CN114716579B - 一种果胶接枝共聚物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种果胶接枝共聚物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及果胶改性技术领域，提供了一种果胶接枝共聚物及其制备方法和应用。本发明将氧化还原体系与接枝改性相结合，利用香豆酸对果胶进行接枝改性，增加其溶解度，同时本发明还对果胶进行超声‑微波降解处理，加剧果胶的主链或支链断裂，使得果胶接枝共聚物分子量下降，溶解度增加；本发明通过接枝共聚在果胶分子中引入酚酸基团，还能增加果胶的抗氧化活性。本发明制备的果胶接枝共聚物溶解性好，抗氧化活性高，在食品、保健品和药物中具有广阔的应用前景。

Description

一种果胶接枝共聚物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及果胶改性技术领域，尤其涉及一种果胶接枝共聚物及其制备方法和应用。
背景技术
果胶是植物中天然的高分子多糖化合物，果胶广泛存在于植物果实、根、茎、叶的细胞壁和细胞内层中。纯果胶一般为白色或米黄色的固体粉末，略有特异性的气味。果胶的主要成分是D-半乳糖醛酸，可在食品中作为胶凝剂、增稠剂和稳定剂，应用广泛。除此之外，果胶还具有生物活性，包抗腹泻、抗癌、降胆固醇、治疗糖尿病等功效，并在各种反应机制及新陈代谢途径中都起到显著效果；另外，果胶还具有良好的杀菌、抗菌、止血等功效，以及免疫学特性、抗氧化特性等，已成为一些药物、保健品和化妆品中不可缺少的辅料。
但是，天然果胶溶解度低，食用后很难被人体消化道消化吸收，故摄入的绝大部分经人体消化系统后排出体外，只有少量被肠道微生物发酵形成短式脂肪酸，这限制了果胶一些可能存在的生理功能及其生理特性的作用效果。
为了改变果胶难溶解的问题，学者们对果胶的一些结构进行人为的修饰，以得到某些具有特殊功能的果胶产品，这类果胶称为修饰果胶或改性果胶。改性果胶是将天然果胶进行改性处理，改性处理后水溶性增加，容易被肠道吸收进入血液循环，能够表现出良好的生物活性作用，被认为是一种新兴的生物活性多糖。据研究表明，果胶的生物活性与其溶解度相关联，溶解度增大的同时，果胶的生物活性也会随之增加。因此，选择适宜的改性方法可以改善其水溶性、获得更好的生物活性。目前，常见的果胶改性方法有pH改性法，酶法等，但这些方法存在操作复杂、成本昂贵等缺点，有一定的局限性。
酚酸在日常生活中摄入量较多，植物中通常存在十多种酚酸。香豆酸在食物中比较丰富，几乎存在于水果的所有部位，成熟水果的外部表皮含量最高，并随成熟进程而减少。据报道，酚酸有抗氧化性、抗突变、抗增殖和抗菌等生物活性，它在新鲜加工食品的色、味和氧化稳定性中也起着重要作用。酚酸有很强的抗氧化活性，能增强细胞对氧化应激的抵抗能力，减少氧化损伤。它们通过结合金属离子、清除自由基和分解过氧化物等多种方式，抑制脂质过氧化、蛋白、DNA和其他小分子化合物损伤等。目前，还未见关于果胶与香豆酸接枝共聚物的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种果胶接枝共聚物及其制备方法和应用。本发明利用香豆酸与果胶进行接枝，降低果胶的分子量，增加其溶解度，提高果胶的生物活性和抗氧化活性，并且本发明的方法操作简单，成本低。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种果胶接枝共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将果胶、香豆酸、抗坏血酸和溶剂混合，得到混合溶液；
将所述混合溶液进行超声-微波降解处理，得到降解处理液；
将所述降解处理液和过氧化氢溶液混合进行接枝共聚反应，得到果胶接枝共聚物。
优选的，所述果胶为柑橘果胶。
优选的，所述果胶和香豆酸的质量比为(0.1～2):1。
优选的，所述溶剂为醋酸溶液；所述混合溶液中抗坏血酸的浓度为0.05～0.5mol/L。
优选的，所述超声-微波降解处理的微波功率为350～550W，超声功率为30～100W，处理时间为1～10min。
优选的，所述降解处理液和过氧化氢溶液混合所得混合液中，过氧化氢的浓度为0.05～0.175mol/L。
优选的，所述接枝共聚反应的温度为室温，时间为40～100min，pH值为4～8，所述接枝共聚反应在保护气氛下进行。
优选的，所述接枝共聚反应完成后，还包括将接枝共聚反应所得产物料液依次进行第一渗析、第一干燥、纯化、第二渗析和第二干燥，得到果胶接枝共聚物。
本发明还提供了上述方案所述制备方法制备的果胶接枝共聚物，所述果胶接枝共聚物的接枝度为40～70％。
本发明还提供了上述方案所述的果胶接枝共聚物在食品、保健品和药物中的应用。
本发明提供了一种果胶接枝共聚物的制备方法，包括以下步骤：将果胶、香豆酸、抗坏血酸和溶剂混合，得到混合溶液；将所述混合溶液进行超声-微波降解处理，得到降解处理液；将所述降解处理液和过氧化氢溶液混合进行接枝共聚反应，得到果胶接枝共聚物。本发明将氧化还原体系(抗坏血酸和过氧化氢组成)与接枝改性相结合，利用香豆酸和果胶进行接枝共聚，在接枝共聚过程中，自由基在反应过程中产生的·OH夺取了果胶内的氢原子，使氢键作用力减弱，疏水性减小，溶解度增加；同时本发明还对果胶进行超声-微波降解处理，加剧果胶的主链或支链断裂，使得果胶接枝共聚物分子量下降，溶解度增加；另外，本发明通过接枝共聚在果胶分子中引入酚酸基团，还能够增强果胶的供氢或供电子能力，从而增加果胶的抗氧化活性。
此外，本发明采用的酚酸接枝法是一种新的多糖改性方法，工艺简单，安全环保，为新型酚酸-多糖衍生物产品的开发和应用提供一定的理论依据。
本发明还提供了上述制备方法制备得到的果胶接枝共聚物。本发明提供的果胶接枝共聚物溶解性好，抗氧化活性高，在食品、保健品和药物中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为对比例1中的柑橘果胶、对比例2中的改性柑橘果胶和最佳条件下制备的香豆酸-柑橘果胶接枝物的傅里叶红外光谱图；
图2为对比例1中未改性的柑橘果胶的扫描电镜图；
图3为对比例2制备的改性柑橘果胶的扫描电镜图；
图4为最佳条件下制备的香豆酸-柑橘果胶接枝物的扫描电镜图；
图5为体外PC12细胞实验的LDH含量测定结果；
图6为体外PC12细胞实验的MDA含量测定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种果胶接枝共聚物的制备方法，包括以下步骤：
将果胶、香豆酸、抗坏血酸和溶剂混合，得到混合溶液；
将所述混合溶液进行超声-微波降解处理，得到降解处理液；
将所述降解处理液和过氧化氢溶液混合进行接枝共聚反应，得到果胶接枝共聚物。
本发明将果胶、香豆酸、抗坏血酸和溶剂混合，得到混合溶液。在本发明中，所述果胶优选为柑橘果胶，所述柑橘果胶的分子量优选为100～200KDa；本发明对所述柑橘果胶的来源没有特殊要求，采用市售的柑橘果胶或自行提取均可。在本发明中，所述溶剂优选为醋酸溶液；所述醋酸溶液的质量分数优选为0.1～5％，更优选为1％；所述混合溶液中抗坏血酸的浓度优选为0.05～0.5mol/L，更优选为0.125～0.175mol/L，进一步优选为0.15mol/L；所述果胶和香豆酸的质量比优选为(0.1～2):1，更优选为(0.1～1):1；所述混合溶液中抗坏血酸和过氧化氢的摩尔浓度比优选为(0.5～5):1，更优选为(1～3):1。本发明优选先将果胶溶解于醋酸溶液中，然后再加入抗坏血酸和香豆酸，得到混合溶液；在本发明的具体实施例中，还优选将所得混合溶液的pH值调节至4～8，优选调节至5～7，进一步优选调节至6，以满足后续接枝共聚反应的pH值要求，调节所得混合溶液pH值用试剂优选为氢氧化钠和盐酸。
得到混合溶液后，本发明将所述混合溶液进行超声-微波降解处理，得到降解处理液。在本发明中，所述超声-微波降解处理的微波功率优选为350～550W，更优选为400～500W，进一步优选为480W，超声功率优选为30～100W，更优选为50～90W，更优选为60～70W，处理时间优选为1～10min，更优选为2～6min，进一步优选为3～5min；所述超声-微波降解处理优选在超声-微波连用仪中进行。本发明通过超声-微波降解处理加剧果胶的主链或支链断裂，从而使果胶接枝共聚物分子量下降，溶解度增加。
得到降解处理液后，本发明将所述降解处理液和过氧化氢溶液混合进行接枝共聚反应，得到果胶接枝共聚物。在本发明中，所述降解处理液和过氧化氢溶液混合所得混合液中，过氧化氢的浓度优选为0.05～0.175mol/L，更优选为0.075～0.125mol/L，进一步优选为0.075mol/L。所述抗坏血酸和过氧化氢组成氧化还原体系，在接枝共聚反应过程中，氧化还原体系能够降解柑橘果胶，使柑橘果胶脱氢形成柑橘果胶自由基。
在本发明中，所述接枝共聚反应的温度优选为室温，无需进行额外的加热或降温，所述接枝共聚反应的时间优选为40～100min，更优选为50～70min，进一步优选为60min，所述接枝共聚反应的pH值优选为4～8，更优选为5～7，进一步优选为6，所述接枝共聚反应优选在保护气氛下进行，所述保护气氛优选为氮气。在本发明的具体实施例中，优选先将氮气通入装有降解反应液的反应容器中，通入氮气60min后，再加入过氧化氢启动反应。在本发明的具体实施例中，所述过氧化氢优选以双氧水的形式使用，本发明对所述双氧水的浓度没有特殊要求，能够保证接枝共聚反应体系中过氧化氢的浓度满足上述要求即可。
在接枝共聚反应过程中，香豆酸和果胶发生共聚，生成果胶接枝共聚物，在果胶分子中引入酚酸基团，研究结果表明，酚酸基团具体是接枝在果胶的C-6位置，具体的反应式表示如下：
Figure BDA0003562214680000051
接枝共聚反应完成后，本发明优选还包括将接枝共聚反应所得产物料液依次进行第一渗析、第一干燥、纯化、第二渗析和第二干燥，得到果胶接枝共聚物。在本发明中，所述第一渗析和第二渗析均优选为透析膜渗析，所述透析膜的截留分子量优选为800Da～14KDa，更优选为5KDa～14KDa，所述第一渗析和第二渗析的时间独立地的优选为48～72h，更优选为72h；所述纯化优选为索式提取，所述索式提取用提取剂优选为乙醇，所述索式提取的时间优选为6～24h，更优选为8～12h，进一步优选为8h；所述第一干燥和第二干燥均优选为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度优选为-50～80℃，时间优选为6～48h，更优选为8～24h，进一步优选为12h。
本发明还提供了上述方案所述制备方法制备的果胶接枝共聚物，所述果胶接枝共聚物优选为香豆酸-柑橘果胶接枝共聚物；所述果胶接枝共聚物的分子量优选为80～150KDa；在本发明中，所述果胶接枝共聚物的分子量与溶解度呈反比，分子量越小，溶解度越大；本发明提供的果胶接枝共聚物溶解性好，抗氧化活性高。
本发明还提供了上述方案在食品、保健品和药物中的应用，具体是利用上述果胶接枝共聚物为原料制备食品、保健品或药物，本发明对所述应用的具体方式没有用特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方式即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中使用的果胶均为柑橘果胶，柑橘果胶的提取方法如下：
将柑橘皮放入水中，料液比为1g:20mL，提取温度为95℃，加入六偏磷酸钠，所得混合料液中六偏磷酸钠的质量分数为0.3％，用0.3mol/L的稀HCl调整溶液的pH值为2，然后恒温搅拌提取1h，趁热过滤，共提取两次，合并两次提取得到提取液，55℃下真空旋转蒸发浓缩，浓缩比为1:5。用氨水调节浓缩液的pH至3，加入浓缩液体积的2倍的95％乙醇沉淀1h，离心后用70％与90％的酸性乙醇各洗一次，4800rpm离心10min，在55℃下真空干燥24h，得到柑橘果胶。
实施例1
准确称取0.1g柑橘果胶完全溶解于50mL 1％的醋酸溶液中，然后加入抗坏血酸和1g的香豆酸，控制混合溶液中抗坏血酸的浓度为0.075mol/L，采用氢氧化钠和盐酸将混合溶液的pH值调节至6.0，在超声功率为50W，微波功率为480W的条件下进行超声-微波降解处理1min，得到降解处理液。将氮气缓慢通入装有降解处理液的反应瓶中，60min后加入过氧化氢溶液启动反应，控制反应体系中过氧化氢的浓度为0.075mol/L，在氮气条件下持续反应2h。反应后的混合物倒入分子量为14000Da的透析袋中，用去离子水透析72h后冷冻干燥，冻干后的产物用乙醇索氏提取12h，再用去离子水透析并冻干，得到柑橘果胶接枝共聚物。
实施例2
准确称取0.1g柑橘果胶完全溶解于50mL 1％的醋酸溶液中，然后加入抗坏血酸和1g的香豆酸，控制混合溶液中抗坏血酸的浓度为0.15mol/L，采用氢氧化钠和盐酸将混合溶液的pH值调节至6.0，在超声功率为50W，微波功率为482W的条件下进行超声-微波降解处理3min，得到降解处理液。将氮气缓慢通入装有降解处理液的反应瓶中，60min后加入过氧化氢溶液启动反应，控制反应体系中过氧化氢的浓度为0.075mol/L，在氮气条件下持续反应2h。反应后的混合物倒入分子量为14000Da的透析袋中，用去离子水透析72h后冷冻干燥，冻干后的产物用乙醇索氏提取12h，再用去离子水透析并冻干，得到柑橘果胶接枝共聚物。
实施例3
准确称取0.5g柑橘果胶完全溶解于50mL 1％的醋酸溶液中，然后加入抗坏血酸和1g的香豆酸，控制混合溶液中抗坏血酸的浓度为0.15mol/L，采用氢氧化钠和盐酸将混合溶液的pH值调节至6.0，在超声功率为70W，微波功率为480W的条件下进行超声-微波降解处理3min，得到降解处理液。将氮气缓慢通入装有降解处理液的反应瓶中，60min后加入过氧化氢溶液启动反应，控制反应体系中过氧化氢的浓度为0.075mol/L，在氮气条件下持续反应2h。反应后的混合物倒入分子量为14000Da的透析袋中，用去离子水透析72h后冷冻干燥，冻干后的产物用乙醇索氏提取12h，再用去离子水透析并冻干，得到柑橘果胶接枝共聚物。
实施例4
准确称取1g柑橘果胶完全溶解于50mL 1％的醋酸溶液中，然后加入抗坏血酸和1g的香豆酸，控制混合溶液中抗坏血酸的浓度为0.225mol/L，采用氢氧化钠和盐酸将混合溶液的pH值调节至6.0，在超声功率为70W，微波功率为480W的条件下进行超声-微波降解处理3min，得到降解处理液。将氮气缓慢通入装有降解处理液的反应瓶中，60min后加入过氧化氢溶液启动反应，控制反应体系中过氧化氢的浓度为0.075mol/L，在氮气条件下持续反应2h。反应后的混合物倒入分子量为14000Da的透析袋中，用去离子水透析72h后冷冻干燥，冻干后的产物用乙醇索氏提取12h，再用去离子水透析并冻干，得到柑橘果胶接枝共聚物。
实施例5
准确称取1g柑橘果胶完全溶解于50mL 1％的醋酸溶液中，然后加入抗坏血酸和1g的香豆酸，控制混合溶液中抗坏血酸的浓度为0.225mol/L，采用氢氧化钠和盐酸将混合溶液的pH值调节至6.0，在超声功率为90W，微波功率为480W的条件下进行超声-微波降解处理5min，得到降解处理液。将氮气缓慢通入装有降解处理液的反应瓶中，60min后加入过氧化氢溶液启动反应，控制反应体系中过氧化氢的浓度为0.075mol/L，在氮气条件下持续反应2h。反应后的混合物倒入分子量为14000Da的透析袋中，用去离子水透析72h后冷冻干燥，冻干后的产物用乙醇索氏提取12h，再用去离子水透析并冻干，得到柑橘果胶接枝共聚物。
性能测试
1、对实施例1～5制备的柑橘果胶接枝共聚物的溶解度和分子量进行测试，结果如表1所示(溶解度为室温下在水中的溶解度)。
表1实施例1～5制备的柑橘果胶接枝共聚物的溶解度和分子量
实施例 1 2 3 4 5
溶解度(％) 71.88±0.82 80.89±0.77 82.26±0.75 70.69±0.62 64.73±0.80
分子量(KDa) 60.97±0.15 58.42±0.14 56.72±0.12 62.41±0.11 65.37±0.14
从表1中数据可以看出，实施例1～5制备的柑橘果胶接枝共聚物的分子量呈现下降趋势，而柑橘果胶接枝共聚物的溶解度有所升高，溶解度最高可达到80％以上，在接枝改性过程中自由基夺取了果胶内的氢原子，使氢键作用力减弱，疏水性减小，溶解度增加。且由表1可以看出溶解度与分子量成反比，即分子量越小，溶解度越大。
2、对实施例1～5制备的柑橘果胶接枝共聚物的抗氧化活性进行测试，抗氧化活性分别以DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羟自由基清除能力和还原能力进行表征，具体的测试方法如下(下述方法中，样品溶液的溶剂均为蒸馏水)：
DPPH自由基清除能力测试：取0.5mg/mL样品溶液1mL加入试管中，然后加入甲醇配制的0.2mmol/L的DPPH溶液2mL，混匀后遮光处理20min，在517nm下测定吸光度值A1。以蒸馏水为对照，吸光度值为A2，用甲醇溶液调零。按下式计算DPPH清除率:
DPPH清除率(％)＝(1-A1/A2)×100％
ABTS自由基清除能力测试：制备25mLABTS储备溶液(7mmol/L)，其中过硫酸钾溶液2.45mmol/L，常温下避光反应16h得到ABTS溶液。用PBS缓冲液(10mol/L，pH7.4)稀释ABTS溶液，使其在734nm处吸光度为0.70±0.02，得到ABTS工作液。取1mL 0.5mg/mL样品溶液与3mLABTS工作液混合，避光反应10min。在734nm下测定样品吸光度A1，以纯水作试剂空白，测定吸光度为A0。按下式计算ABTS阳离子自由基清除率：
ABTS阳离子自由基清除率(％)＝(1-A1/A0)×100％
羟基自由基清除能力：取0.5mg/mL样品溶液1mL，分别加入10mmol/L硫酸亚铁溶液1mL、10mmol/L水杨酸-乙醇溶液1mL、8.8mmol/L过氧化氢溶液1mL、37℃反应30min，然后在510nm处测蒸馏水代替样品的吸光度值，记为Ai；其他条件相同，仅不加乙醇–水杨酸的溶液，测得吸光度值Aj；其他条件相同，仅不加样品溶液，测得吸光度值A0。羟基自由基清除率按照下式计算：
羟基自由基清除率(％)＝{1-(Ai-Aj)/A0}×100％
亚铁还原能力测试：取1mL 0.5mg/mL的样品溶液，依次加入2.5mL磷酸缓冲液(0.2mol/L，pH 6.6)，1.0mL铁氰化钾溶液(1.0％，w/v)，混匀，50℃水浴20min，然后向混合液中加入2.5mL三氯乙酸溶液(10％，w/v)，充分混匀，在转速2000rpm条件下离心10min。取2.5mL上清液，向其中加入0.5mL FeCl2溶液(1.0％，w/v)和2.5mL去离子水，10min后测定其在700nm处的吸光度值。反应液吸光值与还原力呈正比。
DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羟自由基清除能力和还原能力的测试结果见表2：
表2抗氧化活性测试结果
Figure BDA0003562214680000091
Figure BDA0003562214680000101
由表2可知，实施例1～5制备的柑橘果胶接枝共聚物的抗氧化活性显著提高，DPPH自由基清除能力从最高达到50.04％，ABTS自由基清除能力最高达到49.63％，羟自由基清除能力最高达到29.42％，亚铁离子还原能力从0.676提高到0.726％。由此可知，将酚酸接枝到果胶上能显著提高柑橘果胶的抗氧化活性。
3、原料比例、反应条件对果胶接枝共聚物溶解度的影响
(1)不同反应物比例
考察不同反应物质量比(柑橘果胶：香豆酸，香豆酸的用量均为1g)对溶解度的影响，固定抗坏血酸与H2O2浓度比为2:1，超声功率为50W，超声-微波降解处理的时间为3min，其他步骤参数按照实施例1～5的方法进行，结果见表3。
表3不同反应物质量比对产物溶解度的影响
反应物质量比 溶解度(％)
0.1：1 73.97％±0.35
0.5：1 82.62％±0.75
1：1 73.15％±0.26
(2)不同抗坏血酸与H2O2浓度比
考察不同抗坏血酸与H2O2浓度比对溶解度的影响，固定柑橘果胶和香豆酸的质量比0.5:1(香豆酸的用量为1g)，超声功率为50W，超声-微波作用时间为3min，H2O2浓度为0.075mol/L，其他步骤参数按照实施例1～5的方法进行，结果见表4。
表4不同抗坏血酸浓度对产物溶解度的影响
Figure BDA0003562214680000102
Figure BDA0003562214680000111
(3)不同超声-微波作用时间
考察不同超声-微波作用时间对溶解度的影响，固定反应物质量比0.5：1，香豆酸的用量为1g，抗坏血酸与H2O2浓度比为2:1，H2O2浓度为0.075mol/L，超声功率为50W，其他步骤参数按照实施例1～5的方法进行，结果见表5。
表5不同超声-微波作用时间对产物溶解度的影响
超声-微波作用时间(min) 溶解度(％)
1 77.21％±0.36
3 82.26％±0.37
5 76.24％±0.52
(4)不同超声功率
考察不同超声功率对溶解度的影响，固定反应物质量比0.5:1，香豆酸的用量为1g，抗坏血酸与H2O2浓度比为2:1，H2O2浓度为0.075mol/L，超声-微波作用时间为3min，其他步骤参数按照实施例1～5的方法进行，结果见表6。
表6不同过氧化氢浓度对溶解度的影响
超声功率(W) 溶解度(％)
50 84.15％±0.21
70 82.26％±0.42
90 81.36％±0.44
(5)正交实验
选择反应物质量比A、抗坏血酸浓度与过氧化氢浓度比B、超声-微波作用时间C和超声功率D四个影响因素，按照表7的正交试验因素与水平表进行L9(34)正交试验，其他步骤参数参见实施例1～5，结果见表8～9。
表7正交试验因素与水平
Figure BDA0003562214680000112
Figure BDA0003562214680000121
表8正交试验结果表
Figure BDA0003562214680000122
表9方差分析表
方差来源 SS df MS F 显著性
因素A 10506.776 2 3502.259 229.861 ＊＊
因素B 51.406 2 25.703 1.687
因素C 42.034 2 21.017 1.379
因素D 52.661 2 26.331 1.728
误差 30.473 2 15.236
总和 10683.35 8 234.655
由表3～表8的结果可知，影响柑橘果胶接枝共聚物溶解度的各因素主次顺序为：反应物比例A＞超声功率D>抗坏血酸与H2O2的浓度比B>超声-微波作用时间C，且通过正交试验得出最优组合为A2B2C2D1，此时柑橘果胶接枝共聚物的溶解度最高，为84.15％。方差分析结果(表9)表明，在选定的条件范围内，反应物比例A对实验结果有非常显著的影响(P<0.01)，而其他3种因素对实验结果的影响不显著。结合综合极差和方差分析结果，得到最佳改性果胶合成方案为反应物比例0.5:1，AA的浓度为0.150mol/L，超声功率为50W，超声-微波作用时间为3min。通过验证试验对该合成工艺进行验证，在该反应条件下衍生物的溶解度最高，为84.15％，将最佳条件下制备的果胶接枝共聚物记为香豆酸-柑橘果胶接枝物。
对比例1
采用未经改性的柑橘果胶作为对比例1。
对比例2
其他条件和最佳改性果胶合成方案相同，仅省略超声-微波降解的步骤，得到改性柑橘果胶。
性能测试：
1、测试对比例1中的柑橘果胶、对比例2中的改性柑橘果胶和最佳条件下制备的香豆酸-柑橘果胶接枝物的分子量以及溶解度(室温条件下在水中的溶解度)，每次测定做三次平行试验试验，取平均值，结果如表10所示。
表10对比例1～2与香豆酸-柑橘果胶接枝物分子量、溶解度的测定
对比例1 对比例2 香豆酸-柑橘果胶接枝物
分子量(KDa) 109.98±0.10 59.83±0.08 55.68±0.12
溶解度(％) 39.75±0.26 51.63±0.25 84.15±0.21
由表10可知，与对比例1(原柑橘果胶)相比，改性后的香豆酸-柑橘果胶接枝物分子量显著降低，且经过超声-微波作用的香豆酸-柑橘果胶分子量最低，达到55.68±0.12KDa。这是因为自由基在反应过程中产生的·OH夺取了果胶内的氢原子，使氢键作用力减弱，且在超声-微波的辅助作用下加剧柑橘果胶的主链或支链断裂，致使得分子量下降。而改性后的香豆酸-柑橘果胶接枝物的溶解度比对比例1～2的溶解度明显增加。结合表1可发现，改性后的香豆酸-柑橘果胶接枝物的溶解度随着分子量的下降呈现上升趋势，溶解度与分子量之间呈现负相关。
2、测试对比例1中的柑橘果胶、对比例2中的改性柑橘果胶和最佳条件下制备的香豆酸-柑橘果胶接枝物的抗氧化活性，测试方法和上述方案一致，测试结果见表11。
表11对比例1～2与香豆酸-柑橘果胶接枝物抗氧化活性的测定
Figure BDA0003562214680000141
由表11可知，香豆酸-柑橘果胶接枝物的抗氧化活性指标皆高于对比例的抗氧化活性，结合表1和表10也可发现，随着分子量的下降，抗氧化活性都随之增加，这可能是由于在接枝过程中果胶上酚酸基团的共价插入增强了果胶的供氢或者供电子能力，从而增加了果胶的抗氧化活性。
3、对对比例1中的柑橘果胶、对比例2中的改性柑橘果胶和最佳条件下制备的香豆酸-柑橘果胶接枝物进行傅里叶红外光谱图测试，结果如图1所示。
由图1可知，改性后的果胶与对比例1的傅里叶红外光谱的相似，说明香豆酸-柑橘果胶接枝物的基本结构没有发生大的变化。其次在波长1420cm-1(-CH2弯曲振动)处的峰明显减弱，说明C-6位的-CH2基的消失，C-6可能为果胶的反应活性位点；而在1517cm-1、1350cm-1和1100cm-1处出新的峰值，分别为共轭基团的C＝C拉伸、新的C-N共价键以及C-O-C类型的醚键，说明香豆酸成功接枝于果胶链上，且柑橘果胶与香豆酸是以共价键的形式相结合。以及在图中可见其他伸缩振动峰的增强，也间接的证明了香豆酸已经成功接枝到柑橘果胶上。
4、对对比例1中的柑橘果胶、对比例2中的改性柑橘果胶和最佳条件下制备的香豆酸-柑橘果胶接枝物进行扫描电镜测试，结果如图2～4所示，图2～4依次为对比例1、对比例2以及香豆酸-柑橘果胶接枝物的扫描电镜图。
由图2～4可知，香豆酸-柑橘果胶接枝物的表面结构与天然果胶明显不同，与对比例相比表面呈现明显的微观结构的变化，对比例1呈块状结构，部分团聚且质地较厚，而香豆酸-柑橘果胶接枝共聚物比对比例2表面更加光滑平整、结构疏松，这与果胶分子间和果胶内氢键减弱有关，且舒展开的结构更利于溶解性的增加。
5、体外PC12细胞实验
通过体外PC12细胞实验测试对比例1中的柑橘果胶、对比例2中的改性柑橘果胶和最佳条件下制备的香豆酸-柑橘果胶接枝物的抗氧化损伤能力，具体测试步骤如下：
(1)将对数期PC12细胞接种于96孔培养板，每孔200μL，置于培养箱中培养24h后，吸弃培养液，用DPBS清洗，在样品组加入200μL样品培养24h，VC组加入等量VC培养24h后，分别加入H2O2刺激4h。
(2)LDH活力测试
按照(1)中样品组、VC组处理细胞后，小心吸出100μL上清培养液，加入新的96孔板中，按照试剂盒说明书要求进行操作，具体操作条件见表12。
表12 LDH活力测试操作
Figure BDA0003562214680000151
NaOH溶液加入后，混合，室温静置5min，使用酶标仪测定波长450nm处的吸光值，并按照下式计算LDH活力：
Figure BDA0003562214680000161
(3)MDA含量测试
按照(1)中样品组、VC组处理细胞后，小心吸出原培养基，加入300μL胰蛋白酶溶液，轻轻拍打培养板壁使细胞消化脱落，加入DMEM完全培养基，终止消化反应，用移液枪将细胞悬液吸入2mL离心管中。1000r/min转速下离心10min，倒出上清液，用PBS重悬洗一次，离心，倒出上清液。在细胞沉淀中加入500μL PBS重悬后，细胞超声破碎仪在冰水浴条件下破碎细胞，制备细胞匀浆。按照MDA以及BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书要求进行试验操作。具体的操作条件见表13～表14。
表13 BCA蛋白质浓度测试条件
试剂 空白孔 标准孔 测定孔
蒸馏水(μL) 10 0 0
524μg/mL标准品(μL) 0 10 0
待测样本(μL) 0 0 10
工作液(μL) 250 250 250
按照表13中的条件添加试剂，混匀后在37℃下孵育37min，波长562nm，使用酶标仪测试吸光值，按照下式计算BCA蛋白浓度：
Figure BDA0003562214680000162
表14 MDA测试条件
试剂 空白孔 标准孔 测定孔
无水乙醇(μL) 50 0 0
10nmol/mL标准品(μL) 0 50 0
待测样本(μL) 0 0 50
工作液(μL) 1000 1000 1000
按照表14中的条件添加试剂后，涡旋混匀，95℃以上水浴20min，取出后流水冷却，波长530nm，将酶标仪空板进行扫描，准确吸取各管反应液250μL添加到96孔板中，酶标仪测定各孔吸光度值(计算时减去空板读书)。
按照下式计算MDA含量：
Figure BDA0003562214680000171
测试结果见图5～6，其中图5为LDH含量测定结果，图6为MDA含量测定结果。根据图5～6可以看出，对比例1～2和香豆酸-柑橘果胶接枝物与VC组相比，LDH和MDA含量明显升高，这说明PC12细胞的细胞膜的完整性受到破坏，损伤相对更严重。但是对比例2以及香豆酸-柑橘果胶接枝物与对比例1相比，LDH和MDA含量均有所降低，这说明改性后的柑橘果胶可以显著改善预防H2O2诱导的氧化损伤能力。且与对比例2相比，香豆酸-柑橘果胶接枝物处理后的PC12细胞所释放的LDH和MDA含量更少，这说明经超声辅助改性后柑橘果胶共聚物抗氧化损伤能力更强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种果胶接枝共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将果胶、香豆酸、抗坏血酸和溶剂混合，得到混合溶液；所述果胶和香豆酸的质量比为(0.1~1):1；所述溶剂为醋酸溶液；所述混合溶液中抗坏血酸的浓度为0.05~0.5mol/L；
将所述混合溶液进行超声-微波降解处理，得到降解处理液；所述超声-微波降解处理的微波功率为350~550W，超声功率为30~100W，处理时间为1~10min；
将所述降解处理液和过氧化氢溶液混合进行接枝共聚反应，得到果胶接枝共聚物；所述降解处理液和过氧化氢溶液混合所得混合液中，过氧化氢的浓度为0.05~0.175mol/L，抗坏血酸和过氧化氢的摩尔浓度比为(1～3):1；所述接枝共聚反应的温度为室温，时间为40~100min，pH值为4~8，所述接枝共聚反应在保护气氛下进行。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述果胶为柑橘果胶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述接枝共聚反应完成后，还包括将接枝共聚反应所得产物料液依次进行第一渗析、第一干燥、纯化、第二渗析和第二干燥，得到果胶接枝共聚物。
4.权利要求1~3任意一项所述制备方法制备的果胶接枝共聚物，所述果胶接枝共聚物的接枝度为40~70%。
5.权利要求4所述的果胶接枝共聚物在制备食品、保健品和抗氧化药物中的应用。
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