CN114672545A - 一种单碱基分辨率检测rna中n6-异戊烯基腺嘌呤修饰的方法 - Google Patents

一种单碱基分辨率检测rna中n6-异戊烯基腺嘌呤修饰的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种单碱基分辨率检测RNA中N6‑异戊烯基腺嘌呤修饰的方法，包括：S1、向待检测RNA中加入碘，RNA上的N6‑异戊烯基腺嘌呤和碘发生加成反应，使得N6‑异戊烯基腺嘌呤的N1和N6位形成环化结构；S2、向加成反应后的RNA中加入AMV逆转录酶，RNA中的N1，N6环化腺嘌呤在AMV逆转录酶作用下逆转录成DNA的过程中，碱基互补配对时出现错误，通过核酸测序手段识别突变位点，从而得到RNA上i6A修饰位点。本发明方法能够高效、单碱基分辨率检测RNA中的i6A修饰，为i6A的单碱基分辨率的全转录组图谱提供理论依据，并有可能进一步阐明N6‑异戊烯基腺嘌呤生物学功能。

Description

一种单碱基分辨率检测RNA中N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种单碱基分辨率检测RNA中N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的方法。
背景技术
RNA不仅由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)四种碱基组合而成，RNA中还含有多种多样的转录后修饰形式，这些化学修饰具有重要的生物学功能。目前为止，已经发现了超过150多种的RNA转录后修饰。并且RNA转录后修饰分布广泛，几乎存在于所有类型RNA中，其中存在修饰方式最多的是tRNA；此外，在mRNA、rRNA、小核RNAs(Small nuclearRNAs，snRNAs)、微型RNAs(microRNAs，miRNAs)中也发现越来越多的修饰位点以及修饰类型。常见的RNA修饰包括N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)、假尿苷(pseudouridine)、5-甲基胞苷(5-methylcytidine，m5C)、2'-O-核糖甲基化(2'-O-ribosemethylation)和N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine，m1A)，这些修饰在很大程度上丰富了RNA的遗传与功能多样性。目前研究较多的是m6A修饰。RNA中腺嘌呤还有一种修饰形式，N6-异戊烯基腺嘌呤(i6A)，被发现分布在细菌和真核生物的tRNA中靠近反密码子的37号位，可以稳定密码子和反密码子的识别继而增强翻译的过程。
修饰的鉴定及测序方法是研究其生物学意义的前提条件。作为一种稀有碱基，N6-异戊烯基腺嘌呤的检测以及生物学功能研究十分有限。目前，异戊烯基腺嘌呤常用的检测方法是利用i6A抗体进行免疫学测定方法，该类方法可以检测出哪些转录本或基因组中含有i6A修饰，但分辨率限制在上百碱基范围，不能具体区分哪个A被甲基化，也不能区分是单个A还是团簇的A被甲基化；并且是基于抗体富集i6A序列片段从而间接鉴定i6A修饰位点，没有通过直接检测i6A位点突变来鉴定修饰位点。因此，亟待开发一种针对RNA中N6-异戊烯基腺嘌呤进行单碱基分辨率检测直接有效的手段。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种单碱基分辨率检测RNA中N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的方法，旨在解决现有基于抗体免疫沉淀的间接检测方法分辨率低的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种单碱基分辨率检测RNA中N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的方法，包括如下步骤：
S1、向待检测RNA中加入碘，RNA上的N6-异戊烯基腺嘌呤和碘发生加成反应，使得所述N6-异戊烯基腺嘌呤的N1和N6位形成环化结构；
S2、向加成反应后的RNA中加入AMV逆转录酶，RNA中的N1，N6环化腺嘌呤在AMV逆转录酶作用下逆转录成DNA的过程中，碱基互补配对时出现错误，通过核酸测序手段识别突变位点，从而得到RNA上N6-异戊烯基腺嘌呤修饰位点。
优选地，步骤S1具体为：将待检测RNA溶于碘的碘化钾溶液，于20℃～40℃下振荡反应5min～15min，然后向反应液中逐滴滴加饱和硫代硫酸钠溶液至溶液澄清，再缓慢滴加饱和碳酸钠溶液或饱和碳酸氢钠溶液至没有气泡产生。
优选地，步骤S2具体为：先利用AMV逆转录酶逆转录环化后的RNA；再采用RNA文库制备技术结合高通量测序手段进行全转录组N6-异戊烯基腺嘌呤修饰位点的识别，或者采用PCR与TA-cloning技术进行特定转录本上N6-异戊烯基腺嘌呤修饰位点的识别与验证。
优选地，所述待检测RNA通过提取细胞总RNA，再富集N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的RNA得到。
进一步优选地，在提取细胞总RNA之前，将N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸与所述细胞共培养一段时间，所述N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸的浓度为100μM～400μM。
优选地，所述待检测RNA通过靶基因序列的体外转录得到，转录底物中含有N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸。
进一步优选地，所述体外转录具体包括：构建利用T7启动子启动所述靶基因表达的表达载体，以所述表达载体为模板，利用T7RNA聚合酶催化所述转录底物合成待检测RNA。
进一步优选地，所述转录底物中包含等物质的量的rATP、rCTP、rGTP和rUTP，以及2倍-16倍于rATP的物质的量的N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸。
进一步优选地，所述N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸的物质的量是rATP的物质的量的2倍-8倍。
进一步优选地，所述N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸用分子探针进行标记，所述分子探针含有能够与N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸中的异戊烯基团特异性反应的功能性分子和荧光标记分子，所述功能性分子为亲电氟化试剂、苯胺衍生化的亚硝基类化合物或1,2,4-三唑啉-3,5-二酮类衍生物，所述亲电氟化试剂为1-氟-4-甲基-1,4-二氮二环[2.2.2]辛烷双四氟硼酸盐、1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮二环[2.2.2]辛烷双四氟硼酸盐、N-氟苯磺酰亚胺或N-氟吡啶三氟甲磺酸盐，所述苯胺衍生化的亚硝基类化合物的侧链含有叠氮或碳碳三键官能团，所述1,2,4-三唑啉-3,5-二酮类衍生物的侧链含有叠氮或碳碳三键官能团。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)异戊烯基腺嘌呤核苷(iPA)是一种自然界存在的主要的游离天然细胞分裂素，这种细胞分裂素与植物的生长发育有着密切的关系，包括种子的萌发、细胞增殖、维管束发育、顶端优势和叶的衰老等，对其的研究具有重要意义。本发明提出的一种单碱基分辨率检测RNA N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的检测和标记方法，通过N6-异戊烯基腺嘌呤和碘反应成环，所生成的结构无法形成氢键，使得该位点碱基会产生随机配对，继而被识别出来，是基于核酸腺嘌呤的化学标记与诱导突变，由于突变位点可以精确到单碱基的分辨率，是一个直接的单碱基鉴定方法，利用这一新的检测方法有望得到N6-异戊烯基腺嘌呤的单碱基分辨率的全转录组图谱。
(2)本发明能够在体外和体内实现核糖核酸(RNA)腺嘌呤的N6异戊烯基标记。本发明在突变测序的基础上，可将其应用于多种基于基因测序的分析方法，如各种类型核酸上N6-异戊烯基腺嘌呤修饰位点的检测，以及基于N6-异戊烯基腺苷的细胞RNA动态测序等。
附图说明
图1为本发明实施例1合成的N6-异戊烯基腺嘌呤及其碘加成反应粗产物的核磁共振氢谱对比图。
图2为本发明实施例1中i6A碘加成反应粗产物的核磁共振氢谱图。
图3为本发明实施例1中i6A碘加成反应粗产物的核磁共振碳谱图。
图4为本发明实施例1中i6A碘加成反应粗产物经饱和硫代硫酸钠和饱和碳酸钠处理后的核磁共振氢谱图。
图5为本发明实施例1中i6A碘加成反应粗产物经饱和硫代硫酸钠和饱和碳酸钠处理后的核磁共振碳谱图。
图6为本发明实施例1中i6A碘加成反应粗产物经饱和硫代硫酸钠和饱和碳酸钠处理后的Advion质谱图。
图7为本发明实施例1合成的N6-异戊烯基腺嘌呤及i6A碘加成反应粗产物经饱和硫代硫酸钠和饱和碳酸钠处理后的高效液相色谱对比图。
图8为本发明实施例1中i6A碘加成反应粗产物经饱和硫代硫酸钠和饱和碳酸钠处理后的一种形式产物([M+H]+＝462.06244(6.52min))的LCMS图。
图9为本发明实施例1中i6A碘加成反应粗产物经饱和硫代硫酸钠和饱和碳酸钠处理后的另一种形式产物([M+H]+＝462.06244(7.34min))的LCMS图。
图10为本发明实施例2构建的T7-EGFPDNA序列图。
图11为本发明实施例2中T7-EGFP体外转录检测图，其中，泳道1为T7-EGFP DNA序列模板，泳道2为以Hela基因组为模板的体外转录产物，泳道3为以T7-EGFP DNA序列为模板的体外转录产物。
图12为本发明实施例2中T7 RNA聚合酶对i6A的识别能力检测结果，其中，pc1为阳性对照组1加入rNTP的转录产物，pc2为阳性对照组2加入等量A/C/G/U的转录产物，1-4分别为实验组1至4用不同浓度i6ATP替换ATP的转录产物。
图13为本发明实施例2中优化转录体系的转录检测结果，其中，pc为加入rNTP混合液A/C/G/U0.5μL 100mM的阳性对照组的转录产物，实验组依次为加入rNTP混合液A/C/G/U0.5μL 100mM的基础上加入0.5、1、2、4、6、8μL100mMi6A的转录产物。
图14为本发明实施例2中荧光标记i6A后体外转录RNA在无goldview核酸染料染色情况下的电泳检测结果，其中，泳道1为对照组不加入i6A的转录产物，泳道2和3为阳性对照组，在加入C/U/G0.5μL 100mM的基础上分别加入1μL和2μL i6A(100mM)的转录产物，泳道4-6为实验组，分别在加入A/C/U/G 0.5μL 100mM的基础上加入2、4、8μL i6A(100mM)的转录产物。
图15为本发明实施例3中在体外转录过程中特定位点i6A的插入效率检测结果，其中，内容A是特定位点i6A插入以及I2处理突变示意图，内容B是不同处理下体外转录产物特定位点的检测图。
图16为本发明实施例3中体外转录产物测序突变统计图。
图17为本发明实施例4中用含有100μM、200μM、400μM、800μM、2mM浓度i6A的DMEM培养基培养Hela细胞，分别在12h和24h后通过CCK8检测细胞活性的结果。
图18为本发明实施例4中用含有200μM、400μM、800μM浓度带有荧光标记i6A的DMEM培养基培养Hela细胞24h后提取细胞总RNA在有goldview核酸染料染色情况下(A)和无goldview核酸染料染色情况下(B)的电泳检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种单碱基分辨率检测RNA中N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的方法，包括如下步骤：
S1、向待检测RNA中加入碘，RNA上的N6-异戊烯基腺嘌呤(i6A)和碘发生加成反应，使得所述N6-异戊烯基腺嘌呤的N1和N6位形成环化结构；
S2、向加成反应后的RNA中加入AMV逆转录酶，RNA中的N1，N6环化腺嘌呤在AMV逆转录酶作用下逆转录成DNA的过程中，碱基互补配对时出现错误，通过核酸测序手段识别突变位点，从而得到RNA上N6-异戊烯基腺嘌呤修饰位点。
在本发明中，碘诱导的双键加成反应后，碘具有一定的离去性，其紧邻的碳原子可以亲电进攻电子云密度较高的原子，对于腺嘌呤而言，其嘌呤环上的氮原子就具有电子云密度较高的特性，特别是1号位的氮原子。我们在实验中发现，N6-异戊烯基腺嘌呤在与碘发生加成反应后，N6位置的异戊烯基碘可以诱导碘原子离去后碳原子亲电进攻相邻位置的N1，形成N1、N6关环反应，屏蔽原本这两个位置用于碱基互补配对的氢键，使之从氢键给体变成氢键受体。在AMV逆转录酶介导的逆转录过程中，AMV逆转录酶能够识别腺嘌呤用于碱基互补配对的氢键被屏蔽的环化结构，使得A碱基无法与T碱基正常配对，而可能与C、G、A碱基随机配对，借助核酸测序的手段，检测到的该位点碱基突变为G、C或T，达到识别N6-异戊烯基腺嘌呤位点的目的。此外，针对RNA嘌呤上的N6-异戊烯基，发展了一系列特异性生物正交Ene-连接反应，对其进行荧光标记，也可以用于该类修饰的检测。
其中，步骤S1具体为：将待检测RNA溶于碘的碘化钾溶液，于20℃～40℃下振荡反应5min～15min，然后向反应液中逐滴滴加饱和硫代硫酸钠溶液至溶液澄清，再缓慢滴加饱和碳酸钠溶液或饱和碳酸氢钠溶液至没有气泡产生。一些实施例中，碘加成试剂例如但不限于碘的碘化钾溶液，过量碘的去除方法例如但不限于用饱和硫代硫酸钠溶液处理，采用例如但不限于饱和碳酸钠溶液或饱和碳酸氢钠溶液处理调节反应液为碱性，以维持环化腺嘌呤的稳定。优选地，本发明在RNA碘加成与环化处理后还包括对RNA进行纯化的步骤，所采用的纯化方法可以为本领域常规的RNA异丙醇沉淀法。
步骤S2具体为：先利用AMV逆转录酶逆转录环化后的RNA；再采用RNA文库制备技术结合高通量测序手段进行全转录组N6-异戊烯基腺嘌呤修饰位点的识别，或者采用PCR与TA-cloning技术进行特定转录本上N6-异戊烯基腺嘌呤修饰位点的识别与验证。
当本发明方法用于检测细胞中天然存在的RNAi6A修饰位点时，所述待检测RNA通过提取细胞总RNA，再富集N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的RNA得到。一些实施例中，提取细胞总RNA后，还可以从中进一步分离出mRNA后，再进行富集。本发明对可应用的样本细胞种类没有特殊限定，细胞例如但不限于普通哺乳动物细胞、哺乳动物癌细胞、哺乳动物干细胞、病毒的宿主细胞、细菌以及来源于各种类型的组织与器官的细胞。在本发明中，细胞与组织的收集、裂解、提取总RNA与全转录组RNA的方法采用本领域常规的RNA提取方法即可，无特殊要求，例如本发明具体实施过程中采用TRIzol Reagent提取总RNA，GenEluteTM mRNAMiniprep Kit提取mRNA。富集方法可采用chemicalpull-down技术，具体方法在此不做限定，例如设计一种探针，一头带有与异戊烯基发生特异性化学反应的功能分子，一头带有生物素(biotin)，将探针与细胞中提取到的RNA混合反应，然后利用链霉亲和素的磁珠进行富集。
在本发明研究中发现，真核细胞中的RNA聚合酶能够识别i6A，因此人为引入i6A，使之参与细胞中的转录过程，可以通过控制i6A的加入时间检测特定时间点细胞转录谱的变化。具体地，在提取细胞总RNA之前，将N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸与待检测细胞共培养一段时间，所述N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸的浓度为100μM～400μM。若i6A浓度太高，对细胞活性会有明显抑制作用。
另一方面，所述待检测RNA通过靶基因序列的体外转录得到，转录底物中含有N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸。转录底物中可以仅含有i6A，不含有正常A，但为了提高转录效率，优选转录底物中既含有i6A，又含有正常A。一些实施例中，转录底物中包含等物质的量的rATP、rCTP、rGTP和rUTP，以及2倍-16倍于rATP的物质的量的N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸。进一步优选地，N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸的物质的量是rATP的物质的量的2倍-8倍。
其中，体外转录具体包括：构建利用T7启动子启动所述靶基因表达的表达载体，以所述表达载体为模板，利用T7RNA聚合酶催化所述转录底物合成待检测RNA。本发明实验发现，T7 RNA聚合酶对于i6ATP具有良好的识别能力。
本申请发明人在先研究发现一类功能性分子能够与异戊烯类修饰的生物分子中的异戊烯基团发生特异性反应，并形成包含氟原子、叠氮或碳碳三键取代基结构，该类功能性分子可以为亲电氟化试剂、苯胺衍生化的亚硝基类化合物或1,2,4-三唑啉-3,5-二酮类衍生物，所述亲电氟化试剂为1-氟-4-甲基-1,4-二氮二环[2.2.2]辛烷双四氟硼酸盐、1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮二环[2.2.2]辛烷双四氟硼酸盐、N-氟苯磺酰亚胺或N-氟吡啶三氟甲磺酸盐，所述苯胺衍生化的亚硝基类化合物的侧链含有叠氮或碳碳三键官能团，所述1,2,4-三唑啉-3,5-二酮类衍生物的侧链含有叠氮或碳碳三键官能团，可参见中国专利CN111909993B。为了直观检测靶基因转录mRNA中i6A的标记效率，可以对N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸用同时带有荧光标记分子和该类功能性分子的分子探针进行标记，例如但不限于带有异硫氰酸荧光素(FITC)基团的4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)，即FITC-PTAD。标记方法具体为：将上述分子探针与i6A混合，在冰浴中反应0.5h～2h。同样地，该分子探针也可以对体内天然存在的i6A修饰的RNA进行标记。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1N6-异戊烯基腺嘌呤与其碘加成反应
本实施例先人工合成了N6-异戊烯基腺嘌呤，具体合成步骤可参考VitaliI.Tararov等人的论文(Synthesis 2011(15):2483-2489)。对合成产物进行核磁共振氢谱检测、高效液相色谱分析以及高效液相色谱-质谱联用分析验证。
称取合成的化合物N6-异戊烯基腺嘌呤(50.2mg,0.15mmol,1equiv.)于干燥EP管中，加入0.5mL溶剂(DMSO-d6)溶解N6-异戊烯基腺嘌呤，加入I2(113.8mg,0.45mmol,3equiv.)，反应液于室温迅速震荡5min后，取适量反应液立即转移至干燥核磁管中并通过400MHz核磁共振仪检测样品氢谱和碳谱，参见图1至图3。在剩余反应液中逐滴滴加饱和硫代硫酸钠溶液直至溶液澄清，之后，缓慢滴加饱和碳酸钠溶液直至没有气泡产生。分别取适量反应液进行核磁共振氢谱和碳谱检测、质谱分析、高效液相色谱分析以及高效液相色谱-质谱联用分析，参见图4至图9。
实施例2T7 RNA聚合酶体外转录mRNA上i6A修饰的检测
(1)构建T7 RNA聚合酶介导的EGFP体外转录体系并验证体外转录过程
鉴于T7 RNA聚合酶的高度专一性，T7启动子作为一种强启动子能够高效引导下游基因的表达，本实施例利用T7启动子引导EGFP基因的体外转录。如图10所示，将T7启动子序列构建到EGFP绿色荧光报告基因的5’端，得到T7-EGFP序列，在体外环境下T7 RNA聚合酶的加入可以有效引导EGFP的转录。
以构建的T7-EGFP为模板，在T7 RNA聚合酶的催化作用下，以rNTP为底物，37℃反应2h。反应结束后用DNase I降解掉模板DNA。最后对产物RNA进行沉淀纯化，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的转录效果，用T7-EGFP模板序列以及Hela基因组RNA作为对照。如图11所示，实验结果表明，通过以上T7 RNAp体外转录体系，成功实现了对目标基因EGFP的体外转录。
(2)检测T7RNA聚合酶对i6ATP的识别能力
本实施例为检测T7 RNA聚合酶(T7 RNAp)对i6ATP的识别能力，首先构建了含有i6ATP的T7 RNA聚合酶体外转录体系。这一体系中包括：T7-EGFP基因序列1μg，T7 RNAp 1μL，体外转录缓冲液2μL；设置两组阳性对照组，对照组1(pc1)包含rNTP混合物2μL(100mM)；对照组2(pc2)分别单独添加A/C/G/U各0.5μL(100mM)；四个实验组从1到4分别加入1-4倍i6ATP，也就是分别0.5，1，1.5，2μL(100mM)，以及C/G/U各0.5μL(100mM)；对照组及实验组均加DEPC水至20μL。将各系统在37℃下保持2h，实验组1至4延长至6h。然后，用DNase I在37℃下消化30min。之后，将产物用75％的乙醇在-20℃沉淀过夜，然后用75％乙醇洗涤沉淀，并用20μLDEPC水重新溶解。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测EGFP mRNA的转录效果。如图12所示，实验结果表明在低浓度的i6ATP的条件下没有检测到EGFP mRNA的转录，当i6ATP添加量超过150％～200％后成功检测到EGFP mRNA的条带，这说明T7 RNA聚合酶对于i6ATP具有一定的识别能力。
(3)优化i6ATP存在条件下的体外转录体系
为提高i6ATP加入条件下EGFP的转录效率，对以上体外转录体系进行了优化。优化后体外转录体系包括T7-EGFP基因序列1μg，T7 RNAp 1μL，体外转录缓冲液2μL；阳性对照组：rNTP混合液A/C/G/U各0.5μL 100mM；实验1组：A/C/G/U 0.5μL 100mM，i6ATP 0.5μL100mM；实验2组：A/C/G/U 0.5μL 100mM，i6A 1μL 100mM；实验3组：A/C/G/U 0.5μL 100mM，i6A 2μL 100mM；实验4组：A/C/G/U 0.5μL 100mM，i6A 4μL 100mM；实验5组：A/C/G/U 0.5μL100mM，i6A 6μL 100mM；实验6组：A/C/G/U 0.5μL 100mM，i6A 8μL 100mM；DEPC水补足至20μL。将此转录体系在37℃下保持2h。然后，用DNase I在37℃下消化模板30min。之后再将RNA沉淀纯化并进行琼脂糖凝胶电泳检测。如图13所示，实验结果表明在底物中既加入正常ATP，又加入一定浓度i6ATP后EGFP的转录效率显著提高，实验2组-4组的EGFP转录效率相当，随着i6A浓度的进一步提高，实验5组和6组转录效率略有降低。
(4)检测优化体系中i6ATP参与靶基因EGFP转录的情况
通过以上实验已经表明i6ATP能够成功被T7 RNA聚合酶识别，并且优化了在i6ATP存在条件下EGFP mRNA的体外转录体系。为了进一步验证i6A转录进入EGFP中，通过FITC-PTAD对i6A异戊烯基基团进行标记。将溶于15μLDEPC水中的2μg mRNA和5μLFITC-PTAD溶液(5mM)混合，反应在冰浴中保持1h。然后加入1μL(20mg/mL)糖原和80μL EtOH沉淀RNA，并在-80℃下保存16h。将得到的悬浮液以14800rpm离心10min，固体用10μL 70％乙醇洗涤并以13000rpm离心5min。去除上清液，将RNA在空气中干燥10min，20μL无RNA酶的水中再溶解，并用Nanodrop 2000分光光度计确定RNA浓度。之后，通过琼脂糖凝胶电泳在没有核酸染料Godview的情况下检测RNA条带荧光。如图14所示，实验结果表明对照组检测不到FITC的荧光，而随着i6A浓度的增大，RNA条带的荧光强度逐渐增大，这表明RNA中i6A的含量逐渐升高，i6A对RNA的标记效率逐渐升高。实验表明，可以利用i6A在体外转录过程中对mRNA进行标记。
实施例3检测i6A参与体外RNA转录的效率
(1)检测体外转录过程中特定位点i6A的插入效率
类似实施例2，利用T7 RNA聚合酶转录体系，分别以i6A：A的比例为0:1、3:7条件下转录获得EGFP的mRNA序列，然后对各组EGFP RNA序列进行I2处理，将实施例1中合成的化合物N6-异戊烯基腺嘌呤替换成等物质的量的EGFP RNA序列，其余步骤同实施例1。处理完成后通过反转录获得各组中EGFP的cDNA序列。然后以获得的cDNA序列为模板，通过PCR扩增获得各组中突变后的EGFP基因序列。
其中，反转录过程为：按如下表配制反转录反应体系，在振荡器上混匀体系，然后将其离心至PCR管底部，25℃，10min，42℃，60min，4℃保存。
Figure BDA0003619614260000111
Figure BDA0003619614260000121
RT-PCR过程为：1)按如下表配制RT-PCR反应体系
Figure BDA0003619614260000122
2)RT-PCR反应条件设置：
①94℃，5min。
②25个循环：94℃，30s；54℃，30s；72℃，30s。
③72℃，7min。
④4℃，保存。
将RT-PCR扩增出的各组EGFP基因序列克隆进入T载体，通过DH5α大肠杆菌的扩增，每组分别挑取50个克隆测序检测突变后EGFP基因的突变位点，并分析i6A的插入效率。实验结果如图15所示，结果表明在特定位点i6A的插入效率在15％～20％左右。
如上所述分别在i6A不存在以及i6A含量为30％的条件下，通过T7 RNA聚合酶进行体外转录，获得EGFP体外转录mRNA。然后通过I2处理，在i6A插入位点由于I2的存在使i6A发生突变，突变后的i6A在反转录过程中可以随机与A、G、C配对但是不能与T正常配对，从而使检测得到的EGFP基因位点由A突变为T、G、C。如此通过统计在EGFP mRNA中发生突变的腺苷酸的数量即可统计出i6A在体外转录条件下对RNA的标记效率。实验结果如图16所示，结果表明在30％i6A存在条件下，mRNA被标记的效率达到80％～90％左右。这将有效实现T7 RNA聚合酶引导下i6A对目标RNA的有效标记示踪以及功能的追踪检测。
实施例4验证i6A在真核细胞中被识别并参与转录过程
(1)i6A的毒理实验
为了更好地检测i6A参与细胞中RNA的转录过程。首先检测了i6A对细胞毒性的影响，优化了i6A处理细胞的浓度。设置i6A的浓度梯度为100μM，200μM，400μM，800μM，2mM，分别用含有梯度浓度的DMEM培养基培养Hela细胞12h和24h，然后用CCK8试剂盒分别在12h和24h两个时间点检测细胞活性。如图17所示，经实验结果分析表明i6A浓度在400μM以内对细胞活性影响较小，当浓度达到800μM后细胞活性会受到较为明显的抑制，浓度达到2mM后对细胞活性具有显著的抑制作用。
(2)检测i6A能否被真核细胞中RNA聚合酶识别
本实施例检测i6A能否参与真核细胞中RNA转录过程。首先将Hela细胞在6孔板中培养至70％～80％。然后向DMEM培养基中添加不同量的i6A，使得i6A的终浓度分别为200μM，400μM，800μM。培养12h后，收集所有细胞并提取总RNA。如上所述中用FITC-PTAD进一步标记i6A。对RNA标记完成后，去除多余染料，并重新纯化RNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测FITC对RNA的标记效率，从而可以反映i6A是否转录进入RNA中。如图18所示，通过结果分析表明在goldview核酸染料染色条件下检测到在i6A加入条件下细胞中总RNA相比于野生型稳定性要好，另外其5s和16s RNA条带相对于野生型明显上移，28s条带没有明显变化。通过FITC染色发现对照组检测不到荧光信号而i6A存在条件下细胞总RNA检测到明显荧光信号，而800μM i6A的加入RNA荧光强度反而减弱，这可能是因为800μM i6A对细胞有一定毒性。通过这一实验表明，真核细胞中i6A能够被识别，并参与RNA转录过程。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单碱基分辨率检测RNA中N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、向待检测RNA中加入碘，RNA上的N6-异戊烯基腺嘌呤和碘发生加成反应，使得所述N6-异戊烯基腺嘌呤的N1和N6位形成环化结构；
S2、向加成反应后的RNA中加入AMV逆转录酶，RNA中的N1，N6环化腺嘌呤在AMV逆转录酶作用下逆转录成DNA的过程中，碱基互补配对时出现错误，通过核酸测序手段识别突变位点，从而得到RNA上N6-异戊烯基腺嘌呤修饰位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1具体为：将待检测RNA溶于碘的碘化钾溶液，于20℃～40℃下振荡反应5min～15min，然后向反应液中逐滴滴加饱和硫代硫酸钠溶液至溶液澄清，再缓慢滴加饱和碳酸钠溶液或饱和碳酸氢钠溶液至没有气泡产生。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2具体为：先利用AMV逆转录酶逆转录环化后的RNA；再采用RNA文库制备技术结合高通量测序手段进行全转录组N6-异戊烯基腺嘌呤修饰位点的识别，或者采用PCR与TA-cloning技术进行特定转录本上N6-异戊烯基腺嘌呤修饰位点的识别与验证。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述待检测RNA通过提取细胞总RNA，再富集N6-异戊烯基腺嘌呤修饰的RNA得到。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在提取细胞总RNA之前，将N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸与所述细胞共培养一段时间，所述N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸的浓度为100μM～400μM。
6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述待检测RNA通过靶基因序列的体外转录得到，转录底物中含有N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述体外转录具体包括：构建利用T7启动子启动所述靶基因表达的表达载体，以所述表达载体为模板，利用T7RNA聚合酶催化所述转录底物合成待检测RNA。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述转录底物中包含等物质的量的rATP、rCTP、rGTP和rUTP，以及2倍-16倍于rATP的物质的量的N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸的物质的量是rATP的物质的量的2倍-8倍。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸用分子探针进行标记，所述分子探针含有能够与N6-异戊烯基腺嘌呤核糖核苷三磷酸中的异戊烯基团特异性反应的功能性分子和荧光标记分子，所述功能性分子为亲电氟化试剂、苯胺衍生化的亚硝基类化合物或1,2,4-三唑啉-3,5-二酮类衍生物，所述亲电氟化试剂为1-氟-4-甲基-1,4-二氮二环[2.2.2]辛烷双四氟硼酸盐、1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮二环[2.2.2]辛烷双四氟硼酸盐、N-氟苯磺酰亚胺或N-氟吡啶三氟甲磺酸盐，所述苯胺衍生化的亚硝基类化合物的侧链含有叠氮或碳碳三键官能团，所述1,2,4-三唑啉-3,5-二酮类衍生物的侧链含有叠氮或碳碳三键官能团。
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