CN114657246A

CN114657246A - 一种预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的标志物及其应用

Info

Publication number: CN114657246A
Application number: CN202210150465.XA
Authority: CN
Inventors: 龚畅; 贾诗杰
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2022-02-18
Filing date: 2022-02-18
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2042-02-18
Also published as: CN114657246B

Abstract

本发明公开了一种预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的标志物及其应用；本发明通过多重RNA原位分析方法检测了外周血循环肿瘤细胞内的FTH1基因的表达，证明了新辅助化疗前外周血中高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量高或者比例高的患者不易获得病理完全缓解；通过检测新辅助化疗前高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量能预测新辅助化疗的疗效，其AUC＝0.805，通过检测新辅助化疗前高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量占CTCs总数比例能预测新辅助化疗的疗效，其AUC＝0.847，具有较高的预测价值。

Description

一种预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的标志物及其应用。

背景技术

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤之一。根据2020年世界卫生组织国际癌症研究机构的全球癌症负担数据，乳腺癌新发病例数高达226万，取代新发病例数为220万的肺癌成为全球第一大癌。

乳腺癌严峻的防治形势获得了全球医务工作者的关注，随着对乳腺癌这一全身疾病的了解，治疗模式从单一的手术治疗逐步转变为基于不同分子分型的手术、化疗、放疗、内分泌治疗、免疫治疗相结合的综合治疗模式，其中新辅助化疗(Neoadjuvantchemotherapy)作为具有降低肿瘤负荷，提供保乳或保腋窝的机会，以及获得体内药物敏感性的相关信息以指导后续治疗等优势，成为临床上局部晚期的患者，或者有降期保乳、保腋窝需要的患者的常规治疗方式。新辅助化疗又称术前化疗，是指在手术治疗前给予全身化疗。首诊时满足以下条件之一的患者可考虑选择新辅助治疗：肿块较大；腋窝淋巴结转移；HER2阳性；三阴性；有保乳意愿但肿瘤大小与乳房体积的比例大难以保乳者。

病理完全缓解(Pathological complete response,pCR)是指在完成新辅助系统治疗后，对完整切除的乳腺标本和所有取样的区域淋巴结进行苏木精-伊红染色评估无残留浸润性癌或只有原位癌成分。多项大型临床研究结果证明，新辅助化疗后获得pCR的患者有更好的长期结果。

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指从实体瘤源释放到循环血液中的癌细胞，大部分在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，是肿瘤的转移潜力。CTCs在迁移和转移的过程中发生了上皮间质转化(EpithelialMesenchymal Transition,EMT)，表现为上皮型标记物的上皮标志物如EpCAM和细胞角蛋白的下调、间质标志物如波形蛋白和TWIST的上调。获得间充质型标记物的CTCs亚型具有更强的运动性和侵袭性。CanPatrol CTC富集技术基于上皮标志物(EpCAM、CK8/18/19)与间质标志物(Vimentin、Tiwst)可以将CTCs主要分为两种亚型：表达上皮型标记物的上皮型CTCs和EMT型CTCs，后者包括了表达间充质型标记物的间充质型CTCs和同时表达上皮型、间充质型标记物的混合型CTCs。相关的研究发现EMT型CTCs与乳腺癌的不良预后相关，但与乳腺癌新辅助化疗疗效的关系尚不明确。

发明内容

本发明的目的在于提供通过检测高表达FTH1的上皮间质转化型循环肿瘤细胞数量和/或高表达FTH1的上皮间质转化型循环肿瘤细胞的比例来预测新辅助化疗疗效。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供检测FTH1基因或FTH1基因编码的mRNA或FTH1基因编码的蛋白质的物质在制备预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述FTH1为循环肿瘤细胞内的FTH1。

在本发明的一些优选实施方式中，所述循环肿瘤细胞为上皮间质转化型循环肿瘤细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述物质为检测FTH1基因或FTH1基因编码的mRNA或FTH1基因编码的蛋白所需的试剂和/或仪器。

在本发明的一些实施方式中，所述检测FTH1基因编码的mRNA所需的试剂包括检测FTH1基因编码的mRNA所使用的探针。

在本发明的一些实施方式中，所述探针序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的一些实施方式中，所述产品中还包含检测循环肿瘤细胞(CTCs)亚型的物质。

在本发明的一些实施方式中，所述亚型为上皮间质转化型(EMT型)。

在本发明的一些实施方式中，所述检测循环肿瘤细胞(CTCs)亚型(EMT型)的物质为通过对循环肿瘤细胞的间质细胞标志蛋白进行检测的物质。

在本发明的一些实施方式中，所述对循环肿瘤细胞的间质细胞标志蛋白质进行检测的物质为抗体、适配体或多肽。

通过检测上皮间质转化型(EMT型)的循环肿瘤细胞内的FTH1的表达情况进而确定高表达FTH1的EMT型循环肿瘤细胞的数量和/或比例。高表达FTH1的EMT型循环肿瘤细胞的比例是指其数量占循环肿瘤细胞总数的比例。高表达FTH1基因的EMT型的循环肿瘤细胞数量和/或比例越高，患者越不易获得病理完全缓解。

在本发明的一些实施方式中，所述检测的样本为外周血。

本发明的第二方面，提供一种预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的产品，其包含检测检测FTH1基因或FTH1基因编码的mRNA或FTH1基因编码的蛋白质的物质。

在本发明的一些优选实施方式中，所述探针序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的一些优选实施方式中，所述循环肿瘤细胞为EMT型的循环肿瘤细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述产品还包括记载有如下标准的可读载体：

新辅助化疗前高表达FTH1的上皮间质转化型循环肿瘤细胞数量多和/或高表达FTH1的上皮间质转化型循环肿瘤细胞比例高的非转移性乳腺癌患者从新辅助化疗后中获益的可能性低于新辅助化疗前高表达FTH1的上皮间质转化型循环肿瘤细胞数量少和/或高表达FTH1基因的上皮间质转化型循环肿瘤细胞比例低的非转移性乳腺癌患者。

即新辅助化疗前外周血中高表达FTH1的EMT型循环肿瘤细胞数量多的非转移性乳腺癌患者从新辅助化疗中获益的可能性低于数量少的患者；新辅助化疗前外周血中高表达FTH1的EMT型循环肿瘤细胞数量占循环肿瘤细胞总数的比例高的非转移性乳腺癌患者从新辅助化疗中获益的可能性低于比例低的患者。

在本发明的一些实施方式中，所述产品可以为试剂盒。

本发明的第三方面，提供一种用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的系统，包括：

表达定量装置，用于确定FTH1的表达量；

数据分析装置，基于FTH1的表达量，评估非转移性乳腺癌患者从新辅助化疗中获益的可能性；以及

结果输出装置，用于输出评估结果。

在本发明的一些实施方式中，基于FTH1的表达量，确定高表达FTH1的上皮间质转化型循环肿瘤细胞数量或高表达FTH1基因的上皮间质转化型循环肿瘤细胞比例，评估非转移性乳腺癌患者从新辅助化疗中获益的可能性。

在本发明的一些实施方式中，所述表达定量装置中用于检测循环肿瘤细胞(CTCs)亚型的物质。

本发明的第四方面，提供FTH1作为标志物在开发预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述循环肿瘤细胞优选为上皮间质转化型循环肿瘤细胞。

申请人认为，高表达FTH1的细胞具有高水平的铁氧化酶活性，能在癌细胞中通过稳定Fe²⁺的含量以在高水平稳定ROS水平从而发挥着促癌作用。高表达FTH1的EMT型CTCs具有更强的侵袭性，通过检测基线时高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量及比例能预测非转移性乳腺癌新辅助化疗的疗效。

本发明的有益效果是：

本发明通过多重RNA原位分析方法检测了外周血循环肿瘤细胞内的FTH1基因的表达，证明了新辅助化疗前外周血中高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量高的患者不易获得病理完全缓解；证明了新辅助化疗前外周血中高表达FTH1基因的EMT型CTCs的比例高的患者不易获得病理完全缓解；可以将循环肿瘤细胞FTH1基因用于开发预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的生物标志物。

申请人通过实验验证新辅助化疗前高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量能预测新辅助化疗的疗效，其AUC＝0.805；通过检测新辅助化疗前高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量占CTCs总数比例能预测新辅助化疗的疗效，其AUC＝0.847；可以看出具有较高的预测价值。而且不同于影像学检测新辅助化疗过程中原发瘤的变化来评价疗效，本发明能在治疗前预测疗效，为个性化治疗提供条件，操作便捷易于临床使用。

附图说明

图1显示CanPatrol循环肿瘤细胞分型检测系统通过多重RNA原位分析检测到的不同类型的细胞标志物和FTH1基因的信号点。其中，红色信号点为上皮型细胞标记物信号点(图1a)，绿色信号点为间充质型细胞标记物信号点(图1b)，白色信号点为白细胞标记物信号点(图1c)，紫色信号点为FTH1基因信号点(图1d)。

图2显示新辅助化疗前外周血中高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量在pCR组和non-pCR组间的数量差异。

图3显示新辅助化疗前外周血中高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量占CTCs总数的比例在pCR组和non-pCR组间的比例差异。

图4显示高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量对新辅助化疗pCR率的预测能力。

图5显示高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量占CTCs总数的比例对新辅助化疗pCR率的预测能力。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

1、样品收集

研究纳入77名来自于中山大学孙逸仙纪念医院乳腺肿瘤中心的经病理确诊为乳腺浸润性癌的患者。所有患者经影像学检查排除了转移性乳腺癌，符合新辅助化疗的指征且既往未因乳腺癌行任何其他抗肿瘤治疗。所有患者5年内未患除乳腺癌以外的其他恶性肿瘤。由本中心的主任医师制定患者的个性化新辅助化疗的方案并为其实施合适的手术。其中63患者在新辅助化疗前检测到CTCs，根据术后病理结果，22名患者获得了pCR和41名患者获得non-pCR。

所有的标本是患者接受新辅助化疗前的5ml外周血标本。

2、检测流程

主要设备为CanPatrol循环肿瘤细胞分型检测系统(益善生物技术股份有限公司)。

2.1预处理

用红细胞裂解缓冲液(154mM NH₄Cl+10mM KHCO₃+0.1mM EDTA(Sigma,St.Louis,USA))室温下裂解红细胞，用TDZ5-WS型号离心机离心，加入含10％甲醛的PBS(Sigma,St.Louis,USA)固定后用真空泵((Auto Science,Tianjin,China)过滤样本，使细胞贴紧在8μm的滤膜上(Millipore,Billerica,USA)，真空泵的压力至少为0.08MPa。加入含4％甲醛溶液的PBS(Sigma,St.Louis,USA)，抽掉过滤器内溶液，依次加入1mL 50％、70％、100％酒精溶液对样本脱水后置于-20℃保存。

过滤柱从-20℃冰箱取出后放到真空泵上，依次加入1ml 100％、70％、50％酒精静止两分钟抽掉，共6分钟。加入1～2ml PBS洗涤3次，每次室温静置2min，完成样本亲水。

滤膜与100μL的TritonX-100室温孵育5min，加入1～2ml PBS洗涤3次，每次室温静置2min，完成样本透化。

滤膜与100μL胃蛋白酶(Qiagen,Hilden,Germany)室温孵育1h，加入1～2ml PBS洗涤3次，每次室温静置2min，完成样本消化。

2.2探针杂交、预扩增、扩增、复染

将滤膜与100μL加入了杂交探针的盐离子缓冲剂(30％马血清+1.5％十二烷基硫酸钠+3mM Tris-HCl)40℃孵育3h。用1～2ml SSC洗涤3次，每次室温静置2min。随后用分别预扩增探针工作液(30％马血清+1.5％十二烷基硫酸钠+3mM Tris-HCl+0.5fmol预扩增探针)、扩增探针工作液(30％马血清+1.5％十二烷基硫酸钠+3mM Tris-HCl+1fmol扩增探针)重复以上操作。在滤膜上加入10μL复染液(4’，6二脒基-2-苯基吲哚)复染，置于-20℃保存或室温放置15min进行镜检。

申请人使用的分型探针基于不同的标志物，分别是四种上皮标志物：EpCAM、CK8/18/19(探针序列如SEQ ID No.1-No.4)；两种间充质标志物：Vimentin、Tiwst(SEQ IDNo.5-No.6)；一种白细胞标志物：CD45(SEQ ID No.7)。所有的生物标记物均来自中国上海Invitrogen公司。FTH1基因探针由Bender医疗系统有限公司制作，序列见SEQ ID No.8。

SEQ ID NO.1：TGGTGCTCGTTGATGAGTCAAGCCAGCTTTGAGCAAATGAAAAGCCCATCATTGTTCTGGCTCTCATCGCAGTCAGGATCTCCTTGTCTGTTCTTCTGACCTCAGAGCAGGTTATTTCAG；

SEQ ID NO.2：CGTACCTTGTCTATGAAGGAACTTGGTCTCCAGCATCTTGCCTAAGGTTGTTGATGTAGCCTGAGGAAGTTGATCTCGTCCAGATGTGTCCGAGATCTGGTGACCTCAGCAATGATGCTG；

SEQ ID NO.3：AGAAAGGACAGGACTCAGGCGAGTGGTGAAGCTCATGCTGTCAGGTCCTCGATGATCTTGCAATCTGCAGAACGATGCGGAAGTCATCAGCAGCAAGACGCTGCAGTCGTGTGATATTGG；

SEQ ID NO.4：CTGTAGGAAGTCATGGCGAGAAGTCATCTGCAGCCAGACGCTGTTCCGTCTCAAACTTGGTTCTTCTTCAGGTAGGCCAGCTCAGCGTACTGATTTCCTCGTGAACCAGGCTTCAGCATC；

SEQ ID NO.5：GAGCGAGAGTGGCAGAGGACCTTTGTCGTTGGTTAGCTGGCATATTGCTGACGTACGTCAGAGCGCCCCTAAGTTTTTAAAAGATTGCAGGGTGTTTTCGGGCCAATAGTGTCTTGGTAG；

SEQ ID NO.6：ACAATGACATCTAGGTCTCCCTGGTAGAGGAAGTCGATGTCAACTGTTCAGACTTCTATCCCTCTTGAGAATGCATGCATTTTCAGTGGCTGATTGGCACTTACCATGGGTCCTCAATAA；

SEQ ID NO.7：TCGCAATTCTTATGCGACTCTGTCATGGAGACAGTCATGTGTATTTCCAGCTTCAACTTCCCATCAATATAGCTGGCATTTTGTGCAGCAATGTATTTCCTACTTGAACCATCAGGCATC；

SEQ ID NO.8：CAAGCACTGTTGAAGCAGGAACGGCTATGGGGAAATTAGCAAACCCCAACATGCATGCACATCCCAAGACCTCAAAGACACGGCACTTAAGGAATCTGGAACAGCCACACCTTAGTATACCAGACTCTGGATTCAGAGTCAGCTAGACTGAACCATTGGA。

2.3细胞镜检

使用CTC自动分析系统，使用的软件为Metafer4。完成20倍预扫、40倍DAPI拍摄、40倍荧光信号拍摄、图像调整。

根据上皮标志物(EpCAM、CK8/18/19)与间质标志物(Vimentin、Tiwst)将CTCs在细胞学上分为三个亚群：上皮细胞型CTCs、间质细胞型CTCs、上皮细胞和间质细胞混合表型CTCs(亦称混合型CTCs)。表达间质细胞标志物的CTCs称为EMT型CTCs，包括间质细胞型CTCs与混合型CTCs。

上皮型、间质型、混合型CTCs镜检结果判断标准为：细胞核清晰且有核纹；红色信号点或绿色信号点大于或等于7个，且为白色信号点少于7个。红色信号点为上皮型CTCs信号点，绿色为间充型CTCs信号点，白色为白细胞信号点。

mRNA原位杂交的有效信号点为明亮、集中的紫色规则实点，像素点≥10个。FTH1基因高表达的标准为紫色的信号点大于等于9个。

具体可见图1。

3结果分析

使用SPSS 26进行统计学分析。

1)用Mann-Whitney U检验比较non-pCR组与pCR组之间新辅助化疗前外周血中高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量及比例的差异。高表达FTH1基因的EMT型CTCs的比例是指其数量占外周血中CTCs总数的比例。双侧p<0.05为存在统计学差异。

如图2，pCR组新辅助治疗前外周血中高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量显著少于non-pCR组(p<0.001)。

如图3，pCR组新辅助治疗前外周血中高表达FTH1基因的EMT型CTCs的比例显著低于non-pCR组(p<0.001)。

2)构建受试者工作特性曲线(ROC)评估高表达FTH1基因的EMT型CTCs预测pCR率的表现。用曲线下面积(AUC)及95％置信区间(95％CI)展示预测效能，用最大约登指数判断临界值。

结果显示如图4，用高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量绘制ROC曲线去预测pCR率，其AUC＝0.805(95％CI＝0.697-0.913,p<0.001)。约登指数计算出最佳临界值为0.5。鉴于循环肿瘤细胞的数量为整数，申请人认为最佳临界值为1。申请人认为新辅助治疗前外周血中高表达FTH1基因的EMT型CTCs的数量≥1的患者不易获得pCR。

如图5，用高表达FTH1基因的EMT型CTCs的比例绘制ROC曲线去预测pCR率，其AUC＝0.847(95％CI＝0.752-0.942,p<0.001)。约登指数计算出最佳临界值为19.5％。我们认为新辅助治疗前外周血中高表达FTH1基因的EMT型CTCs的比例≥19.5％的患者不易获得pCR。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院

<120> 一种预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的标志物及其应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggtgctcgt tgatgagtca agccagcttt gagcaaatga aaagcccatc attgttctgg 60

ctctcatcgc agtcaggatc tccttgtctg ttcttctgac ctcagagcag gttatttcag 120

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtaccttgt ctatgaagga acttggtctc cagcatcttg cctaaggttg ttgatgtagc 60

ctgaggaagt tgatctcgtc cagatgtgtc cgagatctgg tgacctcagc aatgatgctg 120

<210> 3

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agaaaggaca ggactcaggc gagtggtgaa gctcatgctg tcaggtcctc gatgatcttg 60

caatctgcag aacgatgcgg aagtcatcag cagcaagacg ctgcagtcgt gtgatattgg 120

<210> 4

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgtaggaag tcatggcgag aagtcatctg cagccagacg ctgttccgtc tcaaacttgg 60

ttcttcttca ggtaggccag ctcagcgtac tgatttcctc gtgaaccagg cttcagcatc 120

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagcgagagt ggcagaggac ctttgtcgtt ggttagctgg catattgctg acgtacgtca 60

gagcgcccct aagtttttaa aagattgcag ggtgttttcg ggccaatagt gtcttggtag 120

<210> 6

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acaatgacat ctaggtctcc ctggtagagg aagtcgatgt caactgttca gacttctatc 60

cctcttgaga atgcatgcat tttcagtggc tgattggcac ttaccatggg tcctcaataa 120

<210> 7

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcgcaattct tatgcgactc tgtcatggag acagtcatgt gtatttccag cttcaacttc 60

ccatcaatat agctggcatt ttgtgcagca atgtatttcc tacttgaacc atcaggcatc 120

<210> 8

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caagcactgt tgaagcagga acggctatgg ggaaattagc aaaccccaac atgcatgcac 60

atcccaagac ctcaaagaca cggcacttaa ggaatctgga acagccacac cttagtatac 120

cagactctgg attcagagtc agctagactg aaccattgga 160

Claims

1.检测FTH1基因或FTH1基因编码的mRNA或FTH1基因编码的蛋白质的物质在制备预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述FTH1为循环肿瘤细胞内的FTH1。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述循环肿瘤细胞为上皮间质转化型循环肿瘤细胞。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述物质为检测FTH1基因或FTH1基因编码的mRNA或FTH1基因编码的蛋白所需的试剂和/或仪器。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测FTH1基因编码的mRNA所需的试剂包括检测FTH1基因编码的mRNA所使用的探针。

6.一种预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的产品，其包含a)和b)；

a)检测FTH1基因或FTH1基因编码的mRNA或FTH1基因编码的蛋白质的物质；

b)检测循环肿瘤细胞的亚型的物质；

优选地，所述亚型为上皮间质转化型。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述FTH1为循环肿瘤细胞内的FTH1；所述循环肿瘤细胞优选为上皮间质转化型的循环肿瘤细胞。

8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述物质为检测FTH1基因或FTH1基因编码的mRNA或FTH1基因编码的蛋白所需的试剂和/或仪器。

9.一种用于预测乳腺癌新辅助化疗疗效的系统，包括：

表达定量装置，用于确定FTH1的表达量；

结果输出装置，用于输出评估结果。

10.FTH1作为标志物在开发预测非转移性乳腺癌新辅助化疗疗效的产品中的应用；优选地，所述FTH1为循环肿瘤细胞内的FTH1；所述循环肿瘤细胞优选为上皮间质转化型循环肿瘤细胞。