号传导结构域，所述第三信号传导结构域包括与分别由SEQ ID NO:21-41、54和56表示的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ/1XX(即，CD3ζ或CD3ζ1XX)、CS1或CD8的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列，其中所述第三信号传导结构域与所述第一信号传导结构域和所述第二信号传导结构域不同。
在具有包含仅一个信号传导结构域的胞内结构域的CAR的一些示例性实施例中，所述胞内结构域包括与蛋白质的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列，所述蛋白质包含但不限于DNAM1、CD28H、KIR2DS2、DAP12或DAP10。
在具有包含两个不同的信号传导结构域的胞内结构域的CAR的一些示例性实施例中，所述胞内结构域包括呈某种形式的融合的细胞质结构域或其部分，所述形式包含但不限于：2B4-CD3ζ/1XX、2B4-DNAM1、2B4-FcERIγ、2B4-DAP10、CD16-DNAM1、CD16-DAP10、CD16-DAP12、CD2-CD3ζ/1XX、CD2-DNAM1、CD2-FcERIγ、CD2-DAP10、CD28-DNAM1、CD28-FcERIγ、CD28-DAP10、CD28-DAP12、CD28H-CD3ζ/1XX、DAP10-CD3ζ/1XX、DAP10-DAP12、DAP12-CD3ζ/1XX、DAP12-DAP10、DNAM1-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-DAP10、KIR2DS2-2B4或NKp46-2B4。
在具有包含三个不同的信号传导结构域的胞内结构域的CAR的一些示例性实施例中，所述胞内结构域包括呈某种形式的融合的细胞质结构域或其部分，所述形式包含但不限于：2B4-DAP10-CD3ζ/1XX、2B4-IL21R-DAP10、2B4-IL2RB-DAP10、2B4-IL2RB-CD3ζ/1XX、2B4-41BB-DAP10、CD16-2B4-DAP10或KIR2DS2-2B4-CD3ζ/1XX。
在一些实施例中，CAR的跨膜结构域包括与CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1或T细胞受体多肽的跨膜区的全长或一部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些其它实施例中，CAR的跨膜结构域包括与分别由SEQ ID NO:1-20、53和55表示的2B4、CD2、CD16、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1或CD8的跨膜区的全长或一部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在CAR的一些实施例中，跨膜结构域和其立即连接的信号传导结构域来自同一蛋白质。在CAR的一些其它实施例中，跨膜结构域和立即连接的信号传导结构域来自不同的蛋白质。
表1B提供了包括跨膜结构域和胞内结构域(标记为TM-(胞内结构域))的CAR构建体的非限制性实例。一般而言，所展示的CAR构建体各自包括跨膜结构域和胞内结构域，所述胞内结构域包括源自一个或多个信号转导蛋白的细胞质区的一个或多个信号传导结构域。在实施例中，包含在CAR胞内结构域中的一个或多个信号传导结构域源自TM所源自的同一蛋白质或不同蛋白质。如表1B所示，表示CAR的跨膜结构域(TM)的部分带下划线，包含在胞内结构域中的结构域带括号“()”，其中TM和信号传导结构域中的每一个由结构域序列所源自的信号转导蛋白的名称命名。在实施例中，每个TM或信号传导结构域的氨基酸序列可以与指定的信号转导蛋白的对应跨膜或细胞质区的全长或一部分具有约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性。如本文提供的包括跨膜结构域和胞内结构域的示例性CAR构建体包含但不限于：NKG2D-(2B4-IL2RB-CD3ζ)、CD8-(41BB-CD3ζ1XX)、CD28-(CD28-2B4-CD3ζ)、CD28H-(CD28H-CD3ζ)、DNAM1-(DNAM1-CD3ζ)、DAP10-(DAP10-CD3ζ)、KIR2DS2-(KIR2DS2-CD3ζ)、KIR2DS2-(KIR2DS2-DAP10)、KIR2DS2-(KIR2DS2-2B4)、CD16-(CD16-2B4-DAP10)、CD16-(CD16-DNAM1)、NKp46-(NKp46-2B4)、NKp46-(NKp46-2B4-CD3ζ)、NKp46-(NKp46-CD2-Dap10)、CD2-(CD2-CD3ζ)、2B4-(2B4-CD3ζ)、2B4-(2B4-FcERIg)和CS1-(CS1-CD3ζ)。在一些实施例中，包括跨膜结构域和胞内结构域的以上示例性CAR构建体中的每个CAR构建体包括与表1B中的由SEQ ID NO:57-74中的每一个表示的序列具有约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同一性的氨基酸序列。表1B中提供的每个构建体的说明性序列具有被格式化为与序列左侧的图示中的对应区的格式相匹配的文本(即，下划线、正常或粗体文本)。对于表1B的大多数说明性构建体，TM为第一序列区；然而，构建体可以包含位于TM之前的细胞外结构域(参见例如构建体6)，并且可以来自TM的同一蛋白质或不同蛋白质。在一些实施例中，包含在CAR胞内结构域中的两个或更多个信号传导结构域可以被如间隔子或接头等一个或多个额外序列分开。
表1B：
Figure BDA0003659030370000391
Figure BDA0003659030370000401
Figure BDA0003659030370000411
包括以上提供的任何TM-(胞内结构域)的CAR可以被构建为特异性靶向如通过CAR的胞外结构域中包括的抗原结合结构域确定的至少一个抗原。在一些实施例中，CAR可以特异性靶向与疾病或病原体相关的抗原。在一些实施例中，CAR可以特异性靶向肿瘤抗原，其中所述肿瘤可以是液体瘤或实体瘤。CAR的胞外结构域包括用于抗原特异性结合的一个或多个抗原识别结构域。在一些实施例中，胞外结构域可进一步包括信号肽或前导序列和/或间隔子。
在某些实施例中，所提供的CAR的胞外结构域包括抗原识别结构域，所述抗原识别结构域包括鼠抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼Ig、鲨鱼仅重链抗体(VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体或其抗体片段。抗体片段的非限制性实例包含Fab、Fab'、F(ab)'2、F(ab)'3、Fv、抗原结合性单链可变片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定性Fv(dsFv)、微体、双体、三体、四体、单结构域抗原结合片段(sdAb，纳米体(Nanobody))、重组仅重链抗体(VHH)和维持整个抗体的结合特异性的其它抗体片段。
可以被经基因工程化的iPSC和衍生效应细胞中包括的CAR靶向的抗原的非限制性实例包含ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAlX)、CCRI、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CD269(BCMA)、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原(例如，细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2(EGP 2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A 1(MAGE-A1)、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症睾丸抗原NY-ESO-1、瘤胎抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(WT-1)和病原体抗原。病原体的非限制性实例包括能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原虫。
在一些实施例中，所提供的CAR的胞外结构域进一步包括信号肽。信号肽将CAR多肽引导到内质网(ER)以进行适当的糖基化和质膜锚定。通常，可以使用将分泌蛋白靶向到ER通路的任何真核信号序列。示例性合适的信号肽包含但不限于IL-2信号序列、κ前导序列、CD8α前导序列、白蛋白信号序列、催乳素信号序列和IgG信号肽以及GM-CSF信号肽。
在一些实施例中，所提供的CAR的胞外结构域可以任选地包括用于在抗原识别结构域与CAR的跨膜结构域之间提供灵活性的铰链(也被称为间隔子)区。在一些示例性且非限制性的实施例中，CAR的铰链包括与已知多肽，如CD8、CD28、CD3ζ、CD40、4-1BB、OX40、CD84、CD166、CD8α、CD8β、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、CD27、CD40、NKGD2、IgG1或免疫球蛋白中的CH2/CH3结构域或其组合具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所提供的CAR的铰链区包括与免疫球蛋白的CH2/CH3结构域具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，包括所提供的一种或多种CAR的效应细胞可以用于治疗：自身免疫性病症；血液系统恶性肿瘤；实肿瘤；或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关的感染。恶性血液病的实例包含但不限于急性和慢性白血病(急性骨髓白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma；NHL)、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合症。实体癌症的实例包含但不限于脑癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、子宫癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、头癌、颈癌、胃癌、子宫颈癌、直肠癌、喉癌和食道癌。多种自身免疫病症的实例包含但不限于斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、幼年型特发性关节炎的一些形式、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves'disease)、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barrésyndrome)、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、心肌炎的一些形式、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/全身性硬化症、休格连氏综合症(
Figure BDA0003659030370000431
syndrome)、全身性红斑狼疮、甲状腺炎的一些形式、葡萄膜炎的一些形式、白癜风、肉芽肿性多血管炎(韦格纳氏病(Wegener's))。病毒感染的实例包含但不限于HIV(人类免疫缺陷病毒)、HSV(单纯疱疹病毒)、KSHV(卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)相关疱疹病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒(Respiratory SyncytialVirus))、EBV(埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus))、CMV(巨细胞病毒)、VZV(水痘带状疱疹病毒)、腺病毒、慢病毒、BK多瘤病毒相关病症。
本发明的一个方面提供了iPSC和由其分化的衍生效应细胞，其包括编码CAR的多核苷酸，所述CAR包括本文提供的胞内结构域之一。在所述CAR的一个实施例中，CAR为CD19特异性的。在另一实施例中，CAR为MICA/B特异性的。在另一实施例中，CAR为BCMA特异性的。在又另一实施例中，CAR为CD38特异性的。在仍另一实施例中，CAR为HER2特异性的。在一个其它实施例中，CAR为MSLN特异性的。仍，在另一实施例中，CAR为PSMA特异性的。在又另一实施例中，CAR为VEGF-R2特异性的。
在本发明的另一方面，包括编码包括所提供的胞内结构域之一的第一CAR的多核苷酸的iPSC和由其分化的衍生效应细胞可以进一步包括具有不同抗原特异性的第二CAR。第二CAR的胞内结构域与第一CAR的胞内结构域可以相同或可以不相同。在一些实施例中，第二CAR包括与第一CAR的胞内结构域不同的胞内结构域，并且为本文提供的胞内结构域之一。在一些其它实施例中，第二CAR包括与第一CAR的胞内结构域不同的胞内结构域，并且不是本文提供的胞内结构域之一。
非限制性CAR策略进一步包含：异二聚体，所述异二聚体通过使一对细胞内结构域二聚化而有条件地激活CAR(参见例如，美国专利第9,587,020号)；分离CAR，其中抗原结合的同源重组、铰链和胞内结构域以产生CAR(参见例如，美国公开案第20170183407号)；多链CAR，其允许分别连接到抗原结合结构域和信号传导结构域的两个跨膜结构域之间的非共价连接(参见例如，美国公开案第2014/0134142号)；具有双特异性抗原结合结构域的CAR(参见例如，美国专利第9,447,194号)，或具有识别相同或不同抗原或表位的一对抗原结合结构域(参见例如，美国专利第8,409,577号)；或串联CAR(参见例如，Hegde等人,《临床研究杂志(J Clin Invest.)》2016；126(8):3036-3052)；诱导性CAR(参见例如，美国公开案第2016/0046700号、第2016/0058857号、第2017/0166877号)；可切换的CAR(参见例如美国公开案第2014/0219975号)；和本领域已知的任何其它设计。
适于插入本文提供的一种或多种CAR的基因组基因座包含符合基因组安全港标准的基因座和/或其中需要敲低或敲除由插入引起的所选基因座中的基因的基因座。在一些实施例中，适于CAR插入的基因组基因座包含但不限于AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。
在一个实施例中，包括插入在TCR恒定区(TRAC或TRBC)中，导致TCR敲除并且任选地将CAR表达置于内源性TCR启动子的控制之下的CAR的iPSC和其衍生细胞。在包括无效的TCR和包括所提供的胞内结构域之一的CAR的iPSC衍生细胞的一个特定实施例中，所述衍生细胞为T细胞。在另一实施例中，包括CAR的iPSC和其衍生细胞具有插入在NKG2A基因座或NKG2D基因座中，引起NKG2A或NKG2D敲除，并且任选地将CAR表达置于内源性NKG2A或NKG2D启动子的控制下的CAR。在包括无效的NKG2A或NKG2D和CAR的iPSC衍生细胞的一个特定实施例中，所述衍生细胞为NK细胞。在又另一实施例中，包括CAR的iPSC和其衍生细胞具有插入在CD38编码区中，引起CD38敲除，并且任选地将CAR表达置于内源性CD38启动子的控制下的CAR。在包括无效的CD38和包括所提供的胞内结构域之一的CAR的细胞的一个实施例中，CAR对CD38具有特异性。在一个实施例中，包括包含胞内结构域之一的CAR的iPSC和其衍生细胞具有插入在CD58编码区中从而引起CD58敲除的CAR。在一个实施例中，包括包含胞内结构域之一的CAR的iPSC和其衍生细胞具有插入在CD54编码区中从而引起CD54敲除的CAR。在一个实施例中，包括包含胞内结构域之一的CAR的iPSC和其衍生细胞具有插入在CIS(含细胞因子诱导型SH2的蛋白质)编码区中从而引起CIS敲除的CAR。在一个实施例中，包括包含胞内结构域之一的CAR的iPSC和其衍生细胞具有插入在CBL-B(E3泛素-蛋白连接酶CBL-B)编码区中从而引起CBL-B敲除的CAR。在一个实施例中，包括所提供的CAR的iPSC和其衍生细胞具有插入在SOCS2编码区中从而引SOCS2敲除的CAR。在一个实施例中，包括所提供的CAR的iPSC和其衍生细胞具有插入在CD56(NCAM1)编码区中的CAR。在另一实施例中，包括所提供的CAR的iPSC和其衍生细胞具有插入在PD1、CTLA4、LAG3和TIM3中的任一种的编码区中从而引起在插入位点处敲除检查点受体的CAR。在另外的实施例中，包括所提供的CAR的iPSC和其衍生细胞具有插入在TIGIT的编码区中从而引起TIGIT敲除的CAR。
另外提供的实施例包含通过使经基因组工程化的iPSC分化获得的衍生效应细胞，其中iPSC和衍生细胞两者均包括如本文所述的CAR，其中iPSC和衍生细胞进一步包括一种或多种额外经修饰的模态，所述经修饰的模态包含但不限于：CD38敲除；aCD38-CAR；hnCD16；外源性细胞因子和/或其信号传导组分；HLA-I和/或HLA-II缺陷；HLA-G的过表达和CD58和CD54中的一种或两种的敲除；无效的TCR；表面呈递的CD3；抗原特异性TCR；NKG2C；DAP10/12；NKG2C-IL15-CD33(“2C1533”)，如本说明书中进一步详述的。
2.CD38基因敲除
细胞表面分子CD38在源自淋巴谱系和骨髓谱系两者的多种血液恶性病中被高度上调，这使得用于使癌细胞耗竭的抗体治疗剂成为有吸引力的标点，所述血液恶性病包含多发性骨髓瘤和CD20阴性B细胞恶性肿瘤。抗体介导的癌细胞耗竭通常可归因于免疫效应机制，例如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)的直接细胞凋亡诱导和活化的组合。除ADCC以外，与治疗抗体协同作用的免疫效应机制还可以包括吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
除在恶性细胞上高度表达外，CD38也在浆细胞上以及NK细胞和活化的T细胞和B细胞上表达。在造血期间，CD38在CD34+干细胞和淋巴、红细胞系和骨髓的谱系专门化祖细胞上并且在持续到浆细胞阶段的成熟的最终阶段期间表达。作为II型跨膜糖蛋白，CD38既作为受体，又作为参与核苷酸代谢物产生的多功能酶执行细胞功能。作为酶，CD38催化从NAD+到ADP-核糖的反应的合成和水解，从而产生二级信使CADPR和NAADP，其刺激钙从内质网和溶酶体中释放，这对于过程是钙依赖性的细胞粘附过程至关重要。作为受体，CD38识别CD31并且调控活化NK细胞中的细胞因子释放和细胞毒性。还报道了CD38与脂筏中的细胞表面蛋白缔合，调控细胞质Ca2+通量，并且介导淋巴细胞和骨髓细胞中的信号转导。
在恶性肿瘤治疗中，全身性地使用CD38抗原结合受体转导的T细胞已显示裂解CD34+造血祖细胞、单核细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的CD38+级分，导致因为接受者免疫效应细胞功能受损而使得治疗反应不完全并且功效降低或消除。另外，在用达雷木单抗、CD38特异性抗体治疗的多发性骨髓瘤患者中，尽管其它免疫细胞类型(例如T细胞和B细胞)不管其CD38表达如何都不受影响，但观测到骨髓和外周血两者中NK细胞减少(Casneuf等人,《血液研究进展(Blood Advances.)》2017；1(23)：2105-2114)。在不受理论限制的情况下，包括如所提供的MICA/B-CAR的CD38无效的效应细胞可以克服CD38介导的互相杀伤并且避免特异性抗体和/或CD38抗原结合结构域诱导的效应细胞耗尽或减少。另外，由于CD38在如T细胞或B细胞等激活的淋巴细胞上被上调，因此可以使用如达土木单抗等CD38特异性抗体来在CD38无效时消除激活的淋巴细胞或抑制这些淋巴细胞在适应性同种异体效应细胞的受体体内的激活，使得可以减少和/或预防宿主淋巴细胞对这些效应细胞的同种异体排斥，并且可以增加这些效应细胞的存活率和持久性，即使存在用于淋巴耗尽的CD38抗体也是如此。如此，本申请还提供了通过使用CD38特异性抗体、所分泌的CD38特异性衔接子或CD38CAR(嵌合抗原受体)对受体T细胞和B细胞的激活和/或消除激活的受体T细胞和B细胞来增强效应细胞持久性和/或存活率同时降低或防止同种异体排斥的策略。
在本文所提供的一个实施例中，iPSC中的CD38敲除是双等位基因基因敲除。如本文所公开的，所提供的CD38无效的iPSC能够分化以产生功能性衍生效应细胞，所述功能性衍生效应细胞包含但不限于具有永久造血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、共同骨髓祖细胞、共同淋巴祖细胞、红细胞、骨髓细胞、中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞和具有原代NK、T和/或NKT细胞中不存在的一种或多种功能特征的衍生免疫效应细胞。在一些实施例中，当使用CD38抗体以诱导ADCC或使用CD38-CAR以靶向细胞杀伤时，CD38-/-iPSC和/或其衍生效应细胞不会被所述CD38抗体或CD38 CAR消除，由此增加iPSC和其效应细胞在存在此类治疗剂的情况下和/或暴露于此类治疗剂之后的持久性和/或存活率。在一些实施例中，效应细胞的体内持久性和/或存活率在存在此类治疗剂的情况下和/或暴露于此类治疗剂之后增加。在一些实施例中，CD38无效的效应细胞为源自iPSC的NK细胞。在一些实施例中，CD38无效的效应细胞为源自iPSC的T细胞。在一些实施例中，CD38无效的iPSC和衍生细胞包括如本文所述的一种或多种额外基因组编辑，所述基因组编辑包含但不限于hnCD16表达、CAR表达、细胞因子/细胞因子受体表达、HLA I和/或HLAII敲除以及所提供的额外模态。
在另一实施例中，在CD38中的所选位置处在插入本文所提供的一个或多个转基因的同时敲除CD38可以通过例如靶向CD38的敲入/敲除(CD38-KI/KO)构建体实现。在所述构建体的一些实施例中，构建体包括用于位置选择性插入在CD38基因座内的一对CD38靶向同源臂。在一些实施例中，预选的靶向位点位于CD38的外显子内。本文所提供的CD38-KI/KO构建体允许转基因在CD38内源性启动子下或在所述构建体中包括的外源性启动子下表达。当两个或更多个转基因将被插入在CD38基因座中的所选位置处时，接头序列，例如，2A接头或IRES被置于任何两个转基因之间。2A接头编码源自FMDV、ERAV、PTV-I和TaV的自切割肽(分别被称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”)，从而使得通过单次翻译产生单独的蛋白质。在一些实施例中，构建体中包括绝缘体以降低转基因和/或外源性启动子沉默的风险。CD38-KI/KO构建体中包括的外源性启动子可以是CAG或其它组成型启动子、诱导型启动子、时间特异性启动子、组织特异性启动子或细胞类型特异性启动子，包含但不限于CMV、EF1α、PGK和UBC。
3.CD16敲入
CD16已鉴别为两种同功异构物：Fc受体FcγRIIIa(CD16a；NM_000569.6)和FcγRIIIb(CD16b；NM_000570.4)。CD16a为由NK细胞表达的跨膜蛋白，其结合附接到靶细胞的单体IgG以活化NK细胞且促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。CD16b仅由人类嗜中性粒细胞表达。如本文中所使用，“高亲和力CD16”、“不可裂解的CD16”或“高亲和力不可裂解的CD16”是指各种CD16变体。野生型CD16具有低亲和力并且经历胞外结构域脱落，这是一种蛋白水解裂解过程，其在NK细胞活化后调控白细胞上的多种细胞表面分子的细胞表面密度。F176V(在一些出版物中也被称为F158V)是具有高亲和力的示例性CD16多态性变体；而S197P变体是CD16的经基因工程化的不可切割版本的实例。包含F176V和S197P两者的经工程化的CD16变体具有高亲和力并且不可裂解，其更详细地描述于WO2015/148926中，并且其完整公开内容以引入的方式并入本文中。另外，CD16的胞外结构域基本上被至少一部分CD64胞外结构域置换的嵌合CD16受体也可实现能够进行ADCC的CD16受体的所期望的高亲和力和不可裂解特征。在一些实施例中，嵌合CD16的置换胞外结构域包含以下中的一种或多种：CD64的EC1、EC2和EC3外显子(UniPRotKB_P12314或其同功异构物或多态变体)。
因此，高亲和力不可裂解的CD16受体(hnCD16)在一些实施例中包含F176V和S197P两者；并且在一些实施例中包含F176V，其中消除了裂解区域。在一些其它实施例中，hnCD16包括具有与各自包括CD64胞外结构域的至少一部分的示例性序列SEQ ID NO:42、43和44中的任一个相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％或其之间的任何百分比的同一性的序列。SEQ ID NO:42、43和44分别通过例示SEQ IDNO:45-47进行编码。如本文和整个本申请中所用，两个序列之间的同一性百分比是序列共用的相同位置的数的函数(即，同一性％＝相同位置的数量/位置的总数量×100)，所述函数考虑了需要引入以对两个序列进行最佳比对的间隙的数和每个间隙的长度。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用所属领域中公认的数学算法实现。
SEQ ID NO:42：
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPS YRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKF FHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGL QLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(340个氨基酸基于CD64结构域的构建；CD16TM；CD16ICD)
SEQ ID NO：43
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPS YRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKF FHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGL QLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(336个氨基酸基于CD64外显子的构建；CD16TM；CD16ICD)
SEQ ID NO：44
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPS YRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKF FHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGL QLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
(335个氨基酸基于CD64外显子的构建；CD16TM；CD16ICD)
SEQ ID NO：45
Figure BDA0003659030370000491
SEQ ID NO:46
Figure BDA0003659030370000492
Figure BDA0003659030370000501
SEQ ID NO:47
Figure BDA0003659030370000502
因此，本文提供克隆iPSC，其经基因工程化以在如本文所涵盖和描述的其它编辑中包含高亲和力不可裂解的CD16受体(hnCD16)，其中经基因工程化的iPSC能够分化成包含引入iPSC中的hnCD16的效应细胞。在一些实施例中，包含hnCD16的衍生效应细胞为NK细胞。在一些实施例中，包含hnCD16的衍生效应细胞为T细胞。在iPSC或其衍生细胞中表达的外源性hnCD16在与ADCC抗体或其片段结合和与识别所述hnCD16的CD16或CD64细胞外结合结构域的双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子结合时具有高亲和力。双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子在以下本申请中进一步描述(参见以下)。因此，本申请提供了通过与在衍生效应细胞上表达的hnCD16的细胞外结构域的高亲和力结合，以对治疗如以下部分中进一步详述的病状、疾病或感染的治疗用途足够的量预负载有一种或多种预选的ADCC抗体的衍生效应细胞或其细胞群体，其中所述hnCD16包括CD64或具有F176V和S197P的CD16的细胞外结合结构域。
在一些其它实施例中，进一步修饰或置换hnCD16的天然CD16跨膜结构域和/或细胞内结构域，使得产生嵌合Fc受体(CFcR)以包含非天然跨膜结构域、非天然刺激结构域和/或非天然信号传导结构域。本文所使用的术语“非天然”意指除提供细胞外结构域的受体外，跨膜结构域、刺激结构域或信号传导结构域源自不同受体。在本文的说明中，基于CD16或其变体的CFcR不具有源自CD16的跨膜结构域、刺激结构域或信号传导结构域。在一些实施例中，基于外源性hnCD16的CFcR包括源自以下的非天然跨膜结构域：CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T细胞受体多肽。在一些实施例中，基于外源性hnCD16的CFcR包括源自以下的非天然刺激性/抑制结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA4或NKG2D多肽。在一些实施例中，基于外源性hnCD16的CFcR包含衍生自以下的非天然信号传导结构域：CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽。在hnCD16的一个实施例中，所提供的嵌合受体包含均衍生自以下中的一种的跨膜结构域和信号传导结构域：IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C和NKG2D多肽。基于hnCD16的嵌合Fc受体的一个特定实施例包含NKG2D的跨膜结构域、2B4的刺激结构域和CD3ζ的信号传导结构域；其中hnCD16的细胞外结构域衍生自CD64或CD16的细胞外结构域的全长或部分序列，其中CD16的细胞外结构域包含F176V和S197P。基于hnCD16的嵌合Fc受体的另一实施例包含CD3ζ的跨膜结构域和信号传导结构域；其中hnCD16的细胞外结构域衍生自CD64或CD16的细胞外结构域的全长或部分序列，其中CD16的细胞外结构域包含F176V和S197P。
如上文所描述的基于hnCD16的嵌合Fc受体的各种实施例能够以高亲和力结合到抗体或其片段的Fc区；或结合到双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子的Fc区。结合后，嵌合受体的刺激结构域和/或信号传导结构域实现效应细胞的活化和细胞因子分泌，并且杀死由抗体或具有肿瘤抗原结合组分以及Fc区的所述双特异性、三特异性或多特异性衔接子或结合子靶向的肿瘤细胞。在不受理论限制的情况下，通过非天然跨膜结构域、刺激性结构域和/或信号传导结构域，或通过与基于hnCD16的嵌合Fc受体的胞外结构域结合的衔接子，CFcR可以有助于效应细胞的杀伤能力，同时提高效应细胞的增殖和/或扩增潜能。抗体和衔接子可使表达抗原的肿瘤细胞和表达CFcR的效应细胞紧密接近，这也有助于增强肿瘤细胞的杀伤。双特异性、三特异性、多特异性衔接子或结合子的示例性肿瘤抗原包含但不限于B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘素和ROR1。适合于在攻击肿瘤细胞时接合表达基于hnCD16的CFcR的效应细胞的一些非限制性示例性双特异性、三特异性、多特异性衔接子或结合子包括CD16(或CD64)-CD30、CD16(或CD64)-BCMA、CD16(或CD64)-IL15-EPCAM和CD16(或CD64)-IL15-CD33。
不同于由在NK细胞活化之后从细胞表面裂解的原代NK细胞表达的内源性CD16受体，衍生NK细胞中CD16的各种不可裂解型式避免CD16脱落，并且维持恒定表达。在衍生NK细胞中，不可裂解的CD16增加TNFα和CD107a的表达，指示细胞功能得到改善。不可裂解的CD16还增强了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及双特异性、三特异性或多特异性衔接子的接合。ADCC是通过将CD16结合到抗体涂布的靶细胞的NK细胞介导的裂解的机制。在向需要细胞疗法的受试者给予细胞之前，衍生NK细胞中引入的hnCD16的额外高亲和力特征也允许通过hnCD16将ADCC抗体活体外负载到NK细胞。如所提供的，hnCD16可以在一些实施例中包括F176V和S197P，或可以包括源自如由SEQ ID NO:42、43或44所例示的CD64的全部或部分胞外结构域，或可以进一步包括非天然跨膜结构域、刺激性结构域和信号传导结构域中的至少一种。如所公开的，本申请还提供了以对于治疗如以下部分中进一步详述的病状、疾病或感染的治疗用途足够的量预负载有一种或多种预选的ADCC抗体的衍生NK或其细胞群体。
不同于原代NK细胞，来自原代来源(即，天然/原生来源，例如外周血、脐带血或其它供体组织)的成熟T细胞不表达CD16。出人意料的是，包含所表达的外源性不可裂解的CD16的iPSC不损害T细胞发育生物学，并且能够分化成功能性衍生T细胞，其不仅表达外源性CD16，而且能够通过所获得的ADCC机制执行功能。衍生T细胞中这一获得的ADCC可以额外用作用于双靶向和/或用于挽救通常与CAR-T细胞疗法一起存在的抗原逃逸的方法，在抗原逃逸的情况下肿瘤随着靶向CAR-T的抗原表达或经突变的抗原的表达减少或丧失以避免被CAR(嵌合抗原受体)识别而复发。当所述衍生T细胞通过外源性CD16表达包含获得的ADCC时，并且当抗体靶向与CAR靶向的抗原不同的肿瘤抗原时，抗体可用于挽救CAR-T抗原逃逸并且减少或防止CAR-T治疗中常见的靶向肿瘤的复发或再现。减少和/或防止抗原逃逸同时实现双靶向的这种策略同样适用于表达一种或多种CAR的NK细胞。可以用于这种抗原逃逸减少和防止策略的各种CAR包含本申请中描述的CAR。
因此，在实施例中，本发明提供了一种衍生T细胞，除了所提供的至少一种CAR之外，其还包括外源性CD16。在进一步提供的实施例中，除了hnCD16和CAR的表达之外，本文获得的衍生T细胞包括CD38敲除。在一些实施例中，衍生T细胞中包含的hnCD16包含F176V和S197P。在一些其它实施例中，衍生T细胞中包括的hnCD16包括源自如通过SEQ ID NO:42、43或44所例示的CD64的全部或部分胞外结构域；或者可以进一步包括非天然跨膜结构域、刺激性结构域和信号传导结构域中的至少一种。如所解释，这类衍生T细胞具有获得性机制以用由ADCC介导的单克隆抗体靶向肿瘤，从而增强抗体的治疗效果。如所公开的，本申请还提供以对于治疗如以下部分中进一步详述的病状、疾病或感染的治疗用途足够的量预负载有一种或多种预选的ADCC抗体的衍生T细胞或其细胞群体。在一些其它实施例中，表达hnCD16和所提供的CAR的衍生T细胞也是CD38无效的，使得细胞可以避免在存在靶向肿瘤抗原CD38的治疗剂的情况下被消除。在一个实施例中，靶向肿瘤抗原CD38的所述治疗剂是CD38抗体。在另一实施例中，靶向肿瘤抗原CD38的所述治疗剂是包括如本文所述的胞内结构域的CD38-CAR。
4.外源性引入的细胞因子和/或细胞因子信号传导
通过避免全身性高剂量给予临床相关的细胞因子，由于这类实践的剂量限制性毒性的风险降低，同时建立细胞因子介导的细胞自主性。为了实现淋巴细胞自主性而不需要额外施用可溶性细胞因子，将IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和/或其相应受体中的一种或多种的部分肽或全部肽引入到细胞中以细胞因子本身进行表达或不进行表达的情况下实现细胞因子信号传导，由此维持或改善细胞生长、增殖、扩增和/或效应功能，并且降低细胞因子毒性的风险。在一些实施例中，在细胞表面上表达用于细胞因子信号传导的所引入细胞因子和/或其相应的天然或修饰受体。在一些实施例中，组成性地激活细胞因子信号传导。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是可诱导的。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是瞬时的和/或暂时的。
图1呈现了使用IL15作为说明性实例的几种构建体设计。图1中的设计中的任何设计的跨膜(TM)结构域对于IL15受体可以是天然的，或可以用任何其它膜结合蛋白的跨膜结构域修饰或替代。
设计1：IL15和IL15Rα通过使用自切割肽共表达，模拟IL15的反式呈递而不消除IL15的顺式呈递。
设计2：IL15Rα通过接头在C末端处与IL15融合，模拟反式呈递而不消除IL15的顺式呈递并且确保IL15膜结合。
设计3：具有截短的细胞内结构域的IL15Rα通过接头在C末端处与IL15融合，模拟IL15的反式呈递，维持IL15膜结合，并且另外消除顺式呈递和/或由正常IL15R通过其细胞内结构域介导的任何其它潜在信号转导通路。IL15Rα的细胞内结构域已被认为对于在IL15响应细胞中表达的受体和对于扩增和起作用的响应细胞至关重要。这种截短的构建体包括与SEQ ID NO:48具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:49表示的示例性核酸序列编码。在截短的IL15/IL15Rα的一个实施例中，构建体不包括SEQ ID NO:48的最后4个氨基酸“KSRQ”，并且包括与SEQ ID NO:50具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQ
(379个氨基酸；信号肽和接头肽加下划线)
SEQ ID NO:49
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATCCATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTAAATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCTACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTCCTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTCGAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCAGGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTCGTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGTCCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGCCGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACCGAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGCATCAGAGATCCCGCCCTGGTGCATCAGCGGCCTGCCCCTCCAAGCACAGTGACAACAGCTGGCGTGACCCCCCAGCCTGAGAGCCTGAGCCCTTCTGGAAAAGAGCCTGCCGCCAGCAGCCCCAGCAGCAACAATACTGCCGCCACCACAGCCGCCATCGTGCCTGGATCTCAGCTGATGCCCAGCAAGAGCCCTAGCACCGGCACCACCGAGATCAGCAGCCACGAGTCTAGCCACGGCACCCCATCTCAGACCACCGCCAAGAACTGGGAGCTGACAGCCAGCGCCTCTCACCAGCCTCCAGGCGTGTACCCTCAGGGCCACAGCGATACCACAGTGGCCATCAGCACCTCCACCGTGCTGCTGTGTGGACTGAGCGCCGTGTCACTGCTGGCCTGCTACCTGAAGTCCAGACAGTGA(1140个氨基酸)
SEQ ID NO:50
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYL
(375个氨基酸；信号肽和连接肽加下划线)
所属领域的普通技术人员将了解，上述信号肽和接头序列为说明性的，并且绝不限制其适用作信号肽或接头的变化形式。存在许多所属领域的技术人员已知且可获得的合适信号肽或接头序列。所属领域的普通技术人员理解，信号肽和/或接头序列可以取代另一序列而不改变由信号肽引导或由接头连接的功能肽的活性。
设计4：由于设计3构建体显示出在促进效应细胞存活和扩增方面是具有功能的，这证明IL15Rα的细胞质结构域可以省略而不会对这类设计中配备有IL15的效应细胞的自主特征产生负面影响，设计4是提供设计3的另一个工作替代方案的构建体，除了一端上的与IL15融合的Sushi结构域和另一端上的跨膜结构域(mb-Sushi)之外，基本上整个IL15Rα被从所述构建体中去除，任选地利用Sushi结构域与跨膜结构域之间的接头。融合的IL15/mb-Sushi通过任何膜结合蛋白的跨膜结构域在细胞表面上表达。在例如设计4的构建体的情况下，在只保留所期望的IL15的反式呈递时，消除通过IL15Rα的不必要的信号传导，包括顺式呈递。在一些实施例中，包括与Sushi结构域融合的IL15的组分包括与SEQ ID NO:51具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:52表示的示例性核酸序列编码。
SEQ ID NO:51
MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(242个氨基酸；信号肽和连接肽加下划线)
SEQ ID NO:52
ATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTGGTCGCGGCTGCAACGCGAGTCCATAGCGGTATCCATGTTTTTATTCTTGGGTGTTTTTCTGCTGGGCTGCCTAAGACCGAGGCCAACTGGGTAAATGTCATCAGTGACCTCAAGAAAATAGAAGACCTTATACAAAGCATGCACATTGATGCTACTCTCTACACTGAGTCAGATGTACATCCCTCATGCAAAGTGACGGCCATGAAATGTTTCCTCCTCGAACTTCAAGTCATATCTCTGGAAAGTGGCGACGCGTCCATCCACGACACGGTCGAAAACCTGATAATACTCGCTAATAATAGTCTCTCTTCAAATGGTAACGTAACCGAGTCAGGTTGCAAAGAGTGCGAAGAGTTGGAAGAAAAAAACATAAAGGAGTTCCTGCAAAGTTTCGTGCACATTGTGCAGATGTTCATTAATACCTCTAGCGGCGGAGGATCAGGTGGCGGTGGAAGCGGAGGTGGAGGCTCCGGTGGAGGAGGTAGTGGCGGAGGTTCTCTTCAAATAACTTGTCCTCCACCGATGTCCGTAGAACATGCGGATATTTGGGTAAAATCCTATAGCTTGTACAGCCGAGAGCGGTATATCTGCAACAGCGGCTTCAAGCGGAAGGCCGGCACAAGCAGCCTGACCGAGTGCGTGCTGAACAAGGCCACCAACGTGGCCCACTGGACCACCCCTAGCCTGAAGTGCATCAGA
(726个氨基酸)
所属领域的普通技术人员将了解，上述信号肽和接头序列为说明性的，并且绝不限制其适用作信号肽或接头的变化形式。存在许多所属领域的技术人员已知且可获得的合适信号肽或接头序列。所属领域的普通技术人员理解，信号肽和/或接头序列可以取代另一序列而不改变由信号肽引导或由接头连接的功能肽的活性。
设计5：天然或经修饰的IL15Rβ通过接头在C末端处与IL15融合，从而实现组成型信号传导并且维持IL15膜结合和反式重呈递。
设计6：天然或经修饰的共同受体γC通过接头在C末端处与IL15融合，以用于细胞因子的组成型信号传导和膜结合反式呈递。共同受体γC也被称为共同γ链或CD132，也称为IL2受体亚单位γ或IL2RG。γC是许多白介素受体的受体复合体所共有的细胞因子受体亚基，所述白介素受体包含但不限于IL2、IL4、IL7、IL9、IL15和IL21受体。
设计7：在不存在IL15的情况下形成同源二聚体的经工程化的IL15Rβ可用于产生细胞因子的组成性信号传导。
在一些实施例中，可以使用图1中的设计中的一个或多个设计将细胞因子IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21和/或其受体中的一种或多种引入到iPSC中，并且在iPSC分化后引入到其衍生细胞中。在一些实施例中，IL2或IL15细胞表面表达和信号传导是通过设计1至7中的任一种中所说明的构建体。在一些实施例中，IL4、IL7、IL9或IL21细胞表面表达和信号传导是通过设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体或细胞因子特异性受体。在一些实施例中，IL7表面表达和信号传导是通过设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体或细胞因子特异性受体，例如IL4受体。图1中的设计中的任何设计的跨膜(TM)结构域对于相应细胞因子受体可以是天然的，或可以用任何其它膜结合蛋白的跨膜结构域修饰或替代。
在包含CAR和外源性细胞因子两者和/或细胞因子受体信号传导的iPSC和其衍生细胞中，CAR和IL可在单独构建体中表达，或可在包含CAR和IL两者的双顺反子构建体中共表达。在一些其它实施例中，呈由图1中的构建体设计中的任何构建体设计表示的形式的IL15可通过使展示为例如CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR的2A编码序列自我裂解而与CAR表达构建体的5'端或3'端连接。因此，IL15和CAR处于单一开放阅读框(ORF)中。在一个实施例中，CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR构建体包括图1的设计3中的IL15。在另一个实施例中，CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR构建体包括图1的设计3中的IL15。在又另一个实施例中，CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR构建体包括图1的设计7中的IL15。当表达CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR时，自我裂解2A肽允许所表达的CAR和IL15解离，并且然后可在细胞表面呈递解离的IL15。CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR双顺反子设计在时间和数量上以及在可选择以并入例如诱导性启动子以表达单一ORF的相同控制机制下允许配位的CAR和IL15表达。自我裂解肽发现于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae virus family)的成员中，包括口疮病毒属(aphthovirus)，例如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus；FMDV)、马鼻炎A病毒(equine rhinitis A virus；ERAV)、明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus；TaV)和猪捷申病毒-1(porcine tescho virus-1；PTV-I)(Donnelly,ML等人,《普通病毒学期刊(J.Gen.Virol)》,82,1027-101(2001)；Ryan,MD等人,《普通病毒学期刊》,72,2727-2732(2001))；和心病毒属(cardiovirus)，例如泰勒病毒(Theilovirus)(例如，泰勒氏鼠类脑脊髓炎(Theiler's murine encephalomyelitis))和脑心肌炎病毒。源自FMDV、ERAV、PTV-I和TaV的2A肽有时也分别被称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”。
也涵盖用于IL15的如本文所公开的双顺反子CAR-2A-IL15或IL15-2A-CAR实施例以用于表达本文所提供的任何其它细胞因子，例如IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18和IL21。在一些实施例中，IL2细胞表面表达和信号传导是通过设计1至7中的任一种中所说明的构建体。在一些其它实施例中，IL4、IL7、IL9或IL21细胞表面表达和信号传导是通过设计5、6或7中所说明的构建体，通过使用共同受体和/或细胞因子特异性受体。
5.HLA-I和HLA-II缺陷
必须在同种异体受体中匹配多种HLA I类和II类蛋白质以获得组织相容性，以避免同种异体排斥反应问题。本文提供一种iPSC细胞系和由其分化的衍生细胞，其中消除或大体上减少HLA I类和HLA II类蛋白质的表达。HLA I类缺陷可以通过使HLA I类基因座(染色体6p21)的任何区的功能缺失或使HLA I类相关基因，包含不限于β-2微球蛋白(B2M)基因、TAP1基因、TAP2基因和TAP相关蛋白，缺失或降低其表达水平来实现。举例来说，B2M基因编码所有HLA I类异二聚体的细胞表面表达所必需的共同亚单位。B2M无效的细胞为HLA-I缺陷型的。HLA II类缺陷可以通过使HLA-II相关基因(包含不限于RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP)发生功能缺失或降低来实现。CIITA是通过II类蛋白质表达所需的转录因子RFX5的活化起作用的转录共激活子。CIITA无效的细胞为HLA-II缺陷型的。本文提供一种具有HLA-I和HLA-II缺陷两者，例如缺少B2M和CIITA表达两者的iPSC和其衍生细胞，其中所获得的衍生效应细胞通过消除对MHC(主要组织相容性复合物)匹配的需要实现同种异体细胞疗法，并且避免宿主(同种异体)T细胞的识别和杀伤。
然而，对于一些细胞类型，缺乏I类表达导致被NK细胞溶解。为克服这种“自我缺失”反应，HLA-G可任选地基因敲入以避免NK细胞识别和杀死衍生自经工程化的iPSC的HLA-I缺陷型效应细胞。在一个实施例中，所提供的HLA-I缺陷型iPSC和其衍生细胞进一步包括HLA-G敲入。可替代地，在一个实施例中，所提供的HLA-I缺陷型iPSC和其衍生细胞进一步包括CD58敲除和CD54敲除中的一种或两种。CD58(或LFA-3)和CD54(或ICAM-1)为起始信号依赖性细胞相互作用并且有助于细胞(包括免疫细胞)迁移的粘附蛋白。先前未知的是iPSC中的CD58和/或CD54破坏是否以及如何影响在将iPSC分化定向为功能性免疫效应细胞(包含T细胞和NK细胞)时的多能细胞和发育生物学。先前还未知的是，CD58和/或CD54敲除是否可以有效和/或充分降低HLA-I缺陷型iPSC源性作用细胞对同种异体NK细胞杀伤的敏感性。这里表明CD58敲除在减少同种异体NK细胞活化方面具有比CD54敲除更高的效率；而CD58和CD54两者的双敲除对NK细胞激活的减少作用最强。在一些观测中，相比于HLA-I缺陷型细胞在克服“自我缺失”作用中的HLA-G过表达，CD58和CD54双敲除甚至更有效。
如上文所提供，在一些实施例中，HLA-I和HLA-II缺陷型iPSC和其衍生细胞具有编码HLA-G的外源性多核苷酸。在一些实施例中，HLA-I和HLA-II缺陷型iPSC和其衍生细胞为CD58剔除型。在一些其它实施例中HLA-I和HLA-II缺陷型iPSC和其衍生细胞为CD54剔除型。在又一些其它实施例中，HLA-I和HLA-II缺陷型iPSC和其衍生细胞为CD58剔除型和CD54剔除型。
在一些实施例中，对HLA-I和/或HLA-II缺陷的工程化可以通过使靶向经上调的表面蛋白的失活CAR在激活的受体免疫细胞中表达以避免同种异体排斥而被绕过或保持完整。在一些实施例中，激活的受体免疫细胞中的所述经上调的表面蛋白包含但不限于CD38、CD25、CD69或CD44。当细胞表达这种失活CAR时，优选的是所述细胞不表达由CAR靶向的同一表面蛋白或具有所述同一表面蛋白的敲除。
6.经基因工程化的iPSC和本文提供的衍生细胞
鉴于以上，本申请提供了iPSC、iPS细胞系细胞或其群体，以及通过使所述iPSC分化获得的衍生效应细胞，其中每个细胞包括具有如本文所述的胞内结构域的至少一种CAR。在一些实施例中，衍生效应细胞包含但不限于具有永久造血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、共同骨髓祖细胞、共同淋巴祖细胞、红细胞、骨髓细胞、中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞和具有原代NK、T和/或NKT细胞中不存在的一种或多种功能特征的衍生免疫效应细胞。
本文还提供了含有CAR的细胞，所述细胞进一步包括CD38-/-(在本文中也被称为“CD38无效”或CD38敲除)，其中所述细胞为iPSC、iPS细胞系细胞或通过iPSC分化获得的包括CAR和CD38敲除的衍生功能性效应细胞。在一些实施例中，衍生效应细胞包含但不限具有永久造血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、共同骨髓祖细胞、共同淋巴祖细胞、红细胞、骨髓细胞、中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞和具有原代NK、T和/或NKT细胞中不存在的一种或多种功能特征的衍生免疫效应细胞。
本文进一步提供了包括编码CAR的多核苷酸和编码高亲和力不可切割的CD16(hnCD16)的多核苷酸的iPSC，其中所述iPSC能够分化以产生功能性衍生造血细胞。包括CAR和hnCD16两者的细胞适于通过CAR结合性和CD16介导的ADCC的双重靶向，由此增加肿瘤靶向精度、增强肿瘤杀伤并且使肿瘤抗原逃逸的影响最小化。进一步地，在一些实施例中，包括具有所提供的胞内结构域的CD38-CAR和hnCD16的iPSC和/或其衍生效应细胞也是CD38无效的，使得当使用CD38抗体来诱导hnCD16介导的增强的ADCC时，包括CD38敲除、CD38-CAR和hnCD16-CD38抗体的iPSC和/或其衍生效应细胞可以靶向表达CD38的(肿瘤)细胞和/或同种异体激活的受体细胞而会不引起效应细胞消除，由此增加iPSC及其效应细胞的持久性和/或存活率。在一些实施例中，效应细胞包含T细胞。在一些实施例中，效应细胞包括NK细胞。包括CAR、CD38无效和hnCD16的iPSC源性T或NK细胞在存在CD38抗体或CD38 CAR的情况下经历细胞耗竭减少；具有ADCC(在T细胞的情况下获得的ADCC)，从而提供多种用于肿瘤杀伤同时具有改善的细胞持久性的机制。
包括如本文提供的第一CAR的iPSC可以包括编码具有不同于第一CAR的靶特异性的第二嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，其中iPSC能够分化以产生具有靶向两个不同肿瘤抗原的两种CAR的功能性衍生效应细胞。在一个实施例中，由包括在iPSC和其衍生效应细胞中的CAR靶向的两个不同抗原包含但不限于MICA/B、CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、CD25、CD69、CD44、HER2、CD52、EGFR、GD2、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1。在一个实施例中，iPSC和/或其衍生效应细胞具有靶向CD38、CD25、CD69或CD44的CAR，并且所述细胞在靶向的蛋白质中也无效。
额外提供了一种iPSC，其包括编码如本文提供的CAR的多核苷酸和编码至少一种外源性细胞因子和/或其受体(IL)以使细胞因子信号传导能够有助于细胞存活率、持久性和/或扩增的多核苷酸，其中所述iPSC能够分化以产生具有改善的存活率、持久性、扩增和效应细胞功能的功能性衍生效应细胞。外源性引入的细胞因子信号传导包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21中的任一种或两种或更多种的信号传导。在一些实施例中，用于细胞因子信号传导的细胞因子和/或其相应受体的所引入部分或全部肽在细胞表面上表达。在一些实施例中，组成性地激活细胞因子信号传导。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是可诱导的。在一些实施例中，细胞因子信号传导的激活是瞬时的和/或暂时的。在一些实施例中，细胞表面细胞因子/细胞因子受体的瞬时/暂时表达是通过逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体、小环或包括mRNA的RNA。在一些实施例中，包括在含有CAR的iPSC或其衍生细胞中的外源性细胞表面细胞因子和/或受体实现了IL7信号传导。在一些实施例中，包括在含有CAR的iPSC或其衍生细胞中的外源性细胞表面细胞因子和/或受体实现了IL10信号传导。在一些实施例中，包括在含有CAR的iPSC或其衍生细胞中的外源性细胞表面细胞因子和/或受体实现了IL15信号传导。在所述CAR IL iPSC的一些实施例中，IL15表达通过图1的构建体3进行。在所述CAR IL iPSC的一些实施例中，IL15表达通过图1的构建体4进行。以上实施例的所述CAR IL iPSC和其衍生细胞能够自主地维持或改善细胞生长、增殖、扩增和/或效应功能，而不在体外或体内接触额外提供的可溶性细胞因子。在CAR IL iPSC和其衍生效应细胞的一些实施例中，所述细胞是CD38无效的并且可以与CD38抗体一起使用以诱导ADCC而不引起效应细胞的消除，由此协同增加iPSC和其效应细胞的持久性和/或存活率。
还提供了一种iPSC，其包括所提供的CAR、B2M敲除和CIITA敲除，以及任选地HLA-G过表达、CD58敲除和CD54敲除，其中所述iPSC能够分化以产生功能性衍生造血细胞。所述CAR B2M-/-CIITA-/-iPSC和其衍生效应细胞为HLA-I缺陷型和HLA-II缺陷型两种。在另外的实施例中，HLA-I和HLA-II缺陷型CAR iPSC和其衍生效应细胞也是CD38无效的，并且可以与CD38抗体一起使用以诱导ADCC而不引起效应细胞消除，由此增加iPSC和其效应细胞细胞持久性和/或存活率。在一些实施例中，效应细胞在体内具有增加的持久性和/或存活率。
鉴于以上，本文提供了一种iPSC，其包括CAR以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种：CD38敲除、hnCD16、第二CAR、外源性细胞因子/受体和B2M/CIITA敲除；其中当B2M被敲除时，编码HLA-G或CD58敲除和CD54敲除中的至少一种的多核苷酸被任选地引入，并且其中所述iPSC能够分化以产生功能性衍生造血细胞。本申请中还包含功能性iPSC衍生效应细胞，其包括CAR以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种：CD38敲除、hnCD16、B2M/CIITA敲除、第二CAR和外源性细胞因子/受体；其中当B2M被敲除时，编码HLA-G或CD58敲除和CD54敲除中的至少一种的多核苷酸被任选地引入，并且其中衍生效应细胞包含但不限于具有永久造血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、共同骨髓祖细胞、共同淋巴祖细胞、红细胞、骨髓细胞、中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞和具有原代NK、T和/或NKT细胞中不存在的一种或多种功能特征的衍生免疫效应细胞。
本文提供的另一方面包含包括IL15和IL15Rα的截短的融合蛋白的iPSC或iPSC源性细胞，其中所述融合蛋白不包括细胞内结构域。在图1中显示为“IL15Rα(ΔICD)融合”和“IL5/mb-Sushi”，这些实施例贯穿本申请进一步统一缩写为IL15Δ并且是表3中展示的“IL”的实施例之一。在“IL”的一些实施例中，缺乏细胞内结构域的截短的IL15/IL15Rα融合蛋白包括与SEQ ID NO:48、51或50具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在“IL”的一些实施例中，缺乏细胞内结构域的截短的IL15/IL15Rα融合蛋白包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在“IL”的一些实施例中，缺乏细胞内结构域的截短的IL15/IL15Rα融合蛋白包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在“IL”的一些实施例中，缺乏细胞内结构域的截短的IL15/IL15Rα融合蛋白包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在包括缺乏细胞内结构域的截短的IL15/IL15Rα融合蛋白(IL15Δ)的iPSC或iPSC源性细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包括CAR以及任选地以下中的一种或多种：CD38敲除、hnCD16、第二CAR、外源性细胞因子/受体和B2M/CIITA敲除；其中当B2M被敲除时，编码HLA-G或CD58敲除和CD54敲除之一的多核苷酸被任选地引入，并且其中所述iPSC能够分化以产生功能性衍生效应细胞，并且其中所述衍生效应细胞包含但不限于具有永久造血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、共同骨髓祖细胞、共同淋巴祖细胞、红细胞、骨髓细胞、中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞和具有原代NK、T和/或NKT细胞中不存在的一种或多种功能特征的衍生免疫效应细胞。
因此，本申请提供了iPSC和其功能衍生造血细胞，其包括表2中的以下基因型中的任一种基因型。如本申请的表2中提供的“CAR(第2)”表示具有不同于第一CAR的靶向特异性的CAR，并且非限制性实例包含靶向以下中的至少一种的CAR：CD19、BCMA、CD20、CD22、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1。如表2中提供的“IL”表示以下之一：IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18和IL21，这取决于选择哪种特异性细胞因子/受体表达。进一步地，“IL”还涵盖IL15Δ实施例，所述实施例在上文详述为IL15和IL15Rα的截短的融合蛋白，但没有细胞内结构域。进一步地，当iPSC和其功能性衍生效应细胞具有包括CAR(第一CAR或第二CAR)和IL两者的基因型时，在所述细胞的一个实施例中，所述CAR和IL包括在包括2A序列的双顺反子表达盒中。相比而言，在一些其它实施例中，CAR和IL在包含于iPSC和其功能性衍生造血细胞中的单独表达盒中。在一个特定实施例中，包括在表达CAR和IL两者的iPSC和其功能性衍生效应细胞中的是图1的构建体3或4中的IL15，其中所述IL15构建体包括在与CAR一起或与CAR分开的表达盒中。
表2：所提供的细胞的适用的示例性基因型：
Figure BDA0003659030370000621
Figure BDA0003659030370000631
Figure BDA0003659030370000641
Figure BDA0003659030370000651
Figure BDA0003659030370000661
7.额外修饰
在一些实施例中，包括表2中的基因型中的任一种基因型的iPSC和其衍生效应细胞可以额外包括：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP和染色体6p21区中的任何基因中的至少一种的缺失或减少的表达；或HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、衔接子以及用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一种中的所引入或增加的表达。
双特异性或多特异性衔接子为由不同抗体的两个或更多个单链可变片段(scFv)组成的融合蛋白，其中至少一个scFv与效应细胞表面分子结合，并且至少另一个scFv通过肿瘤特异性表面分子与肿瘤细胞结合。可以用于双特异性或多特异性衔接子识别或偶联的示例性效应细胞表面分子或表面触发受体包含但不限于CD3、CD28、CD5、CD16、NKG2D、CD64、CD32、CD89、NKG2C和如本文所公开的嵌合Fc受体。在一些实施例中，在效应细胞的表面上表达以用于衔接子识别的CD16是hnCD16，其包含如I.2部分中所描述的CD16(含有F176V和任选的S197P)或CD64细胞外结构域以及天然或非天然的跨膜结构域、刺激结构域和/或信号传导结构域。在一些实施例中，在效应细胞的表面上表达以用于衔接子识别的CD16是基于hnCD16的嵌合Fc受体(CFcR)。在一些实施例中，基于hnCD16的CFcR包含NKG2D的跨膜结构域、2B4的刺激结构域和CD3ζ的信号传导结构域；其中hnCD16的细胞外结构域衍生自CD64或CD16的细胞外结构域的全长或部分序列；并且其中CD16的细胞外结构域包含F176V和任选的S197P。用于双特异性或多特异性衔接子识别的示例性肿瘤细胞表面分子包含但不限于B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-钙粘素、ROR1。在一个实施例中，双特异性抗体为CD3-CD19。在另一实施例中，双特异性抗体为CD16-CD30或CD64-CD30。在另一实施例中，双特异性抗体为CD16-BCMA或CD64-BCMA。在再一实施例中，双特异性抗体为CD3-CD33。在又另一实施例中，双特异性抗体进一步包括介于效应细胞与肿瘤细胞抗原结合结构域之间的接头，例如作为效应NK细胞的用于促进效应细胞扩增的接头的经修饰的IL15(在一些公开案中被称为TriKE，或三特异性杀伤衔接子)。在一个实施例中，TriKE为CD16-IL15-EPCAM或CD64-IL15-EPCAM。在另一实施例中，TriKE为CD16-IL15-CD33或CD64-IL15-CD33。在又另一实施例中，TriKE为NKG2C-IL15-CD33(“2C1533”)。
在一些实施例中，双特异性或多特异性衔接子的表面触发受体对于效应细胞可以是内源性的，这有时取决于细胞类型。在一些其它实施例中，一种或多种外源性表面触发受体可以使用本文提供的方法和组合物，即通过包括表2中列出的基因型的iPSC的额外工程化，随后将iPSC的分化定向到包括与源iPSC相同的基因型和表面触发受体的T、NK或任何其它效应细胞而被引入到效应细胞中。
8.用于免疫疗法的抗体
在一些实施例中，除如本文所提供的经基因组工程化的效应细胞以外，包含靶向与病状、疾病或适应症相关的抗原的抗体或抗体片段的额外治疗剂可在组合疗法中与这些效应细胞一起使用。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体是人类化抗体、人类化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施例中，抗体或抗体片段与病毒抗原特异性结合。在其它实施例中，抗体或抗体片段与肿瘤抗原特异性结合。在一些实施例中，肿瘤或病毒特异性抗原活化所给予的iPSC衍生的效应细胞以增强其杀伤能力。在一些实施例中，适于作为所施用的iPSC源性效应细胞的额外治疗剂进行组合治疗的抗体包含但不限于CD20抗体(利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌布里图昔单抗、奥卡拉珠单抗、奥比珠单抗)、HER2抗体(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、CD52抗体(阿仑单抗)、EGFR抗体(西妥昔单抗)、GD2抗体(迪努妥昔单抗)、PDL1抗体(阿维鲁单抗)、CD38抗体(达土木单抗、艾沙妥昔单抗、MOR202)、CD123抗体(7G3、CSL362)、SLAMF7抗体(埃罗妥珠单抗)、MICA/B抗体(7C6、6F11、1C2)和其人源化或经Fc修饰的变体或片段或其功能等效物和生物仿制药。在一些实施例中，iPSC源性效应细胞包括造血谱系细胞，所述造血谱系细胞包括表2中列出的基因型。在一些实施例中，iPSC源性效应细胞包括NK细胞，所述NK细胞包括表2中列出的基因型。在一些实施例中，iPSC源性效应细胞包括T细胞，所述T细胞包括表2中列出的基因型。
在可用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些实施例中，所述组合包括预选的单克隆抗体和包括包含所提供的胞内结构域的至少一种CAR的iPSC源性NK或T细胞。在可用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些其它实施例中，所述组合包括预选的单克隆抗体和包括至少一个hnCD16和包括所提供的胞内结构域的CAR的iPSC源性NK或T细胞。在可用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些实施例中，所述组合包括单克隆抗体和包括至少一个hnCD16和包括所提供的胞内结构域的CAR的iPSC源性NK或T细胞。不受理论的限制，hnCD16提供单克隆抗体的增强的ADCC，而CAR不仅靶向特异性肿瘤抗原，而且使用与靶向不同肿瘤抗原的单克隆抗体组合的双靶向策略来防止肿瘤抗原逃逸。在可用于治疗液体瘤或实体瘤的组合的一些实施例中，所述组合包括包含至少一个CD38-CAR以及CD38抗体的iPSC源性NK或T细胞，所述至少一个CD38-CAR包括本文提供的胞内结构域、无效的CD38。在一个实施例中，所述组合包括包含CD38-CAR以及CD38抗体、达雷妥尤单抗、艾妥昔单抗和MOR202之一的iPSC源性NK细胞，所述CD38-CAR包括本文提供的胞内结构域、无效的CD38和hnCD16。在一个实施例中，所述组合包括包含CD38-CAR和达雷妥尤单抗的iPSC源性NK细胞，所述CD38-CAR包括本文提供的胞内结构域、无效的CD38和hnCD16。在一些另外的实施例中，包括在与达雷妥尤单抗的组合中的iPSC源性NK细胞包括CD38-CAR、无效的CD38、hnCD16、IL15和靶向MICA/B的CAR或以下之一：CD19、BCMA、CD20、CD22、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1；其中IL15与CAR共表达或分开表达；并且IL15呈图1的构建体1到7中呈现的形式中的任一种形式。在一些特定实施例中，当IL15与CAR共表达或分开表达时，其呈构建体3、4或7的形式。
9.检查点抑制剂
检查点为在不受抑制时能够抑制或下调免疫应答的细胞分子，通常为细胞表面分子。现在清楚的是，肿瘤选择某些免疫检查点路径作为免疫抗性的主要机制，特别是针对对肿瘤抗原具有特异性的T细胞。检查点抑制剂(CI)是能够减少检查点基因表达或基因产物，或降低检查点分子的活性，从而阻断抑制性检查点，恢复免疫系统功能的拮抗剂。靶向PD1/PDL1或CTLA4的检查点抑制剂的研发转变了肿瘤学前景，其中这些试剂提供多种适应症的长期缓解。然而，许多肿瘤亚型对检查点阻断疗法具有抗性，并且复发仍然是一个大问题。本申请的一个方面提供了一种用于通过包含如在与CI的组合疗法中提供的经基因组工程化的功能性衍生细胞来克服CI抗性的治疗方法。在组合疗法的一个实施例中，衍生细胞为NK细胞。在组合疗法的另一实施例中，衍生细胞为T细胞。除了展现直接的抗肿瘤能力外，本文所提供的衍生NK细胞已显示出抵抗PDL1-PD1介导的抑制作用，并且具有增强T细胞迁移、将T细胞募集到肿瘤微环境并且增强肿瘤部位处的T细胞活化的能力。因此，由功能上有效的经基因组工程化的衍生NK细胞促进的T细胞的肿瘤浸润表明，所述NK细胞能够与T细胞靶向的免疫疗法，包含检查点抑制剂协同作用，以缓解局部免疫抑制并且减少肿瘤负荷。
在一个实施例中，用于检查点抑制剂组合疗法的衍生NK细胞包括CAR，所述CAR包括本文提供的胞内结构域，以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种CD38：敲除、hnCD16表达、B2M/CIITA敲除、第二CAR和外源性细胞表面细胞因子和/或受体表达；其中当B2M被敲除时，编码HLA-G或CD58敲除或CD54敲除中的至少一种的多核苷酸被任选地包含在内。在一些实施例中，衍生NK细胞包括表2中列出的基因型中的任一种基因型。在一些实施例中，以上衍生NK细胞额外包括：TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP以及染色体6p21区中的任何基因中的至少一种的缺失或减少的表达；或HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、衔接子和用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一种中的所引入或增加的表达。
在另一实施例中，用于检查点抑制剂组合疗法的衍生T细胞包括CAR，所述CAR包括本文提供的胞内结构域以及任选地以下中的一种、两种、三种或更多种：CD38敲除、hnCD16表达、B2M/CIITA敲除、第二CAR和外源性细胞表面细胞因子和/或受体表达；其中当B2M被敲除时，编码HLA-G或CD58敲除或CD54敲除中的至少一种的多核苷酸被任选地包含在内。在一些实施例中，衍生T细胞包括表2中列出的基因型中的任一种基因型。在一些实施例中，以上衍生T细胞额外包括TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP以及染色体6p21区中的任何基因中的至少一种中的缺失或减少的表达；或HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、衔接子和用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一种中的所引入或增加的表达。
以上所述衍生NK或T细胞通过使包括CAR的iPSC克隆系分化获得，所述CAR包括本文提供的胞内结构域以及任选地以下中的一种、两种、三种或全部四种：CD38敲除、hnCD16表达、B2M/CIITA敲除、第二CAR和外源性细胞表面细胞因子表达；其中当B2M被敲除时，编码HLA-G或CD58敲除和CD54敲除中的至少一种的多核苷酸被任选地引入。在一些实施例中，以上所述iPSC克隆系进一步包括TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP以及染色体6p21区域中的任何基因中的至少一种中的缺失或减少的表达；或HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、衔接子和用于与双特异性、多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一种中的所引入或增加的表达。
用于与如本文所提供的衍生NK细胞或T细胞的组合疗法的合适的检查点抑制剂包含但不限于PD1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM3(Havcr2)、TIGIT(WUCAM和Vstm3)、LAG3(Lag3、CD223)、CTLA4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2aR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR(例如，2DL1、2DL2、2DL3、3DL1和3DL2)的拮抗剂。
在一些实施例中，抑制上述任一种检查点分子的拮抗剂是抗体。在一些实施例中，检查点抑制性抗体可以是鼠类抗体、人类抗体、人类化抗体、骆驼Ig、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体或其抗体片段。抗体片段的非限制性实例包括Fab、Fab′、F(ab)′2、F(ab)′3、Fv、单链抗原结合片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微体、双体、三体、四体、单结构域抗原结合片段(sdAb，纳米体)、只有重链的重组抗体(VHH)和维持整个抗体的结合特异性的其它抗体片段，其相比于整个抗体可以更有成本效益地产生、更易于使用或更敏感。在一些实施例中，所述一种或两种或三种或更多种检查点抑制剂包括以下中的至少一种：阿特珠单抗(PDL1 mAb)、阿维鲁单抗(PDL1 mAb)、度伐单抗(PDL1mAb)、曲美木单抗(tremelimumab)(CTLA4 mAb)、伊匹单抗(CTLA4 mAb)、IPH4102(KIR抗体)、IPH43(MICA抗体)、IPH33(TLR3抗体)、利瑞木单抗(KIR抗体)、莫纳利珠单抗(NKG2A抗体)、纳武单抗(PD1 mAb)、派姆单抗(PD1 mAb)和其任何衍生物、功能等效物或生物仿制药。
在一些实施例中，抑制上述任一种检查点分子的拮抗剂是基于微RNA的，因为发现许多miRNA作为控制免疫检查点的表达的调控因子(Dragomir等人,《癌症生物医学(CancerBiol Med.)》2018,15(2):103-115)。在一些实施例中，检查点拮抗性miRNA包含但不限于miR-28、miR-15/16、miR-138、miR-342、miR-20b、miR-21、miR-130b、miR-34a、miR-197、miR-200c、miR-200、miR-17-5p、miR-570、miR-424、miR-155、miR-574-3p、miR-513和miR-29c。
与所提供的衍生NK或T细胞的组合疗法的一些实施例包括用于靶向至少一种检查点分子的至少一种检查点抑制剂；其中衍生细胞具有表2中列出的基因型。与所提供的衍生NK细胞或T细胞的组合疗法的一些其它实施例包含两种、三种或更多种检查点抑制剂，使得靶向两种、三种或更多种检查点分子。在包括至少一种检查点抑制剂和具有表2中列出的基因型的衍生细胞的组合疗法的一些实施例中，所述检查点抑制剂为抗体、或人源化或经Fc修饰的变体或片段、或其功能等效物或生物类似物，并且所述检查点抑制剂通过使编码所述抗体或其片段或变体的外源性多核苷酸序列表达由衍生细胞产生。在一些实施例中，编码抑制检查点的抗体或其片段或变体的外源性多核苷酸序列在单独构建体中或在双顺反子构建体中与CAR共表达，所述双顺反子构建体包含CAR和编码抗体或其片段的序列两者。在一些其它实施例中，编码抗体或其片段的序列可通过自我裂解2A编码序列连接到CAR表达构建体的5'端或3'端，示出为例如CAR-2A-CI或CI-2A-CAR。因此，检查点抑制剂和CAR的编码序列在单一开放阅读框(ORF)中。当通过能够浸润肿瘤微环境(TME)的衍生效应细胞将检查点抑制剂以有效负载递送、表达和分泌时，其在接合TME后抵消抑制性检查点分子，从而允许利用例如CAR或活化受体的活化模态活化效应细胞。在一些实施例中，与CAR共表达的检查点抑制剂抑制以下检查点分子中的至少一种检查点抑制剂：PD1、PDL-1、TIM3、TIGIT、LAG3、CTLA4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR。在一些实施例中，与CAR在具有表2中列出的基因型的衍生细胞中共表达的检查点抑制剂选自包括以下的组：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、曲美木单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和其人源化或经Fc修饰的变体、片段以及其功能等效物或生物仿制药。在一些实施例中，与CAR共表达的检查点抑制剂是阿特珠单抗或其人源化或经Fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物类似物。在一些其它实施例中，与CAR共表达的检查点抑制剂是纳武单抗或其人源化或经Fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物类似物。在一些其它实施例中，与CAR共表达的检查点抑制剂是派立珠单抗或其人源化或经Fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物类似物。
在包括本文所提供的衍生细胞和抑制检查点分子的至少一种抗体的组合疗法的一些其它实施例中，所述抗体不由衍生细胞产生或不在衍生细胞中产生，并且在施用具有表2中列出的基因型的衍生细胞之前、同时或之后另外施用。在一些实施例中，在与所提供的衍生NK细胞或T细胞的组合疗法中给予一种、两种、三种或更多种检查点抑制剂是同时或依序的。在包括具有表2中列出的基因型的衍生NK细胞或T细胞的组合治疗的一个实施例中，治疗中包含的检查点抑制剂为阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、曲美木单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和其人源化或经Fc修饰的变体、片段以及其功能等效物或生物仿制药中的一种或多种。在包括具有表2中列出的基因型的衍生NK细胞或T细胞的组合治疗的一些实施例中，治疗中包含的检查点抑制剂为阿特珠单抗或其人源化或经Fc修饰的变体、片段以及其功能等效物或生物类似物。在包括具有表2中列出的基因型的衍生NK细胞或T细胞的组合治疗的一些实施例中，治疗中包含的检查点抑制剂为纳武单抗或其人源化或经Fc修饰的变体、片段或其功能等效物或生物仿制药。在包括具有表2中列出的基因型的衍生NK细胞或T细胞的组合治疗的一些实施例中，治疗中包含的检查点抑制剂为帕博利珠单抗或其人源化或经Fc修饰的变体、片段以及其功能等效物或生物类似物。
II.在iPSC中所选基因座处进行靶向基因组编辑的方法
如本文中可互换使用的基因组编辑(Genome editing/genomic editing)是一种类型的基因工程化，其中在靶细胞的基因组中插入、缺失和/或置换DNA。靶向基因组编辑(可与“靶向基因组编辑”或“靶向基因编辑”互换)能够在基因组中的预选位点实现插入、缺失和/或取代。当在靶向编辑期间使内源性序列在插入位点缺失时，可因序列缺失而基因敲除或基因敲减包含受影响序列的内源性基因。因此，靶向编辑还可以用于精确地破坏内源性基因表达。本文中类似地使用术语“靶向整合”，其是指一种涉及在使内源性序列在插入位点缺失或不缺失的情况下插入一个或多个外源性序列的过程。相比之下，随机整合的基因经历位置效应和沉默，使其表达不可靠且不可预测。举例来说，着丝点和亚端粒区域特别容易发生转基因沉默。相反，新整合的基因可影响周围的内源性基因和染色质，从而潜在地改变细胞行为或有利于细胞转化。因此，将外源性DNA插入预选基因座(例如安全港基因座或基因组安全港(GSH))对于安全、效率、拷贝数控制以及可靠的基因反应控制非常重要。可替代地，可以将外源性DNA插入在预选的基因座中，其中预期破坏基因座处的基因表达，包含敲低和敲除。
可以通过核酸酶非依赖性方法或通过核酸酶依赖性方法实现靶向编辑。在核酸酶非依赖性靶向编辑方法中，同源重组是通过宿主细胞的酶机制，由侧接所插入的外源性多核苷酸的同源序列引导。
替代地，可以通过利用特异性稀有切割核酸内切酶，特异性引入双链断裂(DSB)来以更高的频率实现靶向编辑。这类核酸酶依赖性靶向编辑是利用DNA修复机制，包括非同源末端连接(NHEJ)，其响应于DSB而发生。在不具有含有外源性遗传物质的供体载体的情况下，NHEJ通常引起少量的内源性核苷酸的随机插入或缺失(插入/缺失)。相比之下，当存在含有位于一对同源臂两侧的外源性遗传物质的供体载体时，可以在同源定向修复(HDR)期间通过同源重组将外源性遗传物质引入到基因组中，从而引起“靶向整合”。在一些情况下，靶向整合位点旨在位于所选基因的编码区内，并且因此靶向整合可能破坏基因表达，从而引起在一个单一编辑步骤中同时敲入和敲除(KI/KO)。
根据一些实施例，可以实现在所关注基因座(GOI)中将一个或多个转基因插入在所选位置处以同时敲除所述基因。适于同时敲入和敲除(KI/KO)的基因座包含但不限于B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。在具有用于位置选择性插入的相应的位点特异性靶向同源臂的情况下，其允许转基因在内源性启动子下在所述位点处表达，或在包含于构建体中的外源性启动子下表达。当两个或更多个转基因将被插入在CD38基因座中的所选位置处时，接头序列，例如，2A接头或IRES被置于任何两个转基因之间。2A接头编码源自FMDV、ERAV、PTV-I和TaV的自切割肽(分别被称为“F2A”、“E2A”、“P2A”和“T2A”)，从而使得通过单次翻译产生单独的蛋白质。在一些实施例中，构建体中包括绝缘体以降低转基因和/或外源性启动子沉默的风险。外源性启动子可以是CAG，或其它组成性、诱导性、时间特异性、组织特异性和/或细胞类型特异性的启动子，包括但不限于CMV、EF1α、PGK和UBC。
能够引入特定和靶向DSB的可用核酸内切酶包含但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA引导的CRISPR(簇聚的规则间隔的短回文重复序列)系统。另外，利用phiC31和Bxb1整合酶的DICE(双整合酶盒交换)系统也是一种用于靶向整合的有前景的工具。
ZFN是靶向核酸酶，其包含与锌指DNA结合结构域融合的核酸酶。“锌指DNA结合结构域”或“ZFBD”意指通过一个或多个锌指，以序列特异性方式结合DNA的多肽结构域。锌指是锌指结合结构域内具有约30个氨基酸的结构域，其结构通过锌离子的配位而稳定。锌指的实例包含但不限于C2H2锌指、C3H锌指和C4锌指。“设计”的锌指结构域是一种不存在于自然界中的结构域，其设计/组成主要来源于合理准则，例如应用取代规则和计算机化算法来处理储存现有ZFP设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如，美国专利第6,140,081号；第6,453,242号；以及第6,534,261号；还参见国际公开案第WO 98/53058号；第WO98/53059号；第WO 98/53060号；第WO 02/016536号和第WO 03/016496号。“所选”锌指结构域是一种在自然界中未发现的结构域，其产生主要来源于经验方法，例如噬菌体呈现、相互作用截留或杂交选择。ZFN更详细地描述于美国专利第7,888,121号和美国专利第7,972,854号中，其完整公开内容以引入的方式并入本文中。ZFN在所属领域中的最公认实例是FokI核酸酶与锌指DNA结合结构域的融合物。
TALEN为靶向核酸酶，其包含与TAL效应物DNA结合结构域融合的核酸酶。“转录活化因子样效应物DNA结合结构域”、“TAL效应物DNA结合结构域”或“TALE DNA结合结构域”意指负责TAL效应蛋白与DNA结合的TAL效应蛋白的多肽结构域。TAL效应蛋白是由黄单胞菌属(Xanthomonas)植物病原体在感染期间分泌。这些蛋白质进入植物细胞的核，经由其DNA结合结构域结合效应子特异性DNA序列，并且经由其转录活化结构域在这些序列处激活基因转录。TAL效应物DNA结合结构域特异性取决于不完全的34个氨基酸重复序列的效应子可变数目，其包含所选重复位置处的多态性，称为重复可变双残基(RVD)。TALEN更详细描述于在美国公开案第2011/0145940号，所述美国公开案通过引用并入本文。TALEN在所属领域中的最公认实例是FokI核酸酶与TAL效应物DNA结合结构域的融合多肽。
用于本发明方法的靶向的核酸酶的另一实例为靶向的Spo11核酸酶，这是包括与DNA结合结构域，例如对所关注DNA序列具有特异性的锌指DNA结合结构域、TAL效应DNA结合结构域等融合的具有核酸酶活性的Spo11多肽的多肽。
适合于本发明的靶向核酸酶的其它实例包含但不限于Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1和Wβ/SPBc/TP901-1,不论单独地或组合地使用。
靶向核酸酶的其它非限制性实例包括天然存在的核酸酶和重组核酸酶；来自包括以下的家族的CRISPR相关核酸酶：cas、cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm和cmr；限制性核酸内切酶；大范围核酸酶；归巢核酸内切酶等。
使用Cas9作为实例，CRISPR/Cas9需要两种主要组分：(1)Cas9核酸内切酶；以及(2)crRNA-tracrRNA复合物。当共表达时，所述两种组分形成募集到标靶DNA序列的复合物，所述序列包含PAM和靠近PAM的接种区域。crRNA和tracrRNA可以组合形成嵌合向导RNA(gRNA)以引导Cas9靶向所选序列。这两种组分然后可以经由转染或转导递送到哺乳动物细胞。
DICE介导的插入是利用一对重组酶(例如phiC31和Bxb1)来提供外源性DNA的单向整合，其严格局限于每种酶自身的小attB和attP识别位点。由于这些att靶点并非天然存在于哺乳动物基因组中，因此必须首先将其引入基因组中的所期望整合位点。参见例如美国公开案第2015/0140665号，所述美国公开案的公开内容通过引用并入本文。
本发明的一个方面提供一种构建体，其包含一种或多种用于靶向基因组整合的外源性多核苷酸。在一个实施例中，所述构建体进一步包含对所期望的整合位点具有特异性的一对同源臂，并且靶向整合的方法包含向细胞中引入所述构建体以允许细胞宿主酶机制实现定点同源重组。在另一实施例中，细胞中的靶向整合的方法包含向细胞中引入包含一种或多种外源性多核苷酸的构建体，以及向细胞中引入包含对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合结构域的ZFN表达盒以实现ZFN介导的插入。在又一实施例中，细胞中的靶向整合的方法包含向细胞中引入包含一种或多种外源性多核苷酸的构建体，以及向细胞中引入包含对所期望的整合位点具有特异性的DNA结合结构域的TALEN表达盒以实现TALEN介导的插入。在另一实施例中，细胞中的靶向整合的方法包含向细胞中引入包含一种或多种外源性多核苷酸的构建体，向细胞中引入Cas9表达盒和包含对所期望的整合位点具有特异性的向导序列的gRNA以实现Cas9介导的插入。在再一实施例中，细胞中的靶向整合的方法包含将包含一对DICE重组酶的一个或多个att位点的构建体引入细胞中的所期望的整合位点、向细胞中引入包含一种或多种外源性多核苷酸的构建体，和引入DICE重组酶的表达盒以实现DICE介导的靶向整合。
有望用于靶向整合的位点包含但不限于安全港基因座或基因组安全港(GSH)，其是人类基因组的基因内或基因外区域，在理论上，所述区域能够容纳新整合的DNA的可预测表达而不会对宿主细胞或生物体产生副作用。适用的安全港必须准许足够的转基因表达以产生所期望水平的载体编码的蛋白质或非编码RNA。安全港还不得使细胞容易发生恶性转化，也不得改变细胞功能。如果整合位点是潜在的安全港基因座，那么理想的是需要满足包含但不限于以下的准则：如通过序列注释所判断，调控元件或基因没有中断；是基因密集区域中的基因间区域，或沿相反方向转录的两种基因之间的汇聚位置；保持距离以使载体编码的转录活化因子与相邻基因(特别是癌症相关基因和微RNA基因)的启动子之间的长程相互作用的可能性最小化；并且具有明显普遍存在的转录活性，如通过按较宽空间和时间表达的序列标签(EST)表达谱所反映，其指示普遍存在的转录活性。这个后一特征在干细胞中尤其重要，其中在分化期间，染色质重塑通常引起一些基因座的沉默和其它基因座的潜在激活。在适合于外源性插入的区域内，选择用于插入的确切基因座应该不含重复元件和保守序列且可以针对其容易地设计出用于扩增同源臂的引物。
适用于人类基因组编辑或具体地说靶向整合的位点包含但不限于腺相关病毒位点1(AAVS1)、趋化因子(CC基序)受体5(CCR5)基因座和小鼠ROSA26基因座的人类直系同源物。另外，小鼠H11基因座的人类直系同源物也可以是使用本文所公开的靶向整合组合物和方法进行插入的合适位点。另外，也可以使用胶原蛋白和HTRP基因座作为靶向整合的安全港。然而，每个所选位点的验证已显示为必需的，特别是在特异性整合事件的干细胞中，并且通常需要优化插入策略，包括启动子选择、外源性基因序列和排列，以及构建体设计。
对于靶向插入/缺失，编辑位点通常包含于旨在破坏其表达和/或功能的内源性基因中。在一个实施例中，包括靶向插入/缺失的内源性基因与免疫应答调控和调节相关。在一些其它实施例中，包含靶向插入/缺失的内源性基因与以下相关：靶向模态、受体、信号传导分子、转录因子、药物靶点候选物、免疫应答调控和调节，或抑制干细胞和/或祖细胞和其衍生细胞的移植、贩运、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活率的蛋白质。
如此，本发明的一个方面提供了一种在所选基因座中的靶向整合的方法，所述所选基因座包含基因组安全港或已知或已证明是安全的并且针对连续基因表达或时序基因表达调控良好的预选的基因座，如AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH或RUNX1，或满足基因组安全港标准的其它基因座。在一些实施例中，靶向整合位于期望作为整合的结果的敲低或敲除基因的基因座之一中，其中此类基因座包含但不限于B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT。
在一个实施例中，包括将包括一个或多个外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中，以及引入包括对期望整合位点具有特异性的一对同源臂以及一个或多个外源性序列的构建体，以实现通过细胞宿主酶机制进行位点特异性同源重组的在细胞中靶向整合的方法，其中所述期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。
在另一实施例中，在细胞中靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中，以及将对期望整合位点具有特异性的DNA结合结构域的ZFN表达盒引入到细胞中以实现ZFN介导的插入，其中所述期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在又另一实施例中，在细胞中靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中，以及将包括对期望整合位点具有特异性的DNA结合结构域的TALEN表达盒引入到细胞中以实现TALEN介导的插入，其中所述期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在另一实施例中，在细胞中靶向整合的方法包括将包括一种或多种外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中、将CRISPR核酸酶表达盒和包括对期望整合位点具有特异性的引导序列的gRNA引入到细胞中以实现CRISPR核酸酶介导的插入，其中所述期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在仍另一实施例中，在细胞中靶向整合的方法包括将包括一对DICE重组酶的一个或多个att位点的构建体引入到细胞中的期望整合位点中、将包括一个或多个外源性多核苷酸的构建体引入到细胞中以及引入用于DICE重组酶的表达盒以实现DICE介导的靶向整合，其中所述期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。
此外，如本文所提供，用于在安全港中进行靶向整合的上述方法用于插入所关注的任何多核苷酸，例如编码以下的多核苷酸：安全开关蛋白质、靶向模态、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白质和肽、药物靶点候选物，和促进干细胞和/或祖细胞的移植、贩运、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活率的蛋白质。在一些其它实施例中，包含一种或多种外源性多核苷酸的构建体进一步包含一个或多个标志物基因。在一个实施例中，本发明的构建体中的外源性多核苷酸是编码安全开关蛋白质的自杀基因。适用于诱导细胞死亡的自杀基因系统包含但不限于胱天蛋白酶9(或胱天蛋白酶3或7)和AP1903；胸苷激酶(TK)和苷昔洛韦(ganciclovir)(GCV)；胞嘧啶脱氨酶(CD)和5-氟胞嘧啶(5-FC)。另外，一些自杀基因系统对细胞类型具有特异性，例如使用B细胞分子CD20对T淋巴细胞进行基因修饰允许其在给予mAb利妥昔单抗后消除。此外，当经基因工程化的细胞暴露于西妥昔单抗时，含有由西妥昔单抗识别的抗原决定基的经修饰EGFR可以用于耗尽所述细胞。因此，本发明的一个方面提供一种靶向整合一个或多个编码安全开关蛋白质的自杀基因的方法，所述安全开关蛋白质选自胱天蛋白酶9(胱天蛋白酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、经修饰EGFR和B细胞CD20。
在一些实施例中，通过本文中的方法整合的一种或多种外源性多核苷酸是由包含于用于靶向整合的构建体中的可操作连接的外源性启动子驱动。所述启动子可以是诱导性的或构造性的，且可以是时间特异性、组织特异性或细胞类型特异性的。适用于本发明方法的构建性启动子包含但不限于巨细胞病毒(CMV)、延伸因子1α(EF1α)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、杂交CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)和泛素C(UBC)启动子。在一个实施例中，外源性启动子是CAG。
通过本文中的方法整合的外源性多核苷酸可以由宿主基因组中的内源性启动子在整合位点处驱动。在一个实施例中，本发明的方法是用于使一种或多种外源性多核苷酸靶向整合于细胞基因组中的AAVS1基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性AAVS1启动子驱动。在另一实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的ROSA26基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性ROSA26启动子驱动。在再一实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的H11基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性H11启动子驱动。在另一实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的胶原蛋白基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性胶原蛋白启动子驱动。在再一实施例中，本发明的方法是用于靶向整合于细胞基因组中的HTRP基因座。在一个实施例中，至少一种整合的多核苷酸是由内源性HTRP启动子驱动。理论上，只有正确插入所期望位置才能实现由内源性启动子驱动的外源性基因的基因表达。
在一些实施例中，用于靶向整合方法的包含于构建体中的一种或多种外源性多核苷酸是由一个启动子驱动。在一些实施例中，构建体包含一个或多个位于由相同启动子驱动的两个相邻多核苷酸之间的接头序列，以使得各部分之间的物理间距更大并且使酶机制的可行性最大化。接头序列的连接肽可以由为了使各部分(外源性多核苷酸，和/或由其编码的蛋白质或肽)之间产生物理间距而选择的氨基酸组成，视相关功能而定，其较柔软或较硬。接头序列可以通过蛋白酶裂解或以化学方式裂解以产生单独的部分。接头中的酶裂解位点的实例包括蛋白水解酶，例如肠激酶、因子Xa、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和凝血酶的裂解位点。在一些实施例中，所述蛋白酶为由宿主天然产生的蛋白酶或其通过外源性引入。替代地，接头中的裂解位点可以是在暴露于所选化学物质(例如溴化氰、羟胺或低pH)后能够裂解的位点。任选的接头序列可以服务于除提供裂解位点以外的目的。接头序列应允许所述部分相对于另一相邻部分的有效定位，以便所述部分正确地发挥作用。接头还可以是长度足以防止部分之间的任何空间位阻的简单氨基酸序列。另外，接头序列可以实现转译后修饰，包含但不限于例如磷酸化位点、生物素化位点、硫酸化位点、γ-羧基化位点等。在一些实施例中，接头序列是柔软的，以便使生物活性肽不能保持单一非所要的构形。接头可以主要包含具有小侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以提供柔性。在一些实施例中，约80％或90％或更多的接头序列包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸残基。在若干实施例中，G4S连接肽将融合蛋白的末端处理结构域和核酸内切酶结构域分开。在其它实施例中，2A接头序列允许单次转译产生两种单独的蛋白质。可以容易地凭经验鉴别合适的接头序列。另外，接头序列的合适大小和序列也可以通过常规计算机建模技术确定。在一个实施例中，接头序列编码自切割肽。在一个实施例中，自我裂解肽为2A。在一些其它实施例中，接头序列提供内部核糖体入口序列(IRES)。在一些实施例中，任何两个连续接头序列都不同。
将包含用于靶向整合的外源性多核苷酸的构建体引入细胞中的方法可以使用本身已知的将基因转移到细胞的方法实现。在一个实施例中，构建体包含病毒载体的骨架，所述病毒载体例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体。在一些实施例中，质粒载体用于将外源性多核苷酸递送到靶细胞和/或使外源性多核苷酸在靶细胞(例如pAl-11、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等等中表达。在一些其它实施例中，游离型载体用于将外源性多核苷酸递送到靶细胞。在一些实施例中，重组腺相关病毒(rAAV)可用于基因工程化以通过同源重组来引入插入、缺失或取代。不同于慢病毒，rAAV不会整合到宿主基因组中。另外，相较于常规靶向质粒的转染，游离型rAAV载体以高得多的速率介导同源定向的基因靶向。在一些实施例中，AAV6或AAV2载体用于在iPSC的基因组中的标靶位点处引入插入、缺失或取代。在一些实施例中，使用本文的方法和组合物获得的经基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包括表2中列出的至少一种基因型。
III.获得和维持经基因组工程化的iPSC的方法
本发明提供一种获得和维持经基因组工程化的iPSC的方法，其包含在一个或多个所期望的位点处的一个或多个靶向编辑，其中所述靶向编辑在扩增的经基因组工程化的iPSC或iPSC衍生的非多能细胞中在相应的所选编辑位点处保持完整和功能。所述靶向编辑将插入、缺失和/或取代引入基因组iPSC和其衍生细胞中，即，在所选位点引入靶向整合和/或插入/缺失。与对患者来源的外周血起源的原代效应细胞进行直接工程化相比，通过编辑如本文提供的iPSC并使所述iPSC分化获得经基因组工程化的衍生细胞的许多益处包含但不限于：经工程化的效应细胞的来源不受限制；无需重复操纵效应细胞，尤其是在涉及多种经工程化的模态时；所获得的效应细胞因具有伸长端粒和经历较少耗尽而再生；效应细胞群体在编辑位点、拷贝数和缺乏等位基因变异、随机突变和表达上色方面是同质的，这主要是由于如本文所提供的经工程化的iPSC中能够进行克隆选择。
在特定实施例中，包括一个或多个所选位点处的一个或多个靶向编辑的经基因组工程化的iPSC作为单一细胞在表3中所示的作为命运维持培养基(Fate MaintenanceMedium；FMM)的细胞培养基中维持、传代和扩增持续延长的时段，其中所述iPSC在所选位点处保留靶向编辑和功能修饰。培养基的组分可以表3中所示的最优范围内的量存在于培养基中。FMM中培养的iPSC已显示继续维持其未分化和基础或初始概况；基因组稳定性，而不需要培养物清洗或选择；并且通过活体外类胚胎体或单层分化(不形成类胚胎体)；和活体内畸胎瘤形成的分化容易产生所有三种体细胞谱系。例如，参见国际公开案第WO 2015/134652号，所述国际公开案的公开内容通过引用并入本文。
表3：用于iPSC重编程和维持的例示性培养基
Figure BDA0003659030370000811
在一些实施例中，包含一种或多种靶向整合和/或插入/缺失的经基因组工程化的iPSC在包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂并且不含或基本上不含TGFβ受体/ALK5抑制剂的培养基中维持、传代和扩增，其中所述iPSC在所选位点保留完整和功能性靶向编辑。
本发明的另一方面提供一种产生经基因组工程化的iPSC的方法，其通过iPSC的靶向编辑；或通过首先利用靶向编辑产生经基因组工程化的非多能细胞，并且然后将所选/分离的经基因组工程化的非多能细胞重编程，以获得包含与非多能细胞相同的靶向编辑的iPSC。本发明的另一方面提供经基因组工程化的非多能细胞，其通过将靶向整合和/或靶向插入/缺失引入细胞中而同时经历重编程，其中所接触的非多能细胞处于足以用于重编程的条件下，并且其中重编程的条件包含使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触。在同时进行基因组工程化和重编程的方法的各种实施例中，可以在起始重编程之前或基本上同时，通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触而将靶向整合和/或靶向插入/缺失引入非多能细胞中。
在一些实施例中，为了对非多能细胞同时进行基因组工程化和重编程，还可以在通过使非多能细胞与一种或多种重编程因子和小分子接触而起始多日重编程工艺之后，将靶向整合和/或插入/缺失引入非多能细胞中，并且其中携带构建体的载体是在重编程细胞呈现一种或多种内源性多能基因(包括但不限于SSEA4、Tra181和CD30)的稳定表达之前引入。
在一些实施例中，重编程通过使非多能细胞与至少一种重编程因子以及任选地TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合(FRM；表3)接触来启动。在一些实施例中，通过以上任何方法进行的经基因组工程化的iPSC进一步使用包括MEK抑制剂、GSK3抑制剂与ROCK抑制剂的组合(FMM；表3)的混合物来维持和扩增。
在产生经基因组工程化的iPSC的方法的一些实施例中，所述方法包括：通过将一种或多种靶向整合和/或插入/缺失引入带iPSC中来对iPSC进行基因组工程化，以获得具有至少一种表2中列出的基因型的经基因组工程化的iPSC。替代地，产生经基因组工程化的iPSC的方法包含：(a)将一个或多个靶向编辑引入非多能细胞中，以获得包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的经基因组工程化的非多能细胞，和(b)使经基因组工程化的非多能细胞与一种或多种重编程因子和任选的小分子组合物接触，以获得包含位于所选位点的靶向整合和/或插入/缺失的经基因组工程化的iPSC，所述小分子组合物包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂。可替代地，产生经基因组工程化的iPSC的方法包括：(a)使非多能细胞与一种或多种重编程因子以及任选地包括TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和/或ROCK抑制剂的小分子组合物接触，以启动非多能细胞的重编程；(b)将一种或多种靶向整合和/或插入/缺失引入到用于基因组工程化的重编程非多能细胞中；以及(c)获得包括位于所选位点处的靶向整合和/或插入/缺失的克隆经基因组工程化的iPSC。
重编程因子选自由以下组成的群组：OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、SV40LT、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3、L1TD1和其任何组合，如PCT/US2015/018801和PCT/US16/57136中所公开，其公开内容以引入的方式并入本文中。一种或多种重编程因子可以呈多肽形式。重编程因子也可以呈多核苷酸形式，并且因此通过载体(例如，逆转录病毒、仙台病毒、腺病毒、游离基因体、质粒和小环)引入非多能细胞中。在特定实施例中，通过慢病毒载体引入编码至少一种重编程因子的一种或多种多核苷酸。在一些实施例中，通过游离型载体引入一种或多种多核苷酸。在各种其它实施例中，通过仙台病毒载体引入一种或多种多核苷酸。在一些实施例中，所述一种或多种多核苷酸通过质粒与所考虑的各种重编程因子的化学计量的组合来引入。例如，参见国际公开案第WO2019/075057号，所述国际公开案的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，非多能细胞是利用包含不同外源性多核苷酸和/或不同启动子的多个构建体，通过用于在相同或不同的所选位点进行靶向整合的多种载体转移。这些外源性多核苷酸可以包括自杀基因或编码靶向模态、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白和肽、药物靶点候选物的基因或编码蛋白质的基因，所述蛋白质促进iPSC或其衍生细胞的移植、贩运、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活率。在一些实施例中，外源性多核苷酸编码RNA，包括但不限于siRNA、shRNA、miRNA和反义核酸。这些外源性多核苷酸可以由一个或多个启动子驱动，所述启动子选自由以下组成的群组：组成性启动子、诱导性启动子、时间特异性启动子和组织或细胞类型特异性启动子。因此，当在例如在诱导剂的存在下或在特定分化细胞类型中激活启动子的条件下时，多核苷酸是可表达的。在一些实施例中，多核苷酸在iPSC和/或在由iPSC分化的细胞中表达。在一个实施例中，一个或多个自杀基因是由组成性启动子驱动，例如胱天蛋白酶-9由CAG驱动。可以同时或连续将包含不同外源性多核苷酸和/或不同启动子的这些构建体转移到非多能细胞中。经历多个构建体的靶向整合的非多能细胞可同时接触一种或多种重编程因子以与基因工程化同时起始重编程，从而获得在同一细胞池中包含多个靶向整合的经基因组工程化的iPSC。因此，这种稳固方法实现同时重编程和工程化策略，以衍生具有整合到一个或多个所选标靶位点的多种模态的克隆的经基因组工程化的hiPSC。在一些实施例中，使用本文的方法和组合物获得的经基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包括表2中列出的至少一种基因型。
IV.通过使经基因组工程化的iPSC分化以及使用iPSC分化平台进行的CAR胞内结构域筛选获得经基因工程化的效应细胞的方法
本发明的另一方面提供一种通过畸胎瘤形成活体内分化经基因组工程化的iPSC的方法，其中由经基因组工程化的iPSC活体内衍生的分化细胞保留完整和功能性靶向编辑，包括在所期望的位点处的靶向整合和/或插入/缺失。在一些实施例中，在体内通过畸胎瘤分化的源自经基因组工程化的iPSC的细胞包括整合在一个或多个期望位点处的一个或多个诱导型自杀基因，所述期望位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，或满足基因组安全港准则的其它基因座。在一些其它实施例中，经基因组工程化的iPSC经由畸胎瘤体内衍生的分化细胞包含编码靶向模态或编码促进干细胞和/或祖细胞的贩运、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活率的蛋白质的多核苷酸。在一些实施例中，包含一个或多个诱导性自杀基因的经基因组工程化的iPSC经由畸胎瘤体内衍生的分化细胞，在与免疫应答调控和介导相关的内源性基因中进一步包含一个或多个插入/缺失。在一些实施例中，插入/缺失包含于一个或多个内源性检查点基因中。在一些实施例中，插入/缺失包含于一个或多个内源性T细胞受体基因中。在一些实施例中，插入/缺失包含于一个或多个内源性MHC I类抑制基因中。在一些实施例中，插入/缺失包含于与主要组织相容性复合物相关的一个或多个内源性基因中。在一些实施例中，插入/缺失包括在一种或多种内源性基因中，所述一种或多种内源性基因包含但不限于B2M、PD1、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、TCR基因。在一个实施例中，在所选位点处包含一种或多种外源性多核苷酸的经基因组工程化的iPSC在B2M(β-2微球蛋白)编码基因中进一步包含靶向编辑。
在特定实施例中，包含如本文所提供的一种或多种基因修饰的经基因组工程化的iPSC用于活体外衍生造血细胞谱系或任何其它特定细胞类型，其中衍生的非多能细胞保留功能性基因修饰，包括在所选位点处的靶向编辑。在一个实施例中，经基因组工程化的iPSC源性细胞包含但不限于具有永久造血内皮细胞(HE)潜能的中胚层细胞、永久HE、CD34造血细胞、造血干细胞和祖细胞、造血多能祖细胞(MPP)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、共同骨髓祖细胞、共同淋巴祖细胞、红细胞、骨髓细胞、中性粒细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞和巨噬细胞，其中源自经基因组工程化的iPSC的这些细胞在期望位点处保持包含靶向编辑的功能性遗传修饰。
用于获得iPSC源性造血细胞谱系的适用分化方法和组合物包含例如国际公开案第WO2017/078807号中描绘的那些，所述国际公开案的公开内容通过引用并入本文。如所提供，用于产生造血细胞谱系的方法和组合物是在无血清、无饲养层和/或无基质的条件下并且在可扩展和单层培养平台中在无需EB形成的情况下通过衍生自多能干细胞(包括hiPSC)的永久造血内皮细胞(HE)。可以根据所提供的方法分化的细胞的范围是从多能干细胞到专门化为特定末端分化细胞和转分化细胞的祖细胞、和到直接转向造血命运而不经历多能中间体的多种谱系细胞。类似地，通过分化干细胞而产生的细胞的范围是从多能干细胞或祖细胞到末端分化细胞，以及到所有中间造血细胞谱系。
用于在单层培养中分化和扩增来自多能干细胞的造血谱系细胞的方法包含使多能干细胞与BMP路径活化剂和任选的bFGF接触。如所提供，无需由多能干细胞形成类胚胎体便获得并且扩增多能干细胞衍生的中胚层细胞。然后使中胚层细胞与BMP路径活化剂、bFGF和WNT路径活化剂接触，以获得具有永久造血内皮细胞(HE)潜能的扩增中胚层细胞，而不会由多能干细胞形成类胚胎体。通过随后与bFGF和任选的ROCK抑制剂和/或WNT路径活化剂接触，将具有永久HE潜能的中胚层细胞分化成永久HE细胞，其在分化期间还得到扩增。
本文所提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB介导的多能干细胞分化，原因在于：EB形成产生了适度到最低限度的细胞扩增；不允许单层培养，而单层培养对于需要所述细胞在群体中均匀扩增和均匀分化的许多应用至关重要；并且费力且效率低。
所提供的单层分化平台促进向永久造血内皮细胞分化，从而使得衍生造血干细胞和分化后代，例如T细胞、B细胞、NKT细胞和NK细胞。单层分化策略将增强的分化效率与大规模扩增组合，实现了在不同治疗应用中递送治疗相关数量的多能干细胞源性效应细胞。此外，使用本文所提供的方法进行的单层培养产生功能性造血谱系细胞，其实现了全范围的活体外分化、离体调节，和活体内长期造血自我更新、重建和移植。如所提供，iPSC衍生的造血谱系细胞包含但不限于永久造血内皮细胞、造血多能祖细胞、造血干细胞和祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。
用于引导多能干细胞分化成永久造血谱系细胞的方法，其中所述方法包含：(i)使多能干细胞与包含BMP活化剂和任选的bFGF的组合物接触，以起始多能干细胞分化成和扩增中胚层细胞；(ii)使所述中胚层细胞与包含BMP活化剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物接触，以起始中胚层细胞分化成和扩增具有永久HE潜能的中胚层细胞，其中所述组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂；(iii)使具有永久HE潜能的中胚层细胞与组合物接触，以起始具有永久造血内皮细胞潜能的多能干细胞衍生的中胚层细胞分化成和扩增永久造血内皮细胞，所述组合物包含ROCK抑制剂；一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6和IL11；和任选的Wnt路径活化剂，其中所述组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂。
在一些实施例中，所述方法进一步包含使多能干细胞与包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物接触，以接种和扩增多能干细胞，其中所述组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂。在一些实施例中，所述多能干细胞为iPSC或天然iPSC或包括一个或多个遗传印记的iPSC；并且包括在iPSC中的一个或多个遗传印记保留在从所述iPSC分化的效应细胞中。在用于引导多能干细胞分化成造血谱系细胞的方法的一些实施例中，多能干细胞分化成造血谱系细胞缺乏产生类胚胎体，并且呈单层培养形式。
在上述方法的一些实施例中，所获得的多能干细胞衍生的永久造血内皮细胞是CD34+。在一些实施例中，所获得的永久造血内皮细胞为CD34+CD43-。在一些实施例中，永久造血内皮细胞为CD34+CD43-CXCR4-CD73-。在一些实施例中，永久造血内皮细胞为CD34+CXCR4-CD73-。在一些实施例中，永久造血内皮细胞为CD34+CD43-CD93-。在一些实施例中，永久造血内皮细胞为CD34+CD93-。
在上述方法的一些实施例中，所述方法进一步包含(i)使多能干细胞衍生的永久造血内皮细胞与组合物接触，以起始永久造血内皮细胞分化成前T细胞祖细胞，所述组合物包含ROCK抑制剂；一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO和IL7；和任选的BMP活化剂；和任选地，(ii)使前T细胞祖细胞与组合物接触，以起始前T细胞祖细胞分化成T细胞祖细胞或T细胞，所述组合物包含一种或多种选自由SCF、Flt3L和IL7组成的群组的生长因子和细胞因子，但不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在所述方法的一些实施例中，多能干细胞衍生的T细胞祖细胞为CD34+CD45+CD7+。在所述方法的一些实施例中，多能干细胞衍生的T细胞祖细胞为CD45+CD7+。
在用于将多能干细胞的分化定向到造血谱系的细胞中的以上方法的又一些实施例中，所述方法进一步包括：(i)使多能干细胞源性永久造血内皮细胞与组合物接触，以启动所述永久造血内皮细胞分化为前NK细胞祖细胞，所述组合物包括：ROCK抑制剂；选自由以下组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子：VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15；以及任选地(ii)使多能干细胞源性前NK细胞祖细胞与包括选自由SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子的组合物接触，以启动所述前NK细胞祖细胞分化为NK细胞祖细胞或NK细胞，其中培养基不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化剂和ROCK抑制剂中的一种或多种。在一些实施例中，多能干细胞衍生的NK祖细胞为CD3-CD45+CD56+CD7+。在一些实施例中，多能干细胞衍生的NK细胞为CD3-CD45+CD56+，并且任选地进一步由NKp46+、CD57+和CD16+定义。
因此，使用以上分化方法，可以获得一个或多个iPSC源性造血细胞群体：(i)使用选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的一种或多种培养基获得的CD34+HE细胞(iCD34)；(ii)使用选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的一种或多种培养基获得的永久造血内皮细胞(iHE)；(iii)使用选自iMPP-A、iTC-A2、iTC-B2、iNK-A2和iNK-B2的一种或多种培养基获得的永久HSC；(iv)使用iMPP-A获得的多能祖细胞(iMPP)；(v)使用选自iTC-A2和iTC-B2的一种或多种培养基获得的T谱系细胞祖细胞(ipro-T)；(vi)使用iTC-B2获得的T谱系细胞(iTC)；(vii)使用选自iNK-A2和iNK-B2的一种或多种培养基获得的NK谱系细胞祖细胞(ipro-NK)；和/或(viii)NK谱系细胞(iNK)和iNK-B2。在一些实施例中，培养基：
a.iCD34-C包含ROCK抑制剂、一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：bFGF、VEGF、SCF、IL6、IL11、IGF和EPO，和任选的Wnt路径活化剂；并且不含TGFβ受体/ALK抑制剂；
b.iMPP-A包含BMP活化剂、ROCK抑制剂以及一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6、Flt3L和IL11；
c.iTC-A2包含ROCK抑制剂；一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、TPO和IL7；和任选的BMP活化剂；
d.iTC-B2包含一种或多种选自由SCF、Flt3L和IL7组成的群组的生长因子和细胞因子；
e.iNK-A2包括ROCK抑制剂以及选自由SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；并且
f.iNK-B2包含一种或多种选自由以下组成的群组的生长因子和细胞因子：SCF、Flt3L、IL7和IL15。
在一些实施例中，由以上方法获得的经基因组工程化的iPSC源性细胞包括整合在一个或多个期望整合位点处的一个或多个诱导型自杀基因，所述一个或多个期望整合位点包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT。在一些其它实施例中，经基因组工程化的iPSC衍生细胞包含编码以下的多核苷酸：安全开关蛋白质、靶向模态、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白质和肽、药物靶点候选物或促进干细胞和/或祖细胞的贩运、归巢、活力、自我更新、持久性和/或存活率的蛋白质。在一些实施例中，包含一个或多个自杀基因的经基因组工程化的iPSC衍生细胞进一步包含一个或多个内源性基因中所包含的一种或多种插入/缺失，所述内源性基因与免疫应答调控和介导相关，包含但不限于检查点基因、内源性T细胞受体基因和MHC I类抑制基因。在一个实施例中，包含一个或多个自杀基因的经基因组工程化的iPSC衍生细胞进一步包含B2M基因中的插入/缺失，其中基因敲除B2M。
另外，用于获得到第二命运的经基因组工程化的造血细胞的第一命运的经基因组工程化的造血细胞的适用去分化方法和组合物包含例如国际公开案第WO2011/159726号中所描绘的那些方法和组合物，所述公开案的公开内容通过引用并入本文。其中提供的方法和组合物允许部分地将初始非多能细胞重编程为非多能中间细胞，这是通过在重编程期间限制内源性Nanog基因的表达；并且使所述非多能中间细胞经历用于使中间细胞分化成所期望的细胞类型的条件来进行。在一些实施例中，使用本文的方法和组合物获得的经基因组修饰的iPSC和其衍生细胞包括表2中列出的至少一种基因型。
V.具有从经基因工程化的iPSC分化的外源性功能模态的衍生免疫细胞的治疗用途
在一些实施例中，本发明提供一种组合物，其包含功能增强的衍生免疫细胞的分离群体或亚群，所述免疫细胞使用如所公开的方法和组合物由经基因组工程化的iPSC分化。在一些实施例中，iPSC包括能保留在iPSC源性免疫细胞中的一种或多种靶向基因编辑，其中经基因工程化的iPSC和其衍生细胞适于基于细胞的过继性疗法。在一个实施例中，经基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的CD34细胞。在一个实施例中，经基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的HSC细胞。在一个实施例中，经基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包括iPSC源性proT细胞或T谱系细胞。在一个实施例中，经基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包括iPSC源性proNK细胞或NK谱系细胞。在一个实施例中，经基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的免疫调控细胞或骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)。在一些实施例中，进一步离体调节iPSC衍生的经基因工程化的免疫细胞以改善治疗潜能。在一个实施例中，已衍生自iPSC的经基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包含数目或比例增加的初始T细胞、干细胞记忆T细胞和/或中枢记忆T细胞。在一个实施例中，已衍生自iPSC的经基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包含数目或比例增加的I型NKT细胞。在另一实施例中，已衍生自iPSC的经基因工程化的免疫细胞的分离群体或亚群包含数目或比例增加的适应性NK细胞。在一些实施例中，源自iPSC的经基因工程化的CD34细胞、HSC细胞、T谱系细胞、NK谱系细胞或骨髓源性抑制细胞的分离群体或亚群为同种异体的。在一些其它实施例中，源自iPSC的经基因工程化的CD34细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞或MDSC的分离群体或亚群为自体的。
在一些实施例中，用于分化的iPSC包括被选择为在效应细胞中传达所期望的治疗属性的遗传印记，条件是分化期间的细胞发育生物学不会被破坏，并且条件是遗传印记保留在源自所述iPSC的分化的效应细胞中并且在其中起作用。
在一些实施例中，多能干细胞中的遗传印记包含(i)在将非多能细胞重编程为iPSC期间或之后通过在多能细胞的基因组中进行基因组插入、缺失或取代而获得的一种或多种基因修饰模态；或(ii)对供者、疾病或治疗反应具有特异性的来源特异性免疫细胞的一种或多种可保留治疗属性，且其中多能细胞是由来源特异性免疫细胞重编程，其中iPSC保留来源治疗属性，iPSC衍生的造血谱系细胞中也包含所述来源治疗属性。
在一些实施例中，经基因修饰的模态包括以下中的一种或多种：安全开关蛋白、靶向模态、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白和肽、药物靶点候选物；或者促进iPSC或其衍生细胞的移植、贩运、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫应答调控和调节和/或存活率的蛋白质。在一些实施例中，经基因修饰的iPSC和其衍生细胞包括表2中列出的基因型。在一些其它实施例中，包括表2中列出的基因型的经基因修饰的iPSC和其衍生细胞进一步包括额外经基因修饰的模态，所述额外经基因修饰的模态包括：(1)TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5或RFXAP以及染色体6p21区中的任何基因的缺失或减少的表达的一种或多种；以及(2)HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、抗原特异性TCR、Fc受体或用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体的引入或增加的表达。
在再一些其它实施例中，造血谱系细胞包含与以下中的至少两种的组合有关的来源特异性免疫细胞的治疗属性：(i)一种或多种靶向抗原的受体表达；(ii)经修饰HLA；(iii)对肿瘤微环境的抗性；(iv)旁观者免疫细胞的募集和免疫调节；(iv)靶上特异性改善，同时肿瘤外效应降低；和(v)归巢、持久性、细胞毒性或抗原逃逸拯救改善。
在一些实施例中，包括表2中列出的基因型的iPSC衍生效应细胞，并且所述细胞表达包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18或IL21或其任何经修饰的蛋白质在内的至少一个细胞因子和/或其受体，并且表达至少一种CAR。在一些实施例中，细胞因子和CAR的工程化表达具有NK细胞特异性。在一些其它实施例中，细胞因子和CAR的工程化表达具有T细胞特异性。在一个实施例中，CAR包括MICA/B结合结构域。在一些实施例中，iPSC衍生造血效应细胞具有抗原特异性。在一些实施例中，抗原特异性衍生效应细胞靶向液体肿瘤。在一些实施例中，抗原特异性衍生效应细胞靶向实体肿瘤。在一些实施例中，抗原特异性iPSC衍生造血效应细胞能够挽救肿瘤抗原逃逸。
多种疾病可以通过向适合于过继性细胞疗法的受试者引入本发明的免疫细胞而得到改善。在一些实施例中，所提供的iPSC衍生造血细胞用于同种异体过继性细胞疗法。另外，在一些实施例中，本发明提供上述治疗性组合物的治疗用途，其通过将所述组合物引入到适合于过继性细胞疗法的受试者中进行，其中所述受试者患有自身免疫病症；恶性血液病；实体肿瘤；或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关的感染。恶性血液病的实例包含但不限于急性和慢性白血病(急性骨髓白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML))、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma；NHL)、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合症。实体癌症的实例包含但不限于脑癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、子宫癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、头癌、颈癌、胃癌、子宫颈癌、直肠癌、喉癌和食道癌。多种自身免疫病症的实例包含但不限于斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、幼年型特发性关节炎的一些形式、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves'disease)、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barrésyndrome)、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、心肌炎的一些形式、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/全身性硬化症、休格连氏综合症(
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syndrome)、全身性红斑狼疮、甲状腺炎的一些形式、葡萄膜炎的一些形式、白癜风、肉芽肿性多血管炎(韦格纳氏病(Wegener's))。病毒感染的实例包含但不限于HIV(人类免疫缺陷病毒)、HSV(单纯疱疹病毒)、KSHV(卡波西氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)相关疱疹病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus))、EBV(埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus))、CMV(巨细胞病毒)、VZV(水痘带状疱疹病毒)、腺病毒、慢病毒、BK多瘤病毒相关病症。
使用本文所公开的实施例的衍生造血谱系细胞的治疗可在症状后进行，或用于复发预防。术语“治疗(treatment/treating)”等在本文中一般用于意指获得所期望的药理学和/或生理学作用。对于疾病和/或可归因于所述疾病的不良作用，所述作用就完全或部分预防疾病来说，可以是防治性的，和/或就部分或完全治愈来说，可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对受试者的疾病的任何干预，并且包含：防止可能易患所述疾病、但尚未被诊断患有所述疾病的受试者出现所述疾病；抑制疾病，即阻止其发展；或缓解所述疾病，即，使所述疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后给予治疗剂或组合物。发展中的疾病的治疗也是备受关注的，其中治疗稳定或减少患者的非所要临床症状。在特定实施例中，需要治疗的受试者患有可以通过细胞疗法使至少一种相关症状得以含有、缓解和/或改善的疾病、病状和/或损伤。某些实施例设想了需要细胞疗法的受试者包含但不限于骨髓或干细胞移植的候选者、已接受化学疗法或照射疗法的受试者、患有过度增殖病症或癌症，例如过度增殖病症或造血系统癌症或有患所述病症的风险的受试者、患有肿瘤，例如实体瘤，或有罹患所述肿瘤的风险的受试者、患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病或有患病毒感染或与病毒感染相关的疾病的风险的受试者。
在评估对包括本文所公开的实施例的衍生造血谱系细胞的治疗的应答性时，应答可以由包括以下中的至少一种的标准来测量：临床效益率、直到死亡的存活、病理性完全应答、病理性应答的半定量测量、临床完全缓解、临床部分缓解、临床稳定疾病、无复发的存活、无转移的存活、无疾病的存活、循环肿瘤细胞减少、循环标志物和RECIST(实体瘤的应答评估准则)准则。
可以在其它治疗之前、期间和/或之后在受试者中给予包含如所公开的衍生造血谱系细胞的治疗组合物。因此，组合疗法的方法可涉及在使用额外治疗剂之前、期间和/或之后给予或制备iPSC衍生的免疫细胞。如上文所提供，一种或多种额外治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分，或免疫调节药物(IMiD)。给予iPSC衍生的免疫细胞与给予额外治疗剂可以在时间上间隔几小时、几天或甚至几周。另外地或可替代地，给予可与其它生物活性剂或模态组合，所述生物活性剂或模态例如但不限于抗肿瘤剂、非药物疗法，例如手术。
在组合细胞疗法的一些实施例中，治疗组合包含本文所提供的iPSC衍生的造血谱系细胞和额外治疗剂，所述额外治疗剂是抗体或抗体片段。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体可以是人类化抗体、人类化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施例中，抗体或抗体片段与病毒抗原特异性结合。在其它实施例中，抗体或抗体片段与肿瘤抗原特异性结合。在一些实施例中，肿瘤或病毒特异性抗原活化所给予的iPSC衍生的造血谱系细胞以增强其杀伤能力。在一些实施例中，适于作为所施用的iPSC源性造血谱系细胞的额外治疗剂的组合治疗的抗体包含但不限于CD20抗体(例如，利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌布里图昔单抗、奥卡拉珠单抗、奥比珠单抗)、HER2抗体(例如，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、CD52抗体(例如，阿仑单抗)、EGFR抗体(例如，西妥昔单抗)、GD2抗体(例如，迪努妥昔单抗)、PDL1抗体(例如，阿维鲁单抗)、CD38抗体(例如，达土木单抗、艾沙妥昔单抗、MOR202)、CD123抗体(例如，7G3、CSL362)、SLAMF7抗体(埃罗妥珠单抗)、MICA/B抗体(7C6、6F11、1C2)和其人源化或经Fc修饰的变体或片段或其功能等效物和生物仿制药。
在一些实施例中，额外治疗剂包含一种或多种检查点抑制剂。检查点是指在不受抑制时能够抑制或下调免疫应答的细胞分子，通常为细胞表面分子。检查点抑制剂是能够减少检查点基因表达或基因产物，或降低检查点分子活性的拮抗剂。适用于与如本文所提供的衍生效应细胞，包含NK细胞或T细胞的组合疗法的检查点抑制剂包含但不限于PD1(Pdcdl、CD279)、PDL-1(CD274)、TIM3(Havcr2)、TIGIT(WUCAM和Vstm3)、LAG3(Lag3、CD223)、CTLA4(Ctla4、CD152)、2B4(CD244)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、A2aR、BATE、BTLA、CD39(Entpdl)、CD47、CD73(NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2(Pou2f2)、视黄酸受体α(Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR(例如2DL1、2DL2、2DL3、3DL1和3DL2)的拮抗剂。
包含所提供的衍生效应细胞的组合疗法的一些实施例进一步包含至少一种靶向检查点分子的抑制剂。与所提供的衍生效应细胞的组合疗法的一些其它实施例包含两种、三种或更多种检查点抑制剂，使得靶向两种、三种或更多种检查点分子。在一些实施例中，用于如本文所描述的组合疗法的效应细胞为如所提供的衍生NK细胞。在一些实施例中，用于如本文所描述的组合疗法的效应细胞为衍生T细胞。在一些实施例中，如本文所提供，用于组合疗法的衍生NK细胞或T细胞在功能上得到增强。在一些实施例中，两种、三种或更多种检查点抑制剂可以在组合疗法中在给予衍生效应细胞同时、之前或之后给予。在一些实施例中，两种或更多种检查点抑制剂是同时或一次一个地(依序)给予。
在一些实施例中，抑制上述任一种检查点分子的拮抗剂是抗体。在一些实施例中，检查点抑制性抗体可以是鼠类抗体、人类抗体、人类化抗体、骆驼Ig、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、Ig NAR、嵌合抗体、重组抗体或其抗体片段。抗体片段的非限制性实例包括Fab、Fab′、F(ab)′2、F(ab)′3、Fv、单链抗原结合片段(scFv)、(scFv)2、二硫键稳定的Fv(dsFv)、微体、双体、三体、四体、单结构域抗原结合片段(sdAb，纳米体)、只有重链的重组抗体(VHH)和维持整个抗体的结合特异性的其它抗体片段，其相比于整个抗体可以更有成本效益地产生、更易于使用或更敏感。在一些实施例中，一种、或两种、或三种、或更多种检查点抑制剂包含以下中的至少一种：阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫那利珠单抗、纳武单抗、派立珠单抗和其衍生物或功能等效物。
包含衍生效应细胞和一种或多种检查抑制剂的组合疗法适用于治疗液体和实体癌症，包含但不限于皮肤T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、蕈样真菌病(Mycosisfungoide)、佩吉特样网状细胞增生症(Pagetoid reticulosis)、塞氏综合症(Sezarysyndrome)、肉芽肿性皮肤松弛、淋巴瘤样丘疹病、慢性苔癣样糠疹(Pityriasislichenoides chronica)、急性苔癣痘疹样糠疹(Pityriasis lichenoides etvarioliformis acuta)、CD30+皮肤T细胞淋巴瘤、继发性皮肤CD30+大细胞淋巴瘤、非蕈样真菌病CD30皮肤大T细胞淋巴瘤、多形性T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤(Lennert lymphoma)、皮下T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤(angiocentric lymphoma)、母细胞性NK细胞淋巴瘤(blastic NK-cell lymphoma)、B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、头颈部肿瘤、鳞状细胞癌、横纹肌肉瘤(rhabdomyocarcoma)、路易斯肺癌(Lewis lung carcinoma；LLC)、非小细胞肺癌、食管鳞状细胞癌、食道腺癌、肾细胞癌(RCC)、结肠直肠癌(CRC)、急性骨髓白血病(AML)、乳腺癌、胃癌、前列腺小细胞神经内分泌癌瘤(SCNC)、肝癌、神经胶母细胞瘤、肝癌、口腔鳞状细胞癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、肝内胆管细胞癌、肝细胞癌瘤、骨癌、癌转移和鼻咽癌。
在一些实施例中，除如本文所提供的衍生效应细胞以外，用于治疗用途的组合包含一种或多种额外治疗剂，其包含化学治疗剂或放射性部分。化学治疗剂是指细胞毒性抗肿瘤剂，即优先杀死赘生性细胞或中断快速增殖细胞的细胞循环，或发现其根除癌症干细胞并且在治疗上用于防止或减少赘生性细胞生长的化学试剂。化学治疗剂有时也被称作抗瘤形成或细胞毒性药物或药剂，并且为所属领域中熟知的。
在一些实施例中，化学治疗剂包含蒽环霉素(anthracycline)、烷基化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥(nitrogen mustard)、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、含铂剂、干扰素和白介素。示例性化学治疗剂包含但不限于烷基化剂(环磷酰胺、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、马法兰(mephalin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、六甲基三聚氰胺(heamethylmelamine)、噻替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine))、抗代谢物(甲氨蝶呤(methotrexate)、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷(cytarabine)、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀(pentostatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine))、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(依托泊苷(etoposide)、依托泊苷邻苯醌(etoposide orthoquinone)和替尼泊苷(teniposide))、抗生素(道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、双蒽(bisanthrene)、放线菌素D、普卡霉素(plicamycin)、嘌呤霉素(puromycin)和短杆菌肽D(gramicidineD))、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、秋水仙碱(colchicine)、细胞松弛素B(cytochalasinB)、吐根素(emetine)、美登素(maytansine)和安吖啶(amsacrine)。额外药剂包括氨苯乙哌啶酮(gminoglutethimide)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、丝裂霉素、六甲蜜胺(altretamine)、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BCNU)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、阿仑单抗、六甲蜜胺、阿那曲唑(anastrozole)、L-天冬酰胺酶、阿扎胞苷(azacitidine)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝瑟罗汀(bexarotene)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、白消安、二甲睾酮calusterone)、卡培他滨(capecitabine)、塞内昔布(celecoxib)、西妥昔单抗、克拉屈滨(cladribine)、氯呋拉滨(clofurabine)、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、地尼白介素(denileukin diftitox)、己烯雌酚(diethlstilbestrol)、多西他赛(docetaxel)、甲雄烷醇酮(dromostanolone)、表柔比星(epirubicin)、埃罗替尼(erlotinib)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷、乙炔基雌二醇、依西美坦(exemestane)、氟尿苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、戈舍瑞林(goserelin)、羟基脲、替伊莫单抗、艾达霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素α(2a、2b)、伊立替康、来曲唑(letrozole)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、亮丙立德(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、氮芥(meclorethamine)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalin)、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧呋豆素(methoxsalen)、丝裂霉素C、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、诺龙(nandrolone)、诺非单抗(nofetumomab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、帕米膦酸盐(pamidronate)、培美曲塞(pemetrexed)、培加酶(pegademase)、培门冬酶(pegasparagase)、喷司他汀、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、聚苯丙生(polifeprosan)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、奎纳克林(quinacrine)、利妥昔单抗、沙格司亭(sargramostim)、链脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睾内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康(topetecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗、维甲酸(tretinoin)、尿嘧啶芥(uracil mustard)、伐柔比星(valrubicin)、长春瑞宾(vinorelbine)和唑来膦酸盐(zoledronate)。其它合适药剂是批准用于人类用途的那些药剂，包括将批准作为化学治疗剂或放射治疗剂并且所属领域中已知的那些药剂。这类药剂可以通过多个标准医师和肿瘤学家的参考文献(例如《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics)》,第九版,纽约南达科他希尔城(McGraw-Hill,N.Y.),1995)中的任一种或由国家癌症研究所网站(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)引用，两者都会不时更新。
例如沙立度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide)的免疫调节药物(IMiD)刺激NK细胞和T细胞两者。如本文所提供，IMiD可与iPSC衍生的治疗性免疫细胞一起使用以供癌症治疗。
除治疗性组合物中包含的iPSC源性造血谱系细胞的分离的群体外，适于向患者施用的组合物可以进一步包含一种或多种医药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如，药物学上可接受的培养基，例如细胞培养基)或其它药物学上可接受的组分。药学上可接受的载剂和/或稀释剂部分地由所给予的特定组合物以及用于给予治疗组合物的特定方法决定。因此，存在本发明的治疗性组合物的多种合适的调配物(参见例如《雷明顿氏医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》第17版,1985，其公开内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施例中，治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生的T细胞。在一个实施例中，治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生的NK细胞。在一个实施例中，治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生的CD34+HE细胞。在一个实施例中，治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生的HSC。在一个实施例中，治疗组合物包含利用本文所公开的方法和组合物制造的多能细胞衍生的MDSC。可以通过静脉内、腹膜内、经肠或气管给药方法分开给予或与其它合适的化合物组合给予包含如本文所公开的iPSC衍生的造血谱系细胞的群体的治疗组合物，以实现所期望的治疗目标。
这些药学上可接受的载剂和/或稀释剂可以足以使治疗组合物的pH维持在约3与约10之间的量存在。因此，基于总组合物的重量比(weight to weight)，缓冲剂可以高达约5％。治疗组合物中还可以包括电解质，例如(但不限于)氯化钠和氯化钾。在一个方面中，治疗组合物的pH在约4到约10的范围内。替代地，治疗组合物的pH在约5到约9、约6到约9或约6.5到约8的范围内。在另一实施例中，治疗组合物包括pH在所述pH范围中的一种的缓冲液。在另一实施例中，治疗组合物的pH为约7。替代地，治疗组合物的pH在约6.8到约7.4的范围内。在仍另一实施例中，治疗组合物的pH为约7.4。
本发明还部分地提供药学上可接受的细胞培养基在本发明的特定组合物和/或培养物中的用途。这类组合物适合于向人类受试者给予。一般来说，支持根据本发明的实施例的iPSC衍生的免疫细胞的维持、生长和/或健康的任何培养基适用作药学细胞培养基。在特定实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清和/或无饲养层的培养基。在各种实施例中，无血清培养基是无动物成分(animal-free)的，且可任选为无蛋白质的。任选地，所述培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白。无动物成分培养基是指其中所述组分衍生自非动物来源的培养基。重组蛋白置换无动物成分培养基中的天然动物蛋白，且营养物是从合成、植物或微生物来源获得。相比之下，无蛋白质培养基定义为大体上不含蛋白质。所属领域的普通技术人员将了解，上述培养基实例为说明性的并且决不限制适用于本发明的培养基调配物，并且存在所属领域的技术人员已知且可使用的许多合适培养基。
分离的多能干细胞衍生的造血谱系细胞可具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、调控巨噬细胞、调控树突状细胞或间充质基质细胞。在一些实施例中，分离的多能干细胞衍生的造血谱系细胞具有约95％到约100％的T细胞、NK细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)。在一些实施例中，本发明提供具有纯化的T细胞或NK细胞的治疗组合物，例如具有约95％的T细胞、NK细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞或骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)的分离群体的组合物，以治疗需要细胞疗法的受试者。
在一个实施例中，组合细胞疗法包括治疗蛋白或肽和源自包括表2中列出的基因型的经基因组工程化的iPSC的NK细胞的群体，其中衍生NK细胞包括具有所提供的胞内结构域的CAR。在另一实施例中，组合细胞疗法包括抗原特异性治疗蛋白或肽和源自包括表2中列出的基因型的经基因组工程化的iPSC的T细胞的群体，其中衍生T细胞包括无效的CD38和具有所提供的胞内结构域的CAR。在一些实施例中，组合细胞疗法包括达雷妥尤单抗、伊妥昔单抗或MOR202，以及源自包括表2中列出的基因型的经基因组工程化的iPSC的NK或T细胞的群体，其中衍生NK或T细胞包括具有所提供的胞内结构域、无效的CD38和hnCD16的CAR。在又一些其它实施例中，组合细胞疗法包括达土木单抗和源自包括表2中列出的基因型的经基因组工程化的iPSC的NK或T细胞的群体，其中衍生NK或T细胞包括具有所提供的胞内结构域、无效的CD38和hnCD16的第一CAR和第二CAR，其中所述第一CAR和/或所述第二CAR靶向以下中的至少一种：CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1，并且其中所述第一CAR和所述第二CAR靶向不同的抗原。在仍一些其它实施例中，组合细胞疗法包括达土木单抗、艾沙妥昔单抗或MOR202和源自包括表2中列出的基因型的经基因组工程化的iPSC的NK或T细胞的群体，其中衍生NK或T细胞包括第一CAR、第二CAR以及一种或多种外源性细胞因子，所述第一CAR具有所提供的胞内结构域、无效的CD38和hnCD16。在又另一个实施例中，组合细胞疗法包括治疗蛋白或肽和源自包括表2中列出的基因型的经基因组工程化的iPSC的NK细胞的群体，其中衍生NK细胞包括具有所提供的胞内结构域、无效的CD38、hnCD16的第一CAR、第二CAR、一种或多种外源性细胞因子和具有HLA-G过表达或具有CD58敲除和CD54敲除中的至少一种的B2M-/-CIITA-/-。
如所属领域的普通技术人员将理解，基于本文中的方法和组合物的衍生自iPSC的自体和同种异体造血谱系细胞两者均可用于如上文所描述的细胞疗法中。对于自体移植，衍生的造血谱系细胞的分离群体相对于患者是完全或部分HLA匹配的。在另一个实施例中，衍生造血谱系细胞与受试者不是HLA匹配的，其中衍生造血谱系细胞是HLA-I和HLA-II无效的NK细胞或T细胞。
在一些实施例中，治疗组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是每剂量至少0.1×105个细胞、至少1×105个细胞、至少5×105个细胞、至少1×106个细胞、至少5×106个细胞、至少1×107个细胞、至少5×107个细胞、至少1×108个细胞、至少5×108个细胞、至少1×109个细胞或至少5×109个细胞。在一些实施例中，治疗组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是每剂量约0.1×105个细胞到约1×106个细胞；每剂量约0.5×106个细胞到约1×107个细胞；每剂量约0.5×107个细胞到约1×108个细胞；每剂量约0.5×108个细胞到约1×109个细胞；每剂量约1×109个细胞到约5×109个细胞；每剂量约0.5×109个细胞到约8×109个细胞；每剂量约3×109个细胞到约3×1010个细胞，或其间的任何范围。一般来说，对于60kg患者，1×108个细胞/剂量转化为1.67×106个细胞/kg。
在一个实施例中，治疗组合物中的衍生造血谱系细胞的数目是部分或单一脐带血中的免疫细胞数目，或为至少0.1×105个细胞/kg体重、至少0.5×105个细胞/kg体重、至少1×105个细胞/kg体重、至少5×105个细胞/kg体重、至少10×105个细胞/kg体重、至少0.75×106个细胞/kg体重、至少1.25×106个细胞/kg体重、至少1.5×106个细胞/kg体重、至少1.75×106个细胞/kg体重、至少2×106个细胞/kg体重、至少2.5×106个细胞/kg体重、至少3×106个细胞/kg体重、至少4×106个细胞/kg体重、至少5×106个细胞/kg体重、至少10×106个细胞/kg体重、至少15×106个细胞/kg体重、至少20×106个细胞/kg体重、至少25×106个细胞/kg体重、至少30×106个细胞/kg体重、1×108个细胞/kg体重、5×108个细胞/kg体重或1×109个细胞/kg体重。
在一个实施例中，向受试者递送一定剂量的衍生造血谱系细胞。在一个说明性实施例中，向受试者提供的细胞的有效量为至少2×106个细胞/kg、至少3×106个细胞/kg、至少4×106个细胞/kg、至少5×106个细胞/kg、至少6×106个细胞/kg、至少7×106个细胞/kg、至少8×106个细胞/kg、至少9×106个细胞/kg或至少10×106个细胞/kg或更多个细胞/kg，包含细胞的所有干预剂量。
在另一说明性实施例中，向受试者提供的细胞的有效量为约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6×106个细胞/kg、约7×106个细胞/kg、约8×106个细胞/kg、约9×106个细胞/kg或约10×106个细胞/kg或更多个细胞/kg，包含细胞的所有干预剂量。
在另一说明性实施例中，向受试者提供的细胞的有效量为2×106个细胞/kg到约10×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg到约10×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg到约10×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg到约10×106个细胞/kg、2×106个细胞/kg到约6×106个细胞/kg、2×106个细胞/kg到约7×106个细胞/kg、2×106个细胞/kg到约8×106个细胞/kg、3×106个细胞/kg到约6×106个细胞/kg、3×106个细胞/kg到约7×106个细胞/kg、3×106个细胞/kg到约8×106个细胞/kg、4×106个细胞/kg到约6×106个细胞/kg、4×106个细胞/kg到约7×106个细胞/kg、4×106个细胞/kg到约8×106个细胞/kg、5×106个细胞/kg到约6×106个细胞/kg、5×106个细胞/kg到约7×106个细胞/kg、5×106个细胞/kg到约8×106个细胞/kg、或6×106个细胞/kg到约8×106个细胞/kg，包含细胞的所有干预剂量。
在一些实施例中，衍生的造血谱系细胞的治疗用途是单剂量治疗。在一些实施例中，衍生的造血谱系细胞的治疗用途是多剂量治疗。在一些实施例中，多剂量治疗是每天、每3天、每7天、每10天、每15天、每20天、每25天、每30天、每35天、每40天、每45天或每50天或其间的任何天数一次剂量。
包含本发明的衍生造血谱系细胞群体的组合物可以是无菌的，且可以适合于和准备好向人类患者给予(即，可以在不进行任何进一步处理的情况下给予)。准备好给予的基于细胞的组合物意指所述组合物在移植或给予给受试者之前不需要任何进一步处理或操纵。在其它实施例中，本发明提供在与一种或多种药剂一起给予之前扩增和/或调节的衍生造血谱系细胞的分离群体。对于经基因工程化以表达重组TCR或CAR的衍生造血谱系细胞，可使用如例如美国专利6,352,694中所描述的方法活化和扩增细胞。
在某些实施例中，可以利用不同方案向衍生的造血谱系细胞提供初级刺激信号和共刺激信号。举例来说，提供每种信号的试剂可以处于溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，所述试剂可与相同表面(即，“顺式”形式)或个别表面(即，“反式”形式)偶联。替代地，一种试剂可以与表面偶联并且另一种试剂处于溶液中。在一个实施例中，提供共刺激信号的试剂可以结合到细胞表面并且提供初级活化信号的试剂处于溶液中或与表面偶联。在某些实施例中，两种试剂都可以在溶液中。在另一实施例中，试剂可呈可溶形式，并且然后交联到表面，例如表达Fc受体的细胞或抗体或其它结合剂，其将结合于例如美国专利申请公开案第20040101519号和第20060034810号中所公开的试剂以用于人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞预期在本发明的实施例中用于活化和扩增T淋巴细胞。
视所治疗的受试者的病状而定，将必然会出现剂量、频率和方案的一些变化。负责给药的人员将在任何情况下确定个别受试者的适当剂量、频率和方案。
实例
以下实例是以说明性方式而不是以限制性方式提供。
实例1-材料和方法
为了在与不同安全港基因座整合策略组合的各种启动子的控制下有效选择和测试自杀系统，使用本申请人的一种专有hiPSC平台，其能够实现单细胞传代和高通量的基于96孔板的流式细胞测量术分选，以允许衍生具有单一或多种基因调节的克隆hiPSC。
hiPSC在小分子培养物中的维持：一旦培养的融合度达到75％-90％，hiPSC就作为单一细胞常规地传代。对于单一细胞解离，hiPSC用PBS(Mediatech)洗涤一次且在37℃用阿库酶(Accutase)(密理博(Millipore))处理3到5分钟(min)，随后移液以确保单一细胞解离。然后将单一细胞悬浮液与常规培养基等体积混合，在225×g下离心4分钟，再悬浮于FMM中且接种于经Matrigel涂布的表面上。传代数典型为1:6-1:8，在37℃下转移预先涂布有Matrigel的组织培养板持续2-4小时且每2-3天用FMM饲养。将细胞培养物在设定为37℃和5％CO2的含湿气培育箱中维持。
用ZFN、CRISPR进行人类iPSC工程化以靶向编辑所关注模态：使用ROSA26靶向插入作为一实例，对于ZFN介导的基因组编辑，用2.5μg ZFN-L(FTV893)、2.5μg ZFN-R(FTV894)和5μg供体构建体的混合物转染两百万个iPSC，以进行AAVS1靶向插入。对于CRISPR介导的基因组编辑，用5μg ROSA26-gRNA/Cas9(FTV922)和5μg供体构建体的混合物转染两百万个iPSC，以进行ROSA26靶向插入。使用Neon转染系统(生命技术公司(Life Technologies))，使用参数1500V、10毫秒、3个脉冲进行转染。在转染后第2天或第3天，如果质粒含有人工启动子驱动GFP和/或RFP表达盒，那么使用流式细胞测量术测量转染效率。在转染后第4天，将嘌呤霉素以开始7天0.1μg/ml和随后7天0.2μg/ml的浓度添加到培养基中以选择靶向细胞。在嘌呤霉素选择期间，在第10天将细胞传代到新鲜Matrigel涂布的孔上。在嘌呤霉素选择的第16天或更晚，通过流式细胞测量术分析存活细胞的GFP+iPS细胞百分比。
基因组编辑的iPSC的批量分选和克隆分选：在嘌呤霉素选择20天后，对使用ZFN或CRISPR-Cas9进行基因组靶向编辑的iPSC进行GFP+SSEA4+TRA181+iPSC的批量分选和克隆分选。将单一细胞解离的靶向iPSC池再悬浮于冷却的染色缓冲液中，所述缓冲液含有汉克氏平衡盐溶液(Hanks'Balanced Salt Solution)(MediaTech)、4％胎牛血清(Invitrogen)、1×青霉素/链霉素(Mediatech)和10mM Hepes(Mediatech)；新鲜制备以达到最优效能。将所结合的一级抗体，包括SSEA4-PE、TRA181-Alexa Fluor-647(BDBiosciences)添加到细胞溶液中，并且在冰上培育15分钟。所有抗体均以每百万细胞7μL/100μL染色缓冲液使用。将所述溶液在染色缓冲液中洗涤一次，在225g下离心4分钟并且再悬浮于含有10μM噻唑维(Thiazovivn)的染色缓冲液中且在冰上维持以用于流式细胞测量术分选。在FACS Aria II(BD Biosciences)上进行流式细胞测量术分选。对于批量分选，将GFP+SSEA4+TRA181+细胞门控且分选到填充有7ml FMM的15ml标准管中。对于克隆分选，使用100μM喷嘴，以每孔3个事件的浓度，将分选出的细胞直接喷射到96孔板中。每个孔预填充有200μL FMM，所述FMM补充有5μg/mL纤维结合蛋白和1×青霉素/链霉素(Mediatech)且预先用5×Matrigel涂布过夜。5×Matrigel预涂布包括将一个Matrigel等分试样添加到5mLDMEM/F12中，然后在4℃下培育过夜以允许适当再悬浮并且最终以每孔50μL添加到96孔板中，随后在37℃下培育过夜。在将培养基添加到各孔之前立即抽吸5×Matrigel。在完成分选后，在培育之前，将96孔板在225g下离心1-2分钟。将各板保持不受干扰七天。在第七天，从每个孔中去除150μL培养基并且用100μL FMM置换。在分选后第10天，向孔中再馈送另外100μL FMM。早在第2天就检测出群落形成且大部分群落在分选后第7天到第10天之间扩增。在第一次传代中，各孔用PBS洗涤且在37℃下用30μL阿库酶解离大约10分钟。需要延长阿库酶处理反映了已在培养物中闲置较长时间的群落的紧密性。在发现细胞解离之后，将200μLFMM添加到每个孔中且移液若干次以使群落破碎。将解离的菌落转移到预先涂布有5×Matrigel的96孔板的另一孔，并且然后在培育之前在225g下离心2分钟。在扩增之前，进行这种1:1传代以扩展早期群落。后续传代常规地用阿库酶处理3-5分钟且在达到75-90％融合度后按1:4-1:8扩增到FMM中的预先涂布有1×Matrigel的较大孔中。分析每种克隆细胞系的GFP荧光水平和TRA1-81表达量。选择具有接近100％GFP+和TRA1-81+的克隆系以供另外的PCR筛选和分析。在Guava EasyCyte 8HT(密理博)上进行流式细胞测量术分析并且使用Flowjo(FlowJo,LLC)进行分析。
实例2-CAR候选物的功能分析以及表达包括新型胞内结构域的CAR的衍生NK或T细胞
为了筛选功能性嵌合抗原受体(CAR)，将具有相同抗原特异性但在其胞内结构域和/或跨膜结构域方面有所不同的一组候选CAR(CARneo)各自在原代NK和T细胞中表达以检查细胞特异性表面表达谱。如图2A-C所示，这29个构建体具有相同的scFv和CD8铰链区，并且仅在包括胞内结构域的信号传导组分方面有所不同。通过将靶向同一特定抗原的这29个不同CAR构建体的表达谱进行比较，执行此测定以确定哪些构建体，并且更具体地，哪些胞内结构域组分在细胞表面赋予高效且可检测的CAR表达。在一个实例中，所有候选CAR都被构建为MICA/B特异性的。类似地，功能筛选也可以利用例如CD19 scFV的CAR特异性。用携带相应CAR构建体的慢病毒转导衍生NK谱系细胞。图2A-C中的每个CAR构建体在C末端处含有Thy1.1标志物，所述标志物通过P2A肽与构建体隔开(未示出)。在转导后约10天，通过FACS测定经转导的细胞的CAR和Thy1.1表达。基于Thy1.1表达对经成功转导的细胞进行分选，而用对CAR的scFv区具有特异性的抗体执行CAR染色。如图3A-I所示，结果表明在测定时清晰但变化的CAR表达模态，签字某些跨膜区(即CD28、CD8)似乎赋予了增强的CAR表达。然而，构建体3和23在可以归于构建体的细胞阶段和/或生物学时在细胞表面无法检测到。
为了显示由CAR候选物介导的抗原特异性杀伤，将MICA/B-CARneo NK或T细胞与表达MICA/B或MICA/B无效或低的肿瘤细胞一起共培养。使用表达MICA/B-CD28-CD3z1XX CAR的T细胞和表达MICA/B-NKG2D-2B4-CD3z CAR的NK细胞以及不具有CAR的T细胞和NK细胞作为阳性对照和阴性对照。然后将表现出特异性杀伤能力的每个MICA/B-CARneo转导为iPSC。检查所有CARneo-iPSC系的CAR表达、核型异常和基因组稳定性。在iPSC中表达或不表达的情况下，根据本文所述的方法对每种CARneo-iPSC系执行T细胞分化和NK细胞分化两者。第10天、第20天的中间细胞和分化期间其它时间点的细胞都被表征为标志物表达谱和细胞生长。还评估了关键时间点和分化过程结束时的细胞扩增。
为了确定表达MICA/B-CARneo候选物的衍生NK和T细胞的功能谱，检查通过MICA/B-CARneo进行的细胞表面MICA/B的稳定化。
使用含有表达MICA/B-CARneo(MICA/B-CARneo iNK)的iPSC源性NK细胞和表达MICA/B的肿瘤细胞系细胞(靶细胞)的共培养系统。还使用此共培养系统测试了MICA/B-CARneoiNK激活和功能的随后增强。使用ELISA，针对释放到培养物上清液中的可溶性MICA/B的水平检查MICA/B阳性肿瘤与MICA/B-CARneo iNK的共培养。释放到培养物上清液中的可溶性MICA/B在靶细胞与MICA/B-CARneo iNK一起共培养时相比于与未经修饰的NK细胞的共培养的减少支持肿瘤细胞表面MICA/B稳定化的发现。这项测试的阳性对照使用靶细胞与mAb7C6的共培养。
在相同的共培养条件下，通过细胞因子IFNγ和TNFα的产生、通过评估表面CD107a的脱粒以及使用基于胱天蛋白酶的流式测定对靶细胞系的直接杀伤来检查MICA/B-CARneoiNK细胞激活。与MICA/B阴性靶点共培养时未观察到的活性差异相比，响应于MICA/B阳性靶细胞，细胞因子和脱粒的增加的水平以及由MICA/B-CARneo iNK细胞相对于未经修饰的NK细胞的直接杀伤的增加证明了在存在MICA/B细胞表面抗原的情况下MICA/B-CARneo iNK细胞的激活。
为了检查MICA/B-CARneo表达是否增加靶细胞系上的MICA/B的表面密度，使MICA/B-CARneo在不能杀伤靶细胞的非NK细胞系中表达，并且将所得细胞与MICA/B阳性靶点共培养。共温育后，通过流式细胞术评估靶细胞上的MICA/B的水平。与和未经修饰的NK细胞的共培养相比，在与表达MICA/B-CARneo的非NK细胞共培养后，靶细胞上的MICA/B的增加的水平证明了所提供的MICA/B-CARneo对靶细胞系上的MICA/B的表面密度具有积极影响。
通过对源自MICA/B阳性靶细胞与MICA/B-CARneo iNK细胞的体外共培养或来源于源自体内实验、球状体、类器官或3D共培养实验的组织样品的样品NK细胞进行单细胞RNA测序来测试与响应于表面MICA/B的增加的水平而与NK细胞活性相关的基因表达的增加的水平。在源自所述共培养或组织的样品中，穿孔素、颗粒酶A和B的上调以及如CD62L等不成熟标志物的下调证明了与细胞的MICA/B-CARneo表达相关的NK细胞活性的增加。
使用表达人MICA的小鼠黑色素瘤细胞作为肿瘤细胞靶标或使用表达内源性MICA/B的人细胞系评估MICA/B-CARneo的体内功能。对于体内评估，将小鼠或人T细胞用MICA/B-CARneo进行转导，并且除了MICA/B-CARneo iPSC源性NK细胞(MICA/B-CARneo iNK)之外，还用作效应子。
评估小鼠黑色素瘤模型中的MICA/B-CARneo的功效。将小鼠黑色素瘤细胞系B16F10用人MICA(B16F10-MICA)进行转导，并且将这些细胞静脉内(IV)或皮下(SC)移植到免疫活性C57BL/6或免疫受损的NSG小鼠中。静脉内注射B16F10-MICA肿瘤细胞在C57BL/6中产生肺转移并且在NSG小鼠中产生肺和肝转移，并且皮下移植在两种小鼠品系中产生单一实体瘤。在C57BL/6小鼠中，在B16F10-MICA细胞的IV移植后对肺肿瘤结节(转移)进行计数。肿瘤移植后执行MICA/B-CARneo-T细胞的过继性转移以评估这些细胞减少在这些动物体内发展的肿瘤结节的数量的能力。通过总体形态学和组织切片的显微镜检查进一步了评估肿瘤结节。在皮下B16-F10-MICA模型中，通过肿瘤大小的卡尺测量监测肿瘤进展。相比于用模拟经转导的T细胞进行的小鼠治疗，肺中的肿瘤结节数量和/或大小减少反映了使用小鼠MICA/B-CARneo-T细胞对IV移植有B16F10-MICA细胞的C57BL/6小鼠进行治疗的有效性减少了存在的肿瘤结节的数量。类似地，在B16-F10-MICA肿瘤生长的SC模型中，延迟肿瘤进展、延长存活、诱导肿瘤消退或以上的组合也表面MICA/B-CARneo-T细胞治疗的有效性。
在NSG小鼠体内，对肺和肝肿瘤结节进行计数，并且针对减少每个器官中结节的数量的能力将用模拟经转导的T细胞治疗的小鼠与经MICA/Bneo-CAR转导的T细胞进行比较。评估小鼠和人MICA/B-CARneo T细胞两者在NSG小鼠体内控制肿瘤生长的能力。IV移植有来自人或小鼠来源的MICA/B CARneo-T细胞的NSG小鼠的肺和肝中的肿瘤结节的数量和大小的减少反映了治疗的有效性，并且与小鼠的存活延长相关。使用具有MICA/B-CARneo iNK细胞的携带B16-F10-MICA肿瘤的NSG小鼠执行类似测试。
还评估了MICA/B-CARneo针对人肿瘤细胞系的功能。将表达MICA和/或MICB的人细胞系，包含A2058、U266和A375，移植到免疫受损的NSG小鼠体内。使用人MICA/B-CARneo-T细胞或MICA/B-CARneo-iNK细胞，评估携带任何这些肿瘤类型的NSG小鼠的治疗中的延迟的肿瘤进展、诱导的肿瘤消退和延长的存活。
可以使用除了本文作为说明描述的抗原特异性的任何其它抗原特异性确认功能性CARneo候选物。
另外，端粒缩短随着细胞老化而出现，并且与干细胞功能障碍和细胞衰老相关。在此示出，成熟iNK细胞含有相较于成人外周血NK细胞更长的端粒。在针对G0/1细胞的DNA指数进行校正的情况下，使用1301T细胞白血病系作为对照(100％)，通过流式细胞测量术测定iPSC、成人外周血NK细胞和iPSC衍生的NK细胞的端粒长度。如图4中所示，iPSC源性NK细胞维持相较于成人外周血NK细胞(p＝.105，ANOVA)显著更长的端粒长度，这表示iPSC源性NK细胞中增殖、存活和持久性的潜能更大。
所属领域的技术人员将容易地了解，本文所描述的方法、组合物和产物代表示例性实施例，且不意欲为对本发明的范围的限制。所属领域的技术人员显而易见的是，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对本文所公开的本公开进行各种取代和修改。
本说明书中提及的所有专利和公开案均指示本公开涉及的所属领域的技术人员的水平。所有专利和公开案均以引用的方式并入本文中，其程度如同每一个别公开案专门地且单独地指示为以引用的方式并入。
本文说明性描述的本公开可以在不存在本文未专门公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，举例来说，在本文中的每一种情况下，任一个术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”可以用其它两个术语中的任一个置换。已采用的术语和表述是作为描述而非限制的术语使用，且使用这类术语和表述时，不希望排除所示和所描述的特征的任何等效物或其部分，但应认识到，在所要求的本公开的范围内可以存在各种修改。因此，应理解，虽然已通过优选实施例和任选的特征具体地公开了本公开，但所属领域的技术人员可以对本文中所公开的概念进行修饰和变化，且这类修饰和变化被视为属于如所附权利要求书限定的本发明范围内。
序列表
<110> 菲特治疗公司
<120> 用于免疫效应细胞工程化的增强的嵌合抗原受体和其用途
<130> 056932-521001WO
<160> 74
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 2B4跨膜序列
<400> 1
Phe Leu Val Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Phe Leu Gly Thr Leu
1 5 10 15
Ala Cys Phe Cys Val
20
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 4-1BB跨膜序列
<400> 2
Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val
20 25
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> CD16跨膜序列
<400> 3
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp
20 25 30
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> CD2跨膜序列
<400> 4
Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met Val
1 5 10 15
Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln Arg
20 25 30
Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val Ala
35 40 45
Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr Pro
50 55 60
Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His Arg
65 70 75 80
Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val Gln
85 90 95
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
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<223> CD28跨膜序列
<400> 5
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> CD28H跨膜序列
<400> 6
Phe Leu Phe Val Leu Leu Gly Val Gly Ser Met Gly Val Ala Ala Ile
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Val Trp Gly Ala Trp
20
<210> 7
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> CD3ζ跨膜序列
<400> 7
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
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Thr Ala Leu Phe Leu
20
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> DAP10跨膜序列
<400> 8
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
1 5 10 15
Val Gly Ala Val Phe
20
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<223> 合成多肽
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<221> misc_feature
<223> DAP12跨膜序列
<400> 9
Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu
1 5 10 15
Ile Ala Leu Ala Val
20
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
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<223> DNAM1跨膜序列
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Gly Gly Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr Ile
1 5 10 15
Ile Val Ile Phe Leu
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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<223> 合成多肽
<220>
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<223> FcERIγ跨膜序列
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Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr
1 5 10 15
Leu Leu Tyr Cys
20
<210> 12
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL-21R跨膜序列
<400> 12
Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe
1 5 10 15
Ile Pro Ala Phe Trp
20
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL-2RB（IL-15RB）跨膜序列
<400> 13
Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL-2RG跨膜序列
<400> 14
Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
1 5 10 15
Val Tyr Phe Trp Leu
20
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL-7R跨膜序列
<400> 15
Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp
20 25
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> KR2DS2跨膜序列
<400> 16
Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Lys Ile Pro Phe Thr Ile Leu Leu
1 5 10 15
Phe Phe Leu Leu
20
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> NKGD2跨膜序列
<400> 17
Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe
1 5 10 15
Ile Ile Met Val Ala
20
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> NKp30跨膜序列
<400> 18
Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu Arg Ala Gly Phe Tyr Ala Val Ser Phe
1 5 10 15
Leu Ser Val Ala Val
20
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
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<223> Nkp44跨膜序列
<400> 19
Leu Val Pro Val Phe Cys Gly Leu Leu Val Ala Lys Ser Leu Val Leu
1 5 10 15
Ser Ala Leu Leu Val
20
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> NKp46跨膜序列
<400> 20
Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe Leu Val Glu
1 5 10 15
Asp Trp Leu Ser
20
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 2B4细胞质序列
<400> 21
Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu
1 5 10 15
Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn
20 25 30
His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser
35 40 45
Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr
50 55 60
Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys
65 70 75 80
Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly
85 90 95
Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu
100 105 110
Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
115 120
<210> 22
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 4-1BB细胞质序列
<400> 22
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 23
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> CD16细胞质序列
<400> 23
Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
1 5 10 15
<210> 24
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> CD2细胞质序列
<400> 24
His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val His
1 5 10 15
Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys Pro
20 25 30
Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn
35 40 45
<210> 25
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> CD28细胞质序列
<400> 25
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 26
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> CD28H细胞质序列
<400> 26
Phe Trp Gly Arg Arg Ser Cys Gln Gln Arg Asp Ser Gly Asn Ser Pro
1 5 10 15
Gly Asn Ala Phe Tyr Ser Asn Val Leu Tyr Arg Pro Arg Gly Ala Pro
20 25 30
Lys Lys Ser Glu Asp Cys Ser Gly Glu Gly Lys Asp Gln Arg Gly Gln
35 40 45
Ser Ile Tyr Ser Thr Ser Phe Pro Gln Pro Ala Pro Arg Gln Pro His
50 55 60
Leu Ala Ser Arg Pro Cys Pro Ser Pro Arg Pro Cys Pro Ser Pro Arg
65 70 75 80
Pro Gly His Pro Val Ser Met Val Arg Val Ser Pro Arg Pro Ser Pro
85 90 95
Thr Gln Gln Pro Arg Pro Lys Gly Phe Pro Lys Val Gly Glu Glu
100 105 110
<210> 27
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> CD3ζ细胞质序列
<400> 27
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 28
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> DAP10细胞质序列
<400> 28
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 29
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> DAP12细胞质序列
<400> 29
Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala
1 5 10 15
Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu
20 25 30
Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg
35 40 45
Pro Tyr Tyr Lys
50
<210> 30
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> DNAM1细胞质序列
<400> 30
Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr Glu Ser Trp
1 5 10 15
Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile Ser Thr Ser
20 25 30
Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp Ile Tyr Val
35 40 45
Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val
50 55 60
<210> 31
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> FcERIγ细胞质序列
<400> 31
Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys
1 5 10 15
Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr
20 25 30
Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
35 40
<210> 32
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL-21R细胞质序列
<400> 32
Ser Leu Lys Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala
1 5 10 15
Val Pro Ser Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser
20 25 30
Gly Asp Phe Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu
35 40 45
Glu Leu Gly Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr
50 55 60
Ser Cys His Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu
65 70 75 80
Leu Gln Glu Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro
85 90 95
Ser Phe Trp Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu
100 105 110
Glu Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val
115 120 125
Leu Asp Ala Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp
130 135 140
Gly Tyr Pro Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly
145 150 155 160
Leu Glu Asp Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly
165 170 175
Cys Val Ser Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu
180 185 190
Leu Asp Arg Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly
195 200 205
Gly Leu Pro Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu
210 215 220
Ala Gly Ser Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly
225 230 235 240
Phe Val Gly Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser
245 250 255
Pro Gly Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val
260 265 270
Ile Pro Pro Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser
275 280 285
<210> 33
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL-2RB（IL-15RB）细胞质序列
<400> 33
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn
85 90 95
Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala
100 105 110
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp
115 120 125
Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp
145 150 155 160
Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro
165 170 175
Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro
180 185 190
Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly
195 200 205
Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro
210 215 220
Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro
225 230 235 240
Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu
245 250 255
Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
260 265 270
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
275 280 285
<210> 34
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL-2RG细胞质序列
<400> 34
Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu
1 5 10 15
Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys
20 25 30
Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu
35 40 45
Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly
50 55 60
Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr
65 70 75 80
Thr Leu Lys Pro Glu Thr
85
<210> 35
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL-7R细胞质序列
<400> 35
Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys
1 5 10 15
Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val
20 25 30
Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp
35 40 45
Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe
50 55 60
Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val
65 70 75 80
Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser
85 90 95
Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala
100 105 110
Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu
115 120 125
Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu
130 135 140
Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser
165 170 175
Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr
180 185 190
Gln Asn Gln
195
<210> 36
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> KIR2DS2细胞质序列
<400> 36
His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu
1 5 10 15
Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val Asn Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp
20 25 30
His Gln Glu Val Ser Tyr Ala
35
<210> 37
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> NKG2D细胞质序列
<400> 37
Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln
1 5 10 15
Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile
20 25 30
Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp
35 40 45
Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys
50 55 60
Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr
65 70 75 80
His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp
85 90 95
Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met
100 105 110
Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile
115 120 125
Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
130 135 140
<210> 38
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> NKp30细胞质序列
<400> 38
Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Gln Gly Lys Cys Leu Thr Trp Lys Gly Pro
1 5 10 15
Arg Arg Gln Leu Pro Ala Val Val Pro Ala Pro Leu Pro Pro Pro Cys
20 25 30
Gly Ser Ser Ala His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Gly
35 40 45
<210> 39
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> Nkp44细胞质序列
<400> 39
Trp Trp Gly Asp Ile Trp Trp Lys Thr Met Met Glu Leu Arg Ser Leu
1 5 10 15
Asp Thr Gln Lys Ala Thr Cys His Leu Gln Gln Val Thr Asp Leu Pro
20 25 30
Trp Thr Ser Val Ser Ser Pro Val Glu Arg Glu Ile Leu Tyr His Thr
35 40 45
Val Ala Arg Thr Lys Ile Ser Asp Asp Asp Asp Glu His Thr Leu
50 55 60
<210> 40
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> NKp46细胞质序列
<400> 40
Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser Arg Ala Ser Thr Trp Glu Gly
1 5 10 15
Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu
20 25
<210> 41
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> ITAM1中含有2个突变的CD3ζ细胞质序列，CD3ζ1XX
<400> 41
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 42
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 基于CD64结构域的构造；CD16TM；CD16ICD
<400> 42
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275 280 285
Val Trp Phe His Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu
290 295 300
Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg
305 310 315 320
Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp
325 330 335
Pro Gln Asp Lys
340
<210> 43
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 基于CD64外显子的构造；CD16TM；CD16ICD
<400> 43
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Phe Phe Pro Pro Gly
275 280 285
Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp
290 295 300
Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg
305 310 315 320
Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
325 330 335
<210> 44
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 基于CD64外显子的构造；CD16TM；CD16ICD
<400> 44
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Phe Phe Pro Pro Gly Tyr
275 280 285
Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr
290 295 300
Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp
305 310 315 320
Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
325 330 335
<210> 45
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 45
cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa 60
gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag 120
gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg 180
tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt 240
gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata 300
cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa 360
ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt 420
tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg 480
aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac 540
acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca 600
tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg 660
ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg 720
cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg 780
ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg 840
gagcttcaag tgcttggcct ccagttacca actcctgtct ggtttcatta ccaagtctct 900
ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca gtggacacag gactatattt ctctgtgaag 960
acaaacattc gaagctcaac aagagactgg aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac 1020
cctcaagaca aa 1032
<210> 46
<211> 1020
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 46
cttggagaca acatgtggtt cttgacaact ctgctccttt gggttccagt tgatgggcaa 60
gtggacacca caaaggcagt gatcactttg cagcctccat gggtcagcgt gttccaagag 120
gaaaccgtaa ccttgcattg tgaggtgctc catctgcctg ggagcagctc tacacagtgg 180
tttctcaatg gcacagccac tcagacctcg acccccagct acagaatcac ctctgccagt 240
gtcaatgaca gtggtgaata caggtgccag agaggtctct cagggcgaag tgaccccata 300
cagctggaaa tccacagagg ctggctacta ctgcaggtct ccagcagagt cttcacggaa 360
ggagaacctc tggccttgag gtgtcatgcg tggaaggata agctggtgta caatgtgctt 420
tactatcgaa atggcaaagc ctttaagttt ttccactgga attctaacct caccattctg 480
aaaaccaaca taagtcacaa tggcacctac cattgctcag gcatgggaaa gcatcgctac 540
acatcagcag gaatatctgt cactgtgaaa gagctatttc cagctccagt gctgaatgca 600
tctgtgacat ccccactcct ggaggggaat ctggtcaccc tgagctgtga aacaaagttg 660
ctcttgcaga ggcctggttt gcagctttac ttctccttct acatgggcag caagaccctg 720
cgaggcagga acacatcctc tgaataccaa atactaactg ctagaagaga agactctggg 780
ttatactggt gcgaggctgc cacagaggat ggaaatgtcc ttaagcgcag ccctgagttg 840
gagcttcaag tgcttggttt gttctttcca cctgggtacc aagtctcttt ctgcttggtg 900
atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct ctgtgaagac aaacattcga 960
agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa tttaaatgga gaaaggaccc tcaagacaaa 1020
<210> 47
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 47
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca 60
aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc 120
ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc 180
acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt 240
ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc 300
cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg 360
gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat 420
ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaac tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 480
agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540
atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600
ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660
cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720
acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780
gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840
cttggcttct ttccacctgg gtaccaagtc tctttctgct tggtgatggt actccttttt 900
gcagtggaca caggactata tttctctgtg aagacaaaca ttcgaagctc aacaagagac 960
tggaaggacc ataaatttaa atggagaaag gaccctcaag acaaa 1005
<210> 48
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 48
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu
20 25 30
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
50 55 60
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
85 90 95
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
115 120 125
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
130 135 140
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
180 185 190
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
195 200 205
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
210 215 220
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
225 230 235 240
Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr
245 250 255
Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser
260 265 270
Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala
275 280 285
Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser
290 295 300
Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly
305 310 315 320
Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala
325 330 335
Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
340 345 350
Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val
355 360 365
Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln
370 375
<210> 49
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 49
atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60
catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120
aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180
actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240
ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300
gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360
ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420
gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480
agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540
cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600
cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660
gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720
atcagagatc ccgccctggt gcatcagcgg cctgcccctc caagcacagt gacaacagct 780
ggcgtgaccc cccagcctga gagcctgagc ccttctggaa aagagcctgc cgccagcagc 840
cccagcagca acaatactgc cgccaccaca gccgccatcg tgcctggatc tcagctgatg 900
cccagcaaga gccctagcac cggcaccacc gagatcagca gccacgagtc tagccacggc 960
accccatctc agaccaccgc caagaactgg gagctgacag ccagcgcctc tcaccagcct 1020
ccaggcgtgt accctcaggg ccacagcgat accacagtgg ccatcagcac ctccaccgtg 1080
ctgctgtgtg gactgagcgc cgtgtcactg ctggcctgct acctgaagtc cagacagtga 1140
<210> 50
<211> 375
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 50
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu
20 25 30
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
50 55 60
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
85 90 95
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
115 120 125
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
130 135 140
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
180 185 190
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
195 200 205
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
210 215 220
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
225 230 235 240
Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr
245 250 255
Val Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser
260 265 270
Gly Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala
275 280 285
Thr Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser
290 295 300
Pro Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly
305 310 315 320
Thr Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala
325 330 335
Ser His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
340 345 350
Val Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val
355 360 365
Ser Leu Leu Ala Cys Tyr Leu
370 375
<210> 51
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 51
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu
20 25 30
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
35 40 45
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
50 55 60
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
65 70 75 80
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
85 90 95
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
115 120 125
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
130 135 140
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Gln Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp
180 185 190
Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser
195 200 205
Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu
210 215 220
Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys
225 230 235 240
Ile Arg
<210> 52
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 52
atggactgga cctggattct gttcctggtc gcggctgcaa cgcgagtcca tagcggtatc 60
catgttttta ttcttgggtg tttttctgct gggctgccta agaccgaggc caactgggta 120
aatgtcatca gtgacctcaa gaaaatagaa gaccttatac aaagcatgca cattgatgct 180
actctctaca ctgagtcaga tgtacatccc tcatgcaaag tgacggccat gaaatgtttc 240
ctcctcgaac ttcaagtcat atctctggaa agtggcgacg cgtccatcca cgacacggtc 300
gaaaacctga taatactcgc taataatagt ctctcttcaa atggtaacgt aaccgagtca 360
ggttgcaaag agtgcgaaga gttggaagaa aaaaacataa aggagttcct gcaaagtttc 420
gtgcacattg tgcagatgtt cattaatacc tctagcggcg gaggatcagg tggcggtgga 480
agcggaggtg gaggctccgg tggaggaggt agtggcggag gttctcttca aataacttgt 540
cctccaccga tgtccgtaga acatgcggat atttgggtaa aatcctatag cttgtacagc 600
cgagagcggt atatctgcaa cagcggcttc aagcggaagg ccggcacaag cagcctgacc 660
gagtgcgtgc tgaacaaggc caccaacgtg gcccactgga ccacccctag cctgaagtgc 720
atcaga 726
<210> 53
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CS1跨膜序列
<400> 53
Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Val Pro Leu Leu Leu Ser Leu Phe Val
1 5 10 15
Leu Gly Leu Phe Leu
20
<210> 54
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CS1细胞质序列
<400> 54
Trp Phe Leu Lys Arg Glu Arg Gln Glu Glu Tyr Ile Glu Glu Lys Lys
1 5 10 15
Arg Val Asp Ile Cys Arg Glu Thr Pro Asn Ile Cys Pro His Ser Gly
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Tyr Asp Thr Ile Pro His Thr Asn Arg Thr Ile Leu
35 40 45
Lys Glu Asp Pro Ala Asn Thr Val Tyr Ser Thr Val Glu Ile Pro Lys
50 55 60
Lys Met Glu Asn Pro His Ser Leu Leu Thr Met Pro Asp Thr Pro Arg
65 70 75 80
Leu Phe Ala Tyr Glu Asn Val Ile
85
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD8跨膜序列
<400> 55
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
1 5 10
<210> 56
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD8细胞质序列
<400> 56
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
1 5 10 15
Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser Gly
20 25 30
Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
35 40
<210> 57
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NKG2D-2B4-IL2RB-CD3z
<400> 57
Ser Asn Leu Phe Val Ala Ser Trp Ile Ala Val Met Ile Ile Phe Arg
1 5 10 15
Ile Gly Met Ala Val Ala Ile Phe Cys Cys Phe Phe Phe Pro Ser Trp
20 25 30
Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe
35 40 45
Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His
50 55 60
Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met
65 70 75 80
Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr
85 90 95
Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg
100 105 110
Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys
115 120 125
Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu
130 135 140
Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu
145 150 155 160
Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser
165 170 175
Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser
180 185 190
Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile
195 200 205
Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu
210 215 220
Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser
225 230 235 240
Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro
245 250 255
Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro
260 265 270
Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly
275 280 285
Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr
290 295 300
Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu
305 310 315 320
Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala
325 330 335
Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp
340 345 350
Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu
355 360 365
Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu
370 375 380
Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser
385 390 395 400
Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro
405 410 415
Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp
420 425 430
Pro Thr His Leu Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
435 440 445
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
450 455 460
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
465 470 475 480
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
485 490 495
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
500 505 510
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
515 520 525
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
530 535 540
Ala Leu Pro Pro Arg
545
<210> 58
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD8-41BB-1XX
<400> 58
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
20 25 30
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
50 55 60
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
65 70 75 80
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
85 90 95
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
100 105 110
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Phe Asn Glu Leu
115 120 125
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Phe Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
130 135 140
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser
145 150 155 160
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
165 170 175
Pro Arg
<210> 59
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28-CD28-2B4-CD3z
<400> 59
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr
65 70 75 80
Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys
85 90 95
Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln
115 120 125
Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser
130 135 140
Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr
145 150 155 160
Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu
165 170 175
Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe
180 185 190
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
195 200 205
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
210 215 220
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
225 230 235 240
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
245 250 255
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
260 265 270
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
275 280 285
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
290 295 300
<210> 60
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD28H-CD28H-CD3z
<400> 60
Phe Leu Phe Val Leu Leu Gly Val Gly Ser Met Gly Val Ala Ala Ile
1 5 10 15
Val Trp Gly Ala Trp Phe Trp Gly Arg Arg Ser Cys Gln Gln Arg Asp
20 25 30
Ser Gly Asn Ser Pro Gly Asn Ala Phe Tyr Ser Asn Val Leu Tyr Arg
35 40 45
Pro Arg Gly Ala Pro Lys Lys Ser Glu Asp Cys Ser Gly Glu Gly Lys
50 55 60
Asp Gln Arg Gly Gln Ser Ile Tyr Ser Thr Ser Phe Pro Gln Pro Ala
65 70 75 80
Pro Arg Gln Pro His Leu Ala Ser Arg Pro Cys Pro Ser Pro Arg Pro
85 90 95
Cys Pro Ser Pro Arg Pro Gly His Pro Val Ser Met Val Arg Val Ser
100 105 110
Pro Arg Pro Ser Pro Thr Gln Gln Pro Arg Pro Lys Gly Phe Pro Lys
115 120 125
Val Gly Glu Glu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
130 135 140
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
145 150 155 160
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
165 170 175
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
180 185 190
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
195 200 205
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
225 230 235 240
Leu Pro Pro Arg
<210> 61
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> DNAM1-DNAM1-CD3z
<400> 61
Gly Gly Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr Ile
1 5 10 15
Ile Val Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu
20 25 30
Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser
35 40 45
Pro Ile Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg
50 55 60
Glu Asp Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr
65 70 75 80
Arg Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
85 90 95
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
100 105 110
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
115 120 125
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
130 135 140
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
145 150 155 160
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
180 185 190
Pro Arg
<210> 62
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> DAP10-DAP10-DAP10-CD3z
<400> 62
Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Leu Leu Ala
20 25 30
Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala
35 40 45
Val Phe Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly
50 55 60
Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg
65 70 75 80
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
85 90 95
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
100 105 110
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
115 120 125
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
130 135 140
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
145 150 155 160
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
165 170 175
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
180 185
<210> 63
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> KIR2DS2-KIR2DS2-CD3z
<400> 63
Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Lys Ile Pro Phe Thr Ile Leu Leu
1 5 10 15
Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val
20 25 30
Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val Asn Ser Glu Asp Ser
35 40 45
Asp Glu Gln Asp His Gln Glu Val Ser Tyr Ala Arg Val Lys Phe Ser
50 55 60
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
65 70 75 80
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
85 90 95
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
100 105 110
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
115 120 125
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
130 135 140
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
145 150 155 160
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
165 170
<210> 64
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> KIR2DS2-KIR2DS2-DAP10
<400> 64
Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Lys Ile Pro Phe Thr Ile Leu Leu
1 5 10 15
Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val
20 25 30
Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val Asn Ser Glu Asp Ser
35 40 45
Asp Glu Gln Asp His Gln Glu Val Ser Tyr Ala Leu Cys Ala Arg Pro
50 55 60
Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro
65 70 75 80
Gly Arg Gly
<210> 65
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> KIR2DS2-KIR2DS2-2B4
<400> 65
Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Lys Ile Pro Phe Thr Ile Leu Leu
1 5 10 15
Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val
20 25 30
Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg Thr Val Asn Ser Glu Asp Ser
35 40 45
Asp Glu Gln Asp His Gln Glu Val Ser Tyr Ala Trp Arg Arg Lys Arg
50 55 60
Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln
85 90 95
Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln
100 105 110
Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu
115 120 125
Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro
130 135 140
Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys
145 150 155 160
Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp
165 170 175
Val Tyr Ser
<210> 66
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD16-CD16-2B4-DAP10
<400> 66
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
20 25 30
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Trp Arg
35 40 45
Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu
50 55 60
Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu
65 70 75 80
Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu
100 105 110
Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn
115 120 125
His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser
130 135 140
Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu
145 150 155 160
Asn Phe Asp Val Tyr Ser Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala
165 170 175
Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
180 185 190
<210> 67
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD16-CD16-DNAM1
<400> 67
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
20 25 30
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Asn Arg
35 40 45
Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr Glu Ser Trp Asp Thr
50 55 60
Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile Ser Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp Ile Tyr Val Asn Tyr
85 90 95
Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val
100 105
<210> 68
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NKp46-NKp46-2B4
<400> 68
Met Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe Leu Val
1 5 10 15
Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser Arg Ala
20 25 30
Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu Trp Arg
35 40 45
Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu
50 55 60
Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu
65 70 75 80
Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu
100 105 110
Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn
115 120 125
His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser
130 135 140
Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu
145 150 155 160
Asn Phe Asp Val Tyr Ser
165
<210> 69
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NKp46-NKp46-2B4-CD3z
<400> 69
Met Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe Leu Val
1 5 10 15
Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser Arg Ala
20 25 30
Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu Trp Arg
35 40 45
Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu
50 55 60
Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu
65 70 75 80
Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu
100 105 110
Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn
115 120 125
His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser
130 135 140
Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu
145 150 155 160
Asn Phe Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
165 170 175
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
180 185 190
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
195 200 205
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
210 215 220
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
225 230 235 240
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
245 250 255
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
260 265 270
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
275
<210> 70
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NKp46-NKp46-CD2-Dap10
<400> 70
Met Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe Leu Val
1 5 10 15
Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser Arg Ala
20 25 30
Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu Lys Arg
35 40 45
Lys Lys Gln Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala
50 55 60
His Arg Val Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro
65 70 75 80
Ala Ser Thr Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro
85 90 95
Pro Gly His Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly
100 105 110
His Arg Val Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly
115 120 125
Thr Gln Val His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val
130 135 140
Gln Pro Lys Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser
145 150 155 160
Ser Asn Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly
165 170 175
Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
180 185
<210> 71
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD2-CD2-CD3z
<400> 71
Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met Val
1 5 10 15
Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln Arg
20 25 30
Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val Ala
35 40 45
Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr Pro
50 55 60
Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His Arg
65 70 75 80
Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val Gln
85 90 95
His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val His
100 105 110
Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys Pro
115 120 125
Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg Val
130 135 140
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
145 150 155 160
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
165 170 175
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
180 185 190
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
195 200 205
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
225 230 235 240
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
245 250
<210> 72
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 2B4-2B4-CD3z
<400> 72
Phe Leu Val Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Phe Leu Gly Thr Leu
1 5 10 15
Ala Cys Phe Cys Val Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu
20 25 30
Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu
35 40 45
Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser
65 70 75 80
Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys
85 90 95
Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile
100 105 110
Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg
115 120 125
Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys
130 135 140
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
145 150 155 160
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
165 170 175
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
180 185 190
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
195 200 205
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
210 215 220
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
225 230 235 240
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
245 250
<210> 73
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 2B4-2B4-FcERIg
<400> 73
Phe Leu Val Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Phe Leu Gly Thr Leu
1 5 10 15
Ala Cys Phe Cys Val Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu
20 25 30
Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu
35 40 45
Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser
65 70 75 80
Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys
85 90 95
Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile
100 105 110
Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg
115 120 125
Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Arg Leu Lys
130 135 140
Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly
145 150 155 160
Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu
165 170 175
Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
180
<210> 74
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CS1-CS1-CD3z
<400> 74
Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Val Pro Leu Leu Leu Ser Leu Phe Val
1 5 10 15
Leu Gly Leu Phe Leu Trp Phe Leu Lys Arg Glu Arg Gln Glu Glu Tyr
20 25 30
Ile Glu Glu Lys Lys Arg Val Asp Ile Cys Arg Glu Thr Pro Asn Ile
35 40 45
Cys Pro His Ser Gly Glu Asn Thr Glu Tyr Asp Thr Ile Pro His Thr
50 55 60
Asn Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asp Pro Ala Asn Thr Val Tyr Ser Thr
65 70 75 80
Val Glu Ile Pro Lys Lys Met Glu Asn Pro His Ser Leu Leu Thr Met
85 90 95
Pro Asp Thr Pro Arg Leu Phe Ala Tyr Glu Asn Val Ile Arg Val Lys
100 105 110
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
115 120 125
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
130 135 140
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
145 150 155 160
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
165 170 175
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
180 185 190
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
195 200 205
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215 220

Claims (49)

1.一种嵌合抗原受体，其包括：胞外结构域，所述胞外结构域包括至少一个抗原识别结构域；跨膜结构域；以及胞内结构域，所述胞内结构域包括至少一个信号传导结构域；
其中所述至少一个信号传导结构域源自对T和/或NK细胞激活或功能化具有特异性的信号转导蛋白的细胞质结构域；
其中所述嵌合抗原受体在包括在诱导多能干细胞(iPSC)中时促进将所述iPSC分化定向到期望的衍生效应细胞，并且其中从所述iPSC分化的iPSC源性效应细胞具有以下特性中的至少一个特性，所述特性包括相较于从外周血、脐带血或任何其它供体组织获得的原代免疫细胞：
(i)改善的持久性和/或存活率；
(ii)改善的细胞扩增；
(iii)增加的细胞毒性；
(iv)增加的对同种异体排斥的抗性；
(v)改善的肿瘤渗透性；
(vi)增强的将旁观者免疫细胞迁移到肿瘤位点和/或激活或募集所述旁观者免疫细胞的能力；以及
(vii)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中
(a)所述信号转导蛋白包括以下中的任一种：2B4(自然杀伤细胞受体2B4)、4-1BB(肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、CD16(IgG Fc区受体III-A)、CD2(T细胞表面抗原CD2)、CD28(T细胞特异性表面糖蛋白CD28)、CD28H(含跨膜结构域和免疫球蛋白结构域的蛋白2)、CD3ζ(T细胞表面糖蛋白CD3ζ链)、DAP10(造血细胞信号转导子)、DAP12(TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白)、DNAM1(CD226抗原)、FcERIγ(高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ)、IL21R(白介素-21受体)、IL-2Rβ/IL-15RB(白介素-2受体亚基β)、IL-2Rγ(细胞因子受体共有亚基γ)、IL-7R(白介素-7受体亚基α)、KIR2DS2(杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DS2)、NKG2D(NKG2-D II型整合膜蛋白)、NKp30(自然细胞毒性触发受体3)、NKp44(自然细胞毒性触发受体2)、NKp46(自然细胞毒性触发受体1)、CS1(SLAM家族成员7)和CD8(T细胞表面糖蛋白CD8α链)；和/或
(b)所述至少一个信号传导结构域包括与分别由SEQ ID NO:21-41、54和56表示的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ IL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其中所述至少一个信号传导结构域包括与分别由SEQ ID NO:21-41、54和56表示的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列；并且其中所述细胞质结构域的所述部分包括ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)、YxxM基序、TxYxxV/I基序、FcRγ、半ITAM和/或ITT样基序。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域包括第一信号传导结构域、第二信号传导结构域以及任选地第三信号传导结构域；并且其中所述第一信号传导结构域、所述第二信号传导结构域和所述第三信号传导结构域不同。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其中所述第二信号传导结构域和所述第三信号传导结构域包括与分别由SEQ ID NO:21-41、54和56表示的2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγIL21R、IL-2Rβ(IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1或CD8的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域包括仅一个信号传导结构域，其中所述胞内结构域包括与DNAM1、CD28H、KIR2DS2、DAP12或DAP10的细胞质结构域或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域包括两个不同的信号传导结构域，并且其中所述胞内结构域包括呈以下形式中的任一种形式的融合的细胞质结构域或其部分：2B4-CD3ζ/1XX、2B4-DNAM1、2B4-FcERIγ、2B4-DAP10、CD16-DNAM1、CD16-DAP10、CD16-DAP12、CD2-CD3ζ/1XX、CD2-DNAM1、CD2-FcERIγ、CD2-DAP10、CD28-DNAM1、CD28-FcERIγ、CD28-DAP10、CD28-DAP12、CD28H-CD3ζ/1XX、DAP10-CD3ζ/1XX、DAP10-DAP12、DAP12-CD3ζ/1XX、DAP12-DAP10、DNAM1-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-DAP10、KIR2DS2-2B4和NKp46-2B4。
8.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域包括三个不同的信号传导结构域，并且其中所述胞内结构域包括呈包括以下的形式中的任一种形式的融合的细胞质结构域或其部分：2B4-DAP10-CD3ζ/1XX、2B4-IL21R-DAP10、2B4-IL2RB-DAP10、2B4-IL2RB-CD3ζ/1XX、2B4-41BB-DAP10、CD16-2B4-DAP10和KIR2DS2-2B4-CD3ζ/1XX。
9.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包括与CD2、CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1或T细胞受体多肽的跨膜区的其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包括与分别由SEQ IDNO:1-20、53和55表示的2B4、CD2、CD16、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1或CD8的跨膜区或其部分具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和其立即连接的信号传导结构域来自同一蛋白质或来自不同的蛋白质。
12.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包括跨膜结构域和胞内结构域(TM-(胞内结构域))，并且其中所述嵌合抗原受体包括：
(i)以下形式之一：NKG2D-(2B4-IL2RB-CD3ζ)、CD8-(41BB-CD3ζ1XX)、CD28-(CD28-2B4-CD3ζ)、CD28H-(CD28H-CD3ζ)、DNAM1-(DNAM1-CD3ζ)、DAP10-(DAP10-CD3ζ)、KIR2DS2-(KIR2DS2-CD3ζ)、KIR2DS2-(KIR2DS2-DAP10)、KIR2DS2-(KIR2DS2-2B4)、CD16-(CD16-2B4-DAP10)、CD16-(CD16-DNAM1)、NKp46-(NKp46-2B4)、NKp46-(NKp46-2B4-CD3ζ)、NKp46-(NKp46-CD2-Dap10)、CD2-(CD2-CD3ζ)、2B4-(2B4-CD3ζ)、2B4-(2B4-FcERIg)和CS1-(CS1-CD3ζ)；或者
(ii)与由SEQ ID NO:57-74中的每一个表示的序列具有约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原识别结构域与和疾病、病原体、液体瘤或实体瘤相关的抗原特异性结合。
14.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原识别结构域对以下具有特异性：
(i)CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1中的任一种：或
(ii)ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAlX)、CCRI、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A 1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症睾丸抗原NY-ESO-1、瘤胎抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(Wilms tumorprotein，WT-1)和病原体抗原中的任一种。
15.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述胞外结构域包括以下中的一种或多种：
(i)两个抗原识别结构域；
(ii)信号肽；和/或
(iii)间隔子/铰链。
16.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包括在共表达细胞表面表达的外源性细胞因子或其受体的部分肽或全长肽的双顺反子构建体中，其中所述外源性细胞因子或其受体包括：
(a)IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和其相应受体中的至少一种；或
(b)以下中的至少一种：
(i)通过使用自切割肽进行的IL15和IL15Rα的共表达；
(ii)IL15与IL15Rα的融合蛋白；
(iii)其中IL15Rα的细胞内结构域被截短或被消除的IL15/IL15Rα融合蛋白；
(iv)IL15与IL15Rα的膜结合的Sushi结构域的融合蛋白；
(v)IL15与IL15Rβ的融合蛋白；
(vi)IL15与共有受体γC的融合蛋白，其中所述共有受体γC为天然的或经修饰的；以及
(vii)IL15Rβ的同源二聚体。
17.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中来自iPSC分化的所述衍生效应细胞包括以下中的一种或多种：衍生CD34细胞、衍生造血干细胞和祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生T细胞祖细胞、衍生NK细胞祖细胞、衍生T细胞、衍生NKT细胞、衍生NK细胞、衍生B细胞或衍生免疫效应细胞。
18.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其中所述iPSC源性免疫效应细胞表达所述嵌合抗原受体，并且包括原代T、NK和/或NKT细胞中不存在的至少一个功能特征。
19.一种细胞或其群体，其中：
(i)所述细胞为免疫细胞、诱导多能细胞(iPSC)、克隆iPSC或iPS细胞系细胞；或者所述细胞为通过使所述iPSC分化获得的衍生效应细胞；并且
(ii)所述细胞包括根据权利要求1到18中任一项所述的至少一个嵌合抗原受体(CAR)。
20.根据权利要求19所述的细胞或其群体，其中所述衍生效应细胞为造血细胞，并且包括比从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的所述衍生细胞的对应物原代细胞的端粒更长的端粒；或者其中所述CAR具有以下特性中的至少一个特性：
(i)为T或NK细胞特异性的；
(ii)在抗原结合中为双特异性的；
(iii)为可切换的CAR；
(iv)为二聚化的CAR；
(v)为分开的CAR；
(vi)为多链CAR；
(vii)为诱导型CAR；以及
(viii)被插入在以下基因座之一处：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT，其中所述插入敲除或减少基因在所述基因座中的表达。
21.根据权利要求19所述的细胞或其群体，其中所述细胞进一步包括以下中的一项或多项：
(i)CD38敲除；
(ii)与所述细胞的对应物原代细胞相比，B2M无效或低以及任选地CIITA无效或低；
(iii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一种或两种的敲除；
(iv)CD16或其变体；
(v)具有不同靶向特异性的第二CAR；
(vi)细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分肽或全部肽；
(vii)表2中列出的基因型中的至少一种基因型；
(viii)与所述细胞的对应物原代细胞相比，TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一种中的缺失或减少的表达；或
(ix)与所述细胞的对应物原代细胞相比，HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、衔接子以及用于与激动剂偶联的表面触发受体中的至少一种中的所引入或增加的表达。
22.根据权利要求19所述的细胞或其群体，其中所述细胞为衍生效应细胞，并且与从外周血、脐带血或任何其它供体组织中获得的所述细胞的对应物原代细胞相比，具有以下特性中的至少一个特性，所述特性包括：
(i)改善的持久性和/或存活率；
(ii)增加的对同种异体反应性受体免疫细胞的抗性；
(iii)增加的细胞毒性；
(iv)改善的肿瘤渗透性；
(v)增强的或获取的ADCC；
(vi)增强的将旁观者免疫细胞迁移到肿瘤位点和/或激活或募集所述旁观者免疫细胞的能力；
(vii)增强的降低肿瘤免疫抑制的能力；
(viii)改善的拯救肿瘤抗原逃逸的能力；
(ix)稳定肿瘤抗原的能力；以及
(x)避免互相杀伤的能力。
23.根据权利要求21所述的细胞或其群体，其中所述细胞进一步包括高亲和力不可切割的CD16(hnCD16)或其变体。
24.根据权利要求21所述的细胞或其群体，其中所述CD16或其变体包括以下中的至少一个：
(a)CD16的胞外结构域中的F176V和S197P；
(b)源自CD64的全部或部分胞外结构域；
(c)非天然(或非CD16)跨膜结构域；
(d)非天然(或非CD16)细胞内结构域；
(e)非天然(或非CD16)信号传导结构域；
(f)非天然刺激性结构域；以及
(g)并非源自CD16并且源自同一多肽或不同多肽的跨膜结构域、信号传导结构域和刺激性结构域。
25.根据权利要求24所述的细胞或其群体，其中：
(a)所述非天然跨膜结构域源自CD3D、CD3E、CD3G、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1或T细胞受体(TCR)多肽；
(b)所述非天然刺激性结构域源自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4或NKG2D多肽；
(c)所述非天然信号传导结构域源自CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137(41BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C或NKG2D多肽；或者
(d)所述非天然跨膜结构域源自NKG2D，所述非天然刺激性结构域源自2B4，并且所述非天然信号传导结构域源自CD3ζ。
26.根据权利要求21所述的细胞或其群体，其中所述细胞进一步包括第二CAR，并且其中所述第二CAR为：
(i)T细胞特异性或NK细胞特异性的；
(ii)双特异性抗原结合性CAR；
(iii)可切换的CAR；
(iv)二聚化的CAR；
(v)分开的CAR；
(vi)多链CAR；
(vii)诱导型CAR；
(viii)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中与细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分肽或全部肽共表达的；
(xi)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中与检查点抑制剂共表达的；
(xii)对CD19、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、HER2、CD52、EGFR、GD2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA和PDL1中的至少一种具有特异性；和/或
(xiii)对以下中的任一种具有特异性：ADGRE2、碳酸酐酶IX(CAlX)、CCRI、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨细胞病毒(CMV)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(EGP2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、EGFRvIII、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-a、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、Lewis A(CA19.9)、Lewis Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A 1(MAGE-A1)、MICA/B、粘蛋白1(Muc-1)、粘蛋白16(Muc-16)、间皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配体、c-Met、癌症睾丸抗原NY-ESO-1、瘤胎抗原(h5T4)、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)、威尔姆斯肿瘤蛋白(WT-1)和病原体抗原。
27.根据权利要求21所述的细胞或其群体，其中所述细胞包括细胞表面表达的外源性细胞因子和/或其受体的部分肽或全部肽，其中：
(a)所述外源性细胞因子和/或其受体包括IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21和其相应受体中的至少一种；或
(b)所述外源性细胞因子和/或其受体包括以下中的至少一种：
(i)通过使用自切割肽进行的IL15和IL15Rα的共表达；
(ii)IL15与IL15Rα的融合蛋白；
(iii)其中IL15Rα的细胞内结构域被截短或被消除的IL15/IL15Rα融合蛋白；
(iv)IL15与IL15Rα的膜结合的Sushi结构域的融合蛋白；
(v)IL15与IL15Rβ的融合蛋白；
(vi)IL15与共有受体γC的融合蛋白，其中所述共有受体γC为天然的或经修饰的；以及
(vii)IL15Rβ的同源二聚体，
其中(i)-(vii)中的任一项可在单独构建体中或在双顺反子构建体中与CAR共表达；
并且任选地，
(c)所述外源性细胞因子和/或其受体为瞬时表达的。
28.根据权利要求19所述的细胞或其群体，其中所述衍生效应细胞能够募集T细胞和/或将T细胞迁移到肿瘤部位，并且其中所述衍生效应细胞能够在存在一种或多种检查点抑制剂的情况下降低肿瘤免疫抑制。
29.根据权利要求26或28所述的细胞或其群体，其中所述检查点抑制剂为一种或多种检查点分子的拮抗剂，所述一种或多种检查点分子包括：PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E和抑制性KIR。
30.根据权利要求29所述的细胞或其群体，其中所述检查点抑制剂包括：
(a)阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐单抗(durvalumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗(lirimumab)、莫那利珠单抗(monalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、派立珠单抗(pembrolizumab)和其衍生物或功能等效物中的一种或多种；或
(b)阿特珠单抗、纳武单抗和派姆单抗中的至少一种。
31.根据权利要求20所述的细胞或其群体，其中所述衍生效应细胞包括衍生CD34细胞、衍生造血干细胞和祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生T细胞祖细胞、衍生NK细胞祖细胞、衍生T细胞、衍生NKT细胞、衍生NK细胞、衍生B细胞或衍生免疫效应细胞。
32.根据权利要求19所述的细胞或其群体，其中所述细胞包括：
(i)整合在安全港基因座或所选基因座中的一种或多种外源性多核苷酸；或
(ii)整合在不同安全港基因座或两个或更多个所选基因座中的多于两种外源性多核苷酸。
33.根据权利要求32所述的细胞或其群体，其中所述安全港基因座包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、GAPDH或RUNX1中的至少一种；并且其中所述所选基因座为B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT之一；并且其中所述外源性多核苷酸的所述整合敲除基因在所述基因座中的表达。
34.根据权利要求33所述的细胞或其群体，其中所述TCR基因座为TCRα或TCRβ的恒定区。
35.一种组合物，其包括根据权利要求19到34中任一项所述的细胞或其群体。
36.一种用于治疗用途的组合物，所述组合物包括根据权利要求19到34中任一项所述的衍生效应细胞以及一种或多种治疗剂。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述一种或多种治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其替代因子、包括一种或多种所关注多核酸的载体、抗体或其功能变体或片段、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中
(1)所述检查点抑制剂包括：
(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂，所述检查点分子包括PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A2aR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara(视黄酸受体α)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E或抑制性KIR；
(b)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、派姆单抗和其衍生物或功能等效物中的一种或多种；
或
(c)阿特珠单抗、纳武单抗和派姆单抗中的至少一种；或者
(2)所述一种或多种治疗剂包括维奈托克(venetoclax)、阿扎胞苷(azacitidine)和泊马度胺(pomalidomide)中的一种或多种。
39.根据权利要求37所述的组合物，其中所述抗体包括：
(a)抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗EGFR、抗CD123、抗GD2、抗PDL1和/或抗CD38抗体；
(b)雷妥昔单抗(rituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、乌布里图昔单抗(ublituximab)、奥卡拉珠单抗(ocaratuzumab)、奥比珠单抗(obinutuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、西妥昔单抗(certuximab)、迪努妥昔单抗(dinutuximab)、阿维鲁单抗、达土木单抗(daratumumab)、艾沙妥昔单抗(isatuximab)、MOR202、7G3、CSL362、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)和其人源化或经Fc修饰的变体或片段以及其功能等效物和生物仿制药中的一种或多种；或者
(c)达土木单抗，并且其中所述衍生效应细胞包括CD38敲除以及任选地CD16或其变体的表达。
40.一种根据权利要求35到39中任一项所述的组合物的治疗用途，其通过将所述组合物引入到适于过继性细胞疗法的受试者体内进行，其中所述受试者患有自身免疫性病症、恶性血液病、实体瘤、癌症或病毒感染。
41.一种制造包括根据权利要求1所述的CAR的衍生效应细胞的方法，其中所述方法包括使经基因工程化的iPSC分化，其中所述iPSC包括编码所述CAR的多核苷酸以及任选地引起以下的一种或多种编辑：
(i)CD38敲除；
(ii)与所述细胞的对应物原代细胞相比，B2M无效或低以及任选地CIITA无效或低；
(iii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一种或两种中的敲除；
(iv)CD16或其变体；
(v)具有不同的靶向特异性的嵌合抗原受体(CAR)；
(vi)细胞表面表达的外源性细胞因子或其受体的部分肽或全部肽；
(vii)表2中列出的基因型中的至少一种基因型；
(viii)与所述iPSC的对应物原代细胞相比，TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD25、CD69、CD44、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3和TIGIT中的至少一种中的缺失或减少的表达；和/或
(ix)与所述iPSC的对应物原代细胞相比，HLA-E、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、抗原特异性TCR、Fc受体、衔接子以及用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一种中的所引入或增加的表达。
42.根据权利要求41所述的方法，其进一步包括对克隆iPSC进行基因组工程化以敲入编码所述CAR的多核苷酸；以及任选地：
(i)以敲除CD38；
(ii)以敲除B2M和CIITA；
(iii)以敲除一种或两种CD58和CD54；和/或
(iv)以引入HLA-G或不可切割的HLA-G、高亲和力不可切割的CD16或其变体、第二CAR和/或细胞表面表达的外源性细胞因子或其受体的部分肽或全部肽的表达。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述基因组工程化包括靶向编辑。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述靶向编辑包括缺失、插入或插入/缺失，并且其中所述靶向编辑通过CRISPR、ZFN、TALEN、归巢核酸酶、同源重组或这些方法的任何其它功能性变型执行。
45.一种克隆iPSC的CRISPR介导的编辑，其中所述编辑包括敲入编码根据权利要求1所述的CAR的多核苷酸。
46.根据权利要求45所述的CRISPR介导的编辑：
(a)其中对克隆iPSC的所述编辑进一步包括敲除CD38，或者
(b)其中所述CAR插入在包括以下的基因座之一处：B2M、TAP1、TAP2、TAP相关蛋白、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或β恒定区、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3或TIGIT；并且其中所述插入敲除基因在所述基因座中的表达。
47.一种治疗疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用细胞，所述细胞包括根据权利要求1到18中任一项所述的CAR。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞包括衍生效应细胞，所述衍生效应细胞包括CD38敲除、CD16或其变体，并且任选地包括：
(i)B2M和CIITA敲除；
(ii)HLA-G或不可切割的HLA-G的所引入表达或CD58和CD54中的一种或两种的敲除；
(iii)第二CAR和/或细胞表面表达的外源性细胞因子或其受体的部分肽或全部肽的所引入表达；和/或
(iii)表2中列出的基因型中的至少一种基因型。
49.根据权利要求47所述的方法，其中与使用不具有根据权利要求1所述的CAR的效应细胞进行的治疗相比，施用所述细胞引起以下中的一项或多项：
(i)减少MICA/B抗原的肿瘤细胞表面脱落；
(ii)增加肿瘤细胞表面MICA/B密度；
(iii)防止肿瘤抗原逃逸；
(iv)克服肿瘤微环境抑制；
(v)增强效应细胞激活和杀伤功能；以及
(vi)体内肿瘤进展控制、肿瘤细胞负荷降低、肿瘤清除和/或改善存活率。
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