CN114732849B - 靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物及口腔喷剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物及口腔喷剂，其靶向新冠病毒入侵复制全过程的中药挥发油组合物，包括杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油中的三种及以上。本发明涉及的靶向冠状病毒入侵复制全过程的中药挥发油组合物以传统中医药挥发油作为筛选材料，以新型冠状病毒的生活周期为依据挑选出靶向新型冠状病毒的多靶点，通过实验筛选出具有抗新型冠状病毒的抗病毒组合物。

Description

靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物及口腔喷剂
技术领域
本发明是靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物及口腔喷剂，属于挥发油组合物技术领域。
背景技术
目前，新型冠状病毒及其变异病毒在全世界范围内大肆流行，通过接触、飞沫或气溶胶等方式进行快速传播。通过对有症状或无症状的受感染者进行检测，发现在无症状和有症状的新型冠状病毒感染患者的唾液中均能检测到较高的新型冠状病毒载量，人们进一步对新型冠状病毒及受感染者进行检测发现，新型冠状病毒症状的严重程度与受感染者的口腔唾液病毒载量相关，病毒在人们唾液腺和口腔粘膜中复制，导致人们被感染甚至致使受感染者丧失味觉和嗅觉，由此看来，口腔粘膜和唾液似乎是该病毒传播的高危途径，使口腔中的病毒失活是降低病毒源头传染性的重要策略之一。
传统的消毒剂，如酒精、含氯消毒剂、过氧化物类物质都能灭活新型冠状病毒，但上述物质只能适用于体外消毒，且长期使用易对人们的皮肤组织、呼吸系统等造成损伤，尤其不适合直接作用于口腔中。
传统中药挥发油是以特定的方法从天然植物中提取得到的植物代谢产物，原料简单易得，大多具有芳香气味成分，富含酮、萜、醛、醇等活性物质，具有增强免疫、抑菌、抗病毒等活性，因此具有一定的微生物及病毒灭杀或抑制作用，被广泛的应用于药物、抗菌剂、抗病毒剂等产品中，与传统化学药物产品相比，中药挥发油不仅具有较好的抗菌杀毒功效，还具有安全、高效、可持续等特点，更不易产生耐药性，因此，利用传统中药挥发油开发安全、环保的抗新型冠状病毒药剂具有广阔前景。
但是，中药挥发油成分易挥发，随着放置时间延长，有效成分含量会显著下降，降低效果；不同中药挥发油配伍不当可能会产生毒副作用；同时中药挥发油不溶于水，会限制其产品形式，造成中药挥发油药剂的应用场景受限，不利于以中药挥发油为原料的抗新型冠状病毒药剂的发展。
且目前，用于抗新冠口服制剂主要是针对ACE2靶点。Daniell等人开发了一种含有ACE2蛋白的口香糖，通过去除唾液中的SARS-CoV-2来减少口腔病毒的传播和感染；另一项研究通过新合成的多肽与SARS-CoV-2竞争ACE2受体来抑制病毒对宿主的入侵。然而，这些口服制剂只专注于单一的蛋白质靶点，考虑到病毒生命周期的不同阶段的存在，我们希望通过靶向新冠病毒多靶点，在不同阶段破坏病毒感染和复制过程，从而最大限度地发挥杀灭病毒的效果。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物及口腔喷剂，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述第一个目的，提供靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物，本发明通过如下技术方案实现。
靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物，包括杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油中的三种及以上。
为了设计对抗SARS-CoV-2感染的治疗策略，了解这种冠状病毒如何在感染过程中侵染宿主以及复制，对于开发相关制剂是至关重要的。事实上，SARS-CoV-2的复制依赖于病毒本身和宿主细胞的许多蛋白质或酶；原则上，这些蛋白质和酶代表了潜在的治疗靶点；当S蛋白与位于宿主细胞表面上的称为血管紧张素转换酶2（ACE2）的细胞受体结合时，冠状病毒开始了其生命周期，宿主蛋白丝氨酸蛋白酶如组织蛋白酶L（Cathepsin L）与弗林蛋白酶（furin）与S蛋白的活化相关，随后，病毒进宿主后，其主要蛋白酶（Mpro/3CL）在病毒的复制发挥重要作用，鉴于这四种蛋白（ACE2、Cathepsin L、Mpro/3CL、和furin）在病毒入侵和复制中的作用，可判断出它们为抗新型冠状病毒有价值的靶点。经过筛选得到的杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油则可分别重点针对上述四种蛋白起到靶向抑制作用，上述挥发油均具有不同程度的抗病毒作用，尤其复配后具有高效的抑制新冠假病毒的入侵以及抗小鼠冠状病毒效果。
优选的，以体积份数计，包括1-5份杭白菊挥发油、0.5-5份金银花挥发油、0.5-5份金莲花挥发油、0.5-5份艾叶挥发油。
优选的，以体积份数计，包括5份杭白菊挥发油、0.5份金银花挥发油、0.5份金莲花挥发油、0.5份艾叶挥发油。
为了实现第二个目的，提供一种以上述靶向抑制新冠病毒入侵复制的中药挥发油组合物为主要原料制得的靶向抑制冠状病毒入侵复制的口腔喷剂，本发明通过下述技术方案实现。
靶向抑制冠状病毒入侵复制的口腔喷剂，以体积份数计，包括2.5-20%上述所述的靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物、0.5-1%磷脂、1-10%甘油、余量水。该抗病毒口腔喷剂选择的原料均为高效、易获得、生产成本低的物质，靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物最大化的发挥了针对冠状病毒的预防效果，具有抑制甚至杀灭口腔中新型冠状病毒的功能，抑制新型冠状病毒的复制，有效防止携带有新型冠状病毒的唾液飞沫传播，有效的起到抑制冠状病毒的传播和扩散；磷脂和甘油提高了口腔喷剂的粘附力，同时还可形成脂质体包裹住中药挥发油组合物，使中药挥发油组合物均匀的分散在口腔喷剂中，还可避免靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物在口腔作用部位被快速清除，延长靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物的滞留时间，提高靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物的抗新型冠状病毒的效果。
优选的，以体积份数计，包括5%杭白菊挥发油、0.5%金银花挥发油、0.5%金莲花挥发油、0.5%艾叶挥发油、0.5-1%磷脂、1-10%甘油、余量水。
为了实现第三个目的，提供靶向抑制冠状病毒入侵复制的口腔喷剂的制备方法，本发明通过下述技术方案实现。
靶向抑制冠状病毒入侵复制的口腔喷剂的制备方法，用于制备上述的靶向抑制冠状病毒入侵复制的口腔喷剂，包括以下步骤：
S1. 将磷脂、甘油按比例加入适量水中，高速剪切分散均匀，得到基础液，加热备用；
S2.分别提取杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油按比例混合均匀，得到靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物，分别加热备用；
S3.将步骤S2得到的靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物缓慢滴加至步骤S1得到的基础液中，搅拌均匀；
S4.向步骤S3得到的溶液中加水至所需量，调节pH值，高压乳匀数次，灌装既得。
优选的，所述步骤S2中杭白菊挥发油的提取步骤为：
S21.称取中药杭白菊，粉碎后，准备若干干净的圆底三口烧瓶，备用；
S22.将步骤S21备好的粉碎后的中药杭白菊溶于10倍量水，浸泡12个小时，倒入备好的圆底三口烧瓶中，将圆底三口烧瓶于球形冷凝连接，采用电热套解热，反应完全后倒出溶液；
S23.将步骤S22得到的深色浓稠物即为挥发油，储存于-20℃，备用。
优选的，所述步骤S2中金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油的提取步骤与杭白菊挥发油的提取步骤相同。
优选的，所述步骤S4中调节pH值为8-9范围内。弱碱性的环境能提高靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物的存活时间，提高口腔喷剂的抗病毒效果。
优选的，所述步骤S4中高压乳匀的压力在80-90 MPa范围内，次数在5-9之间。多次的乳匀使口腔喷剂内各组分达到较好的匀质分散效果。
本发明的有益效果：
（1）本发明涉及靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物，该靶向抑制新冠病毒入侵复制的中药挥发油组合物以传统中医药挥发油作为筛选材料，以新型冠状病毒的生活周期为依据挑选出靶向新型冠状病毒的多靶点，通过实验筛选出具有抗冠状病毒的抗病毒组合物。
（2）本发明涉及靶向抑制冠状病毒入侵复制的口腔喷剂，该口腔喷剂的主要原料为由杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油组成的靶向多靶点抑制新冠病毒入侵复制的中药挥发油组合物组成，天然、温和、无刺激，具有安全、环保等优势，具有重大的市场价值和社会意义。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为新型冠状病毒的生活周期；
图2为9种单味中药挥发油对血管紧张素转换酶2的抑制结果示意图；
图3为9种单味中药挥发油对组织蛋白酶L的抑制结果示意图；
图4为9种单味中药挥发油对主蛋白酶的抑制结果示意图；
图5为9种单味中药挥发油对弗林蛋白酶的抑制结果示意图；
图6为口腔喷剂对新冠病毒S蛋白假病毒的抑制活性的结果示意图；
图7为口腔喷剂对小鼠冠状病毒的抑制结果示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1 确定靶向多靶点抗冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物
1.筛选新型冠状病毒靶点蛋白
研究新型冠状病毒的生活周期，如图1所示，多个靶点参与新冠病毒的入侵、复制与出芽等过程，筛选出多个在新型冠状病毒入侵人体以及复制过程中起关键作用的蛋白。
（1）血管紧张素转换酶2（ACE2）：血管紧张素转换酶2与激活的S蛋白结合后会促进新型冠状病毒进入宿主细胞，因此抑制血管紧张素转换酶2蛋白的活性将起到抑制新型冠状病毒入侵宿主细胞的作用。
（2）组织蛋白酶L（Cathepsin L）：组织蛋白酶L具有切割S蛋白，促进S蛋白活性的作用，会促进新型冠状病毒侵入宿主细胞，因此抑制组织蛋白酶L蛋白的活性将起到抑制新型冠状病毒入侵宿主细胞的作用。
（3）主蛋白酶（Mpro）：主蛋白酶Mpro/3CL是新型冠状病毒多聚蛋白切割加工所必不可少的蛋白酶，因此抑制主蛋白酶蛋白的活性会阻止新型冠状病毒的复制。
（4）弗林蛋白酶（Furin）：新型冠状病毒的S蛋白中含有弗林蛋白酶样切割位点（FCS），是新型冠状病毒高致病性的原因之一，因此抑制弗林蛋白酶将有利于抑制新型冠状病毒入侵宿主。
2.筛选单味中药挥发油
从现有的数据库中查阅大量关于具有“抗病毒”以及“体外抗病毒”的“挥发油”的文献，挑选出具有消炎杀菌抗病毒功能的62种单味中药挥发油，依据新型冠状病毒的抗病毒机制，初步得到9种单味中药挥发油：杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油、野菊花挥发油、鱼腥草挥发油、石香薷挥发油、麻叶千里光挥发油以及红枫叶挥发油。
结合新型冠状病毒的生活周期，依次将9种单味中药挥发油作用在4种新型冠状病毒靶点蛋白上，筛选出抗病毒效果最好的四种中药挥发油。
（1）筛选作用于血管紧张素转换酶2的中药挥发油：通过血管紧张素转换酶2抑制剂筛选试剂盒（碧云天，货号P0320S）的说明书进行实验操作，配置化学试剂（每孔92µL的Buffer缓冲液以及1µL的血管紧张素转换酶2），按照表1所示依次加入检测试剂和样品，待测样品加全后，混匀，每个样品进行3个重复孔的检测，37℃避光孵育45 min后使用酶标仪进行荧光检测（Ex/Em=325/393nm）设置4组实验，分别为样品组、酶对照组、阳性对照组、空白对照组。分别对应记录为RFU（空白对照）、RFU（100%酶活性对照）、RFU（阳性对照）和RFU（样品）。筛选出抑制作用最佳的靶向血管紧张素转换酶2的中药挥发油，计算每个样品和空白对照的平均荧光值，通过公式“抑制率(%)=[RFU(100%酶活性对照)-RFU(样品)]/[RFU(100%酶活性对照)-RFU(空白对照)]×100%”计算每个样品的抑制百分率，筛选结果如图2所示，抑制作用最佳的靶向血管紧张素转换酶2的中药挥发油为杭白菊挥发油。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（2）筛选作用于组织蛋白酶L的中药挥发油：通过组织蛋白酶L抑制剂筛选试剂盒（荧光型）（维百奥，货号K161-100）的说明书进行实验操作，筛选出抑制作用最佳的靶向组织蛋白酶L的中药挥发油。
制备组织蛋白酶L酶溶液：将1µl的CTSL试剂加至1µl的组织蛋白酶L酶中，用于稀释组织蛋白酶L酶。室温下预孵育组织蛋白酶L酶溶液30min，加入8µl的CTSL检测缓冲液，进一步稀释组织蛋白酶L酶。
将各单味挥发油分别溶解于乙醇溶剂中，用CTSL检测缓冲液稀释至5%，备用。
向96孔的白色孔板的孔中加入48µl CTSL检测缓冲液、1µl的DTT溶液、1µl进一步稀释后的组织蛋白酶L酶，混合均匀，形成共50µl的组织蛋白酶L酶溶液。
共设3组实验，分别为样品组、酶对照组、阳性对照组。
样品组（S）：向孔中加入10µl稀释后的挥发油。
酶对照组（EC）：向孔中加入10µl CTSL检测缓冲液。
阳性对照组（IC）：向孔中加入1µl的CTSL抑制剂和9µl的CTSL检测缓冲液。
上述3组实验在室温下孵育15 min，使用酶标仪进行荧光检测，在动力学模式下测量荧光30min，选择任意两个时间点（T1和T2），得到相应的荧光值（RFU1和RFU2），通过公式“相对抑制率%=（SlopEC-SlopS）/SlopEC*100”计算每个样品的抑制百分率。结果如图3所示，金银花挥发油靶向组织蛋白酶L的抑制效果最佳。
（3）筛选作用于主蛋白酶的中药挥发油：通过新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒（增强型）（碧云天，货号P0315S）的说明书进行实验操作。
将各单味挥发油用乙醇稀释10倍，配制适量的化学试剂（每孔90µL的AssayBuffer和1µL的2019-nCoV Mpro/3CLpro），按照表2依次加入检测试剂和样品，每个样品3个重复。共设4组实验，分别为样品组、酶对照组、阳性对照组、空白对照组。最后于冰上快速加入4µL的Substrate并混匀。37℃避光孵育5 min，使用多功能酶标仪进行荧光测定。
计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，分别记录为RFU（样品）、RFU（100%酶活性对照）、RFU（阳性对照）和RFU（空白对照）。通过公式“抑制率（%）=[RFU（100%酶活性对照）-（RFU样品）]/ [RFU（100%酶活性对照）-RFU（空白对照）]×100%”计算每个样品的抑制百分率，筛选出抑制作用最佳的靶向主蛋白酶的中药挥发油，将单味中药挥发油用乙醇进行稀释，筛选结果如图4所示，靶向主蛋白酶的中药挥发油中，金莲花挥发油的抑制效果最佳。
Figure 246868DEST_PATH_IMAGE002
（4）筛选作用于弗林蛋白酶的中药挥发油：通过弗林蛋白酶抑制剂筛选试剂盒（荧光型）（维百奥，货号K2069-100）的说明书进行实验操作。
用Assay buffer缓冲液以1：20的比例稀释弗林蛋白酶，将8 µl稀释后的弗林蛋白酶分别加入到标记为样品组、溶剂对照组、抑制剂组和100%酶对照组的96孔白色板的孔中，再用Assay buffer缓冲液将所有孔内反应液体积调整至25µl。
将各单味挥发油溶解在乙醇中稀释成50%原液，再使用Assay buffer缓冲液将50%原液挥发油稀释至2%的挥发油稀释液。
设置5组实验组，分别为：样品组、溶剂组、酶对照组、阳性对照组、空白对照组。
样品组：加入25µl稀释后的挥发油。
溶剂组：加入25µl溶剂乙醇。
酶对照组：加入25µl的Assay buffer缓冲液。
阳性对照组：加入2 µl 100µM Furin抑制剂，加入23 µl FurinAssay buffer将体积调节至50µl/孔。
空白对照组：加入50µl的Assay buffer缓冲液。
在室温下孵育30min，避光。使用多功能酶标仪进行荧光测定，在动态模式、Ex/Em=360/460nm条件下，每间隔5min检测一次，共检测60 min，选择任意两个时间点（T1和T2），并得到相应的荧光值（RFU1和RFU2）。通过公式“相对抑制率%=（SlopEC-SlopS）/SlopEC*100”计算每个样品的抑制百分率，筛选出抑制作用最佳的靶向弗林蛋白酶的中药挥发油，将单味中药挥发油用乙醇进行稀释，筛选结果如图5所示，靶向弗林蛋白酶的中药挥发油中，艾叶挥发油的抑制效果最佳。
3.确定靶向多靶点抗病毒挥发油组合物
将筛选出的四个单味中药挥发油进行组合，形成靶向新冠病毒入侵复制的中药挥发油组合物：杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油，各单味中药挥发油的添加量在口腔喷剂中进行配比。
实施例2
由下述步骤制备口腔喷剂：
S1. 将磷脂、甘油按10%：20%的比例加入适量水中，高速剪切分散均匀，得到基础液，加热备用；
S2.分别提取杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油，按比例混合均匀，得到靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物，加热备用；
以体积份数计，靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物包括1份杭白菊挥发油、0.5份金银花挥发油、0.5份金莲花挥发油、0.5份艾叶挥发油，以体积份数计，靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物占口腔喷剂的体积的2.5%，具体的，即在口腔喷剂中的各自占比为1%杭白菊挥发油、0.5%金银花挥发油、0.5%金莲花挥发油、0.5%艾叶挥发油；
提取杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油的步骤为：
S21.分别称取中药杭白菊、中药金银花、中药金莲花、中药艾叶各100 g备用，准备四个干净的1000 mL圆底三口烧瓶备用；
S22.分别将步骤S21备好的100g的中药杭白菊、中药金银花、中药金莲花、中药艾叶溶于10倍量水，浸泡12个小时，倒入备好的圆底三口烧瓶中，将圆底三口烧瓶于球形冷凝连接，采用电热套解热，反应完全后倒出溶液；
S23.将步骤S22得到的深色浓稠物即为挥发油，储存于-20℃，备用。
S3.将步骤S23得到的靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物缓慢滴加至步骤S1得到的基础液中，搅拌均匀；
S4.向步骤S3得到的溶液中加水至所需量，调节pH值在8-9之间，在80-90 MPa的压力下高压乳匀5-9次，7次最佳，灌装既得。
以体积份数计，该实施例中制备得到的口腔喷剂包括1%杭白菊挥发油、0.5%金银花挥发油、0.5%金莲花挥发油、0.5%艾叶挥发油、1%磷脂、5%甘油、91.5%水。
实施例3
以实施例2所述的方法制备口腔喷剂，得到的口腔喷剂包括2%杭白菊挥发油、1%金银花挥发油、0.5%金莲花挥发油、0.5%艾叶挥发油、1%磷脂、5%甘油、90%水。
实施例4
以实施例2所述的方法制备口腔喷剂，得到的口腔喷剂包括3%杭白菊挥发油、1%金银花挥发油、1%金莲花挥发油、1%艾叶挥发油、0.5%磷脂、10%甘油、83.5%水。
实施例5
以实施例2所述的方法制备口腔喷剂，得到的口腔喷剂包括5%杭白菊挥发油、1%金银花挥发油、1%金莲花挥发油、1%艾叶挥发油、0.5%磷脂、5%甘油、86.5%水。
实施例6
以实施例2所述的方法制备口腔喷剂，得到的口腔喷剂包括5%杭白菊挥发油、0.5%金银花挥发油、0.5%金莲花挥发油、0.5%艾叶挥发油、1%磷脂、5%甘油、87.5%水。
对比例1
以实施例2的步骤制备口腔喷剂，不同之处在于，得到的口腔喷剂只包括5%杭白菊挥发油、0.5%金银花挥发油、0.5%金莲花挥发油，不添加艾叶挥发油。
对比例2
以实施例2的步骤制备口腔喷剂，不同之处在于，得到的口腔喷剂只包括5%杭白菊挥发油、0.5%金银花挥发油、0.5%艾叶挥发油，不添加金莲花挥发油。
对比例3
以实施例2的步骤制备口腔喷剂，不同之处在于，得到的口腔喷剂只包括5%杭白菊挥发油、0.5%金莲花挥发油、0.5%艾叶挥发油，不添加金银花挥发油。
对比例4
以实施例2的步骤制备口腔喷剂，不同之处在于，得到的口腔喷剂只包括0.5%金银花挥发油、0.5%金莲花挥发油、0.5%艾叶挥发油，不添加杭白菊挥发油。
试验例1 口腔喷剂的细胞毒性试验
根据GB/T 16886.10-2005中记载的方法，采用四唑盐（MTT）比色法对口腔喷剂进行生物相容性评价，将实施例2-6、对比例1-4中制得的口腔喷剂与细胞在体外进行接触培养，通过对细胞形态、增殖和抑制的影响的观察，评价口腔喷剂样品的体外细胞毒性作用，同时用花生油口腔喷剂作为对照，试验结果如表3所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表3表明，该口腔喷剂的毒性较低，不会影响细胞的正常生长，可安全使用。
试验例2口腔喷剂对新冠病毒S蛋白假病毒的抑制率
将汇合率在60-70%的ACE2过表达的HEK-293T细胞（来源：金唯智生物科技有限公司）接种于96孔白色培养板（细胞量为6000个/孔）。
将1×106 TU/mL的新冠病毒S蛋白假病毒（11991ES50，YEASEN）与口腔喷剂（1%体积分数）在无胎牛血清的DMEM培养基中，于室温下孵育30 min。
用100 µL新冠病毒S蛋白假病毒与口腔喷剂的混合培养物感染HEK-293T细胞，静置5 h。加入100 µL含5%胎牛血清的DMEM培养基，再孵育48 h。弃上清，加入100 µL荧光素酶检测试剂（L00877C-100，Genscript），使用酶标仪测定荧光素酶活性。
共设9组试验组，每组中与新冠病毒S蛋白假病毒混合的口腔喷剂分别来自于实施例2-6和对比例1-4。每组试验组设置3-4个平行。同时设置对照组以及阴性对照组。
对照组：滴加假病毒且不加入其他喷剂。
阴性对照组：以1×106 TU/mL滴度的假病毒与含1%花生油喷剂在无血清DMEM培养基中室温下孵育30 min。
口腔喷剂对新冠病毒S蛋白假病毒的抑制活性的荧光强度测定结果如图6所示，从图6中可以看出，以靶向新冠病毒入侵复制的中药挥发油组合物为原料的口腔喷剂具有较好的抑制新冠假病毒入侵的效果；尤其实施例6，当口腔喷剂中靶向新冠病毒入侵复制的中药挥发油组合物的配比为5份杭白菊挥发油、0.5份金银花挥发油、0.5份金莲花挥发油、0.5份艾叶挥发油时，其对假病毒的抑制效果最好；从对比例1-4可看出，当口腔喷剂中只含三种单味中药挥发油时，其抑制加病毒的效果也会远低于添加靶向新冠病毒入侵复制的中药挥发油组合物所达到的效果。
试验例3空斑实验测试
本试验例用于测定口腔喷剂对小鼠冠状病毒MHV-A59（与SARS-CoV-2同属于β冠状病毒属，相似度66.02%）的抑制率。
取长满单层L2细胞的24孔板，每孔内以50 PFU/mL的滴度滴加小鼠冠状病毒，在37℃、5% CO2条件下吸附2小时后弃去病毒液，向每孔内加入1 mL含10 µL的口腔喷剂的DMEM培养基，共设9组试验组即为实施例2-6和对比例1-4，每组2-3个平行。
同时设置空白对照组以及阴性对照组。
空白对照组：不滴加小鼠冠状病毒和口腔喷剂。
阴性对照组：取长满单层L6细胞的24孔板，每孔内以50 PFU/mL的滴度滴加小鼠冠状病毒，在37℃、5% CO2条件下吸附2小时后弃去病毒液，向每孔内加入1 mL含10 µL的花生油喷剂的DMEM培养基。
每个孔板设置３组平行，在37℃、5% CO2条件下培养，并在15 min、30 min、60 min、90 min的时间点观察细胞病变效应，去除覆盖培养基，每孔加入500 μL固定液固定5-10min，吸弃固定液，再向每孔中加入200 μL浓度为1％的结晶紫染液静置20 min，清水洗脱后在解剖镜下观察空斑数量并计算抑制率，抑制率的计算公式为：抑制率=（空白对照孔空斑数-样品孔空斑数）／空白对照孔空斑数×100%，抑制率结果如表4和图7所示。
Figure 226326DEST_PATH_IMAGE004
通过表4可以看出，以靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物为原料的口腔喷剂具有较好的抗小鼠冠状病毒的效果；图7中，可以更直观的观察到口腔喷剂（靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物）的抑制率结果，当口腔喷剂中靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物的配比为5%杭白菊挥发油、0.5%金银花挥发油、0.5%金莲花挥发油、0.5%艾叶挥发油时，其对小鼠冠状病毒的抑制效果最好，当口腔喷剂中只含三种单味中药挥发油时，其抗小鼠冠状病毒的效果也会远低于添加靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物所达到的效果。由此可以看出，该口腔喷剂具备抗其他冠状病毒的作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物，其特征在于：以体积份数计，由1-5份杭白菊挥发油、0.5-5份金银花挥发油、0.5-5份金莲花挥发油、0.5-5份艾叶挥发油组成。
2.根据权利要求1所述的靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物，其特征在于：以体积份数计，由5份杭白菊挥发油、0.5份金银花挥发油、0.5份金莲花挥发油、0.5份艾叶挥发油组成。
3.靶向抑制冠状病毒入侵复制的口腔喷剂，其特征在于：以体积份数计，由2.5-20%权利要求1或2所述的靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物、0.5-1%磷脂、1-10%甘油、余量水组成。
4.根据权利要求3所述的靶向抑制冠状病毒入侵复制的口腔喷剂，其特征在于：以体积份数计，由5%杭白菊挥发油、0.5%金银花挥发油、0.5%金莲花挥发油、0.5%艾叶挥发油、0.5-1%磷脂、1-10%甘油、余量水组成。
5.靶向抑制冠状病毒入侵复制的口腔喷剂的制备方法，用于制备如权利要求3所述的靶向抑制冠状病毒入侵复制的中药口腔喷剂，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将磷脂、甘油按比例加入适量水中，高速剪切分散均匀，得到基础液，加热备用；
S2.分别提取杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油、艾叶挥发油，按比例混合均匀，得到靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物，分别加热备用；
S3.将步骤S2得到的靶向冠状病毒入侵复制的中药挥发油组合物缓慢滴加至步骤S1得到的基础液中，搅拌均匀；
S4.向步骤S3得到的溶液中加水至所需量，调节pH值为8-9范围内，高压乳匀的压力在80-90 MPa范围内，次数在5-9之间，灌装既得。
6.根据权利要求5所述的靶向抑制冠状病毒入侵复制的口腔喷剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中杭白菊挥发油、金银花挥发油、金莲花挥发油或艾叶挥发油的提取步骤为：
S21.称取中药杭白菊、金银花、金莲花或艾叶之一，粉碎后，准备若干干净的圆底三口烧瓶，备用；
S22.将步骤S21备好的粉碎后的中药溶于10倍量水，浸泡12个小时，倒入备好的圆底三口烧瓶中，将圆底三口烧瓶于球形冷凝连接，采用电热套解热，反应完全后倒出溶液；
S23.将步骤S22得到的深色浓稠物即为挥发油，储存于-20℃，备用。
7.权利要求1或2所述中药挥发油组合物在制备抑制SARS-CoV-2药物中的应用。
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基于分子对接和网络药理学探讨金银花防治新型冠状病毒肺炎潜在作用机制;严宝飞等;《食品安全质量检测学报》;20200725(第14期);全文 *

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