CN114717319A - 用于胆管癌预后评估的基因标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于胆管癌预后评估的分子标志物，属于肿瘤医学技术领域。本发明通过对大量胆管癌患者肿瘤样本的基因组数据进行分析和筛选，找到了可以用于胆管癌预后评估的分子标志物，包括KRAS、TP53、SMAD4和TERT，并构建了胆管癌患者总生存期联合预测标志物，它能够有效区分胆管癌患者总生存期，为临床诊疗提供参考依据。

Description

用于胆管癌预后评估的基因标志物
技术领域
本发明涉及用于胆管癌预后评估的基因标志物，属于肿瘤医学技术领域。
背景技术
胆管癌(cholangiocarcinomas,CC)是一类起源于上皮细胞的恶性肿瘤，根据其解剖部位可分为肝内胆管癌、肝门部胆管癌和肝外胆管癌。胆管癌是继肝细胞癌后的第二常见原发性肝恶性肿瘤，约占所有原发性肝肿瘤的15％和胃肠道恶性肿瘤的3％，胆管癌在国内外的发病率呈逐年上升趋势[1-3]。根据流行病学和临床研究报道，胆管癌发病的高危因素可能包括肝内胆管结石、病毒性肝炎、先天性胆道异常、原发性硬化性胆管炎、肝吸虫病等等，对上述高危人群进行筛查有助于疾病早诊[1]。目前，ERCP下刷检脱落细胞检查是胆管癌首选的病理学诊断方法，但敏感性较低，为早期诊断带来难度[4]。此外，胆管癌的临床特征和影像学特征也常不明显，大部分病人确诊已是晚期，缺乏有效治疗方法[5]。
根据2021年CSCO胆道恶性肿瘤诊疗指南，早中期胆管癌患者以外科治疗为主，但是即使是根治性手术，胆管癌术后复发和转移率仍比较高，患者术后5年总生存率仅为10％～30％[4,6,7]。晚期或转移性胆管癌患者一线治疗仍以吉西他滨联合顺铂的化疗为主，但疗效并不突出。随着二代测序技术的进步，对于胆管癌基因组特征的研究越来越多，推动了胆管癌新靶点和新药的发现和研发。2020年4月，FDA批准了胆管癌第一款靶向药物Pemigatinib，该药可用于治疗化疗进展后携带FGFR2融合的不可切除性胆管癌患者，根据2021年美国临床肿瘤学会公布的FIGHT-202临床研究数据，FGFR2基因融合突变或重排突变的胆管癌患者，使用Pemigatinib治疗中位总生存期达17.5个月，比二线化疗延长近三倍[8-10]。除了Pemigatinib外，另外两款FGFR酪氨酸激酶抑制剂Futibatinib和Infigratinib的初步临床试验结果也显示出一定抗肿瘤疗效[11,12]。Ivosidenib是一款IDH1突变靶向抑制剂，ClarIDHy临床研究数据显示，Ivosidenib治疗胆管癌较化疗能延长生存期[13]。另外两款泛实体瘤药物——NTRK抑制剂(Larotrectinib和Entrectinib)和PD-L1单抗Pembrolizumab，其临床研究为二线及以上治疗、不限癌种，临床数据显示抗肿瘤效果良好[14-16]。尽管胆管癌临床靶向治疗和免疫治疗的临床研究越来越多，但是截止到目前为止，中国胆管癌患者的死亡率仍比较高，预后仍相对较差。
参考文献
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发明内容
本发明尝试从基因组水平出发，探究胆管癌预后的分子机制，为临床诊疗管理提供参考。本发明从2个研究(PMID:33765338；PMID:29848569)中筛选出487例胆管癌患者作为训练组，通过对临床特征数据和基因组特征数据进行筛选，找到了可用于胆管癌患者总生存期(OS)评估的相关基因标志物，利用标志物可以有效区分患者的总生存期。
本发明筛选胆管癌中突变频率>3％的基因，得到了4个可以用于胆管癌患者的总生存期(OS)预测的分子标志物，分别是：KRAS基因突变、TP53基因突变、SMAD4基因突变和TERT基因突变，其中SMAD4基因突变是新发现的胆管癌预后预测基因标志物，对其在DNA突变的层面可以具有对生存期判定的作用。
本发明还将筛选得到的具有预后差异趋势(p<0.05)的4个基因构建了具有较高分类准确性的联合判别模型，可以对患者的OS进行评估，其预测性能优于单个基因模型性能。
本发明从另外4个研究(PMID:28667006；PMID:22561520；PMID:25526346；TCGACholangiocarcinoma)中筛选出343例胆管癌患者作为验证组，通过将训练组筛选得到的4个分子标志物通过生存数据和基因组数据进行验证，由于验证组中TERT基因突变频率仅为0.6％(胆管癌中TERT突变主要以启动子突变为主，验证组均为全外显子检测不覆盖基因启动子区域)，所以TERT基因突变对食管癌预后的影响未验证。验证发现KRAS基因突变、TP53基因突变和SMAD4基因突变对总生存期仍有区分作用。
技术方案是：
本发明的每一个目的是提供了：一种用于胆管癌预后评估的分子标志物，包括以下基因：KRAS、TP53、SMAD4和TERT。
本发明的每二个目的是提供了：用于检测上述基因标志物的试剂盒在用于制备胆管癌预后总生存期的预测诊断试剂中的应用。
所述的应用中，试剂盒是用于对胆管癌手术组织样本、活检组织样本、血浆样本、胆汁样本或者腹水样本的进行检测。
所述的应用中，预测诊断试剂用于对样本中基因标志物的突变情况进行评分，所述的评分通过下式计算：
评分Score-OS＝SKRAS+STP53+SSMAD4+STERT，若基因X为突变型则SX赋值1，若为非突变型则SX赋值0。
本发明的第三个目的是提供了：一种用于胆管癌预后总生存期评估的装置，包括：
测序模块，用于对肿瘤样本进行测序，获得基因标志物的序列信息；
比对模块，用于将序列信息比对于参考基因组，判定是否发生突变；
评分模块，用于对肿瘤样本进行测序，按照下列计算公式计算评分：评分Score-OS＝SKRAS+STP53+SSMAD4+STERT，若基因X为突变型则SX赋值1，若为非突变型则SX赋值0；
判定模块，用于对样本按照评分模块中得到的Score-OS评分进行分类，预测预后总生存期。
本发明的第四个目的是提供了：
一种计算机可读取介质，其记载有可以运行以下方法的计算机程序：
步骤1，获得KRAS、TP53、SMAD4和TERT基因的突变信息；
步骤2，根据患者肿瘤样本中KRAS、TP53、SMAD4和TERT基因的突变信息，通过下列公式计算评分：
评分Score-OS＝SKRAS+STP53+SSMAD4+STERT，SX分别是指KRAS、TP53、SMAD4和TERT基因的突变情况，若基因X为突变型则SX赋值1，若为非突变型则SX赋值0；
步骤3，根据患者肿瘤样本Score-OS评分对患者的胆管癌预后情况进行分类，若评分≥1则被判定为具有较差预后。
本发明的第五个方面，提供了：
对SMAD4基因进行检测的试剂在用于制备胆管癌预后总生存期的预测诊断试剂中的应用。
附图说明
图1是训练组和验证组胆管癌患者的基因图谱
图2中的A、B、C和D区域分别是训练组中KRAS、TP53、TERT和SMAD4基因总生存期Kaplan-Meier生存曲线图
图3是SMAD4基因在KRAS、TP53和TERT突变型和非突变型患者中对OS影响的森林图图4中的A、B和C区别分别是验证组中KRAS、TP53和SMAD4基因总生存期Kaplan-Meier生存曲线图
图5A和图5B分别是训练组和验证组中模型高低危风险组总生存期Kaplan-Meier生存曲线
图6是不同队列中KRAS、TP53、TERT和SMAD4基因突变频率柱状图
具体实施方式
本发明的研究中，训练组患者是来自2个研究(PMID:33765338；PMID:29848569)的487例胆管癌患者，通过对患者的临床特征数据和基因特征数据结合总生存期(OS)进行分析和筛选。要求纳入分析的基因在胆管癌中突变频率>3％，使用单因素Log-rank进行统计分析，4个基因突变被证明是胆管癌患者总生存期的潜在预测生物标志物，为了验证结果的准确性，从另外4个研究(PMID:28667006；PMID:22561520；PMID:25526346；TCGACholangiocarcinoma)中筛选出343例胆管癌患者作为独立验证组，对上述基因进行了验证。
本发明中所提及的突变是指单个碱基改变所引起的单核苷酸变异，或者20个以内的碱基插入、缺失和重复，导致编码氨基酸发生变化。
本发明中所提及的启动子突变是指突变位点位于基因启动子区域或其他调控序列上，可能导致启动子启动转录功能改变的突变。
研究中患者和样本情况
训练组为487名胆管癌患者的肿瘤组织样本，该研究的患者年龄范围为18岁至88岁，中位年龄为64岁，63.2％的患者年龄超过60岁，以老年人为主。48.5％的患者为男性，其余51.5％是女性，男女比例较为均衡。
验证组由343名胆管癌患者组成，248例年龄未知，分析95例已知年龄患者，发现中位年龄为55岁，范围是从35岁到85岁，只有35.7％的患者年龄超过60岁，年龄比训练组偏年轻。男性患者占60.1％，女性患者占39.9％，男性占比高于女性。
具体如表1所示：
表1训练组和验证组患者临床基本特征
Figure BDA0003602440060000061
*表示验证组中有248例患者年龄未知，仅分析了95例已知年龄患者
患者总生存期(OS)计算是从胆管癌病理确诊日期到死亡或最后一次随访日期。
筛选训练组中临床层面与胆管癌预后相关因素
我们在训练组中使用单因素Log-rank分析了这些可能的临床及基因组特征与患者总生存期(OS)的关联。如表2所示，男性胆管癌患者预后有更差的趋势(p<0.100)。以60岁作为阈值，年龄对预后的影响不显著(p>0.100)，可能不是OS的预测标记物。
表2 Log-rank筛选训练组中胆管癌预后相关临床因素
临床特征 HR(95％CI) p值
性别:男性vs.女性 1.22(0.99～1.51) 0.065
年龄:≥60岁vs.<60岁 0.91(0.73～1.13) 0.377
筛选训练组中基因层面与胆管癌预后相关因素
患者总生存期(OS)计算是从胆管癌病理确诊时间到死亡或最后一次随访日期。采用Kaplan-Meier方法估计不同组别患者的OS，并使用log-rank检验分析组间差异。
首选，筛选训练组中体细胞突变频率大于3％的17个基因作为候选对象，并与验证组患者基因突变进行对比，绘制胆管癌的突变图谱分布图，见图1。训练组中高频率的突变基因包括TP53(20.3％)、IDH1(20.1％)、ARID1A(18.7％)、BAP1(16.2％)、KRAS(11.1％)等。训练组中高频率的突变基因包括TP53(42.0％)、ARID1A(19.0％)、KRAS(16.0％)、SMAD4(12.5％)、BAP1(9.6％)等。不管是训练组还是验证组，TP53基因突变频率均为最高。训练组中TERT基因突变频率为4.5％，而验证组中仅为0.6％。训练组中合计检测到22例TERT基因突变，其中20例(90.9％)为启动子突变，由于验证组样本均为全外显子检测，无法覆盖TERT基因启动子，所以验证组中TERT基因突变检出率低。
在训练组中，通过Log-rank筛选出可能与胆管癌预后相关的基因标志物(p<0.050)，Log-rank筛选结果见表3。
表3 Log-rank筛选胆管癌预后相关基因标志物(n＝17)
基因 患者例数(％) HR(95％CI) p值
ARID1A 91(18.7％) 0.98(0.75～1.29) 0.888
ARID2 15(3.1％) 1.28(0.71～2.3) 0.419
ATM 25(5.1％) 1.33(0.86～2.08) 0.199
BAP1 79(16.2％) 0.95(0.71～1.26) 0.708
BRAF 30(6.2％) 1.2(0.78～1.85) 0.406
FGFR2 18(3.7％) 1.36(0.8～2.33) 0.255
IDH1 98(20.1％) 0.83(0.63～1.08) 0.167
IDH2 19(3.9％) 0.88(0.5～1.52) 0.637
KRAS 54(11.1％) 1.91(1.41～2.58) 2.186e<sup>-5</sup>
NRAS 15(3.1％) 1.22(0.69～2.18) 0.492
PBRM1 48(9.9％) 0.77(0.53～1.12) 0.173
PIK3CA 18(3.7％) 1.39(0.83～2.35) 0.211
RASA1 22(4.5％) 0.93(0.56～1.55) 0.794
SMAD4 20(4.1％) 1.76(1.11～2.81) 0.015
SMARCA4 16(3.3％) 1.09(0.56～2.11) 0.804
TERT 22(4.5％) 2.02(1.25～3.26) 0.003
TP53 99(20.3％) 1.61(1.25～2.08) 1.896e<sup>-4</sup>
由上表可以看出，17个基因改变的频率从3.1％到20.3％不等。本发明发现KRAS、TP53、SMAD4和TERT基因突变的患者较非突变型预后显著更差(p<0.050)，生存曲线图见图2。本专利中首次发现了SMAD4基因突变与胆管癌的预后显著相关(突变型vs非突变型mOS为18.2月vs 32.8月，5年生存率为5.0％vs 30.9％，p<0.050)。
验证SMAD4基因突变是独立预测因素
为了验证SMAD4基因突变在KRAS、TP53、TERT基因突变型和非突变型中对OS的独立区分作用，分别分析了SMAD4基因突变型与非突变型在6个不同分组(KRAS非突变型、KRAS突变型、TP53非突变型、TP53突变型、TERT非突变型、TERT突变型)中对OS的风险比(Hazardratio)，并通过森林图进行展示，见图3。从图3中可以发现，6种分组中SMAD4突变型和非突变型对OS均有区分作用，不论哪个分组，SMAD4突变型的患者较非突变型的患者预后都更差(HR>1.00)，进一步验证了SMAD4基因突变可能是胆管癌的独立预后预测基因标志物。
验证组验证了部分基因与胆管癌预后有关
此外，我们还通过独立验证组数据进一步验证上述基因(KRAS、TP53、SMAD4和TERT基因)对预后总生存期OS的区分作用。由于TERT基因在胆管癌中主要以启动子突变为主，而验证组样本主要是全外显子测序panel不覆盖启动子区域，TERT基因非启动子突变在验证组中突变频率仅有0.6％，所以TERT突变未作验证。通过Log-rank分析发现，其他三个基因包括KRAS、TP53和SMAD4基因在验证组中仍被证明是胆管癌预后相关基因标志物(p<0.05)，具体分析结果见表4和图4，进一步验证了KRAS、TP53和SMAD4基因可能是胆管癌的独立预后预测基因标志物。
表4 KRAS、TP53和SMAD4基因在验证组中对总生存期OS的预测作用
基因 患者例数(％) HR(95％CI) p值
KRAS 55(16.0％) 1.66(1.20～2.31) 0.002
SMAD4 43(12.5％) 1.53(1.05～2.25) 0.027
TP53 144(42.0％) 1.65(1.26～2.15) 2.267e<sup>-4</sup>
构建联合模型对患者预后进行分层
将上述4个基因突变通过公式进行联合：评分Score-OS＝SKRAS+STP53+SSMAD4+STERT，T分别是指KRAS、TP53、SMAD4和TERT基因的突变情况，4个基因变量均为二分类变量，若基因X为突变型则SX赋值1，若为非突变型则SX赋值0。
为了对患者死亡风险进行高/低危分层，本发明通过GraphPad Prism v8.0.1软件确定阈值，发现当Score-OS≥1时，χ2最大，且高危组患者比低危组总生存期显著短(p<0.0001),其他不同阈值下的人群占比、χ2和p值见表5。当Score-OS≥1，则认为是高危型，表现为预后不良，并根据该阈值将训练组患者分为两组，Kaplan-Meier生存曲线显示，风险评分Score-OS≥1组的患者OS较评分＜1分组更差(中位OS 21.42月vs 40.02月，p<0.0001)(图5A)。验证组采用相同的阈值进一步验证上述模型，此模型仍然能够区分某些OS较差的患者(中位OS 14.67月vs 31.57月，p<0.0001)(图5B)。
表5不同阈值下的人群占比、χ2和p值
阈值 患者例数(n) 人群占比 χ<sup>2</sup> p值
≥1 150 30.8％ 30.11 <0.0001
≥2 42 8.6％ 16.40 <0.0001
≥3 3 0.6％ 24.83 <0.0001
通过Cox方法分别分析KRAS基因、TP53基因、SMAD4基因、TERT基因以及Score-OS在突变型和非突变组中C-index情况，依次是0.54、0.55、0.51、0.52和0.58，其中联合模型Score-OS的一致性最好。可以看出，通过上述方法构建出的联合多变量判定模型能够更有效地对患者OS情况进行评估，优于单变量模型。
Figure BDA0003602440060000091
panel可用于胆管癌预后基因检测及突变分析
上述胆管癌预后相关的基因可以采用南京世和基因生物技术股份有限公司的
Figure BDA0003602440060000092
panel进行基因检测，该测序panel全面覆盖上述4个基因的全外显子、重要内含子区域以及部分基因(如TERT)启动子区域基因，具体基因列表见表6。通过该测序panel检测了100例胆管癌患者组织样本，KRAS、TP53、SMAD4以及TERT这4个基因的突变频率见图6，均不低于训练组和验证组患者基因突变频率，说明
Figure BDA0003602440060000093
panel对上述胆管癌预后相关基因的覆盖更为全面，可以用于胆管癌预后基因检测。
表6：425panel基因列表
Figure BDA0003602440060000094
Figure BDA0003602440060000101

Claims (7)

1.一种用于胆管癌预后评估的分子标志物，包括以下基因：KRAS、TP53、SMAD4和TERT。
2.用于检测权利要求1所述的基因标志物的试剂在用于制备胆管癌预后总生存期的预测诊断试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，试剂盒是用于对胆管癌手术组织样本、活检组织样本、血浆样本、胆汁样本或者腹水样本的进行检测。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，预测诊断试剂用于对样本中基因标志物的突变情况进行评分，所述的评分通过下式计算：
评分Score-OS＝SKRAS+STP53+SSMAD4+STERT，若基因X为突变型则SX赋值1，若为非突变型则SX赋值0。
5.一种用于胆管癌预后总生存期评估的装置，其特征在于，包括：
测序模块，用于对肿瘤样本进行测序，获得基因标志物的序列信息；
比对模块，用于将序列信息比对于参考基因组，判定是否发生突变；
评分模块，用于对肿瘤样本进行测序，按照下列计算公式计算评分：评分Score-OS＝SKRAS+STP53+SSMAD4+STERT，若基因X为突变型则SX赋值1，若为非突变型则SX赋值0；
判定模块，用于对样本按照评分模块中得到的Score-OS评分进行分类，预测预后总生存期。
6.一种计算机可读取介质，其特征在于，其记载有可以运行以下方法的计算机程序：
步骤1，获得KRAS、TP53、SMAD4和TERT基因的突变信息；
步骤2，根据患者肿瘤样本中KRAS、TP53、SMAD4和TERT基因的突变信息，通过下列公式计算评分：
评分Score-OS＝SKRAS+STP53+SSMAD4+STERT，SX分别是指KRAS、TP53、SMAD4和TERT基因的突变情况，若基因X为突变型则SX赋值1，若为非突变型则SX赋值0；
步骤3，根据患者肿瘤样本Score-OS评分对患者的胆管癌预后情况进行分类，若评分≥1则被判定为具有较差预后。
7.对SMAD4基因进行检测的试剂在用于制备胆管癌预后总生存期的预测诊断试剂中的应用。
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