CN114727934A - 伤口清创系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于伤口清创和愈合的组合物和方法。清创组合物优选包括金属蛋白酶，诸如绒毛膜酶。

Description

伤口清创系统

技术领域

本发明提供用于伤口清创和愈合的组合物和方法。

背景技术

慢性伤口给患者、卫生保健专业人员和美国卫生保健系统带来了显著的负担，影响了570万患者，并且每年花费估计200亿美元。

在其他方面健康的个体中很少见到慢性伤口。事实上，慢性伤口患者经常患有“高度烙印”的疾病诸如糖尿病和肥胖症。慢性伤口是指通过有序且及时的修复过程未能继续产生损伤部位的解剖学上和功能完整性的那些伤口。慢性伤口通常被伪装成共病病症，慢性伤口代表着无症状的流行病，它影响着世界人口的很大部分，并对美国的公共卫生和经济构成了重大且日益严重的威胁。在发达国家，据估计1％至2％的人口在他们的一生期间将经历慢性伤口。仅在美国，慢性伤口就影响了650万患者。在斯堪的纳维亚国家，相关开支占总卫生保健费用的2-4％。

由于卫生保健开支的增加，人口老龄化，以及在美国和其他国家，全世界糖尿病和肥胖症的发病率急剧上升，治疗慢性伤口的负担正在迅速增加。据称，每年用于治疗慢性伤口的花费超过250亿美元。除此之外，我们的退伍军人对伤口护理的需求也在迅速扩大，并且优先考虑伤口护理和研究的需求似乎是迫切的。目前，美国有超过1000个门诊伤口中心在运作，其不包括由临床医生在其办公室、由住院急症护理医院、长期设施和护理院提供的所有伤口护理。根据全球行业分析师的新报告，到2010年，年度伤口护理产品市场将达到153亿美元。美国代表了世界上最大和增长最快的市场。花费在伤口护理上的大量金钱、受影响的个体和照顾他们的家庭的生产力丧失以及他们下降的生活质量给我们的社会带来了巨大的代价。

本领域需要的是用于慢性伤口的新的且有效的治疗。

发明内容

本发明提供用于伤口清创和愈合的组合物和方法。

因此，在一些实施方式中，本发明提供了清创伤口的方法，所述方法包括使所述伤口与有效量的金属蛋白酶接触。

在一些优选的实施方式中，所述有效量的金属蛋白酶有效去除所述伤口中的失活组织。在一些优选的实施方式中，所述金属蛋白酶选自由以下组成的组：低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合。在一些优选的实施方式中，LCE为鳟鱼LCE。在一些优选的实施方式中，LCE与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。在一些优选的实施方式中，LCE活性是使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的酪蛋白作为底物测定的LCE蛋白酶活性，并且其中LCE蛋白酶活性由于酪蛋白被消化成更小的肽时FITC的猝灭释放而引起荧光增加。在一些优选的实施方式中，LCE为重组LCE。在一些优选的实施方式中，重组LCE包括组氨酸-标签。在一些优选的实施方式中，所述金属蛋白酶以基质、绷带、伤口覆盖物、乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。

在一些优选的实施方式中，所述方法进一步包括在清创后将伤口愈合剂施加至所述伤口的步骤。在一些优选的实施方式中，所述伤口愈合剂包括可分化细胞的提取物。在一些优选的实施方式中，所述可分化细胞的提取物为鱼卵提取物。在一些优选的实施方式中，所述鱼卵提取物包括在水性溶液中的约100至380mg/ml蛋白质；约0.1至10mg/ml RNA；和约0.1至5mg/ml DNA和0.1-10％脂质w/w。在一些优选的实施方式中，通过将所述提取物加热至高于80℃、90℃、95℃或100℃来加热处理所述鱼卵提取物。在一些优选的实施方式中，所述加热处理为约1分钟至约30分钟。

在一些优选的实施方式中，所述伤口愈合剂以基质、绷带、伤口覆盖物、乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。

在一些优选的实施方式中，所治疗的伤口为慢性伤口。在一些优选的实施方式中，所述慢性伤口为糖尿病溃疡。

在一些优选的实施方式中，本发明提供制剂，所制剂述包括有效清创伤口量的金属蛋白酶，为乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂。在一些优选的实施方式中，所述有效清创伤口量的金属蛋白酶为有效去除伤口中的失活组织。在一些优选的实施方式中，所述金属蛋白酶选自由以下组成的组：低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合。在一些优选的实施方式中，LCE为鳟鱼LCE。在一些优选的实施方式中，LCE与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。在一些优选的实施方式中，LCE活性是使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的酪蛋白作为底物测定的LCE蛋白酶活性，并且其中LCE蛋白酶活性由于酪蛋白被消化成更小的肽时FITC的猝灭释放而引起荧光增加。在一些优选的实施方式中，LCE为重组LCE。在一些优选的实施方式中，重组LCE包括组氨酸-标签。在一些优选的实施方式中，所述制剂包括在水性溶液中的脲和/或氯化锌(ZnCl₂)。在一些优选的实施方式中，所述脲以1至10M、更优选2至6M、甚至更优选3至5M以及最优选约4M的浓度提供。在一些优选的实施方式中，所述氯化锌以2至40mM、更优选4至20mM、甚至更优选6至18mM以及最优选8至18mM的浓度提供。

在一些优选的实施方式中，本发明提供用于治疗伤口的试剂盒或系统，所述试剂盒或系统包括：第一容器，所述第一容器包括有效量的金属蛋白酶以从伤口去除失活组织；以及第二容器，所述第二容器包括伤口愈合剂。在一些优选的实施方式中，所述金属蛋白酶选自由以下组成的组：低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合。在一些优选的实施方式中，LCE为鳟鱼LCE。在一些优选的实施方式中，LCE与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。在一些优选的实施方式中，LCE活性是使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的酪蛋白作为底物测定的LCE蛋白酶活性，并且其中LCE蛋白酶活性由于酪蛋白被消化成更小的肽时FITC的猝灭释放而引起荧光增加。在一些优选的实施方式中，LCE为重组LCE。在一些优选的实施方式中，重组LCE包括组氨酸-标签。在一些优选的实施方式中，所述金属蛋白酶以基质、绷带、伤口覆盖物、乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。在一些优选的实施方式中，所述伤口愈合剂包括可分化细胞的提取物。在一些优选的实施方式中，所述可分化细胞的提取物为鱼卵提取物。在一些优选的实施方式中，所述鱼卵提取物包括在水性溶液中的约100至380mg/ml蛋白质；约0.1至10mg/ml RNA；和约0.1至5mg/ml DNA和0.1-10％脂质w/w。在一些优选的实施方式中，通过将所述提取物加热至高于80℃、90℃、95℃或100℃来加热处理所述鱼卵提取物。在一些优选的实施方式中，所述加热处理为约1分钟至约30分钟。在一些优选的实施方式中，所述伤口愈合剂以基质、绷带、伤口覆盖物、乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。

在一些优选的实施方式中，本发明提供有效量的金属蛋白酶用于清创伤口的用途。在一些优选的实施方式中，所述有效量的金属蛋白酶有效去除所述伤口中的失活组织。在一些优选的实施方式中，所述金属蛋白酶选自由以下组成的组：低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合。在一些优选的实施方式中，LCE为鳟鱼LCE。在一些优选的实施方式中，LCE与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。在一些优选的实施方式中，LCE活性是使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的酪蛋白作为底物测定的LCE蛋白酶活性，并且其中LCE蛋白酶活性由于酪蛋白被消化成更小的肽时FITC的猝灭释放而引起荧光增加。在一些优选的实施方式中，LCE为重组LCE。在一些优选的实施方式中，重组LCE包括组氨酸-标签。在一些优选的实施方式中，所述金属蛋白酶以基质、绷带、伤口覆盖物、乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。

在进一步优选的实施方式中，本发明提供药物或化妆品组合物，所述药物或化妆品组合物包括：重组金属蛋白酶，所述重组金属蛋白酶选自由低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合组成的组，其中所述重组金属蛋白酶在体外测定中呈现出金属蛋白酶活性。在一些优选的实施方式中，LCE为鳟鱼LCE。在一些优选的实施方式中，鳟鱼LCE序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。在一些优选的实施方式中，LCE活性是使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的酪蛋白作为底物测定的LCE蛋白酶活性，并且其中LCE蛋白酶活性由于酪蛋白被消化成更小的肽时FITC的猝灭释放而引起荧光增加。在一些优选的实施方式中，所述药物或化妆品组合物包括在水性溶液中的脲和/或氯化锌(ZnCl₂)。在一些优选的实施方式中，所述脲以1至10M、更优选2至6M、甚至更优选3至5M以及最优选约4M的浓度提供。在一些优选的实施方式中，所述氯化锌以2至40mM、更优选4至20mM、甚至更优选6至18mM以及最优选8至18mM的浓度提供。

在进一步优选的实施方式中，本发明提供药物或化妆品组合物，所述药物或化妆品组合物包括：重组金属蛋白酶，所述重组金属蛋白酶选自由以下组成的组：低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合；以及一种或多种药学上或化妆品中可接受的赋形剂和/或稀释剂，其中所述组合物为凝胶、乳膏、软膏、洗剂、泡沫、非水性溶液、喷雾、油膏、棍状物、皂、粉末、膜、乳剂、悬浮液或分散体，以及其中所述重组金属蛋白酶在体外测定中呈现出金属蛋白酶活性。在一些优选的实施方式中，LCE为鳟鱼LCE。在一些优选的实施方式中，鳟鱼LCE序列与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。在一些优选的实施方式中，所述药物或化妆品组合物包括在水性溶液中的脲和/或氯化锌(ZnCl₂)。在一些优选的实施方式中，所述脲以1至10M、更优选2至6M、甚至更优选3至5M以及最优选约4M的浓度提供。在一些优选的实施方式中，所述氯化锌以2至40mM、更优选4至20mM、甚至更优选6至18mM以及最优选8至18mM的浓度提供。

在一些优选的实施方式中，提供所述药物或化妆品组合物用于治疗皮肤疾病或病症的用途。在一些优选的实施方式中，所述皮肤病症或疾病为皮肤干燥、角化过度、胼胝、疣、肝斑、老人斑、妊娠纹、日斑、褐斑、痤疮、湿疹或银屑病。

附图说明

图1.凝胶示出LCE1在大肠杆菌(E.coli)中过表达的结果。

图2.来自重组LCE1过表达部分的蛋白酶活性。

图3.添加脲和氯化锌的可溶性重组LCE活性。

定义

术语“天然产物”意指各种各样有机化学部分中的任何一种，其分子排列来源于活生物中的酶促转化，不包括氨基酸、蛋白质、多肽、核酸和序列以及饱和脂肪酸。实例包括但不限于脂质(即其不是饱和脂肪酸)、碳水化合物/糖和多糖、甾体及其衍生物、萜烯及其衍生物、维生素、类胡萝卜素和天然药剂诸如泰素等。术语“合成天然产物”为不从其天然来源获得的天然产物。

“细胞”意指能够自主运作的生命物质的最小结构单位，由一个或多个胞核、细胞质和各种细胞器组成，均由半透膜包围。细胞包括从处于发育的任何阶段的活体或死去的动物体获得或衍生的所有体细胞以及生殖细胞，包括精子和卵(由卵细胞或胚连同营养和保护性包膜组成的动物生殖体)。包括两种一般种类的细胞：原核生物和真核生物。预期用于本发明的细胞包括来自所有界的所有生物的所有类型的细胞：植物、动物、原生生物、真菌、古细菌和真细菌。干细胞是能够通过连续分裂产生许多不同水平的特化细胞的细胞。例如，造血干细胞产生红血细胞和白血细胞两者。从受孕直到死亡，人包含干细胞，但在成年人中，它们的分化能力降低了。

如本文所用，与细胞相关的术语“分化”意指细胞在结构和功能上变得特化的过程，这是在胚发育期间发生的发育潜力的逐渐限制和功能的增加特化并导致特化细胞、组织和器官的形成。

与细胞相关的术语“去分化”意指分化的逆过程，其中细胞在结构和功能上变得更低的特化，从而增加了细胞的发育潜力。

“可分化”意指细胞分化成期望细胞类型的能力。如本文所用，术语“分化”意指特化(分化)或返回至更原始的细胞类型；去分化)。

如在本发明中“细胞提取物”和“卵提取物”的上下文中所用的“提取物”意指通过化学或机械作用，如通过压力、蒸馏、蒸发等获得的如上定义的任何类型细胞的制剂。提取物可以包括细胞的所有或任何单一组分或组分的组合，包括活性组分的浓缩制剂。提取物的这样的组分包括但不限于RNA、DNA、微RNA、脂质、游离氨基酸、所有氨基酸碱基结构包括肽和蛋白质、碳水化合物、矿物质或其组合。本发明考虑的提取物包括但不限于鱼卵、海胆卵、蛙卵、成体干细胞、植物种子和植物干细胞的提取物。

当与疾病或病症结合使用时，术语“管理”意指向被给药预防剂或治疗剂的受试者提供有益作用，这不会导致疾病的治愈。在某些实施方式中，向受试者给药一种或多种预防剂或治疗剂以管理疾病，从而防止疾病的进展或恶化。

如本文所用，术语“防止(prevent)”和“防止(preventing)”包括防止复发、扩散或发作。本发明并非旨在限制完全防止。在一些实施方式中，发作延迟，或疾病的严重性降低。

如本文所用，术语“治疗(treat)”和“治疗(treating)”不限于治愈受试者(例如患者)并且根除疾病的情况。更确切地说，本发明还考虑仅降低症状和/或延缓疾病进展的治疗。

具体实施方式

本发明提供用于伤口清创和愈合的组合物和方法。

皮肤的两个主要层是表皮和真皮。表皮由紧密排列的上皮细胞组成，以及真皮由致密的、不规则的结缔组织组成，其中血管、毛囊、汗腺和其他结构都在其中。皮下组织位于真皮之下。其组成主要为疏松的结缔组织和脂肪组织。肌肉、经筋、韧带、骨和软骨都在皮下组织之下。表皮由角化、复层、扁平上皮组成。真皮包含血管和淋巴管、神经和其他结构诸如毛囊和汗腺。

清创的适应症是去除失活组织，诸如坏死组织、腐肉、生物负荷、生物膜和凋亡细胞。清创被认为是伤口管理的主要组成部分，以使伤口床为表皮细胞再生做准备。通常，失活组织，尤其是坏死组织，充当细菌的营养物来源。失活组织还充当表皮细胞再生的物理屏障，阻碍施加的局部化合物与伤口床直接接触以提供其有益特性。坏死组织还阻碍血管生成、肉芽组织形成、表皮表面重修和正常细胞外基质(ECM)形成。最后，坏死组织的存在可能会阻碍临床医生准确评估伤口的程度和严重性，甚至掩盖可能的潜在感染。

本发明提供了用于清创和伤口愈合所需的试剂和系统。在一些实施方式中，本发明提供用于伤口清创的金属蛋白酶。优选的金属蛋白酶包括但不限于低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合。酶可以优选来源于鱼诸如鳟鱼或鲑鱼，但本发明不限于那些酶的来源。在一些优选的实施方式中，酶是重组产生的。在进一步的实施方式中，本发明提供了包含有效量的一种或多种金属蛋白酶的制剂和制品。酶可以单独用于伤口清创，或者在进一步优选的实施方式中，酶可以连同伤口愈合剂使用。通常，首先进行清创，并且随后施加伤口愈合剂。优选的伤口愈合剂包括但不限于如下文详细描述的可分化细胞的提取物。本发明的组合物、制剂、制品和方法可以用于治疗任何类型的伤口。在一些实施方式中，伤口是慢性伤口诸如糖尿病溃疡。

A.清创酶

在优选的实施方式中，本发明提供用于伤口清创的金属蛋白酶。在一些优选的实施方式中，提供有效量的金属蛋白酶以从伤口部位去除失活组织。失活组织可以包括在伤口部位发现的坏死组织、腐肉、生物负荷、生物膜和凋亡细胞中的一种或全部。

本发明不限于使用特定的金属蛋白酶。优选的金属蛋白酶包括但不限于LCE、HCE及其组合。LCE和HCE优选来源于鱼或其他海洋动物，诸如鲑鱼属鱼(例如，虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和大西洋鲑鱼(Salmo salar))。

合适的LCE和HCE酶由表1中列出的序列标识。

表1

在一些实施方式中，绒毛膜酶与表1中列出的序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同一性，具有的条件是所述酶具有卵膜裂解活性。在一些实施方式中，绒毛膜酶分离自天然来源。在一些优选的实施方式中，绒毛膜酶是重组的。在一些实施方式中，重组酶优选包括额外的序列，诸如促进酶纯化的组氨酸-标签。

在一些优选的实施方式中，绒毛膜酶是虹鳟(虹鳟鱼)LCE。在一些实施方式中，虹鳟LCE具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:1):

在一些优选的实施方式中，本发明中使用的LCE与SEQ ID NO:1具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同一性，具有的条件是酶具有卵膜裂解活性。在一些实施方式中，LCE分离自天然来源。在一些优选的实施方式中，LCE是重组的。在一些实施方式中，重组酶优选包括额外的序列，诸如促进酶纯化的组氨酸-标签。

在一些优选的实施方式中，可溶性重组LCE(例如，在水性溶液或制剂中)的活性通过具有脲和/或氯化锌(ZnCl₂)的制剂而增强。在一些优选的实施方式中，所述脲以1至10M、更优选2至6M、甚至更优选3至5M以及最优选约4M的浓度提供。在一些优选的实施方式中，所述氯化锌以2至40mM、更优选4至20mM、甚至更优选6至18mM以及最优选8至18mM的浓度提供。

B.伤口愈合剂

在一些实施方式中，本发明提供了方法、系统和试剂盒，其中除了清创酶之外还提供了伤口愈合剂。在一些优选的实施方式中，伤口愈合剂在用酶清创后施加至伤口。

本发明不限于使用任何特定的伤口愈合剂。在一些优选的实施方式中，伤口愈合剂包括来自可分化细胞诸如鱼卵的提取物。在一些实施方式中，卵细胞提取物包括在水性溶液中的约100至380mg/ml蛋白质；约0.1至10mg/ml RNA；约0.1至5mg/ml DNA和0.1-10％脂质w/w。在一些优选的实施方式中，组合物具有约330至440mOsm的渗量、约5.0至7.7的pH和约0.8至1.4g/ml的密度。在一些实施方式中，卵细胞提取物选自由以下提取物组成的组：活化的鱼卵细胞提取物和未活化的鱼卵细胞提取物。在一些实施方式中，鱼卵细胞提取物来自受精卵。在一些实施方式中，通过将提取物加热至高于80℃、90℃、95℃或100℃来加热处理细胞提取物。在一些实施方式中，加热处理为约1分钟至约30分钟。在一些优选的实施方式中，卵细胞提取物以乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。

如刚刚描述的，本发明的组合物利用来自以下的细胞、卵和胚提取物：脊椎动物，包括但不限于总纲颌口类(有颚脊椎动物)、硬骨脊椎动物(Euteleostomi)(骨脊椎动物)、辐鳍鱼纲(辐鳍鱼)、肉鳍亚纲(肉鳍鱼和陆生脊椎动物)、四足动物总纲(四足动物)、羊膜动物类(羊膜动物)、合弓纲(合弓类)、哺乳纲(哺乳动物)、早期兽孔目(早期兽孔类)、爬行纲(爬行动物)、缺弓亚纲(陆龟和海龟)、龟鳖目(陆龟和海龟)、双孔亚纲(鸟、鳄鱼、蜥蜴、蛇和近缘类群)、初龙次亚纲(鸟和鳄鱼)、鳄目(凯门鳄、鳄鱼和近缘类群)、鳞蜥蜴亚纲(蚓蜥属、蜥蜴、蛇和大蜥蜴)、喙头蜥目(大蜥蜴)、有鳞目(蚓蜥类、蜥蜴和蛇)、两栖纲(两栖动物)、肺鱼目亚纲(肺鱼)、腔棘鱼亚纲(Actinistia)、腔棘目(腔棘鱼)、软骨鱼纲(鳐鱼、鲨鱼和近缘类群)、盾皮鱼纲(甲青鱼类和盾皮鱼)、头甲鱼纲，更优选鱼、虾、海胆或两栖动物的卵或胚。在一些实施方式中，使用未受精但活化的鱼、虾、海胆或两栖动物的卵。本发明不限于使用任何特定类型的卵。实际上，考虑使用各种各样的卵，包括但不限于来自非洲爪蟾属、虾、海胆、鲑鱼、鳟鱼或斑马鱼的卵。在一些实施方式中，卵是从成熟雌性收集的，并在与水接触时自发激活。在进一步的实施方式中，卵在林格氏盐水(Ringer’s saline)中洗涤。在一些实施方式中，卵不来自禽物种。

本发明的提取物由本文所述的任何来源制备。在一些实施方式中，提取物是细胞提取物。本发明的细胞提取物优选是破碎细胞诸如卵的组合物。可以通过各种各样的方法破坏细胞，包括但不限于机械剪切或共混、超声处理或渗透裂解。在一些实施方式中，细胞提取物优选被进一步处理以产生基本上不含与细胞天然结合的脂质(诸如细胞膜组分)的组合物。基本上不含脂质，其意指细胞提取物包括小于约1％、优选小于约0.5％和更优选小于约0.1％的与用于制造细胞提取物的细胞天然结合的脂质。在一些实施方式中，提取物包括小于约1％和优选小于0.1％的胆固醇或卵清蛋白。因此，在一些实施方式中，细胞提取物包括碳水化合物、蛋白质、糖基化或以其他方式修饰的蛋白质、肽、氨基酸、RNA(mRNA、sRNA、miRNA、rRNA)、DNA、水等以及其组合。在一些实施方式中，细胞提取物可以包括少量的与细胞天然结合的脂质，以及核组分诸如染色体、核酸和核蛋白质。在一些实施方式中，细胞提取物优选是通过去除核、细胞膜以及与细胞天然结合的其他水不溶性物质制备的细胞质提取物或级分。在一些实施方式中，这些组分通过破碎细胞的离心或分级分离去除。在一些实施方式中，细胞提取物优选为包括水溶性细胞组分诸如蛋白质、mRNA和碳水化合物的水性提取物或级分。

可以使用各种各样的方法制备提取物。例如，在一些实施方式中，将卵“干燥”放置在玻璃15ml离心管中，并通过在15,000g沉降15min来破碎。这会产生三层：脂质顶部级分，将其收集、分装和冷冻；中部细胞或细胞质级分，也将其收集、分装和冷冻；以及颗粒级分，将其丢弃。在一些实施方式中，细胞级分或提取物主要包括细胞质的内容物。将细胞级分用作提取物。在一些实施方式中，细胞级分可以与脂质级分组合使用。可以通过在50,000、100,000或200,000g沉降进一步清除细胞质级分，以产生进一步的细胞提取物，其主要是水溶性提取物级分。无论使用何种级分，如有必要，可以使用细胞裂解缓冲液(参见上文)将提取物稀释至约300mOsm。因此，在一些优选的实施方式中，利用由卵或胚胎制备的水溶性提取物。

在其他实施方式中，将卵悬浮在0.5体积的细胞裂解缓冲液中并在冰上超声处理直到所有卵都被裂解。颗粒材料在4℃在15,000g沉降15min。上清液构成提取物。如上文，如果需要，可以将渗量调整到至300mOsm。提取物也可以如上上文清除。

在还其他实施方式中，如方法2中，将卵悬浮在细胞裂解缓冲液中。使用玻璃研钵和杵(Kontes，A型或B型)通过杜恩斯均质化(Dounce homogenization)裂解卵。如上文所述沉降和处理裂解物。

在一些优选的实施方式中，本发明提供由如上文所述的天然来源或由人工来源材料或其组合制备的组合物。在一些实施方式中，提取物的特征在于具有约330至440、优选约350mOsm的渗量。在一些实施方式中，提取物具有约5.0至约7.7的pH，优选约6.5-7.0的pH。在一些实施方式中，提取物具有约100至250mg/ml、优选约160至190mg/ml以及最优选约120mg/ml的蛋白质含量。在一些实施方式中，组合物具有约20至90％水重量/重量(w/w)，优选约37至79％水w/w的水含量。在一些实施方式中，提取物具有约0.8至约1.4g/ml、优选约1.1g/ml的密度。在一些实施方式中，组合物包括微量元素，包括但不限于钙、磷、锌、铜和铁。在一些实施方式中，组合物包括维生素，包括但不限于维生素A、C、E、核黄素、烟酸、B 6、泛酸钙和B12。在一些实施方式中，本发明提供了新鲜鱼子组合物，其包括：2.7至3.4％蛋白质；3至5％的碳水化合物；以磷脂形式的1.0至1.7％脂肪和在新鲜鱼子中的0.01至0.05％矿物质，应当为在提取物中的更少的脂肪和更高的总蛋白质)、37至79重量百分比的水。在一些实施方式中，提取物进一步包括脂质级分。在一些实施方式中，脂质级分包括约60％至约80％的不饱和脂肪酸。在进一步的实施方式中，组合物包括磷脂，包括磷脂酰胆碱(卵磷脂)或如磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)，以及较小程度上的肌醇磷脂、脑苷脂和鞘磷脂。在一些实施方式中，脂质级分为总组合物的约0.1％至约1％、2％、3％、4％或5％，而在其他实施方式中，组合物基本上不含或不含脂质。

在一些实施方式中，处理卵或提取物以防止细菌生长。考虑使用各种各样的方法。在一些实施方式中，组合了以下方法。在一些实施方式中，将未受精的或受精的卵(例如，鱼或两栖动物卵)在使用杀菌剂或抑菌剂均质化之前进行处理。优选的剂包括但不限于含碘的剂，诸如聚乙烯酮碘、布福酊(buffodine)和聚维酮碘，以及其他剂诸如诺瓦萨恩(novasan)、次氯酸钠、杆菌肽、硫酸多黏菌素B、含银化合物诸如磺胺嘧啶银和硝酸银、醋酸甲磺灭脓、制霉菌素、庆大霉素、新霉素。在其他实施方式中，均质化后处理提取物以防止细菌生长。在一些实施方式中，通过加热处理提取物，诸如细胞提取物或细胞质级分。在一些实施方式中，将提取物加热至约37、40、50、60、70、80或90摄氏度约30秒或1、2、5、10、20、30、60或120分钟。

在一些实施方式中，优选通过0.22或0.45μm过滤器过滤卵或提取物以去除细菌。在一些实施方式中，在过滤之前或之后，在加热提取物(至约37、40、50、56、60、70、80、90或95摄氏度约30秒或1、2、5、10、20、30、60或120分钟)后，通过额外的离心(15min-2小时)来处理提取物，以降速存在的任何细菌。令人惊讶的是，已经发现，在剧烈的加热处理后，提取物的生物活性仍能保留。在一些实施方式中，保留的生物活性是刺激线粒体活性的能力和/或增加皮肤成纤维细胞中透明质酸产生的能力。

在其他实施方式中，将卵在制备前在含硫剂(例如，多硫化钙或硫代硫酸钙(石硫合剂))中洗涤。在一些实施方式中，将硫添加至提取物中以去除细菌。在其他实施方式中，将过氧化苯甲酰添加至提取物中。在一些实施方式中，将卵在按重量计0.001％至约0.2％的金属亚氯酸盐和足够的酸中洗涤以将溶液的pH从约2.2调整至约4.5以去除细菌。在进一步的实施方式中，将卵和/或提取物置于真空桶中并与含盐、维生素C或柠檬酸和水的天然溶液混合以去除细菌。在一些实施方式中，将卵和/或提取物与盐水或液体缓冲液一起搅拌、涡旋、超声处理、搅动或振荡以逐出细菌并真空过滤出液体以去除细菌。可以检查液体中和经处理的卵中的细菌含量，用于质量控制。在一些实施方式中，将卵和/或提取物的电泳用于去除细菌。预期这样的方法利用双电层、电场强度、电密度梯度、缓冲溶液的pH、缓冲溶液的离子强度、细菌的生长阶段和阴离子表面活性剂对一些物种的细菌的电泳迁移率的影响。

在一些实施方式中，通过在离心之前处理匀浆或在离心之后处理提取物来去除脂质。考虑使用各种各样的方法。在一些实施方式中，通过以下去除脂质：经由吸脂纸或通过将真空抽吸系统应用到在底部中具有过滤器的容器中的过滤器过滤，其中将提取物放置在容器中并经由过滤器抽吸。在一些实施方式中，通过使用吸收材料和外部密闭容器来去除脂质。提取物通过泵进入填充有吸收材料的容器中，并且然后通过施加真空回收。在一些实施方式中，用中空纤维收缩系统和/或用于从粘性流体中去除脂质的提取溶剂来去除脂质，使用至少一个中空纤维接触器，使流体与提取溶剂接触，这引起流体中的脂质与流体分离，或引起含脂质生物中的脂质与含脂质生物分离。

在一些实施方式中，可以通过添加一种或多种稳定剂诸如脂质稳定剂，或通过包装在设计用于防止氧化的包装中来稳定匀浆和提取物。在一些实施方式中，将抗氧化剂诸如维生素E添加至提取物中以降低脂质氧化的速率。在一些实施方式中，将提取物包装在惰性气氛下的容器中。在一些实施方式中，将提取物包装在无空气的容器诸如铝涂覆的袋(每袋小于10kg用于有效去除氧气)中，或填充有氮气以去除氧气的容器中，以降低脂质氧化的速率。在其他实施方式中，将提取物包装在具有泵递送系统的真空包装容器中。

在利用鱼卵的一些实施方式中，如上文所述处理鱼卵以防止细菌生长。然后通过对鱼卵进行压力处理将鱼卵均质化。在一些实施方式中，将卵进行以下的压力：约1吨至约100吨、优选约5吨至约50吨、更优选约10吨至约30吨以及最优选约20吨。在一些实施方式中，经由液压机施加压力。合适的液压机可从Speidel获得。在一些实施方式中，将匀浆的组分分离。在一些优选的实施方式中，获得的水性细胞质级分，其包括蛋白质、DNA、RNA和如本文其他地方更详细描述的其他组分。在一些实施方式中，提取物除了水溶性组分之外还包括脂质组分。在一些实施方式中，通过离心从匀浆中分离提取物。在一些实施方式中，离心是由分离器促进的连续进料过程。例如，可以从GEA Westfalia获得合适的分离器。

在一些实施方式中，进一步分级分离上文所述的细胞提取物，并且最优选中部级分。可以使用各种各样的方法，包括但不限于FICOL梯度、梯度离心、蛋白质沉淀、冷冻干燥、柱色谱法诸如尺寸排阻色谱法和亲和色谱法、凝胶分离、高压液相色谱法、ChIP和免疫沉淀。将认识到这些级分步骤产生相应的级分，诸如冷冻干燥级分、亲和色谱法级分、沉淀级分等。

因此，在一些实施方式中，本发明提供了由上文所述的细胞提取物制备的粉末。在一些实施方式中，用于生产粉末的细胞提取物由鲑鱼卵制备。在一些实施方式中，用于生产粉末的细胞提取物由鲑鱼卵或鳟鱼卵制备。在一些实施方式中，粉末具有生物活性。在一些优选的实施方式中，粉末是冷冻干燥的。在一些实施方式中，粉末具有小于约10％的水分，以及最优选小于约5％的水分；蛋白质的浓度为约500至约800mg/g粉末，优选约600至约700mg/g粉末，最优选约640mg/g粉末；DNA的浓度为约1至约50μl/mg粉末，优选约5至约25μl/mg粉末，以及最优选约16μl/mg粉末；总RNA(例如，包括mRNA、rRNA和微RNA)的浓度为约1至约50μl/mg粉末，优选约5至约20μl/mg粉末，以及最优选约12μl/mg粉末；以及脂质浓度为约100至约200mg/g粉末，最优选约150mg/g粉末。可以将粉末优选用于制造本文所述的制剂，作为非粉末细胞提取物的替代物。

在一些实施方式中，然后将级分与适用于制备用于局部给药的组合物的组分组合或再溶解，如下文更详细的描述。

如上文提及，本发明不限于使用任何特定的伤口愈合剂。其他合适的伤口愈合剂包括但不限于：抗微生物多肽(α-防御素、LL37、β-防御素等)；抗微生物药物，例如β-内酰胺(β-lactam)药物、喹诺酮(quinolone)药物、环丙沙星(ciprofloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、四环素(tetracycline)、红霉素(erythromycin)、阿米卡星(amikacin)、三氯生(triclosan)、多西环素(doxycycline)、卷曲霉素(capreomycin)、氯己定(chlorhexidine)、金霉素(chlortetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、克林霉素(clindamycin)、乙胺丁醇(ethambutol)、己脒定异硫酸盐(hexamidine isothionate)、甲硝唑(metronidazole)的药学上可接受的盐；喷他脒(pentamidine)、庆大霉素(gentamycin)、卡那霉素(kanamycin)、林可霉素(lineomycin)、美他环素(methacycline)、乌洛托品(methenamine)、米诺环素(minocycline)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmycin)、巴龙霉素(paromomycin)、链霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin)、咪康唑(miconazole)和金刚脘胺(amanfadine)；抗菌银组合物等。

在还其他优选实施方式中，可以将本文所述的重组酶，包括重组LCE和HCE，用于治疗皮肤病症和疾病。例如，该组合物可以在化妆品中用作角质剥脱剂、保湿剂或改善异常皮肤色素沉着诸如肝斑、老人斑、日斑或褐斑。在一些优选实施方式中，重组酶可以如下文所述以合适的化妆品或药物制剂提供。可以用本文所述的重组酶和制剂治疗的疾病和病症包括皮肤干燥、角化过度、胼胝、疣、肝斑、老人斑、妊娠纹、日斑、褐斑、痤疮、湿疹或银屑病。

C.制剂和装置

在一些实施方式中，将上文所述的活性剂(即，清创酶诸如LCE或HCE和/或伤口愈合剂)配制用于通过各种各样的方法递送。在一些实施方式中，将上文所述的提取物配制为用于递送至皮肤、胃肠道、脂肪沉积物、软骨、骨、结缔组织、肌肉或内部器官。在一些实施方式中，将上文所述的活性剂配制用于局部递送。用于局部递送的一般制剂描述在Remington'sPharmaceutical Sciences,18th Edition,Mack Publishing,p.1288-1300[1990]中。根据本发明的组合物和方法，本发明的活性剂可以以另外包括药学上可接受的载体的药物组合物的形式给药。本领域技术人员将理解，向动物诸如哺乳动物给药提取物组合物的合适方法是可用的，并且尽管可以使用多于一种的方法来给药特定的组合物，但是特定方法和剂量可以提供比其他方法和剂量更直接和更有效的反应。药学上可接受的载体也是本领域技术人员公知的。载体的选择将部分地由特定的组合物和由用于给药该组合物的特定方法二者来确定。因此，本发明的药物组合物有多种多样合适的制剂。

在一些优选的实施方式中，将本发明的制剂设计用于局部给药。典型的此类制剂为喷雾、软膏、乳膏和凝胶。

因此，在一些优选的实施方式中，本文所述的重组LCE或HCE酶以药物或化妆品制剂提供。在一些优选的实施方式中，制剂包括一种或多种药学上或化妆品中可接受的赋形剂和/或稀释剂。在一些优选的实施方式中，制剂为凝胶、乳膏、软膏、洗剂、泡沫、非水性溶液、喷雾、油膏、棍状物、皂、粉末、膜、乳剂、悬浮液或分散体。

软膏通常使用以下两种方法制备：(1)油质基底，即由非挥发性油或烃组成的一种，诸如白矿脂或矿物油，或(2)吸收性基底，即由无水物质或多种无水物质组成的一种，其可以吸水，例如无水羊毛脂。通常，在基底形成后，无论是油质的还是吸收性的，活性成分(例如，鲑鱼卵提取物)以提供期望浓度的量添加。

乳膏为油/水乳剂。它们由油相(内相)和水相(连续相)组成，油相通常包括非挥发性油、烃等诸如蜡、矿脂、矿物油等，水相包括水和任何水溶性物质，诸如添加的盐。通过使用乳化剂，例如，表面活性剂诸如硫酸月桂酯钠；亲水性胶体，诸如阿拉伯胶体粘土、铝硅酸镁盐等稳定两相。一旦形成乳剂，通常以达到期望浓度的量添加活性成分(例如，鲑鱼卵提取物)。

凝胶包括选自油质基底、水或乳剂-悬浮液基底的基底，诸如上文所述。向基底中添加的胶凝剂，在基底中形成基质，增加其粘度。胶凝剂的实例是羟丙基纤维素、丙烯酸聚合物等。通常，活性成分(IGF-II)在添加胶凝剂之前以期望浓度添加至制剂中。

乳清可以是水状或较稠的液体，通常(但不总是)颜色清澈。乳清是水基的，使它们的稠度很轻。它们很容易且快速地被皮肤吸收，并提供了优异的方式来递送包括维生素C、肽、α-羟基酸、视黄醇的局部成分。乳清可以叠加在其他乳清以及乳膏或洗剂下，使它们成为非常灵活的产品，可以并入您的皮肤护理方案中。只要个人对任何成分不敏感，所有皮肤类型都可以很好地耐受乳清。乳清可以包括丙三醇(glycerol)或甘油(glycerine)。掺入本发明制剂中的提取物的量不是关键的；浓度应当仅在足以允许将制剂以将递送期望量的提取物的量施加至伤口区域的范围内。

喷雾优选包括气溶胶和泵喷雾制剂两者。

本发明可根据需要与药物科学中通常使用的以下添加剂配制，诸如表面活性剂、油脂、多元醇、低级醇、增稠剂、UV吸收剂、光散射剂、防腐剂、抗氧化剂、抗生素、螯合剂、pH调节剂、调味剂、着色剂和水。

表面活性剂的实例包括聚氧乙烯(以下简称POE支链烷基醚诸如POE辛基十二醇和POE-2-癸基十四醇，POE烷基醚诸如POE油基醇醚和POE鲸蜡醇醚，山梨聚糖酯诸如单油酸山梨醇酐酯、单异硬脂酸山梨醇酐酯和单月桂酸山梨醇酐酯，POE山梨聚糖酯诸如POE单油酸山梨醇酐酯、POE单异硬脂酸山梨醇酐酯和POE单月桂酸山梨醇酐酯，甘油脂肪酸酯诸如单油酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯和单肉豆寇酸甘油酯，POE甘油脂肪酸酯诸如POE单油酸甘油酯、POE单硬脂酸甘油酯和POE单肉豆寇酸甘油酯，POE二氢胆固醇酯，POE硬化蓖麻油，POE硬化蓖麻油脂肪酸酯诸如POE硬化蓖麻油异硬脂酸酯，POE烷基芳基醚诸如POE辛基酚醚，甘油酯诸如单异硬脂酸甘油酯和单肉豆寇酸甘油酯，POE甘油醚诸如POE单异硬甘油酯和POE单肉豆寇酸甘油酯，聚甘油脂肪酸酯诸如单硬脂酸二甘油酯、癸硬脂酸癸甘油酯(decaglyceryl decastearate)、癸异硬脂酸癸甘油酯和二异硬脂酸二甘油酯及其他非离子表面活性剂；钾盐、钠盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、氨基酸盐和其他高级脂肪酸诸如豆蔻酸、硬脂酸、棕榈酸、山萮酸、异硬脂酸和油酸的盐，上述醚羧酸碱金属盐、N-酰基氨基酸盐、N-酰基磺酸盐、高级烷基磺酸盐和其他阴离子表面活性剂；烷基胺盐、多胺、氨基醇脂肪酸、有机硅树脂、烷基季铵盐和其他阳离子表面活性剂；以及卵磷脂、甜菜碱衍生物和其他两性表面活性剂。

油脂的实例包括植物油脂，诸如蓖麻油、橄榄油、可可油、山茶油、椰子油、木蜡、荷荷巴油、葡萄籽油和鳄梨油；动物油脂，诸如貂油和蛋黄油；蜡，诸如蜂蜡、鲸蜡、羊毛脂、巴西棕榈蜡和小烛树蜡；烃，诸如液体石蜡、角鲨烯、微晶蜡、地蜡、石蜡和凡士林；天然或合成脂肪酸，诸如月桂酸、豆蔻酸、硬脂酸、油酸、异硬脂酸和山嵛酸；天然醇或高级醇，诸如鲸蜡醇、硬脂醇、己基癸醇、辛基癸醇和月桂醇；以及酯，诸如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、辛基十二醇肉豆蔻酸酯、油酸辛基十二烷基酯和油酸胆固醇酯。

多元醇的实例包括乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、二丙二醇、甘油、二甘油、三甘油、四甘油和其他聚甘油、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖醇(maltitose)、蔗糖、果糖、木糖、山梨糖醇、麦芽三糖、苏糖醇和赤藓糖醇。

增稠剂的实例包括天然存在的高分子物质，诸如藻酸钠、黄原胶、硅酸铝、木瓜籽提取物、黄芪胶、淀粉、胶原蛋白和透明质酸钠；半合成高分子物质，诸如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、可溶性淀粉和阳离子化纤维素；以及合成高分子物质，诸如羧基乙烯基聚合物和聚乙烯醇。

UV吸收剂的实例包括对氨基苯甲酸、对甲氧基肉桂酸2-乙氧基乙酯、对甲氧基肉桂酸异丙酯、丁基甲氧基苯甲酰基甲烷、甘油基-单-2-乙基己酰基-二-对甲氧基二苯甲酮、二没食子酰三油酸酯(digalloyl trioleate)、2,2'-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮、4-双羟丙基氨基苯甲酸乙酯、2-乙基己基-2-氰基-3,3'-丙烯酸二苯酯、对甲氧基肉桂酸乙基己酯、水杨酸2-乙基己酯、对氨基苯甲酸甘油酯、水杨酸高甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、对二甲基氨基苯甲酸戊酯、2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸。

防腐剂的实例包括苯甲酸盐、水杨酸盐、山梨酸盐、脱氢乙酸盐、对氧基苯甲酸酯、2,4,4'-三氯-2'-羟基二苯醚、3,4,4'-三氯卡班(3,4,4'-trichlorocarbanilide)、苯扎氯铵、扁柏酚、间苯二酚和乙醇。

抗氧化剂的实例包括生育酚、抗坏血酸、丁基羟基茴香醚、羟基甲苯二丁酯、去甲二氢愈创木酸和没食子酸丙酯。

螯合剂的实例包括依地酸钠和柠檬酸钠。

抗生素的实例包括青霉素(penicillin,)、新霉素(neomycin)、头孢菌素(cephalothin)、高锰酸钾、硫化硒、红霉素(erythromycin)、杆菌肽、四环素(tethacyclin)、氯霉素(chloramphenicol)、万古霉素(vancomycin)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、吖啶琐辛(acrisorcin)、氯异味妥因(chlorodontoin)和氟胞嘧啶(flucytosine)。

这些添加剂中的一些的作用是通过增加本发明基本组分的稳定性或经皮吸收度来增强组合物的功效。

此外，任何剂型都是可以接受的，无论在溶液、乳剂、粉末分散体或其他剂型中。应用性广泛，包括基本剂型诸如洗剂、乳剂、乳膏和凝胶。

除上述所述之外，合适的负载体、载体和佐剂包括水、凡士林、矿脂、矿物油、植物油、动物油、有机蜡和无机蜡、聚合物诸如黄原胶、明胶、纤维素、胶原蛋白、淀粉、高岭土、卡拉胶、阿拉伯胶、合成聚合物、醇、多元醇等。载体还可以包括持续释放载体诸如lypizome、微海绵、微球或微胶囊、水性基软膏、油包水乳剂或水包油乳剂、凝胶等。

除了包括在局部递送制剂中之外，上文所述活性剂可以包括在装置诸如伤口敷料和覆盖物、粘性绷带、伤口垫、皮肤贴剂和类似装置中。例如，例如，活性剂可以包括在此类装置中的一层或多层中，使得活性剂可以从装置释放并进入伤口床。因此，在一些实施方式中，活性剂可以掺入与功能化兼容的伤口敷料或生物伤口敷料中。可以通过添加本发明活性剂改进的商购伤口敷料的实例，但不限于Biobrane^TM、纱布、粘合带、绷带(诸如

)和其他商购伤口敷料包括但不限于

DUODERM^TM、TAGADERM^TM和

实施例

实施例1

重组鳟鱼LCE生产

将编码鳟鱼膜溶素(Choriolysin)(LCE1)的ORF克隆到pMAL-c4x中。这样的设计将氨基末端麦芽糖结合蛋白与8x组氨酸标签融合到TEV蛋白酶位点，其将氨基末端克隆到LCE1。在氨苄青霉素选择下，将表达构建体转化为Rosetta(DE3)pLysS。产生的菌株称为Rosetta(DE3)pLysS/MBP_LCE1。将表达Rosetta(DE3)pLysS/MBP_LCE1的单个菌落在3mlLBAMP100中，在37℃剧烈振荡下生长过夜。将过夜生长物以1/125的比率传代到25ml的LBAMP100中。当这些培养物达到0.3至0.5之间的A600密度时，取未诱导的样品，并用0.5mMIPTG诱导培养物。在37℃下振荡4小时后，采集诱导样品。将未诱导和诱导样品在10％SDS-PAGE上解析，并用commassiee亮蓝染色。将凝胶脱色并成像(图1)。

实施例2

重组LCE1的蛋白酶活性测量

分析如实施例1中所述收集的样品中活性蛋白酶的存在。由通过细菌细胞密度确定，将样品等分到20μl等量级分。向每个等分样品中添加20μg溶菌酶，并在室温下孵育至少30分钟。在使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的酪蛋白作为一般蛋白酶底物的测定中测量了表达的LCE的蛋白酶活性。FITC-酪蛋白上的荧光素标记是高度淬灭的。一旦由存在于样品中的LCE1消化，FITC-酪蛋白底物被切割成更小的肽，从而消除了荧光标记的猝灭。在Ex/Em＝485/530nm处测量FITC标记的肽片段的荧光。将质谱级(MSG)，化学稳定的胰蛋白酶用作一般蛋白酶对照。结果在图2和图3中呈现。可以看出，通过添加脲和氯化锌，提高了可溶性LCE的活性(图3)。

实施例3

鱼卵提取物的制备

将从生殖阶段(晚秋)的雌性中收获的新鲜、未受精的鲑鱼(大西洋鲑鱼(Salmosalar))卵保持在冰上，并且优选立即制造提取物。在冷冻保护剂(例如，1.5M 1,2-丙二醇和0.2M蔗糖)中冷冻干卵是可能的，而不会破坏卵膜。应逐渐冷冻(-1℃/min)至-80℃。在整个提取物制备程序中，应将卵解冻并保持在冰上。

将卵在HBSS或具有蛋白酶抑制剂(10μg/ml)的海水中洗涤两次。去除洗涤溶液，并且将卵在预冷的Donce玻璃-玻璃均质器中溶解并均质化。将裂解物转移至Beckman UltraClear聚异质同晶体离心管(5ml)，同时避免卵壳的转移，并在Beckman超离心机中使用SW55T1转子在4℃下以15.000g离心15min。由此获得三个级分；脂质顶部级分、细胞质中部级分和包含卵壳和核碎片的底部级分。细胞质中部级分为收集的提取物。预计该提取物包含大多数细胞溶质细胞器，包括线粒体、溶酶体和过氧化物酶体，应是透明且粘稠，并具有橙色色调。添加蛋白酶抑制剂(10μg/ml贮存物)并将提取物保持在-80℃。

细胞质提取物的进一步分级分离是可能的。在4℃下以100,000g离心60分钟产生2-3个级分，其中顶部/中部细胞质级分包含带有内质网、SV和微粒体的胞质溶胶。通过石蕊试纸测量提取物pH值，通过Bradford测定测量蛋白质浓度，并且通过渗透计测量渗量。

收集中囊胚斑马鱼胚，去除液体并冷冻至-20℃。为了制备提取物，将胚在冰上解冻，通过Donce玻璃-玻璃均质器在少量HBSS或海水(优选小于50％液体v/v)中溶解并均质化。通过无菌亚麻布过滤裂解物，并使用Beckman X-22R离心机，在SX4250转子中，在4℃下以5,000g离心20分钟。收集细胞质提取物(上清液)并添加蛋白酶抑制剂(10μg/ml)。提取物可以经微孔过滤(0.22um MilliQ无菌过滤器)。将提取物保持在-80℃。通过石蕊试纸测量提取物pH值，通过Bradford测定测量蛋白质浓度，并且通过渗透计测量渗量。

此一般程序适用于来自海胆、虾、鱼卵/鱼子或青蛙卵的提取物的制备。简单地说，在妊娠磁性鱼产卵程序(注射hCG激素(1ml/kg))中在产卵前6至8小时(通常在黎明时分(2–4am)产卵后不久，从它们中收集鱼子，或从妊娠蛙中收集。将鱼子/卵冷冻干燥或在-20℃下冷冻或使用新鲜的。鱼子是从不同种类的鱼中收集的。对于海胆，在口腔周围注射0.5M KCl以引起卵的脱落。从卵/鱼子中通过破碎(细胞破碎机或dounce均质化)或以不同速度离心，以将细胞质与所有内容物分开，带/不带卵壳(透明带)，带/不带细胞核/胞质溶胶，带/不带细胞器，带/不带脂质，来制备提取物。可以进行进一步分级分离以分离mRNA、蛋白质、小肽、碳水化合物和脂质中的一种或多种。鱼子中脂肪酸的主要组分是油酸、亚油酸和ω-3脂肪酸。

一旦对鲑鱼卵提取物应用上文方案，鲑鱼卵提取物具有100–380mg/ml不等的高得惊人的蛋白质浓度，6.4–6.8之间的pH，以及大约350mOsm的渗量。提取物清澈并且粘稠并且不可过滤(通过0.45μm MilliQ过滤器)。由于高蛋白质含量和低pH，在添加水或具有低缓冲能力的含水溶液下，提取物中的蛋白质容易沉淀。可以通过添加碱(1-3μl 1M NaOH/ml提取物)将提取物中和至pH 7.0，据此可以在水和含水溶液中稀释。斑马鱼提取物具有23-26mg/ml不等的蛋白质浓度，6.4–6.8之间的pH，以及80-150mOsm之间的渗量。提取物透明且不粘稠，可过滤，并且在所有稀释度下都易于用水稀释。

使用来自InVitrogen的Qube-iT荧光计进一步评估了通过这些方法制造的各种鱼卵提取物的物理特性，包括RNA、DNA和蛋白质含量。

鲑鱼卵匀浆(非离心)包含3-4mg/ml RNA。离心至9-15,000g后，RNA含量降低至2-3mg/ml。这可能是由于RNA被离心下来或降解。有趣的是，鳟鱼卵匀浆(非离心)包含2-3mg/ml RNA，但在离心至9-15,000g后，RNA sis的浓度增加到3-5mg/ml。由鳟鱼卵制成的提取物比由鲑鱼卵制成的提取物粘性更低，并且在离心期间可以更好地将RNA保持在水相悬浮液中。

鲑鱼卵匀浆(非离心)包含60-200μg/ml DNA。离心至9-15,000g后，DNA含量降低至40-51μg/ml。这可能是由于DNA被离心下来。有趣的是，鳟鱼卵匀浆(非离心)比鲑鱼卵提取物包含更多的DNA：130-530μg/ml DNA。离心至9-15,000g后，DNA含量降低至70-125μg/ml，但仍比可比较的鲑鱼卵提取物更高。由鳟鱼卵制成的提取物比由鲑鱼卵制成的提取物粘性更低，并且在离心期间可以将DNA保持在更好的水相悬浮液中。

鲑鱼卵匀浆(非离心)包含180-260mg/ml蛋白质。离心至9-15,000g后，蛋白质含量未变化或略有增加至200-260mg/ml。鳟鱼卵匀浆(非离心)包含250-300mg/ml蛋白质，并且在离心至9-15,000g后，蛋白质含量大致相同(250-270mg/ml)。卵胞质溶胶的蛋白质级分预计不会在施加g力(g-force)下被旋转下来，并且可能预计与卵胞质溶胶的原始蛋白质含量相似。

使用Nano-drop分光光度计对提取物中蛋白质含量的先前测量示出150-250mg/ml的范围。这可能是由于Nano-drop中的检测上限为约250mg/ml。此处呈现的略高的荧光计测量可能更准确。

表1.提取物中RNA、DNA和蛋白质含量的测量总结

提取物的脂质含量由ALS(德国)测量，并且发现涵盖在1,700g至15,000g离心下制备的来自鲑鱼或鳟鱼鱼子的所有提取物中，脂质含量在3.7–4.5g/100g的狭窄范围内。较低的g力离心似乎需要在室温下旋转，以在4摄氏度下为较高的g力给与相当的脂质级分。在比1,700g更低的离心力下也适用于生产提取物，脂质含量可能更高(4-7％)。提取物可能包含以下脂质(右栏)，并且在生产期间从提取物中去除的脂质级分可能包括以下脂质(左栏)

表2.脂质含量可能因批次生产之间的变化而异，并且具体的脂质可以包括：

实施例4

提取物的生产

如实施例1中所述，在1,700g至15,000g(参见上文)不等的离心速度下，提取物的脂质含量惊人地未变化，而其他参数诸如RNA、DNA和蛋白质含量，则随着离心期间g-力的增加而改变。提取物也可以通过较低的离心力，低至400g生产，据此特别是脂质的含量可能更高。

在制备匀浆前，用布福酊(buffodine)(1:100在0.9％NaCl中)洗涤卵10分钟的额外步骤是有益的。此洗涤步骤似乎显著降低了细菌含量。出于安全原因，包装在最终容器中的所有LEX批次均通过加热至56℃持续20分钟进行温和巴氏消毒(孵育)。这种巴氏消毒法将提取物完全灭菌，在室温、4摄氏度或30摄氏度孵育3天下，铺板在细菌培养皿上的提取物发现0个细菌。在室温孵育下铺板在琼脂培养皿上的1个菌落/100μl LEX是观察到的最大值。这是饮用水的安全限值(100个细菌/ml)的1/100。很少观察到的单个菌落可能来自LEX铺板期间的空气，并且与阴性对照(仅平板)的细菌生长相当。

将LEX加热至56℃持续20分钟后，LEX的稳定性和胶原蛋白分泌作用得以保留。当在细胞培养基中以0.5％浓度体外施加至人成纤维细胞持续8天(每日更换培养基)时，对胶原蛋白分泌的作用(测量胶原蛋白从细胞到细胞培养基的流出，并与未处理的对照细胞比较)，与制备后保持在-80℃的未加热提取物处理的细胞相当。与对照相比，观察到加热和未加热的LEX两者都增加了200-400％。

加热处理LEX(HEX)由如上文所述制备的鲑鱼卵提取物(LEX)产生。对于HTX，将鲑鱼卵提取物在无菌1xPBS缓冲液中稀释10倍(1:10)；制备0.5ml等分样品。将所有样品在95℃下加热五分钟，冷却，并且然后在12,100x g下离心2min。收集上清液，标记样品并在-80℃下储存，直至使用。

序列表

<110> 雷杰尼斯有限公司(REGENICS AS)

<120> 伤口清创系统

<130> PPI21172899US

<150> US 62/870,956

<151> 2019-07-05

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成

<400> 1

Met Asp His Arg Pro Pro Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Leu Ser Gln Ala Ser Gly Asn Glu Ile His Asp Glu Leu Asp His Val

20 25 30

Ser Ile Thr Ser Thr Ile Leu Val Ser Asn Asn Gly Thr Asn Glu Leu

35 40 45

Leu Leu Glu Gly Asp Ile Leu Ala Pro Arg Thr Arg Asn Ala Met Lys

50 55 60

Cys Phe Ser Ser Gln Tyr Ser Cys Leu Trp Arg Lys Ser Ile Asp Gly

65 70 75 80

Leu Val Tyr Val Pro Tyr Ile Leu Ser Ala Val Tyr Ser Ser Leu Glu

85 90 95

Val Glu Thr Ile Glu Thr Ser Met Lys Tyr Phe His Gly Lys Thr Cys

100 105 110

Ile Arg Phe Ile Pro Arg Arg Arg Gln Thr Ala Tyr Leu Asp Ile Gln

115 120 125

Ser Ser Gly Gly Cys Phe Ser Ser Met Gly Thr Val Gly Asp Arg Gln

130 135 140

Thr Leu Ser Leu Ala Gln Phe Gly Cys Val Gln His Gly Ile Ile Gln

145 150 155 160

His Glu Leu Leu His Ser Leu Gly Phe His His Glu His Asn Arg Ser

165 170 175

Asp Arg Asp Gln Tyr Ile Arg Ile Asn Trp Gln Tyr Ile Tyr Asn Tyr

180 185 190

Ala Val Glu Asn Phe Gln Lys Gln Asp Thr Asn Asn Leu Asn Thr Ala

195 200 205

Tyr Asp Tyr Ser Ser Val Met His Tyr Asp Arg Thr Ala Phe Thr Asn

210 215 220

Asn Tyr Gly Lys Glu Thr Ile Thr Pro Val Pro Asp Pro Ser Val Ala

225 230 235 240

Ile Gly Gln Arg Gln Gly Met Ser Asp Ile Asp Val Leu Arg Val Asn

245 250 255

Lys Leu Tyr Gln Cys

260

Claims (54)

1.一种清创伤口的方法，包括使所述伤口与有效量的金属蛋白酶接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有效量的金属蛋白酶有效去除所述伤口中的失活组织。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中，所述金属蛋白酶选自由以下组成的组：低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述LCE为鳟鱼LCE。

5.根据权利要求3至4中任一项所述的方法，其中，所述LCE与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中，所述LCE为重组LCE。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述重组LCE包括组氨酸-标签。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述金属蛋白酶以基质、绷带、伤口覆盖物、乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，进一步包括在清创后将伤口愈合剂施加至所述伤口的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述伤口愈合剂包括可分化细胞的提取物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述可分化细胞的提取物为鱼卵提取物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述鱼卵提取物包括在水性溶液中的约100至380mg/ml蛋白质；约0.1至10mg/ml RNA；以及约0.1至5mg/ml DNA和0.1-10％脂质w/w。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，通过将所述提取物加热至高于80℃、90℃、95℃或100℃来加热处理所述鱼卵提取物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述加热处理为约1分钟至约30分钟。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中，所述鱼卵提取物为鲑鱼卵提取物。

16.根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中，所述伤口愈合剂以基质、绷带、伤口覆盖物、乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述伤口为慢性伤口。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述慢性伤口为糖尿病溃疡。

19.一种制剂，包括有效清创伤口量的金属蛋白酶，为乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂。

20.根据权利要求19所述的制剂，其中，所述有效清创伤口量的金属蛋白酶为有效去除伤口中的失活组织。

21.根据权利要求19和20中任一项所述的制剂，其中，所述金属蛋白酶选自由以下组成的组：低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合。

22.根据权利要求21所述的制剂，其中，所述LCE为鳟鱼LCE。

23.根据权利要求21和22中任一项所述的制剂，其中，所述LCE与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的制剂，其中，所述LCE为重组LCE。

25.根据权利要求24所述的制剂，其中，所述重组LCE包括组氨酸-标签。

26.一种用于治疗伤口的试剂盒或系统，包括：

第一容器，所述第一容器包括有效量的金属蛋白酶以从伤口去除失活组织；以及

第二容器，所述第二容器包括伤口愈合剂。

27.根据权利要求26所述的试剂盒或系统，其中，所述金属蛋白酶选自由以下组成的组：低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合。

28.根据权利要求27所述的试剂盒或系统，其中，所述LCE为鳟鱼LCE。

29.根据权利要求27至28中任一项所述的试剂盒或系统，其中，所述LCE与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的试剂盒或系统，其中，所述LCE为重组LCE。

31.根据权利要求30所述的试剂盒或系统，其中，所述重组LCE包括组氨酸-标签。

32.根据权利要求26至31中任一项所述的试剂盒或系统，其中，所述金属蛋白酶以基质、绷带、伤口覆盖物、乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。

33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述伤口愈合剂包括可分化细胞的提取物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述可分化细胞的提取物为鱼卵提取物。

35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述鱼卵提取物包括在水性溶液中的约100至380mg/ml蛋白质；约0.1至10mg/ml RNA；以及约0.1至5mg/ml DNA和0.1-10％脂质w/w。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，通过将所述提取物加热至高于80℃、90℃、95℃或100℃来加热处理所述鱼卵提取物。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述加热处理为约1分钟至约30分钟。

38.根据权利要求32至37中任一项所述的方法，其中，所述伤口愈合剂以基质、绷带、伤口覆盖物、乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。

39.有效量的金属蛋白酶用于清创伤口的用途。

40.根据权利要求39所述的用途，其中，所述有效量的金属蛋白酶有效去除所述伤口中的失活组织。

41.根据权利要求39和40中任一项所述的用途，其中，所述金属蛋白酶选自由以下组成的组：低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合。

42.根据权利要求41所述的用途，其中，所述LCE为鳟鱼LCE。

43.根据权利要求41至42中任一项所述的用途，其中，所述LCE与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。

44.根据权利要求41至43中任一项所述的用途，其中，所述LCE为重组LCE。

45.根据权利要求44所述的用途，其中，所述重组LCE包括组氨酸-标签。

46.根据权利要求39至45中任一项所述的用途，其中，所述金属蛋白酶以基质、绷带、伤口覆盖物、乳膏、凝胶、乳剂、软膏、喷雾、粉末或洗剂提供。

47.一种药物或化妆品组合物，包括：

重组金属蛋白酶，所述重组金属蛋白酶选自由以下组成的组：低绒毛膜酶(LCE)、高绒毛膜酶(HCE)及其组合；以及

一种或多种药学上或化妆品中可接受的赋形剂和/或稀释剂，

其中，所述组合物为凝胶、乳膏、软膏、洗剂、泡沫、非水性溶液、喷雾、油膏、棍状物、皂、粉末、膜、乳剂、悬浮液或分散体以及

其中，所述重组金属蛋白酶在体外测定中呈现出金属蛋白酶活性。

48.根据权利要求47所述的药物或化妆品组合物，其中，所述LCE为鳟鱼LCE。

49.根据权利要求48所述的药物或化妆品组合物，其中，所述LCE与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性并且具有LCE活性。

50.根据权利要求47至49中任一项所述的药物或化妆品组合物用于治疗皮肤疾病或病症的用途。

51.根据权利要求50所述的用途，其中，所述皮肤病症或疾病为皮肤干燥、角化过度、胼胝、疣、肝斑、老人斑、妊娠纹、日斑、褐斑、痤疮、湿疹或银屑病。

52.根据权利要求1至5中任一项所述的方法、制剂、组合物或用途，其中，所述金属蛋白酶为LCE并且其中，所述LCE为在水性溶液中具有脲和/或氯化锌的制剂。

53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述脲以1至10M、更优选2至6M、甚至更优选3至5M以及最优选约4M的浓度提供。

54.根据权利要求52所述的方法，其中，所述氯化锌以2至40mM、更优选4至20mM、甚至更优选6至18mM以及最优选8至18mM的浓度提供。

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