CN114752643A - 一种具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽及其制备方法与应用，属于生物活性肽技术领域。本发明所述制备黑豆肽的方法，包括：(1)将黑豆蛋白粉在100～150℃下红外预处理10～30min，得到预处理的黑豆蛋白粉；(2)将预处理的黑豆蛋白粉配制为溶液，采用菠萝蛋白酶进行酶解，得到酶解液；(3)将酶解液进行离心、收集上清液进行冷冻干燥，得到多肽粉；(4)将多肽粉溶于乙醇/正己烷混合溶液，提取，离心、收集上清液；浓缩，干燥，得到所述的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽。本发明所述的黑豆肽具有抑制脂质过氧化的功能特性，可以很好地溶于乳液体系，可以作为天然抗氧化剂应用在乳液食品的贮藏和保鲜中，延长食品货架期。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽及其制备方法与应用，属于生物活性肽技术领域。
背景技术
油脂氧化容易使食品劣变，产生危害机体健康的物质，造成极大的经济损失，水包油型(O/W)乳液是食品工业中常见的食品存在形式，相对于较纯油体系，高油-水界面比导致乳液食品更易发生脂质的氧化，还会产生不良风味、有害成分，进而缩短乳液基食品的货架期和食用安全。因此，如何有效抑制油脂氧化是食品行业亟待解决的一大难题。然而，目前国内使用的抗氧化剂主要是化学合成的，如BHA(丁基羟基茴香醚)、BHT(二丁基羟基甲苯)等，它们的抗氧化性能良好，广泛用于食品工业中。但这些化学合成的抗氧化剂的安全性一直是个非常敏感的问题。多酚类天然抗氧化剂具备清除氧自由基、抑制脂质氧化的能力，然而多酚类物质易受金属离子催化而发生促氧化作用，所以其在抑制油脂氧化方面的应用受到限制。因此，研究开发低毒低害、易吸收、活性强的天然抗氧化肽对控制油脂氧化以及保障食品安全有重要意义。
抗氧化肽因其来源广且安全性高逐渐受到人们的关注。与合成抗氧化剂相比，抗氧化肽的稳定性更高、活性更强，并且具有高营养价值、低毒、易吸收等优越特性。研究发现，植物蛋白的内源性抗氧化肽含量不高，提取操作复杂，成本较高；而通过酶解制备抗氧化肽具有反应条件温和、方便快捷、重复性高、活性强等优点，是一种制备抗氧化肽的有效方法。
目前，国内外研究人员已从不同来源蛋白质中提取到各种具有抗氧化活性的肽类物质，并对其进行相关机理研究的天然抗氧化肽主要是肌肽和谷胱甘肽等极少数肽，对天然蛋白酶解物中具有一定抗氧化活性低分子肽的研究较少。
另外，研究发现，抗氧化肽主要通过提供氢原子、螯合金属离子、清除机体内的活性氧来达到抗氧化的作用。然而目前对于其在油脂体系中的利用与研究较少，主要集中于抑制肉制品中的脂质过氧化以达到保鲜作用，如Soo Yong Kim等人从雪鱼骨架蛋白的酶解产物中分离出能高效抑制脂质氧化的抗氧化肽等。因此，如何提取能够用于乳液中的抗氧化肽以及抗氧化肽在乳液体系的应用仍需要研究探讨。
发明内容
[技术问题]
现有技术中缺少能够用于乳液中的抗氧化肽。
[技术方案]
为了解决上述问题，本发明以黑豆为原料，通过蛋白酶解技术制备黑豆活性肽；之后通过提取亲脂多肽，得到了具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽；将其用于水包油乳液能实现良好的抗氧化效果。
本发明的第一个目的是提供一种制备具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽的方法，包括如下步骤：
(1)红外预处理：
将黑豆蛋白粉在100～150℃下红外预处理10～30min，得到预处理的黑豆蛋白粉；
(2)蛋白酶酶解处理：
将步骤(1)得到的预处理的黑豆蛋白粉配制为溶液，采用菠萝蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
(3)冷冻干燥：
将步骤(2)的酶解液进行离心、收集上清液进行冷冻干燥，得到多肽粉；
(4)提取亲脂多肽：
将步骤(3)得到的多肽粉溶于乙醇/正己烷混合溶液，提取，离心、收集上清液；浓缩，干燥，得到所述的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的黑豆蛋白粉可以直接购买，也可以自行制备，具体的制备方法包括如下步骤：
黑豆粉脱脂后加入pH为7～10的碱液搅拌1～5h，然后经6000～10000r/min离心15～30min收集上清液，向上清液中加入酸调节pH值至3～6以沉降蛋白质，后经离心取蛋白质沉淀，重悬、冷冻干燥，得到黑豆蛋白粉；其中碱液为氢氧化钠溶液；酸为盐酸溶液，浓度为1～2mol/L；冷冻干燥是将调回中性的蛋白溶液于-80～-60℃冷冻成固态，进行真空冷冻干燥，真空1～15Pa，温度-80～-60℃，干燥1～3天。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的红外预处理一方面是使得球状蛋白变性，肽链展开有利于增大其与蛋白酶的接触面积，另一方面是使得蛋白质的功能特性得到明显改善，且有利于生物活性物质的释放。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的配制的溶液是采用水进行配制，浓度为8～12％(w/v，g/mL)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的菠萝蛋白酶在配制的溶液中的浓度为1～3％(w/v，g/mL)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述的酶解的条件为：酶解温度为45～65℃，酶解时间为3～5h，pH为6.0～8.0。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的离心是6000～10000r/min离心15～30min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述的冷冻干燥是-80～-60℃下冷冻干燥3～6d。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的乙醇/正己烷混合溶液中乙醇和正己烷的体积比为1：3～4。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的多肽粉和乙醇/正己烷混合溶液用量比为3～6g：30～60mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的提取是超声提取，具体是：在30～60℃、10～100Hz超声处理20～120min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的离心是0～5℃下，6000～10000r/min离心10～20min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述的浓缩是旋转蒸发、氮吹浓缩，浓缩至大部分固体析出；所述的干燥是真空干燥；浓缩、干燥都是为了除去有机溶剂。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽。
本发明的第三个目的是本发明所述的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽在油脂抗氧化中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种制备具有抗氧化性的油脂乳液的方法，包括如下步骤：
将油相、乳化剂、水相混合均匀，再加入本发明的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽，混合均匀，搅拌、剪切、均质，得到具有抗氧化性的油脂乳液；
或
将油相、乳化剂、水相混合，搅拌、剪切、均质，得到乳液；之后再加入本发明的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽，混合均匀，得到具有抗氧化性的油脂乳液。
在本发明的一种实施方式中，所述的油相、乳化剂、水相的体积比为30：1：69；具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽在乳液中的浓度为2～10mg/mL。
本发明的第五个目的是本发明所述的方法制备得到的具有抗氧化性的油脂乳液。
[有益效果]
(1)本发明所用原料为黑豆，产量丰富，价格较为低廉，且采用酶解法制备活性多肽，该方法反应条件温和、可控性强、安全性好、成本较低，可实现工业化规模生产，具有重大的现实意义和社会意义。
(2)本发明所述的黑豆肽具有抑制脂质过氧化的功能特性，可以很好地溶于乳液体系，可以作为天然抗氧化剂应用在乳液食品的贮藏和保鲜中，延长食品货架期，对保障食品安全具有重要意义。
附图说明
图1为不同用量的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽(抗氧化肽)在乳液体系中的TBARS值的测试结果。
图2为提取出来的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽与其溶解于植物油的效果图，其中(a)为具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽，(b)左为添加了具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽的花生油，右为纯花生油。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
测试方法：
1、初级氧化产物抑制率(IC50，g/L)的测试：
I＝(A0-A)/A0×100
其中：I-抑制率；A0-亚油酸甲酯的吸光度值；A-加入黑豆肽后亚油酸甲酯的吸光度值；
具体的测试方法如下：
将黑豆肽用亚油酸甲酯溶解，随后置于90℃恒温箱中，为了剔除色差的干扰，将一定量的亚油酸甲酯与样品同时放入烘箱中，在黑暗中放置，经过3小时取出进行分析。从处理后的样品中取出10μL置于96孔板中，依次加入70μL 75％的乙醇、10μL 3％的硫氰酸铵溶液和10μL的2mM氯化亚铁溶液(用3.5％HCl溶解)，室温静置3min，于500nm波长处测定吸光度值，记作过氧化值(A)。
2、次级氧化产物抑制率(IC50，g/L)的测试：
I＝(B0-B/B0×100
其中：I-抑制率；B0-亚油酸甲酯的吸光度值；B-加入黑豆肽后亚油酸甲酯的吸光度值；
具体的测试方法如下：
取50μL氧化结束的的亚油酸甲酯样品加入100μL的TBA试剂，进行混合后放入沸水15分钟，放入冰水10分钟降至室温，置于离心机以2000r/min的速度离心10分钟，收集上清部分，于532nm处测定吸光度(B)。
3、表面疏水性分析
蛋白质分子的表面疏水量最终表示为样品蛋白浓度对荧光强度作图后所得直线的斜率。
具体的测试方法如下：
利用ANS荧光探针法对黑豆抗氧化肽的表面疏水性进行测定。BCA法测定提取的黑豆肽蛋白含量，用0.01mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液稀释蛋白，将多肽溶液稀释至0.005～0.20mg/mL之间。4mL样液，加入50μL 0.008mol/L ANS溶液(用0.01mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液配置)。用F-7000荧光分光光度计测定其荧光强度，激发波长：365nm，发射波长：484nm。
表面疏水性可以表征蛋白三级结构的变化及蛋白分子间相互作用的能力，通常用于预测蛋白的功能性质。
4、TBARS值的测定：
取1.5mL乳液，加入1mL1％硫代巴比妥酸溶液、2.5mL10％三氯醋酸溶液(TCA)，混匀后沸水浴中反应30min，取出于冰水浴中冷却5min，移取2.5mL样液加入等体积三氯甲烷，4500rpm下离心10min，取上清于532nm下测定吸光度(A)。
具体计算公式如下：
TBARS(mg MDA/kg)＝(A-0.0015)/0.7006 R2＝0.995
其中，A：测得上清液吸光度。
实施例采用的原料：
黑豆蛋白粉的制备方法包括如下步骤：
黑豆粉脱脂后加入pH为8的氢氧化钠溶液搅拌3h，然后经8000r/min离心20min收集上清液，向上清液中加入盐酸溶液(浓度为1mol/L)调节pH值至4.5以沉降蛋白质，后经离心(8000r/min离心20min)取蛋白质沉淀，重悬于水后于-80℃冷冻成固态，后于1Pa，-70℃的条件下冷冻干燥3天，得到黑豆蛋白粉。
黑豆购自北京十月稻田公司。
菠萝蛋白酶(2500GDU/g)购自百灵威科技有限公司。
实施例1
一种制备具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽的方法，包括如下步骤：
(1)红外预处理：
将黑豆蛋白粉在100℃下红外预处理20min，得到预处理的黑豆蛋白粉；
(2)蛋白酶酶解处理：
将步骤(1)得到的预处理的黑豆蛋白粉采用水配制为浓度为10％(g/mL)的溶液，加入菠萝蛋白酶，浓度为1.8％(g/mL)，在55℃、pH＝7下酶解4.2h，得到酶解液；
(3)冷冻干燥：
将步骤(2)的酶解液在8000r/min离心20min，收集上清液，在-70℃下冷冻干燥4天，得到多肽粉；
(4)提取亲脂多肽：
将步骤(3)得到的多肽粉5g溶于乙醇/正己烷混合溶液50mL(乙醇和正己烷体积比为1：4)，采用超声仪，80Hz、45℃超声提取30min，8000rpm，4℃离心15min、收集上清液；通过旋转蒸发、氮吹浓缩至大多数固体析出，真空干燥去除有机溶剂，得到所述的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽。
实施例2酶解参数的优化
调整实施例1中酶解的参数如表1，其他和实施例1保持一致，得到具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽。
将得到的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽进行性能测试，测试结果如下：
表1
实施例3提取亲脂多肽的优化
调整实施例1中提取亲脂多肽的参数如表2，其他和实施例1保持一致，得到具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽。
将得到的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽进行性能测试，测试结果如下：
表2
从表2可以看出：提纯前后的疏水值变化说明本方法成功将黑豆肽中的疏水组分浓缩了。之后，将少量花生油加入实施例1得到的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽中，发现：加了黑豆肽的花生油和纯花生油具有相同的清澈度，即：实施例1得到的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽表现出良好的油溶性；说明实施例1得到的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽是既疏水又亲脂的组分(具体如图2)。
对比例1预处理方式的筛选
调整实施例1中预处理的方式如表3，其他和实施例1保持一致，得到具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽。
将得到的黑豆肽进行性能测试，测试结果如下：
表3
对比例2
省略实施例1步骤(1)的红外预处理，其他和实施例1保持一致，得到黑豆肽。
将得到的黑豆肽进行性能测试，测试结果如下：
黑豆肽初级氧化产物抑制率(IC50，g/L)＝11.37±1.02，次级氧化产物抑制率(IC50，g/L)＝6.84±0.78。
对比例3
省略实施例1步骤(4)的亲脂多肽的提取，其他和实施例1保持一致，得到黑豆肽。
将得到的黑豆肽进行性能测试，测试结果如下：
提纯前黑豆肽的表面疏水值为748，提纯后黑豆肽的表面疏水值为13928。
通过比较对比例3和实施例1提纯前后的表面疏水值，可以发现：经过提取，实施例1中黑豆肽中的疏水组分被浓缩聚集，而不提取的话，其疏水组分含量少；且将实施例1的黑豆肽分散在花生油中能够和纯花生油具有相同的清澈度，不提取的话，其黑豆肽在花生油中的分散性不是太好。
实施例4
具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽在油脂抗氧化中的应用，包括如下步骤：
30％(v/v，mL/mL)菜籽油、1％(mL/mL)吐温80与69％(mL/mL)超纯水，混合，在1000rpm磁力搅拌30min，15000rpm剪切2min，均质，得到乳液；
在乳液中加入实施例1的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽，混合均匀，得到含有黑豆肽的乳液；其中具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽的浓度为0、2、4、6、8、10mg/mL。
将得到的含有黑豆肽的乳液进行测试测试结果如下：
表4
| 黑豆肽添加量(mg/mL) | TBARS(mg MDA/kg) |
| 0 | 0.1645±0.0007 |
| 2 | 0.0655±0.0050 |
| 4 | 0.0515±0.0035 |
| 6 | 0.0445±0.0021 |
| 8 | 0.044±0.0042 |
| 10 | 0.038±0.0028 |
实施例5
具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽在油脂抗氧化中的应用，包括如下步骤：
30％(v/v，mL/mL)菜籽油、1％(mL/mL)吐温80与69％(mL/mL)超纯水，混合均匀，再加入实施例1的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽，在1000rpm磁力搅拌30min，15000rpm剪切2min，均质，得到含有黑豆肽的乳液；其中具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽的浓度为0、2、4、6、8、10mg/mL。
将得到的含有黑豆肽的乳液进行测试测试结果如下：
表5
| 黑豆肽添加量(mg/mL) | TBARS(mg MDA/kg) |
| 0 | 0.1645±0.0035 |
| 2 | 0.1385±0.0050 |
| 4 | 0.134±0.0028 |
| 6 | 0.125±0.0028 |
| 8 | 0.117±0.0014 |
| 10 | 0.1175±0.0078 |
对比例4
具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽在油脂抗氧化中的应用，包括如下步骤：
30％(v/v，mL/mL)菜籽油与实施例1的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽，混合均匀，再加入1％(mL/mL)吐温80与69％(mL/mL)超纯水，混合均匀，在1000rpm磁力搅拌30min，15000rpm剪切2min，均质，得到含有黑豆肽的乳液；其中具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽的浓度为2mg/mL。
将得到的含有黑豆肽的乳液进行测试测试结果如下：
TBARS值为0.14005±0.0028mg MDA/kg。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种制备具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)红外预处理：
将黑豆蛋白粉在100～150℃下红外预处理10～30min，得到预处理的黑豆蛋白粉；
(2)蛋白酶酶解处理：
将步骤(1)得到的预处理的黑豆蛋白粉配制为溶液，采用菠萝蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
(3)冷冻干燥：
将步骤(2)的酶解液进行离心、收集上清液进行冷冻干燥，得到多肽粉；
(4)提取亲脂多肽：
将步骤(3)得到的多肽粉溶于乙醇/正己烷混合溶液，提取，离心、收集上清液；浓缩，干燥，得到所述的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的酶解的条件为：酶解温度为45～65℃，酶解时间为3～5h，pH为6.0～8.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的乙醇/正己烷混合溶液中乙醇和正己烷的体积比为1：3～4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的菠萝蛋白酶在配制的溶液中的浓度为1～3％(w/v，g/mL)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的多肽粉和乙醇/正己烷混合溶液用量比为3～6g：30～60mL。
6.权利要求1～5任一项所述的方法制备得到的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽。
7.权利要求6所述的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽在油脂抗氧化中的应用。
8.一种制备具有抗氧化性的油脂乳液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将油相、乳化剂、水相混合均匀，再加入权利要求6所述的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽，混合均匀，搅拌、剪切、均质，得到具有抗氧化性的油脂乳液；
或
将油相、乳化剂、水相混合，搅拌、剪切、均质，得到乳液；之后再加入权利要求6所述的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽，混合均匀，得到具有抗氧化性的油脂乳液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的具有抑制乳液氧化功能的黑豆肽在乳液中的浓度为2～10mg/mL。
10.权利要求8或9所述的方法制备得到的具有抗氧化性的油脂乳液。
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