CN114728023A - 自体胸腺组织移植 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于保留或恢复有需要的对象的胸腺功能的方法和试剂盒。本文公开的方法和试剂盒包括将自体胸腺组织递送到对象的至少一个淋巴结中。在一个方面中，本公开提供了用于保留或恢复已经接受或正在接受胸腺切除手术的对象的胸腺功能的方法。
Description
1.相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年8月5日提交的美国临时申请序列号62/882,887的优先权，其内容通过引用整体纳入本文。
2.技术领域
本发明提供了用于保留或恢复有需要的对象(例如，人对象)的胸腺功能的方法，例如，在胸腺切除手术之后。
3.背景
胸腺是免疫系统的淋巴器官，可以产生和成熟T细胞。胸腺切除术通常用于治疗各种胸腺相关疾病，其中胸腺被手术切除。对于患有重症肌无力、胸腺瘤或胸腺肿瘤的患者，胸腺切除术可能是一种有效的治疗选择。
由于已知胸腺在胎儿和出生后早期最为活跃，因此其大小和活动在生命的最初几年后会开始下降。某些儿童(例如新生儿和婴儿)可以常规进行胸腺切除术以矫正先天性心脏缺陷。由于胸腺可能会位于胸骨下方，阻塞通往心脏的通路，因此可以进行部分或全部胸腺切除术，以具有通往心脏和大血管畅通的通路。在美国，每年约有20,000名婴儿接受胸腺切除术。
然而，胸腺切除术被认为消除了T细胞成熟的主要来源，并可能导致严重的长期临床影响，例如自身免疫性疾病、癌症、感染、特应性疾病和过早免疫老化(prematureimmunologic aging)。尽管胸腺切除术普及，但对于接受过胸腺切除术的儿童，还没有足够有效的治疗方法。
因此，仍然需要有效的治疗方法来保留或恢复已进行胸腺切除术的对象的胸腺功能。本发明的主题提供这样的治疗。
4.发明内容
本发明提供了用于保留或恢复有需要的对象(例如，人对象)的胸腺功能的技术和试剂盒。本发明的主题至少部分基于以下发现：接受过胸腺切除术的儿童，尤其是新生儿和婴儿，可能会发展为严重的长期临床病症和疾病，包括自身免疫性疾病、癌症、感染、特应性疾病和过早的免疫老化。
一方面，本发明提供了一种用于保留或恢复已经接受或正在接受胸腺切除手术的对象的胸腺功能的方法。该方法包括将胸腺组织递送到对象的至少一个淋巴结中，其中胸腺组织对于对象是自体的。
在某些实施方式中，对象患有先天性心脏缺陷。在某些实施方式中，对象已经接受或正在接受心脏直视手术(open heart surgery)。
在某些实施方式中，对象已经接受或正在接受胸腺切除手术。在非限制性实施方式中，当对象是新生儿或婴儿时进行胸腺切除手术。
在某些实施方式中，对象是人对象。在某些实施方式中，对象是新生儿或婴儿。在某些实施方式中，对象是儿童、成年或青少年。
在某些实施方式中，胸腺组织是在胸腺切除手术期间从对象获得的。在某些实施方式中，胸腺组织是在胸腺切除手术之前从对象获得的。
在某些实施方式中，胸腺组织是切碎的胸腺片段。在某些实施方式中，胸腺组织在递送前离体培养。在某些实施方式中，胸腺组织在递送前离体培养至少24小时。在某些实施方式中，胸腺组织通过针被递送到对象的淋巴结中。
在某些实施方式中，胸腺组织通过针被递送到对象的淋巴结中。
在某些实施方式中，胸腺组织在胸腺切除手术期间被递送到淋巴结中。在某些实施方式中，胸腺组织在胸腺切除手术后被递送到淋巴结中。
在某些实施方式中，胸腺组织在递送到淋巴结之前被冷藏保存。在某些实施方式中，在胸腺切除手术后将冷藏保存的胸腺组织递送到淋巴结中。在某些实施方式中，冷藏保存的胸腺组织在胸腺切除手术后约1周、约2周、约3周、约4周、约2个月、约4个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约10年、约15年、约20年或更长时间被递送进淋巴结。
在某些实施方式中，胸腺组织为恢复对象的胸腺功能的有效量。在某些实施方式中，胸腺组织为能在淋巴结中扩增的有效量，其中扩增的胸腺组织恢复对象的胸腺功能。
在某些实施方式中，胸腺组织的量为至少约0.1克。在某些实施方式中，胸腺组织的量高达约20克。在某些实施方式中，胸腺组织的大小至少约为0.1cm3。在某些实施方式中，胸腺组织的大小多达约20cm3。
在某些实施方式中，胸腺组织被递送到对象的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个淋巴结。在某些实施方式中，胸腺组织是冷藏保存的胸腺组织。在非限制性实施方式中，对象的全部胸腺重量的至少约三分之一被递送到对象的至少一个淋巴结中。
在另一个方面，本发明提供了一种用于保留或恢复对象胸腺功能的试剂盒。该试剂盒包括胸腺组织和用于将胸腺组织递送至对象的至少一个淋巴结的工具，其中胸腺组织对于对象而言是自体的。
在某些实施方式中，试剂盒还包括溶液，其中胸腺组织在溶液中提供。在某些实施方式中，溶液包括药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的稀释剂或药学上可接受的运载体。
在某些实施方式中，胸腺组织为恢复对象的胸腺功能的有效量。在某些实施方式中，胸腺组织为能在淋巴结中扩增的有效量，其中扩增的胸腺组织恢复对象的胸腺功能。
在某些实施方式中，该试剂盒还包括包括将胸腺组织递送至对象的至少一个淋巴结的说明书。在非限制性实施方式中，该说明书包括将对象的全部胸腺重量的至少约三分之一递送到对象的至少一个淋巴结中。
在某些实施方式中，用于递送胸腺组织的工具包括微创手术所需的针和工具。
在某些实施方式中，对象已经接受或正在接受胸腺切除手术。
5.附图简要说明
图1A-1C描述了收集并移植的野生型新生胸腺。图1A显示了根据本发明用于移植的BALB/c野生型新生胸腺重量的条形图。图1B显示了根据本发明移植了1/4、1/2或1个胸腺叶或整个胸腺的BALB/c裸鼠数量的条形图。图1C是条形图，显示了多少BALB/c裸鼠被移植了根据本发明的以mg表示的每一剂量的胸腺。
图2A-2E说明了移植四个月后外周血T细胞的流式细胞术分析。图2A显示根据本发明的未移植的(UnTx)BALB/c裸鼠、胸腺移植的(Tx)BALB/c裸鼠和BALB/c野生型小鼠中CD3+T细胞百分比的流式细胞术点图。细胞首先针对单峰进行门控，然后是活细胞、CD45+细胞，最后是CD3表达。图2B显示了根据本发明的具有CD3+的CD45+细胞百分比的散点图。图2C显示了根据本发明的具有CD4+的CD3+细胞百分比的散点图。图2D显示了根据本发明的具有CD8+的CD3+细胞百分比的散点图。图2E显示根据本发明的胸腺移植BALB/c裸鼠中为CD3+T细胞的CD45+细胞百分比的平均值和SEM的散点图。
图3A-3B显示移植5个月后外周血T细胞的流式细胞术分析。图3A显示根据本发明的1/4、1/2、1或2个胸腺叶-移植BALB/c裸鼠中为CD3+T细胞的CD45+细胞百分比的平均值和标准偏差的条形图。图3B显示了在图3A的小鼠中表达TCR-Vβ变体的T细胞百分比的条形图。BALB/c野生型小鼠代表阳性对照(CNTRL)。
图4A-4B显示胸腺组织片段移植六个月后的淋巴结重量。图4A显示了根据本发明的胸腺叶移植的BALB/c裸鼠中平均淋巴结(LN)重量的散点图。图4B显示根据本发明的胸腺移植BALB/c裸鼠中淋巴结(LN)重量的平均值和SEM的散点图。
图5A-5H显示流式细胞术点图，显示根据本发明使用流式细胞术的门控方法，对效应物/效应记忆T-细胞(CD4+CD3+CD44+CD62L-)和(CD8+CD3+CD44+CD62L-)；中央记忆T细胞(CD4+CD3+CD44+CD62L+)和(CD8+CD3+CD44+CD62L+)；激活的效应T细胞(CD4+CD3+CD44-CD62L-)和(CD8+CD3+CD44-CD62L-)；幼稚T细胞(CD4+CD3+CD44-CD62L+)和(CD8+CD3+CD44-CD62L+)。图5A说明了前向散射与侧向散射门。图5B说明了针对单细胞的门。图5C说明了针对活细胞的门。图5D说明了针对CD45+细胞的门。图5E说明了针对CD3+细胞的门。图5F说明了针对CD4+和CD8+细胞的门。图5G说明了针对幼稚的、激活效应的、效应记忆的和中央记忆细胞的CD4+细胞的门控。图5H说明了针对幼稚的、激活效应的、效应记忆的和中央记忆细胞的CD8+细胞的门控。
图6A-6E显示胸腺组织片段移植到成年和老年小鼠的淋巴结后7周，外周血T细胞亚集的流式细胞术分析。图6A显示了根据本发明在接受或不接受1/4胸腺叶移植(Tx)的成年或老年C57BL/6J雌性中的幼稚、效应和效应记忆以及中央记忆CD4+T细胞亚群的流式细胞术点图。图6B-6E显示，根据本发明，在接受或不接受1/4胸腺叶移植的成年或老年C57BL/6J雌性和雄性中的CD4+T细胞，其为：激活的CD4+T细胞效应物(图6B)、CD4+效应记忆T细胞(图6C)、CD4+中央记忆T细胞(图6D)和CD4+幼稚T细胞(图6E)百分比的平均值和SEM的散点图。
6.发明详述
本发明的非限制性实施方式由本说明书和实施例描述。出于公开清楚的目的而非限制的目的，详细的说明书分为以下小节：
6.1定义；
6.2治疗方法；和
6.3试剂盒。
6.1定义
本说明书中使用的术语在本发明主题的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有它们在本领域中的普通含义。某些术语在下文或说明书的其他地方讨论，以在描述所公开主题的组合物和方法以及如何制造和使用它们时向本领域技术人员提供额外的指导。
如本文所用，当与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时，“一个”或“一种”一词的使用可能意味着“一个”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。更进一步地，术语“具有”、“包括”、“包含”和“含有”是可互换的，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。
术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3或超过3个标准偏差内。或者，“约”可表示至多20％，优选至多10％，更优选至多5％，更优选至多1％的给定值的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示值的数量级内，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。
本文中的“个体”或“对象”是脊椎动物，例如人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。非人动物对象的非限制性实例包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；和非人灵长类，如猿和猴。
成年人对象是已达到至少约18岁年龄的对象。成年非人对象是已经达到性成熟的对象。在某些实施方式中，新生儿是已达到至多约1个月大的人对象。在某些实施方式中，婴儿是年龄在约1个月至约2岁之间的人对象。在某些实施方式中，儿童是年龄在约2岁至约12岁之间的人对象。在某些实施方式中，青少年是年龄在约12岁至约18岁之间的人对象。
如本文所用，术语“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病症或疾病。
如本文所用术语，物质的“有效量”是足以实现有益或期望结果(包括临床结果)的量，因此，“有效量”取决于其应用的情境。有效量可以以一次或多次给予。
如本文所用并且如本领域所熟知的，“治疗”是用于获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。就本主题而言，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻或改善一种或多种迹象或症状、减轻疾病程度、稳定(即，不恶化)疾病状态、预防疾病、延迟或减缓疾病进展和/或疾病状态的改善或缓和。降低可以是并发症或症状的严重程度降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。“治疗”还可以意味着与未接受治疗的预期生存期相比延长生存期。在某些实施方式中，本文公开的主题用于恢复对象(例如，人对象、新生儿、婴儿、儿童、青少年或成年)的胸腺功能。在某些实施方式中，本文公开的主题用于增加对象中循环T细胞的水平(例如，外周血中的幼稚T细胞)。
如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且，在适当时，包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。
如本文所用，术语“药学上可接受的”可以指在合理的医学判断范围内适合用于接触对象(例如，人对象或非人动物)的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的，与合理的收益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”可以指药学上可接受的材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、运载体、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸锌或钙或硬脂酸)或溶剂包封材料，涉及将主题化合物、材料或细胞携带或运输到身体的器官或部分。每种赋形剂必须是“可接受的”，即与制剂的其他成分(例如待移植的细胞)相容，并且对对象无害。
6.2治疗方法
本发明提供了用于保留或恢复有需要的对象的胸腺功能的方法。该方法包括将胸腺组织(例如，自体胸腺组织)递送到对象的至少一个淋巴结中，以保留、增加或恢复对象的胸腺功能。在某些实施方式中，本文公开的方法可以预防或减少胸腺切除术的短期或长期临床影响，例如自身免疫疾病、癌症、感染、特应性疾病、过早免疫老化或其组合。
6.2.1胸腺组织
在某些实施方式中，对象已经接受或正在接受胸腺切除手术。在某些实施方式中，递送到对象中的自体胸腺组织是在胸腺切除手术期间从对象获得的。在某些实施方式中，递送到对象中的自体胸腺组织是在胸腺切除手术之前从对象获得的。在某些实施方式中，当对象是新生儿、婴儿或儿童时进行胸腺切除手术。
在一些实施方式中，递送至对象的胸腺组织不是自体的，例如是同种异体的。在一些实施方式中，胸腺组织来自与对象在一个或多个人白细胞抗原(HLA)等位基因上匹配(例如，在1、2、3、4、5或6个HLA等位基因的一个或两个拷贝上匹配)的供者。胸腺组织可以来自与对象部分HLA匹配、完全HLA匹配或单倍型相合(haploidentical)的供者。可以向对象给予免疫抑制方案以减少移植排斥的可能性。可以作为免疫抑制方案的部分给予的药物的非限制性实例包括mTOR抑制剂(例如雷帕霉素)、CD28-B7抑制剂(例如CTLA4-Ig)、CD40-CD40L抑制剂(例如MR1)、类固醇(如皮质类固醇、地塞米松和强的松)、Cox-1和Cox-2抑制剂、大环内酯类抗生素(如雷帕霉素和他克莫司)、环孢素、硫唑嘌呤、抗胸腺细胞球蛋白(Atgam)、胸腺球蛋白(Thymoglobulin)、OKT3、巴利昔单抗、甲强龙(Solumedrol)、达利珠单抗(Daclizumab)、吗替麦考酚酯(Mycophenolate Mofetil)、普乐可复(Prograf)和其他限制、减少或抑制B细胞、T细胞和/或其他先天免疫活性的物质。免疫抑制方案可包括给予一种药物或合适药物的任何组合以实现所需效果。
可以使用本领域已知的任何合适的技术来制备用于递送的胸腺组织，包括例如但不限于Market等，Blood 102，1121-1130(2003)中描述的技术，其内容通过引用全文纳入本文。在某些实施方式中，将从对象收获的胸腺组织加工(例如，切碎或切片)成小片段并重新悬浮在液体中以形成待递送到淋巴结中的溶液。在一些实施方式中，包含胸腺片段的移植物在产生功能性异位胸腺(ectopic thymus)方面优于单细胞悬浮胸腺移植物。例如，包含胸腺片段的移植物可以产生更大量的移植胸腺组织、增加的循环T细胞的比例或数量、增加的循环幼稚T细胞的比例或数量、或本文公开的其他参数的优势。该溶液可以优选是无菌的。该溶液在制造和储存条件下可以是稳定的，并且可以通过使用例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来防止微生物例如细菌和真菌的污染。
在某些实施方式中，溶液包括构成胸腺组织的不同类型的细胞。在某些实施方式中，溶液还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。药学上可接受的运载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。可与本发明公开的方法一起使用的药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；粉状黄芪胶(powdered tragacanth)；麦芽；明胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；可可油和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨(糖)醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水(pyrogen free water)；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐(polyanhydride)；填充剂，例如多肽和氨基酸；血清成分，如血清白蛋白、HDL和LDL；C2-C12醇，例如乙醇；和其他用于药物制剂的无毒相容性物质。
在某些实施方式中，胸腺组织在被处理或递送到对象之前被离体培养。任何本领域已知的用于培养器官的培养基都可以与本发明公开的方法一起使用。在某些实施方式中，培养基包括用于维持组织活力的营养物质、至少一种防止胸腺组织微生物感染的抗生素，以及维持培养基适当pH范围的缓冲系统。在某些实施方式中，培养基包括F12营养混合物25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清、100ug/mL硫酸链霉素、1ug/mL庆大霉素和100ug/dL两性霉素B。在某些实施方式中，胸腺组织在培养基中于37℃的5％CO2培养箱中培养。在某些实施方式中，在胸腺组织被处理或递送到对象之前，胸腺组织离体培养至少约2小时、约4小时、约12小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约10天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周或约10周或更久。在某些实施方式中，胸腺组织在冷藏保存前或冷藏保存后被培养，或其组合。在某些实施方式中，胸腺组织在被处理和/或递送到对象之前不进行离体培养。
在某些实施方式中，胸腺组织在被处理或递送到对象之前被冷藏保存。本领域已知的用于冷藏保存胸腺组织的任何方法都可以与本文所公开的方法一起使用，例如但不限于Jang等，Integr Med Res.2017年3月；6(1)：12-18，其内容通过引用全文纳入本文。在某些实施方式中，胸腺组织在递送到淋巴结之前被冷藏保存至少约12小时、约24小时、约2天、约3天、约1周、约2周、约3周、约4周、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约10个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约15年、约20年或更久。在某些实施方式中，冷藏保存的胸腺组织在胸腺切除手术后很长时间被递送到淋巴结中。在某些实施方式中，胸腺组织在被处理和/或递送到对象中之前不进行冷藏保存。
在某些实施方式中，胸腺组织在胸腺切除手术期间被递送到对象。在某些实施方式中，胸腺组织在胸腺切除手术后被递送到对象。在某些实施方式中，胸腺组织在胸腺切除手术后约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约6小时、约12小时、约24小时、约2天、约3天、约1周、约2周、约3周、约4周、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约10个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约15年、约20年或更久被递送到对象。在非限制性实施方式中，胸腺组织在进行胸腺切除手术时被递送到对象。
在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织为恢复对象的胸腺功能的有效量。在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织为增加对象的胸腺功能的有效量。在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织为在淋巴结中扩增的有效量，例如，扩增的胸腺组织恢复对象的胸腺功能。在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织为能移植到淋巴结中的有效量。在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织为能在淋巴结中形成异位胸腺组织的有效量。在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织为增加对象中循环T细胞(例如，外周血中的T细胞和/或幼稚T细胞)的水平的有效量。在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织为增加对象中循环T细胞的多样性(例如，增加TCR和识别的同源抗原的组库)的有效量。有效量可随对象的病史、年龄、状况、性别以及对象的医疗状况的严重性和类型以及其他药物活性剂的给予而变化。
在某些实施方式中，该方法和系统用于将胸腺细胞或胸腺片段递送到对象的淋巴结中，允许胸腺细胞或片段在淋巴结中植入并产生异位胸腺。在某些实施方式中，异位胸腺恢复对象的胸腺功能，例如，补充或增强正常健康胸腺器官可以执行的一项或多项功能。例如，但不限于，异位胸腺可以参与机体的免疫调节，以参与T细胞的生长、发育、成熟和选择。根据本发明的异位胸腺的产生可用于增强或调节具有免疫系统功能障碍的对象的免疫系统功能，例如，在已接受胸腺切除手术的对象中，例如部分或完全去除胸腺。
在某些实施方式中，本发明涉及将来自新生儿或婴儿对象的胸腺组织移植到对象本人的淋巴结中。在一些实施方式中，对象在从身体获得胸腺组织时，或不久之后(例如，24小时内、一周内、一个月或一年内)接受移植。在这些实施方式中的一些中，当接受移植到淋巴结中时，对象是新生儿或婴儿。在一些实施方式中，在从对象取出胸腺组织数年后，对象接受移植。例如，当对象是新生儿或婴儿时，从对象获取胸腺组织，在对象是成年、儿童或青少年时接受移植。
在某些实施方式中，与将胚胎胸腺组织或成年胸腺组织移植到成年对象相比，将来自新生儿或婴儿的自体胸腺组织移植到新生儿、婴儿或儿童的对象的淋巴结中的方法和系统是有利的。不希望囿于理论，本方法和系统是有利的，因为除其他优点外，将自体新生儿胸腺组织移植到年轻对象(例如，新生儿、婴儿或儿童)的淋巴结中可以为移植的胸腺细胞的生长和功能提供一个类似于原生新生儿胸腺生长和发育的环境。新生哺乳动物，例如人，可以在刚出生后具有有限的外周免疫系统，外周组织中几乎不存在T淋巴细胞。因此，可能需要原生胸腺继续生长变大，从而用淋巴细胞(例如，幼稚T淋巴细胞)填充外周免疫系统。在该早期新生儿发育过程中，由于自身发育以及来自同时成熟的对象的各种影响，包括发育中对象的激素和免疫系统，原生胸腺在分子和细胞水平上会经历巨大变化。已经报道了新生儿胸腺组织的独特分子和细胞特征。例如，在胎儿/新生儿胸腺发育过程中产生的γ/δT细胞在成人胸腺中可能没有发育或发育减少(Ito等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1989)86：631)。此外，在胸腺的围产年龄窗口期间，产生不同的调节性T细胞(Treg)群。这些特殊的Treg可以在维持自身耐受性方面发挥重要作用，并且可以基于分子和激活概况与成人衍生的Treg区分开来(Yang等，Science.2015年5月1日；348(6234)：589-594)。又例如，源自新生儿胸腺的CD4+T细胞可以具有不同于成人胸腺来源细胞的功能特性(BeckyAdkins，The Journal of Immunology，2003，171：5157-5164)。这种独特的发育环境和新生儿胸腺在早期儿童期的变化在其他发育阶段可能不存在，但对于胸腺的结构和功能成熟可能很重要。结果，本方法和系统可以提供在对象生命的其他阶段(例如，当对象是成年人时)可能不存在的发育环境。本文公开的方法和系统可能是有利的，因为，除其他优点外，与胚胎胸腺组织相比，新生儿胸腺组织可能更发达，并且与可能经历了衰老相关的退化的成人胸腺组织相比，也具有更好的生长能力。因此，新生儿胸腺组织可以有更好的机会长成异位胸腺组织，该组织具有足够的质量和功能来恢复对象免疫系统(例如，幼稚T淋巴细胞)的发育和成熟。
在某些实施方式中，胸腺组织的扩增包括淋巴结中胸腺组织的植入、增殖、分化和/或生长，以在淋巴结中产生异位胸腺组织。产生的异位胸腺组织具有生物学活性并具有胸腺功能。在某些实施方式中，胸腺组织在淋巴结中扩增，使得最终产生的异位组织的质量高于递送到淋巴结的胸腺组织的原始质量。在某些实施方式中，最终产生的异位组织的质量为递送到淋巴结中的胸腺组织原始质量的至少约1.1倍、1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍。
在某些实施方式中，血管形成(vascularization)可发生在接受胸腺组织的淋巴结中，例如，在淋巴结内和在异位胸腺组织内可能有血管浸润(vessels infiltrating)并形成脉管系统网络。在某些实施方式中，浸润性脉管系统网络可以形成异位胸腺组织供血的基础。在某些实施方式中，浸润性脉管系统网络可以帮助将T细胞转运到异位胸腺组织和从异位胸腺组织转运。在某些实施方式中，淋巴循环系统也作为异位组织产生的物质(如T细胞)的转运通道。因此，淋巴系统，在某些实施方式中，可以通过其与身体其他部位的串合(crosstalk)将这些物质提供给血液循环系统。
在某些实施方式中，递送到对象的胸腺组织的量(例如本文公开的有效量)为至少约0.1克、至少约0.2克、至少约0.3克、至少约0.4克、至少约0.5克、至少约0.6克、至少约0.7克、至少约0.8克、至少约0.9克、至少约1克、至少约1.5克、至少约2克、至少约2.5克、至少约3克、至少约4克、至少约5克、至少约6克、至少约7克、至少约8克、至少约9克或至少约10克。在某些实施方式中，递送到对象的胸腺组织的量(例如本文公开的有效量)多至约5克、多至约10克、多至约15克或多至约20克。在某些实施方式中，递送到对象的胸腺组织的量(例如本文公开的有效量)为约0.1克、约0.2克、约0.3克、约0.4克、约0.5克、约0.6克、约0.7克、约0.8克、约0.9克、约1克、约2克、约3克、约4克、约5克、约6克、约8克、约10克、约13克、约15克、约18克、约20克或更多。可以在处理之前测量重量，例如，在切碎胸腺组织和添加液体生成悬浮液之前。在一些实施方式中，在处理之后测量重量，例如在切碎胸腺组织并添加液体以产生悬浮液之后。如本文所公开的胸腺组织的量可以被递送到一个淋巴结或可以在两个或更多个淋巴结之间分配。胸腺组织的量可以以一剂或以如本文所公开的任何合适的时间间隔分开的两剂或更多剂给予。当两剂或更多剂时，该量可以是两剂或更多剂之间的总份额，或每剂的量。
在一些实施方式中，胸腺组织以相对于对象体重的量(例如，如本文公开的有效量)递送到对象中。例如，递送到对象的胸腺组织的量可为至少约0.001mg/kg、至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.05mg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约1mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约15mg/kg、至少约20mg/kg、至少约25mg/kg、至少约30mg/kg、至少约40mg/kg、至少约50mg/kg、至少约60mg/kg、至少约70mg/kg、至少约80mg/kg、至少约90mg/kg、至少约100mg/kg、至少约110mg/kg、至少约120mg/kg、至少约130mg/kg、至少约140mg/kg、至少约150mg/kg、至少约160mg/kg、至少约170mg/kg、至少约180mg/kg、至少约190mg/kg、至少约200mg/kg、至少约250mg/kg、至少约500mg/kg、至少约1000mg/kg或至少约1500mg/kg。在一些实施方式中，递送到对象的胸腺组织的量至多约1mg/kg、至多约10mg/kg、至多约20mg/kg、至多约50mg/kg、至多约100mg/kg、至多约110mg/kg、至多约120mg/kg、至多约130mg/kg、至多约140mg/kg、至多约150mg/kg、至多约160mg/kg、至多约170mg/kg、至多约180mg/kg、至多约190mg/kg、至多约200mg/kg、至多约250mg/kg、至多约500mg/kg、至多约1000mg/kg或至多约1500mg/kg。在一些实施方式中，递送到对象的胸腺组织的量为约0.001mg/kg、约0.005mg/kg、约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约110mg/kg、约120mg/kg、约130mg/kg、约140mg/kg、约150mg/kg、约160mg/kg、约170mg/kg、约180mg/kg、约190mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg、约500mg/kg、约1000mg/kg或约1500mg/kg。如本文所公开的有效量可以是相对于对象体重的量。胸腺组织的量可以在处理之前测量，例如，在切碎胸腺组织和添加液体以产生悬浮液之前。如本文所公开的胸腺组织的量可以被递送到一个淋巴结或可以在两个或更多个淋巴结之间分配。给定大小的胸腺组织可以如本文所公开的以一剂或以任何合适的时间间隔分开的两剂或更多剂给予。当两剂或更多剂时，胸腺组织的量可以是两剂或更多剂之间的总份额，或每剂的量。
在某些实施方式中，递送到对象的胸腺组织的大小为至少约0.1cm3、至少约0.2cm3、至少约0.3cm3、至少约0.4cm3、至少约0.5cm3、至少约0.6cm3、至少约0.7cm3、至少约0.8cm3、至少约0.9cm3、至少约1cm3、至少约1.5cm3、至少约2cm3、至少约2.5cm3或至少约3cm3。在某些实施方式中，递送到对象的胸腺组织的大小高达约5cm3、高达约10cm3、高达约15cm3或高达约20cm3。在某些实施方式中，递送到对象的胸腺组织的大小为约0.1cm3、约0.2cm3、约0.3cm3、约0.4cm3、约0.5cm3、约0.6cm3、约0.7cm3、约0.8cm3、约0.9cm3、约1cm3、约2cm3、约3cm3、约4cm3、约5cm3、约6cm3、约8cm3、约10cm3、约13cm3、约15cm3、约18cm3、约20cm3或更大。如本文所公开的有效量可以表示为大小。可以在处理之前测量大小，例如，在切碎胸腺组织并添加液体生成悬浮液之前。在一些实施方式中，在处理之后测量大小，例如在切碎胸腺组织并添加液体以产生悬浮液之后。如本文所公开，给定大小的胸腺组织可以被递送至一个淋巴结或在两个或更多个淋巴结之间分配。给定大小的胸腺组织可以如本文所公开的以一剂或以任何合适的时间间隔分开的两剂或更多剂给予。当两剂或更多剂时，给定大小的胸腺组织可以是两剂或更多剂之间的总份额，或每剂的量。
在某些实施方式中，在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织处于液体悬浮液中。在一些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织处于液体悬浮液中，其体积为至少约0.1mL、至少约0.2mL、至少约0.3mL、至少约0.4mL、至少约0.5mL、至少约0.6mL、至少约0.7mL、至少约0.8mL、至少约0.9mL、至少约1mL、至少约1.5mL、至少约2mL、至少约2.5mL、至少约3mL、至少约4mL、至少约5mL、至少约6mL、至少约7mL、至少约8mL、至少约9mL或至少约10mL(例如，每个淋巴结，或两个或更多淋巴结之间的总份额)。在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织体积为多达约5mL、多达约10mL、多达约15mL或多达约20mL(例如，在两个或更多淋巴结之间分配)。在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织体积为每个淋巴结约0.1mL、约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1mL、约2mL或约3mL。在某些实施方式中，递送到对象中的胸腺组织体积为约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1mL、约2mL、约3mL、约4mL、约5mL、约6mL、约8mL、约10mL、约13mL、约15mL、约18mL、约20mL或更多，在两个或更多淋巴结之间分配。该体积可以如本文所公开的以一剂或以任何合适的时间间隔分开的两剂或更多剂给予。当两剂或更多剂时，体积可以是在两剂或更多剂之间分配的总体积，或每剂的体积。如本文所公开的有效量可以表示为体积。
对象可以接受一剂胸腺组织或相隔任何合适时间段的两剂或更多剂。可以通过一致的间隔或不规则的间隔来分隔开剂次。两剂可以分隔，例如，约半小时、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约16小时、约18小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约3周、约4周、约1个月、约5周、约6周、约7周、约8周、约2个月、约9周、约10周、约11周、约12周、约3个月、约16周、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约14个月、约16个月、约18个月、约20个月、约22个月、约24个月、约30个月、约36个月、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年或约10年。在一些实施方式中，可以以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20剂次给予对象胸腺组织。
在某些实施方式中，所公开的主题可以允许对象具有增加的循环血T细胞计数并恢复正常的免疫功能。在非限制性实施方式中，可以植入对象全胸腺重量的至少约三分之一，以具有高循环血T细胞计数并恢复正常免疫。例如，可以将超过约3mg的胸腺组织递送到小鼠对象体内，该小鼠对象具有平均约8.5mg的完整大小新生胸腺。在人对象中，约7克(gr)、约8克、约9克或约10克的胸腺组织可以被递送到具有平均25克完整大小的小儿胸腺的人对象中。完整的胸腺重量可以是新生儿胸腺的完整重量。完整的胸腺重量可以是婴儿胸腺的完整重量。完整的胸腺重量可以是儿童胸腺的完整重量。完整的胸腺重量可以是儿童胸腺的完整重量。完整的胸腺重量可以是成人胸腺的全部重量。在一些实施方式中，完整胸腺重量可以是与对象年龄相似的正常(例如，健康或免疫能力强)个体的完整胸腺重量。在一些实施方式中，完整胸腺重量可以是与对象年龄不同的正常个体的完整胸腺重量。
在某些实施方式中，本公开的主题可以增加血液循环中的CD3+T细胞并恢复对象的幼稚T细胞群。例如，对象可能患有淋巴细胞减少症，这可能导致幼稚T细胞减少，伴随记忆T细胞群增加。T细胞区室(T cell compartment)中的数量缺陷也会影响幼稚T细胞群。本公开的主题可以允许此类对象通过增加血液循环的CD3+T细胞来恢复幼稚T细胞群。在一些实施方式中，本公开的主题可以减少对象中的T细胞衰老。
在一些实施方式中，作为T细胞的CD45+外周血细胞的频率可以通过本文公开的组合物和方法在对象中增加或维持。例如，在一些情况中，在如本文所公开的将胸腺组织递送到淋巴结之后，作为T细胞的CD45+外周血细胞的频率可以是至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约70％。在一些实施方式中，相比于如本文所公开的递送胸腺组织之前，或相比于未接受胸腺组织的可比对象，作为T细胞的CD45+外周血细胞的频率可以增加至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或更多。例如，如本文所公开的递送胸腺组织之前，作为T细胞的CD45+外周血细胞的频率可以是1％，在递送胸腺组织之后，其可以增加10％以达到11％的频率。
在一些实施方式中，对象外周血中T细胞的浓度可以通过本文公开的组合物和方法增加。例如，在一些情况中，对象的外周血中T细胞的浓度可以增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2-倍、至少约3-倍、至少约4-倍、至少约5-倍、至少约10-倍、至少约20-倍、至少约50-倍、至少约100-倍、至少约200-倍、至少约500-倍、至少约1000-倍或至少约10,000-倍或更多，例如，相比于如本文所公开递送胸腺组织之前，或相比于未接受胸腺组织的可比对象。例如，浓度可以表示为每立方毫米、微升、分升、毫升或升的细胞数。
鉴定T细胞的方法是本领域已知的。在一些实施方式中，T细胞是基于为CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+CD45+或CD3+CD8+CD45+鉴定的。
在一些实施方式中，作为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率可以通过本文公开的方法在对象中增加或维持。例如，在一些情况中，在如本文所公开的将胸腺组织递送至淋巴结之后，作为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率可以是至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％。在一些实施方式中，作为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率可以增加至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或更多，相比于如本文所公开递送胸腺组织之前，或相比于未接受胸腺组织的可比对象。例如，在递送如本文公开的胸腺组织之前，作为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率可以是1％，并且在递送胸腺组织之后可以增加10％以达到11％的频率。
在一些实施方式中，对象外周血中幼稚T细胞的浓度可以通过本文公开的组合物和方法增加。例如，在一些情况中，对象外周血中幼稚T细胞的浓度可以增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2-倍、至少约3-倍、至少约4-倍、至少约5-倍、至少约10-倍、至少约20-倍、至少约50-倍、至少约100-倍、至少约200-倍、至少约500-倍、至少约1000-倍或至少约10,000-倍或更多，例如，相比于如本文所公开递送胸腺组织之前，或相比于未接受胸腺组织的可比对象。例如，浓度可以表示为每立方毫米、微升、分升、毫升或升的细胞数。
鉴定其他物种(例如人)中的幼稚T细胞、本文公开的其他亚群和等效群体的方法是本领域已知的。在一些实施方式中，幼稚T细胞是CD3+CD4+CD44-CD62L+或CD3+CD8+CD44-CD62L+。在一些实施方式中，幼稚T细胞是CD3+CD4+CD45RA+CCR7+、CD3+CD8+CD45RA+CCR7+，或CD3+、CD4+、CD8+、CD45RA+、CCR7+、CD45RO-和CD27+的任何组合。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法可用于在对象中实现一定的CD4∶CD8T细胞比率(例如，循环总T细胞、幼稚T细胞、效应T细胞、效应/记忆T细胞、中央记忆T细胞或其组合的CD4∶CD8比率)。例如，通过本文公开的组合物和方法实现CD4∶CD8比率可以是至少约1∶1、至少约1.1∶1、至少约1.2∶1、至少约1.3∶1、至少约1.4∶1、至少约1.5∶1、至少约1.6∶1、至少约1.7∶1、至少约1.8∶1、至少约1.9∶1或至少约2∶1。在一些实施方式中，通过本文公开的组合物和方法实现CD4∶CD8比率可以是至多约2∶1、至多约2.1∶1、至多约2.2∶1、至多约2.3∶1、至多约2.4∶1、至多约2.5∶1、至多约2.6∶1、至多约2.7∶1、至多约2.8∶1、至多约2.9∶1、至多约3∶1、至多约2.5∶1、至多约3∶1、至多约4∶1或至多约5∶1。在一些实施方式中，通过本文公开的组合物和方法实现CD4∶CD8比率为约2∶1。
本发明的组合物和方法对本文公开的结果的影响可以在将胸腺组织递送至对象的淋巴结之后的任何合适的时间量进行评估。例如，对外周血T细胞的数量和/或频率、幼稚外周血T细胞的浓度和/或频率、CD4∶CD8比率、淋巴结重量、淋巴结中胸腺组织扩增的影响，或本文公开的任何其他结果都可以在将胸腺组织递送到对象的淋巴结之后约1周、约2周、约3周、约4周、约1个月、约5周、约6周、约7周、约8周、约2个月、约9周、约10周、约11周、约12周、约3个月、约16周、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约14个月、约16个月、约18个月、约20个月、约22个月、约24个月、约30个月、约36个月、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年或约10年评估。
本领域已知的用于将试剂、材料或细胞递送至对象的内部器官的任何方法都可以与本公开的主题一起使用。在某些实施方式中，胸腺组织通过针被递送到对象的淋巴结中。在某些实施方式中，针是显微注射针。在某些实施方式中，本文公开的方法包括将针引入对象的淋巴结。微创手术是在超声引导下进行的，与开放手术相比，其好处是对身体的伤害更小。此外，与开放式手术相比，微创手术可以减少疼痛、缩短住院时间和减少并发症。在某些实施方式中，目前公开的方法是使用微创手术进行的。在某些实施方式中，微创手术是在超声引导下进行的。可以使用的微创手术的非限制性示例包括在PCT专利申请号PCT/US2020/027783中公开的那些，其通过引用全文纳入本文。
6.2.2淋巴结
在某些实施方式中，胸腺组织被递送至对象的至少一个淋巴结。在某些实施方式中，胸腺组织被递送至对象的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少五个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个淋巴结。在非限制性实施方式中，可以将约0.05ml、约0.1ml、约0.5ml、约1ml、约2ml或约3ml的胸腺组织递送到淋巴结中。
可以使用本文公开的方法将胸腺组织递送至其中的淋巴结的非限制性实例包括腹部淋巴结、腹腔淋巴结、主动脉旁淋巴结、脾门淋巴结、肝门淋巴结、左胃淋巴结、右胃淋巴结、左胃(胃网膜)淋巴结、右胃(胃网膜)淋巴结、腹膜后淋巴结、幽门淋巴结(例如，幽门上淋巴结、幽门下淋巴结、幽门后淋巴结)、胰腺淋巴结(例如，胰上淋巴结、胰下淋巴结、脾线淋巴结淋巴结)、脾淋巴结、肝淋巴结(例如，囊性淋巴结、孔淋巴结、温斯娄氏孔(foramenof Winslow))，胰十二指肠淋巴结(例如，胰十二指肠上淋巴结、胰十二指肠下淋巴结)、肠系膜上淋巴结、回结肠淋巴结、前淋巴结(prececal lymph node)、盲肠后淋巴结淋巴结、阑尾淋巴结、结肠系膜淋巴结(如结肠旁淋巴结、左结肠淋巴结、中结肠淋巴结、右结肠淋巴结、肠系膜下淋巴结、乙状结肠淋巴结、直肠上淋巴结)、髂总淋巴结(例如，内侧髂总淋巴结、中间髂总淋巴结、外侧髂总淋巴结、主动脉下髂总淋巴结、海角髂总淋巴结(commoniliac node ofpromontory))和髂外淋巴结(例如，髂内部外侧淋巴结(medial externaliliac lymph node)、髂中间外侧淋巴结淋巴结(intermediate external iliac lymphnode)、髂外外侧淋巴结、内侧腔隙-股淋巴结、中间腔隙-股淋巴结、外侧腔隙-股淋巴结、髂间髂外淋巴结、闭孔-髂外闭孔淋巴结)。
在某些实施方式中，当移植的胸腺组织扩增时，淋巴结能够肿胀是很重要的，因此腹膜腔中存在的淋巴结可能特别有用，尤其是在淋巴结与动脉或大静脉不紧密相关的情况下。
6.2.3对象
在某些实施方式中，待通过本文公开的方法治疗的对象已经接受了胸腺切除手术。在某些实施方式中，将通过本文公开的方法治疗的对象正在接受胸腺切除手术，同时将胸腺组织递送到对象的淋巴结中。在某些实施方式中，对象患有先天性心脏缺陷并已接受或正在接受心脏直视手术。心脏直视手术已成为治疗严重先天性心脏缺陷的常规方法。先天性心脏缺陷的早期心脏手术干预可能与胸腺切除手术有关，例如，部分或完全去除胸腺。在某些实施方式中，胸腺切除术是在心脏直视手术期间对对象进行的。在某些实施方式中，当对象是新生儿时进行胸腺切除术。在某些实施方式中，当对象是婴儿时进行胸腺切除术。在某些实施方式中，胸腺切除术是在对象是儿童时进行的。在某些实施方式中，胸腺切除术是在对象年龄为至多1个月、至多2个月、至多3个月、至多4个月、至多5个月、至多6个月、至多8个月、至多10个月、至多1年或至多2年时进行的。在某些实施方式中，胸腺切除术是在对象年龄为至多1个月时进行的。
在一些实施方式中，要通过本发明的组合物和方法治疗的对象具有影响胸腺的病症。影响胸腺的疾病的非限制性例子包括重症肌无力、纯红细胞发育不全、低γ球蛋白血症、胸腺癌、胸腺瘤、A型胸腺瘤、B型胸腺瘤、自身免疫性疾病、T细胞介导的自身免疫、T细胞淋巴细胞减少、胸腺萎缩、年龄-相关性胸腺萎缩、胸腺囊肿、胸腺增生、胸腺细胞减生、胸腺发育不全、胸腺发育不良、严重联合免疫缺陷、尼兹诺夫综合征、威-奥二氏综合征、迪乔治综合征、复发感染、复发病毒感染、过早免疫老化和癌症。
待通过本文公开的方法治疗的对象可以是任何年龄。在某些实施方式中，待通过本文公开的方法治疗的对象是新生儿、婴儿、儿童、青少年或成年。
在某些实施方式中，待通过本文公开的方法治疗的对象是年龄已有至多约1个月的人新生儿。在某些实施方式中，待通过本文公开的方法治疗的对象是年龄已有约1个月至约2岁的人婴儿。在某些实施方式中，待通过本文公开的方法治疗的对象是年龄已有约2岁至约12岁的人儿童。在某些实施方式中，待通过本文公开的方法治疗的对象是年龄已有约12岁至约18岁的人青少年。在某些实施方式中，待通过本文公开的方法治疗的对象是年龄已有至少18岁的成人。在某些实施方式中，待治疗的对象是中年或老年人，例如有年龄相关的胸腺功能衰退。
在某些实施方式中，待通过本文公开的方法治疗的对象是人对象，年龄已有至多约1个月、至多约3个月、至多约6个月、至多约1岁、至多约2岁、至多约3岁、至多约4岁、至多约5岁、至多约6岁、至多约7岁、至多约8岁、至多约9岁、至多约10岁、至多约11岁、至多约12岁、至多约13岁、至多约14岁、至多约15岁、至多约16岁、至多约17岁、至多约18岁或至少18岁。
在某些实施方式中，待通过本文公开的方法治疗的对象是人对象，年龄已有至少约1个月、至少约3个月、至少约6个月、至少约1岁、至少约2岁、至少约3岁、至少约4岁、至少约5岁、至少约6岁、至少约7岁、至少约8岁、至少约9岁、至少约10岁、至少约11岁、至少约12岁、至少约13岁、至少约14岁、至少约15岁、至少约16岁、至少约17岁、至少约18岁、至少约25岁、至少约30岁、至少约35岁、至少约40岁、至少约45岁、至少约50岁、至少约55岁、至少约60岁、至少约65岁、至少约70岁或至少约75岁。
在某些实施方式中，当对象是新生儿、婴儿或儿童时，从对象获得胸腺组织，并在随后解冻并递送给对象之前进行冷藏保存。在某些实施方式中，可以在胸腺切除术后和对象的任何年龄将冷藏保存的胸腺组织递送给对象。在某些实施方式中，从对象获得的胸腺组织可以冷藏保存在多个小瓶中，每个小瓶包含可以递送给对象的胸腺组织的单剂。在某些实施方式中，冷藏保存的胸腺组织在对象的整个生命周期内以多剂递送给对象。
6.3试剂盒
本发明提供了用于保留、恢复或增加对象的胸腺功能的试剂盒，例如，已经接受或正在接受胸腺切除手术的对象。在某些实施方式中，该试剂盒包含胸腺组织和用于将胸腺组织递送至对象的工具，并且胸腺组织对于对象而言是自体的。在某些实施方式中，胸腺组织以包含在试剂盒中的溶液形式提供。
在某些实施方式中，该解决方案包括构成胸腺组织的不同类型的细胞。在某些实施方式中，该溶液还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体。药学上可接受的运载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。可与本发明的试剂盒一起使用的药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；可可脂和栓剂蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨(糖)醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水(pyrogenfree water)；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐(polyanhydride)；填充剂，例如多肽和氨基酸；血清成分，如血清白蛋白、HDL和LDL；C2-C12醇，例如乙醇；和其他用于药物制剂的无毒相容性物质。
在某些实施方式中，包含于试剂盒中的胸腺组织是冷藏保存的。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织冷藏保存了约12小时、约24小时、约2天、约3天、约1周、约2周、约3周、约4周、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约10个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约15年、约20年或更久。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织冷藏至少约12小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约8个月、至少约10个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约15年、至少约20年或更久。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织冷藏至多约12小时、至多约24小时、至多约2天、至多约3天、至多约1周、至多约2周、至多约3周、至多约4周、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月、至多约6个月、至多约8个月、至多约10个月、至多约1年、至多约2年、至多约3年、至多约4年、至多约5年、至多约6年、至多约7年、至多约8年、至多约9年、至多约10年、至多约15年、至多约20年、至多约30年、至多约40年、至多约50年或更短。
在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织的量为至少约0.1克、至少约0.2克、至少约0.3克、至少约0.4克、至少约0.5克、至少约0.6克、至少约0.7克、至少约0.8克、至少约0.9克、至少约1克、至少约1.5克、至少约2克、至少约2.5克、至少约3克、至少约4克、至少约5克、至少约6克、至少约7克、至少约8克、至少约9克或至少约10克。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织的量为多达约5克、多达约10克、多达约15克或多达约20克。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织的量为约0.1克、约0.2克、约0.3克、约0.4克、约0.5克、约0.6克、约0.7克、约0.8克、约0.9克、约1克、约2克、约3克、约4克、约5克、约6克、约8克、约10克、约13克、约15克、约18克、约20克或更多。
在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织的大小为至少约0.1cm3、至少约0.2cm3、至少约0.3cm3、至少约0.4cm3、至少约0.5cm3、至少约0.6cm3、至少约0.7cm3、至少约0.8cm3、至少约0.9cm3、至少约1cm3、至少约1.5cm3、至少约2cm3、至少约2.5cm3、至少约3cm3至少约4cm3或至少约5cm3。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织的大小为多达约5cm3、多达约10cm3、多达约15cm3或多达约20cm3。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织的大小为约0.1cm3、约0.2cm3、约0.3cm3、约0.4cm3、约0.5cm3、约0.6cm3、约0.7cm3、约0.8cm3、约0.9cm3、约1cm3、约2cm3、约3cm3、约4cm3、约5cm3、约6cm3、约8cm3、约10cm3、约13cm3、约15cm3、约18cm3、约20cm3或更多。
在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织为恢复对象的胸腺功能的有效量。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织为在淋巴结中扩增的有效量，扩增的胸腺组织恢复对象的胸腺功能。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织为增加对象的胸腺功能的有效量。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织为植入淋巴结的有效量。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织为形成淋巴结中的异位胸腺组织的有效量。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织为增加对象中循环T细胞(例如循环幼稚T细胞)的水平的有效量。在某些实施方式中，试剂盒中包含的胸腺组织为增加对象循环T细胞的多样性(例如，增加TCR和识别的同源抗原的组库)的有效量。
在一些实施方式中，本发明的试剂盒可以包括合适组分，其用于收获胸腺组织、处理胸腺组织、储存(例如，冷藏保存)胸腺组织、培养胸腺组织、将胸腺组织递送至对象，或其组合。在某些实施方式中，试剂盒不包括胸腺组织。
在某些实施方式中，该试剂盒包含冷藏保存胸腺组织所必需的材料，例如试剂和/或容器。在某些实施方式中，该试剂盒用于冷藏保存胸腺组织约12小时、约24小时、约2天、约3天、约1周、约2周、约3周、约4周、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约8个月、约10个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约15年、约20年或更久。在某些实施方式中，该试剂盒用于冷藏保存胸腺组织至少约12小时、至少约24小时、至少约2天、至少约3天、至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约8个月、至少约10个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约6年、至少约7年、至少约8年、至少约9年、至少约10年、至少约15年、至少约20年或更久。在某些实施方式中，该试剂盒用于冷藏保存胸腺组织至多约12小时、至多约24小时、至多约2天、至多约3天、至多约1周、至多约2周、至多约3周、至多约4周、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月、至多约6个月、至多约8个月、至多约10个月、至多约1年、至多约2年、至多约3年、至多约4年、至多约5年、至多约6年、至多约7年、至多约8年、至多约9年、至多约10年、至多约15年、至多约20年、至多约30年、至多约40年、至多约50年或更短。
在某些实施方式中，该试剂盒是用于收获、处理、储存、培养和/或递送一定量的胸腺组织，其为至少约0.1克、至少约0.2克、至少约0.3克、至少约0.4克、至少约0.5克、至少约0.6克、至少约0.7克、至少约0.8克、至少约0.9克、至少约1克、至少约1.5克、至少约2克、至少约2.5克、至少约3克、至少约4克、至少约5克、至少约6克、至少约7克、至少约8克、至少约9克或至少约10克。
在某些实施方式中，该试剂盒是用于收获、处理、储存、培养和/或递送一定量的胸腺组织，其为多达约5克、多达约10克、多达约15克或多达约20克。在某些实施方式中，该试剂盒是用于收获、处理、储存、培养和/或递送一定量的胸腺组织，其为约0.1克、约0.2克、约0.3克、约0.4克、约0.5克、约0.6克、约0.7克、约0.8克、约0.9克、约1克、约2克、约3克、约4克、约5克、约6克、约8克、约10克、约13克、约15克、约18克、约20克或更多。
在某些实施方式中，该试剂盒是用于收获、处理、储存、培养和/或递送胸腺组织，其大小为至少约0.1cm3、至少约0.2cm3、至少约0.3cm3、至少约0.4cm3、至少约0.5cm3、至少约0.6cm3、至少约0.7cm3、至少约0.8cm3、至少约0.9cm3、至少约1cm3、至少约1.5cm3、至少约2cm3、至少约2.5cm3、至少约3cm3至少约4cm3或至少约5cm3。在某些实施方式中，该试剂盒是用于收获、处理、储存、培养和/或递送胸腺组织，其大小为多达约5cm3、多达约10cm3、多达约15cm3或多达约20cm3。在某些实施方式中，该试剂盒是用于收获、处理、储存、培养和/或递送胸腺组织，其大小为约0.1cm3、约0.2cm3、约0.3cm3、约0.4cm3、约0.5cm3、约0.6cm3、约0.7cm3、约0.8cm3、约0.9cm3、约1cm3、约2cm3、约3cm3、约4cm3、约5cm3、约6cm3、约8cm3、约10cm3、约13cm3、约15cm3、约18cm3、约20cm3或更大。
在一些实施方式中，该试剂盒是用于递送胸腺组织，其体积为至少约0.1mL、至少约0.2mL、至少约0.3mL、至少约0.4mL、至少约0.5mL、至少约0.6mL、至少约0.7mL、至少约0.8mL、至少约0.9mL、至少约1mL、至少约1.5mL、至少约2mL、至少约2.5mL、至少约3mL、至少约4mL、至少约5mL、至少约6mL、至少约7mL、至少约8mL、至少约9mL或至少约10mL(例如，每个淋巴结，或两个或更多淋巴结的总份额)。在一些实施方式中，该试剂盒是用于递送胸腺组织，其体积为高达约5mL、高达约10mL、高达约15mL或高达约20mL(例如，在两个或更多淋巴结之间分配)。在一些实施方式中，该试剂盒是用于递送胸腺组织，其体积为每个淋巴结约0.1mL、约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1mL、约2mL或约3mL。在一些实施方式中，该试剂盒是用于递送胸腺组织，其体积为约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1mL、约2mL、约3mL、约4mL、约5mL、约6mL、约8mL、约10mL、约13mL、约15mL、约18mL、约20mL或更多，在两个或更多淋巴结之间分配。
在一些实施方式中，该试剂盒是用于向对象递送胸腺组织，相对于对象的体重，其量为，例如，至少约0.001mg/kg、至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.05mg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约1mg/kg、至少约5mg/kg、至少约10mg/kg、至少约15mg/kg、至少约20mg/kg、至少约25mg/kg、至少约30mg/kg、至少约40mg/kg、至少约50mg/kg、至少约60mg/kg、至少约70mg/kg、至少约80mg/kg、至少约90mg/kg、至少约100mg/kg、至少约110mg/kg、至少约120mg/kg、至少约130mg/kg、至少约140mg/kg、至少约150mg/kg、至少约160mg/kg、至少约170mg/kg、至少约180mg/kg、至少约190mg/kg、至少约200mg/kg、至少约250mg/kg、至少约500mg/kg、至少约1000mg/kg或至少约1500mg/kg。在一些实施方式中，该量为至多约1mg/kg、至多约10mg/kg、至多约20mg/kg、至多约50mg/kg、至多约100mg/kg、至多约110mg/kg、至多约120mg/kg、至多约130mg/kg、至多约140mg/kg、至多约150mg/kg、至多约160mg/kg、至多约170mg/kg、至多约180mg/kg、至多约190mg/kg、至多约200mg/kg、至多约250mg/kg、至多约500mg/kg、至多约1000mg/kg或至多约1500mg/kg。在一些实施方式中，该量为约0.001mg/kg、约0.005mg/kg、约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约110mg/kg、约120mg/kg、约130mg/kg、约140mg/kg、约150mg/kg、约160mg/kg、约170mg/kg、约180mg/kg、约190mg/kg、约200mg/kg、约250mg/kg、约500mg/kg、约1000mg/kg或约1500mg/kg。
在某些实施方式中，该试剂盒用于收获、加工、储存、培养和/或递送有效量的胸腺组织以恢复对象的胸腺功能。在某些实施方式中，该试剂盒用于收获、加工、储存、培养和/或递送有效量的胸腺组织以在淋巴结中扩增，例如，在扩增的胸腺组织恢复对象的胸腺功能的情况下。在某些实施方式中，该试剂盒用于收获、加工、储存、培养和/或递送有效量的胸腺组织，以增加对象的胸腺功能。在某些实施方式中，该试剂盒用于收获、加工、储存、培养和/或递送有效量的胸腺组织以植入淋巴结。在某些实施方式中，该试剂盒用于收获、加工、储存、培养和/或递送有效量的胸腺组织，以在淋巴结中形成异位胸腺组织。在某些实施方式中，该试剂盒用于收获、加工、储存、培养和/或递送有效量的胸腺组织，以增加对象的循环T细胞(例如循环幼稚T细胞)的水平。
在某些实施方式中，该试剂盒还包括用于保留、增加或恢复已接受或正在接受胸腺切除手术的对象的胸腺功能的说明书。在某些实施方式中，说明书包括方法，例如，如本文所述，例如，在本公开的第6.2节中。
本领域已知的用于将胸腺组织递送至对象的淋巴结的任何合适的工具都可以包括在本文公开的试剂盒中。用于递送胸腺组织的工具的非限制性实例包括管、注射器、针(例如，显微注射玻璃针)、适合冷藏保存的容器、适合组织培养的容器以及微创手术所需的任何工具。
尽管已经详细描述了本公开的主题及其某些优点，但应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的工艺、机器、制造和物质组合物以及方法的特定实施方式。正如本领域普通技术人员从本发明主题的公开内容中容易理解的那样，目前存在或将要开发的工艺、机器、制造、物质组合物或方法，其执行基本相同的功能或根据本公开主题可以使用与本文所述的相应实施方式实现基本相同的结果。因此，所附权利要求旨在将这些工艺、机器、制造、物质组合物或方法包括在其范围内。
在整个本申请中引用了各种专利、专利申请、出版物、产品说明、方案和序列登录号，其公开内容出于所有目的通过引用全文纳入本文。
7.实施例
通过参考以下实施例将更好地理解本公开的主题，其作为本公开的主题的示例而不是限制性的方式提供。
7.1实施例1：裸鼠剂量研究
裸鼠缺乏胸腺，因此无法产生T细胞。因此，裸鼠是免疫缺陷的。在这些小鼠中，通过胸腺移植在肠系膜淋巴结中产生功能性免疫系统。在这里，解决了再生血液T细胞所必需的胸腺组织数量的问题，以及移植到淋巴结中的胸腺组织的数量是否可以产生足够数量的循环血液T细胞。
登记了23只15周龄BALB/c裸鼠(n＝16雌性；n＝7雄性)。21只小鼠在其淋巴结中接受了1/4叶至2叶BALB/c野生型新生胸腺(2个胸腺叶＝1个完整胸腺)的移植。其余两只小鼠接受了来自相同供者小鼠的胸腺单细胞悬液移植。从2窝的12个不同胸腺中取回待移植的样品，平均重量为8.5mg(范围6.2-11mg；图1A)。8只小鼠接受了1/4胸腺叶的移植，6只小鼠接受了1/2或整个胸腺叶，一只小鼠接受了整个胸腺(2叶)(图1B)。当使用1/2叶剂量时，将组织进一步分成两块片段用于移植。对于1叶剂量，在淋巴结中移植了总计4个片段，而对于2叶剂量，移植了总计8个片段。采用这种方法是因为裸鼠淋巴结体积小(平均刚过1mm3)，这限制了组织片段移植的可行性。图1C显示了移植到动物体内的胸腺片段的估计重量。
移植后四个月，通过流式细胞术分析20只存活的小鼠血液中T细胞的存在。三只未移植的BALB/c裸鼠和三只BALB/c野生型小鼠分别用作循环血液T细胞的阴性和阳性对照。使用流式细胞仪分析，图2A显示了不同条件下CD3表达的代表性点图。细胞首先针对单峰(singlet)进行门控，然后是活细胞、CD45+细胞，最后是CD3表达。字母表示小鼠ID。每只小鼠的CD3+T细胞百分比在图2B中给出，其中圆点表示雌性，方点表示雄性。与未接受移植的对照组相比，接受至少1/4个或更多胸腺叶的所有组都表现出循环CD3+T细胞的比例增加。移植1/4或1/2叶剂量的小鼠显示出相当的CD3+T细胞百分比(分别为14.13±3.29和11.76±3.98；P＝0.2634)。与半叶相比，移植1个胸腺叶的CD3+T细胞百分比显著更高(24.02±7.43；1/2叶组比1个叶组的P＝0.0067)。2叶的移植产生了与1叶剂量相似的CD3+T细胞百分比，而胸腺细胞悬液的移植并没有显著增加循环T细胞的频率。无论移植组织的量如何，都可以达到正常的CD4/CD8比率(图2C和2D)。每个点代表一只小鼠。圆点表示雌性，方点表示雄性。
移植小鼠中的CD3+T细胞百分比与移植的胸腺组织的实际重量(mg)相关。将移植的小鼠分为2组，一组包括接受1mg至3mg以下胸腺组织的小鼠，另一组包括接受3mg以上至7mg胸腺组织的小鼠。这两组之间CD3+血液T细胞的产生存在统计学上的显著差异(P＝0.0002；图2E)。在该分析中，根据移植到淋巴结中的胸腺的实际重量(mg)而不是胸腺叶部分，将小鼠分为2组。***表示P值小于0.001。**表示P值小于0.01。ns表示“不显著”(即P值大于0.05)。
这些结果表明了两个结论：(1)在淋巴结中移植的胸腺组织的重量与移植小鼠中循环T细胞的百分比之间存在剂量反应。(2)移植到淋巴结中的胸腺组织的重量存在一个阈值，以获得更多接近野生型的循环T细胞，并可能改善T细胞功能。
一个月后，使用针对15种不同变体的单克隆抗体，通过流式细胞术分析了5只移植小鼠中循环血液T细胞的T细胞受体(TCR)Vβ组库。在这个时间点获得的CD3+T细胞百分比与一个月前获得的相当，唯一的例外是移植了整个胸腺的小鼠，其T细胞百分比略有增加(图3A)。从16次不同的测量中获得平均值。9个TCR-Vβ变体经鉴定在移植小鼠和一只对照BALB/c野生型小鼠中均有表达(图3B)。包括BALB/c野生型小鼠作为阳性对照(CNTRL)。在不同条件下未观察到差异(单向方差分析(one-way ANOVA)P＝0.9956)，证明将胸腺组织递送至淋巴结可以增加缺乏胸腺或胸腺功能缺陷的受者的循环T细胞多样性。
所有20只小鼠在移植后6个半月终止。图4A显示了分离的淋巴结的重量。
与图2B相似，移植1/4胸腺叶的淋巴结重量与移植1/2胸腺叶的淋巴结重量相似(分别为13.49±7.65和18.33±7.03；P＝0.2628；图4A)。每个点代表一只小鼠。圆点表示雌性，方点表示雄性。当移植1叶胸腺时，淋巴结重量显著增加(28.8±13.62；1/4叶组对比1叶组的P＝0.0315)。以与图2E中的数据相同的方式，分离的淋巴结根据其接受的胸腺组织的重量(mg)分为2组。同样，这两组之间存在统计学上的显著差异(P＝0.0428；图4B)。*表示P值小于00.5。
公开的数据表明移植到淋巴结中的胸腺组织的重量、处死时淋巴结的重量和被移植小鼠中循环血液T细胞的数量之间的关系。这些结果表明，在存在体型限制的对象中，可以移植更多的淋巴结以获得更高水平的循环血液T细胞，例如，接近具有正常功能胸腺的对象的百分比。结果还表明，在该模型中，雌性在胸腺移植后可以更有效地产生新的T细胞。不希望囿于理论，响应胸腺移植的性别差异可能是该模型中雌性和雄性之间的激素差异的结果。
上述结果表明，移植更多的胸腺重量可能与更高水平的幼稚T细胞重建有关。例如，在一些实施方式中，与移植小于完整胸腺重量的三分之一相比，移植完整胸腺的至少三分之一重量可以导致更高水平的幼稚T细胞重建。例如，平均8.5mg的完整大小新生小鼠胸腺中的超过3mg，可以相当于在人患者中25克的完整大小儿童胸腺中的略低于9克。考虑到在一些情况下，大约1ml是可以注射到人淋巴结中的最大体积，总共可以在淋巴结中注射9个淋巴结(每个淋巴结1克胸腺组织)以获得完整的儿童胸腺的1/3。
胸腺切除手术可导致T细胞淋巴细胞减少症，其特征为幼稚T细胞减少，伴随记忆T细胞群增加。此外，某些经历胸腺切除术的患者(例如，生命早期，例如＜6个月，胸腺去除＞90％)在生命后期显示T细胞区室中的数量缺陷，主要影响幼稚T细胞群。
如果根据本发明的组合物和方法用胸腺组织自体移植这些患者，可以增加血液循环CD3+T细胞，特别是可以恢复幼稚T细胞群。
7.2实施例2：衰老野生型小鼠研究
本实施例说明移植低剂量胸腺(淋巴结中1/4的胸腺叶)是否可以使移植小鼠的免疫功能复原，以及雌性和雄性之间是否存在任何差异。
登记了32只C57BL/6J小鼠，16只雌性和16只雄性。每个小鼠组依次包括8只成年小鼠(18周龄)和8只老年小鼠(62周龄)。每组中一半的小鼠移植了1/4胸腺叶。从同一窝的GFP+C57BL/6J新生小鼠中分离出供者胸腺。胸腺移植七周后，利用这些亚群中CD44和CD62L的差异表达，通过流式细胞术分析所有32只小鼠的幼稚、效应和记忆T细胞(图5A-5H)。门控策略在图5A-5H中提供。图5A说明了前向散射与侧向散射门。图5B说明了针对单细胞的门。图5C说明了针对活细胞的门。图5D说明了针对CD45+细胞的门。图5E说明了针对CD3+细胞的门。图5F说明了针对CD4+和CD8+细胞的门。图5G说明了针对幼稚的、激活效应的、效应记忆的和中央记忆细胞的CD4+细胞的门控。图5H说明了针对幼稚的、激活效应的、效应记忆的和中央记忆细胞的CD8+细胞的门控。
幼稚T细胞在胸腺中持续产生，但随着小鼠衰老和胸腺退失，幼稚CD4+和CD8+T细胞的比例降低。因此，对老年动物的胸腺移植是否能够增加幼稚T细胞的群进行了测试。
与成年雌性相比，老年雌性在CD4+幼稚T细胞中显示出统计学高度显著的减少(P＜0.0001)(图6A和6E)。这些小鼠中CD4+幼稚T细胞的减少导致激活的CD4+T细胞效应T细胞(P＝0.0062)、CD4+效应/记忆T细胞(P＜0.0001)以及CD4+中央记忆T细胞(P＝0.0297)平行且显著的增加(图6A-6D)。对细胞进行门控，首先针对单峰，然后针对活细胞、CD45+细胞、CD3+细胞、CD4+，最后针对CD44和CD62L表达(图5A-5H)。每个点代表一只小鼠。圆点表示雌性，方点表示雄性。*表示P值小于0.05。**表示P值小于＜0.01。***表示P小于0.001。****表示P值小于0.0001。有趣的是，与成年雄性相比，老年雄性在这些群体中没有表现出任何显著变化(图6B-6E)。
重要的是，相对于未移植的对应者，胸腺移植后老年雌性中的CD4+幼稚T细胞显著增加(P＝0.0127)，而CD4+效应/记忆T细胞的数量显著减少(P＝0.0321)(图6A-6E)。与未移植的对应者相比，在胸腺移植后的老年雄性中也观察到CD4+效应/记忆T细胞群的显著减少(P＝0.0112)(图6B-6E)。在胸腺移植后在成年雌性和雄性中都没有观察到CD4+亚群的变化(图6B-6E)。
这些初步结果表明(1)在该模型中，老年雌性的幼稚T细胞百分比低于年龄匹配的雄性；(2)在该模型中，与年龄匹配的雄性相比，衰老的雌性的幼稚T细胞下降更严重；和(3)移植低剂量胸腺增加老年雌性中CD4+幼稚T细胞的百分比，同时降低CD4+效应/记忆T细胞的比例。
7.3实施例3：人自体胸腺组织移植
人新生儿或婴儿对象出现需要胸腺切除术的适应症，例如，需要手术矫正和作为手术一部分的胸腺切除术的先天性心脏缺陷。手术期间收集胸腺组织，并使用无菌技术将其切或切碎成小片段。任选地，胸腺组织如本文所公开的离体培养和/或冷藏保存。将胸腺组织片段悬浮在含有合适的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体的溶液中，并如本文所公开的那样注射到对象的一个或多个淋巴结中(例如，在超声引导下使用微创)。一个月或几个月后，评估对象的外周血样品以确定外周血T细胞和/或幼稚T细胞的水平是否高于未接受注射的可比较对象，或与注射片段之前该对象中的水平相比更高。如果外周血T细胞和/或幼稚T细胞的水平仍然被认为太低，则可以移植更多的胸腺组织，直到达到足够数量的外周血T细胞和/或幼稚T细胞。
7.4实施例4：胸腺组织移植到人对象中
人对象患有影响胸腺功能的病症，例如与年龄相关的胸腺萎缩。确定合适的供者，例如，具有与对象HLA匹配的完整胸腺的尸体供者。胸腺组织从供者处采集，并使用无菌技术切或切碎成小片段。任选地，胸腺组织如本文所公开的离体培养和/或冷藏保存。将胸腺组织片段悬浮在含有合适的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体的溶液中，并如本文所公开的那样注射到对象的一个或多个淋巴结中(例如，在超声引导下使用微创)。任选地向对象给予免疫抑制方案以提高移植物接受度。一个月或几个月后，评估对象的外周血样品以确定外周血T细胞和/或幼稚T细胞的水平是否高于未接受注射的可比较对象，或与注射片段之前该对象中的水平相比更高。如果外周血T细胞和/或幼稚T细胞的水平仍然被认为太低，则可以移植更多的胸腺组织，直到达到足够数量的外周血T细胞和/或幼稚T细胞。
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尽管已经详细描述了本公开的主题及其优点，但应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的工艺、机器、制造和物质组合物以及方法的特定实施方式。正如本领域普通技术人员从本发明主题的公开内容中容易理解的那样，目前存在或将要开发的工艺、机器、制造、物质组合物或方法，其执行基本相同的功能或根据本发明的主题可以使用与本文所述的相应实施方式实现基本相同的结果。因此，所附权利要求旨在将这些工艺、机器、制造、物质组合物或方法包括在其范围内。
在整个本申请中引用了各种专利、专利申请、出版物、产品说明、方案和序列登录号，其公开内容出于所有目的通过引用全文纳入本文。
Claims (108)
1.一种用于保留或恢复有需要的对象的胸腺功能的方法，所述方法包括将胸腺组织递送到所述对象的至少一个淋巴结中，其中所述胸腺组织是所述对象自体的。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述对象患有先天性心脏缺陷。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述对象已经接受或正在接受心脏直视手术。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中当所述对象是新生儿或婴儿时进行胸腺切除手术。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述对象是人对象。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述对象是新生儿或婴儿。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述对象是儿童、青少年或成年。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述对象已经接受或正在接受胸腺切除手术。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述胸腺组织是在所述胸腺切除手术期间从所述对象获得的。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织是在所述胸腺切除手术之前从所述对象获得的。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织是切碎的胸腺片段。
12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织在所述递送之前离体培养。
13.如权利要求12所述的方法，其中在所述递送之前将所述胸腺组织离体培养至少24小时。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织通过针被递送到所述对象的淋巴结中。
15.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其中在所述胸腺切除手术期间将所述胸腺组织递送到所述淋巴结中。
16.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其中在所述胸腺切除手术之后将所述胸腺组织递送到所述淋巴结中。
17.如权利要求16所述的方法，其中在所述胸腺切除手术之后递送到淋巴结之前将所述胸腺组织在冷藏保存。
18.如权利要求17所述的方法，其中将所述冷藏保存的胸腺组织在所述胸腺切除手术后约1周、约2周、约3周、约4周、约2个月、约4个月、约6个月、约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约10年、约15年、约20年或更长时间递送到淋巴结。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织为恢复所述对象的胸腺功能的有效量。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织为在所述淋巴结中扩增的有效量，其中所述扩增的胸腺组织恢复所述对象的胸腺功能。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织的量为至少约0.1克。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织的量为多达约20克。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述胸腺组织的大小为至少约0.1cm3。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织的大小为多达约20cm3。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中将所述胸腺组织递送到所述对象的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个淋巴结。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中将所述对象的完整胸腺重量的至少约三分之一递送到所述对象的所述至少一个淋巴结中。
27.一种用于保留或恢复对象胸腺功能的试剂盒，包括胸腺组织和用于将所述胸腺组织递送至所述对象的至少一个淋巴结的工具，其中所述胸腺组织是对象自体的。
28.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括溶液，其中所述胸腺组织在所述溶液中提供。
29.如权利要求27或28所述的试剂盒，其中所述溶液包含药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的稀释剂或药学上可接受的运载体。
30.如权利要求27-29中任一项所述的试剂盒，其中所述胸腺组织为恢复所述对象的胸腺功能的有效量。
31.如权利要求27-30中任一项所述的试剂盒，其中所述胸腺组织为在所述淋巴结中扩增的有效量，其中所述扩增的胸腺组织恢复所述对象的胸腺功能。
32.如权利要求27-31中任一项所述的试剂盒，进一步包括说明书，其中所述说明书包括将所述胸腺组织递送至所述对象的所述至少一个淋巴结。
33.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述说明书包括将所述对象的完整胸腺重量的至少约三分之一递送到所述对象的至少一个淋巴结中。
34.如权利要求27-33中任一项所述的试剂盒，其中用于递送所述胸腺组织的所述工具包括微创手术所需的针和工具。
35.如权利要求27-34中任一项所述的试剂盒，其中所述胸腺组织是冷藏保存的胸腺组织。
36.如权利要求27-35中任一项所述的试剂盒，其中所述对象已经接受或正在接受胸腺切除手术。
37.一种方法，包括将胸腺组织递送到对象的淋巴结中，其中所述对象中为T细胞的CD45+外周血细胞的频率在所述递送后为至少20％。
38.如权利要求37所述的方法，其中为T细胞的CD45+外周血细胞的频率在所述递送后为至少25％。
39.如权利要求37所述的方法，其中为T细胞的CD45+外周血细胞的频率在所述递送后为至少30％。
40.一种方法，包括将胸腺组织递送到对象的淋巴结中，其中所述对象中为T细胞的CD45+外周血细胞的频率比所述递送之前所述对象中为T细胞的CD45+外周血细胞的频率增加至少5％。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述为T细胞的CD45+外周血细胞的频率比所述递送之前的所述对象中为T细胞的CD45+外周血细胞的所述频率增加至少10％。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述为T细胞的CD45+外周血细胞的频率比所述递送之前的所述对象中为T细胞的CD45+外周血细胞的频率增加至少20％。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述为T细胞的CD45+外周血细胞的频率比所述递送之前的所述对象中为T细胞的CD45+外周血细胞的频率增加至少30％。
44.一种方法，包括将胸腺组织递送到对象的淋巴结中，其中所述对象的外周血中的T细胞浓度相对于所述递送之前所述对象外周血中的T细胞浓度增加至少5％。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述对象外周血中的T细胞浓度相对于所述递送之前所述对象外周血中的T细胞浓度增加至少10％。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述对象外周血中的T细胞浓度相对于所述递送之前所述对象外周血中的T细胞浓度增加至少20％。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述对象外周血中的T细胞浓度相对于所述递送之前所述对象外周血中的T细胞浓度增加至少30％。
48.一种方法，包括将胸腺组织递送到对象的淋巴结中，其中所述对象中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率在所述递送后为至少20％。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率在所述递送后为至少25％。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率在所述递送后为至少30％。
51.如权利要求48所述的方法，其中所述为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率在所述递送后为至少40％。
52.如权利要求48所述的方法，其中所述为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率在所述递送后为至少50％。
53.一种方法，包括将胸腺组织递送到对象的淋巴结中，其中所述对象中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率比所述递送之前所述对象中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率增加至少5％。
54.如权利要求53所述的方法，其中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率比在所述递送之前所述对象中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率增加至少10％。
55.如权利要求53所述的方法，其中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率比在所述递送之前所述对象中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率增加至少20％。
56.如权利要求53所述的方法，其中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率比在所述递送之前所述对象中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率增加至少30％。
57.如权利要求53所述的方法，其中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率比在所述递送之前所述对象中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率增加至少40％。
58.如权利要求53所述的方法，其中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率比在所述递送之前所述对象中为幼稚T细胞的CD3+外周血细胞的频率增加至少50％。
59.一种方法，包括将胸腺组织递送到对象的淋巴结中，其中所述对象的外周血中幼稚T细胞的浓度相对于所述递送之前所述对象外周血中幼稚T细胞的浓度增加至少5％。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述对象外周血中幼稚T细胞的浓度相对于所述递送之前所述对象外周血中幼稚T细胞浓度增加至少10％。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述对象外周血中幼稚T细胞的浓度相对于所述递送之前所述对象外周血中幼稚T细胞浓度增加至少20％。
62.如权利要求59所述的方法，其中所述对象外周血中幼稚T细胞的浓度相对于所述递送之前所述对象外周血中幼稚T细胞浓度增加至少30％。
63.如权利要求59所述的方法，其中所述对象外周血中幼稚T细胞的浓度相对于所述递送之前所述对象外周血中幼稚T细胞浓度增加至少40％。
64.如权利要求59所述的方法，其中所述对象外周血中幼稚T细胞的浓度相对于所述递送之前所述对象外周血中幼稚T细胞浓度增加至少50％。
65.如权利要求48-64中任一项所述的方法，其中所述幼稚T细胞是CD45RA+CCR7+。
66.如权利要求48-64中任一项所述的方法，其中所述幼稚T细胞是CD44-CD62L+或其人等价物。
67.一种方法，包括将至少约7克胸腺组织递送到对象的一个或多个淋巴结中。
68.如权利要求37-67中任一项所述的方法，其中将至少8克胸腺组织递送到所述对象的一个或多个淋巴结中。
69.如权利要求37-67中任一项所述的方法，其中将至少9克胸腺组织递送到所述对象的一个或多个淋巴结中。
70.如权利要求37-67中任一项所述的方法，其中将至少10克胸腺组织递送到所述对象的一个或多个淋巴结中。
71.一种方法，包括将胸腺组织递送到对象的淋巴结中，其中所述对象为至少40岁。
72.如权利要求37-71中任一项所述的方法，其中所述对象为至少50岁。
73.如权利要求37-71中任一项所述的方法，其中所述对象为至少55岁。
74.如权利要求37-71中任一项所述的方法，其中所述对象为至少60岁。
75.如权利要求37-71中任一项所述的方法，其中所述对象为至少65岁。
76.如权利要求37-71中任一项所述的方法，其中所述对象为至少70岁。
77.一种方法，包括将胸腺组织递送到对象的淋巴结中，其中所述对象体重每公斤递送至少50毫克胸腺组织。
78.如权利要求37-77中任一项所述的方法，其中所述对象体重每公斤递送至少100毫克胸腺组织。
79.如权利要求37-78中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织已被冷藏保存。
80.如权利要求37-79中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织已经被离体培养。
81.如权利要求37-80中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织以增加所述对象胸腺功能的有效量递送。
82.如权利要求37-81中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织以在所述淋巴结中形成异位胸腺组织的有效量递送。
83.如权利要求37-82中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织以增加所述对象中T细胞受体多样性水平的有效量递送。
84.如权利要求37-83中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织以单剂递送。
85.如权利要求37-83中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织以两剂或更多剂递送。
86.如权利要求37-85中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织被递送至单个淋巴结。
87.如权利要求37-85中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织被递送至两个或更多个淋巴结。
88.如权利要求37-87中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织包括切碎的胸腺片段。
89.如权利要求37-85中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织被注射到所述淋巴结中。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述胸腺组织作为微创手术的一部分被注射到所述淋巴结中。
91.如权利要求37-70或77-90中任一项所述的方法，其中，所述对象是新生儿。
92.如权利要求37-70或77-90中任一项所述的方法，其中所述对象是婴儿。
93.如权利要求37-70或77-90中任一项所述的方法，其中所述对象是儿童。
94.如权利要求37-70或77-90中任一项所述的方法，其中所述对象是青少年。
95.如权利要求37-70或77-90中任一项所述的方法，其中所述对象是成年。
96.如权利要求37-70或77-90中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
97.如权利要求37-96中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
98.如权利要求37-97中任一项所述的方法，其中所述对象已经进行了胸腺切除手术。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述胸腺组织是在所述胸腺切除手术期间获得的。
100.如权利要求98或99所述的方法，其中在所述胸腺切除手术期间所述胸腺组织被递送至所述淋巴结。
101.如权利要求98或99所述的方法，其中在所述胸腺切除手术之后所述胸腺组织被递送至所述淋巴结。
102.如权利要求37-101中任一项所述的方法，其中所述对象患有影响所述胸腺的病症。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述影响胸腺的病症是重症肌无力、纯红细胞发育不全、低γ球蛋白血症、胸腺癌、胸腺瘤、A型胸腺瘤、B型胸腺瘤、自身免疫性疾病、T细胞介导的自身免疫、T细胞淋巴细胞减少症、胸腺萎缩、年龄-相关性胸腺萎缩、胸腺囊肿、胸腺增生、胸腺细胞减生、胸腺发育不全、胸腺发育不良、严重联合免疫缺陷、尼兹诺夫综合征、威-奥二氏综合征、迪乔治综合征、复发感染、复发病毒感染、过早免疫老化或癌症。
104.如权利要求37-103中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织是所述对象自体的。
105.如权利要求37-103中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织是所述对象同种异体的。
106.如权利要求37-103中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织是与所述对象HLA-匹配的。
107.如权利要求37-106中任一项所述的方法，进一步包括向所述对象给予免疫抑制方案。
108.如权利要求37-107中任一项所述的方法，其中所述对象在所述递送之后具有约5∶1至1∶1的外周血CD4∶CD8 T细胞比率。
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