CN114642768B - 一种调控巨噬细胞极化和免疫功能的材料及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种调控巨噬细胞极化和免疫功能的材料及其应用，具体公开了一种具有抑制促炎作用的颗粒晶体涂层，所述颗粒晶体涂层由微球和微纳球通过在基底表面自组装制成；所述的微纳球包含至少一种粒径的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微纳球；所述的微球选自氧化无机微球或聚合物有机微球；微球的粒径为1μm‑6μm；微纳球的粒径选自50nm‑500nm。本发明提供了一种抑制巨噬细胞极化的颗粒晶体涂层表面，并利用颗粒自组装技术通过调整颗粒种类及比例得到大量表面形貌组合，利用这些表面组合可以用来进行表面形貌的高通量筛选。

Description

一种调控巨噬细胞极化和免疫功能的材料及其应用
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种调控巨噬细胞极化和免疫功能的材料及其应用。
背景技术
生物植入材料是现代医学疗法的重要组成部分，虽然植入材料在功能和复杂程度上都有明显改进，但人体对植入材料的反应依然会影响植入的成功率和植入材料的寿命。生物材料在植入人体时可能引发异物反应(Foreign Body Response，FBR)，异物反应开始于手术植入的组织损伤，接着免疫细胞浸润并激活，最后形成纤维囊并隔离植入物，阻止植入材料与组织整合，最终导致植入失败[1]。因此，为了提高植入成功率并延长植入物使用寿命，必须减弱异物反应。
巨噬细胞是一类具有具有吞噬作用的白细胞，存在于人体各类组织中，可以被募集并贴附在植入材料表面，通过调控其他细胞如淋巴细胞(Lymphocytes),内皮细胞(Endothelial cells)和成纤维细胞(Fibroblasts)的功能来调控宿主对植入物的反应[2]。巨噬细胞可以在植入物周围互相融合，形成由多数巨噬细胞质膜包围刺激物的异物巨细胞(Foreign Body Giant Cells，FBGC)，标志着异物反应的开始[3]。此外，巨噬细胞包含多种细胞类群，可以分泌多种化学趋化因子和细胞因子来协调组织修复，包括募集和激活其它免疫细胞，控制炎症反应，清除细胞碎片和促进血管再生[3,4]。为了行使这些不同的功能，它们可以在不同的微环境中极化成不同的表型。如在细菌内毒素(lipopolysaccharide，LPS)和干扰素的刺激下，巨噬细胞会向M1型极化，分泌促炎因子(如TNF-α，IL1β，IL6)来抗感染，相反，在组织修复的环境中，它们可以向M2型极化，分泌抗炎因子(如IL10)来促进组织修复[5]。巨噬细胞在识别外来材料并激活免疫反应这一过程中起到关键作用，控制巨噬细胞和生物材料间的相互作用是调控植入材料免疫反应的关键。
通常生物材料的化学组成被认为是细胞粘附和免疫细胞响应的因素，而最新的研究表明，材料的大小，形状，表面形貌也在免疫反应过程中起主导作用[6]。
目前利用表面形貌调控巨噬细胞的手段主要有三种，分别为微纳米沟槽结构，纳米柱状凸起和无规则的粗糙表面。微纳米沟槽结构的制备主要利用电化学蚀刻技术，可以在金属材料表面制成规则整齐的纳米沟槽，宽度在250nm-5μm范围内，小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophages，BMDM)在该微纳结构上会被拉长，并向抗炎表型极化[7]。纳米柱状凸起的制备利用热塑翻印技术，以铂为基础，加入磷、镍、铜制成合金，利用具有纳米孔洞的Al2O3为模板，将合金在540K的温度下以10kN的力压在Al2O3模板上，然后用30％KOH溶液中取下模板，制成具有柱状凸起结构的的合金表面，在该表面培养的小鼠巨噬细胞会降低炎性因子的表达[8]。无规则的粗糙表面利用酸蚀刻技术在合金表面形成不规则的粗糙结构，在该表面上培养的小鼠巨噬细胞与光滑表面上的细胞比具有更大的表面积，与半乳糖凝集素(galectin-3)协同作用可以影响巨噬细胞的极化[9]。
现有技术虽然已有用表面形貌调控巨噬细胞的方法，但是主要针对合金材料，利用蚀刻技术或热塑法在合金表面形成不同的微纳结构，此类方法未涉及其他高分子生物材料表面形貌的制备；且现有技术制备方法较复杂，不利于大批量制备，并且制备期间会引入较多的其他化学组分，可能对细胞或机体造成不利影响。此外，现有技术制备的表面材料对巨噬细胞的作用效果较弱。
参考文献：
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发明内容
针对上述缺点，本发明利用颗粒自组装涂层(colloidal Self-AssembledPatterns，cSAPs)来对表面进行修饰，基底可以是金属，玻璃或者其他高分子材料，不需要复杂的制备方法，不引入无关的化学组分，在基底上可快速形成具有规则有序的微纳米表面结构，以巨噬细胞为研究对象，开发降低巨噬细胞免疫反应的表面形貌，从而降低植入材料的异物反应，提高生物相容性。
本发明一个方面提供了一种具有抑制促炎作用的颗粒晶体涂层，所述颗粒晶体涂层由微球和微纳球通过在基底表面自组装制成；
所述的微纳球包含至少一种粒径的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微纳球；
所述的微球选自氧化无机微球或聚合物有机微球；
微球的粒径为1μm-6μm，优选为2μm-5μm；
微纳球的粒径选自50nm-500nm；优选为60nm-400nm。
在本发明的技术方案中，氧化无机微球选自二氧化硅微球，聚合物有机微球选自聚苯乙烯微球、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球。
在本发明的技术方案中，所述微球和微纳球数量的比例为1:3000-70000。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为4.8μm-5.2μm的二氧化硅微球和粒径为60-400nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为5μm的二氧化硅微球和粒径为400nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成，二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球的数量比为1：3000-3500。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为5μm的二氧化硅微球和粒径为110nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成，二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球的数量比为1：150000-160000。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为5μm的二氧化硅微球和粒径为68nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成，二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球的数量比为1：660000-670000。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为1.8μm-2.2μm的二氧化硅微球和粒径为60-110nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为2μm的二氧化硅微球和110nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成，二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球的数量比为1：9000-11000。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为2μm的二氧化硅微球和粒径为65nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成，二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球的数量比为1：40000-50000。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为4.8μm-5.2μm的二氧化硅微球和粒径为350-450nm的聚甲基丙烯酸甲酯微纳球和粒径为350-450nm的聚苯乙烯微纳球通过在基底表面自组装制成。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为5μm的二氧化硅微球、粒径为400nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球和粒径为400nm的聚苯乙烯微纳球通过在基底表面自组装制成；二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球以及聚苯乙烯微纳球的之间的数量比为1:3000-4000:3500-4500。
本发明另一个方面提供了一种细胞培养的容器，所述容器中与细胞接触的表面具有本发明上述的颗粒晶体涂层的表面。
在本发明的技术方案中，所述的容器种类选自细胞培养皿、细胞培养板、细胞爬片。
本发明另一个方面提供了一种生物材料，所述生物材料具有本发明上述的颗粒晶体涂层的表面。
在本发明的技术方案中，所述生物材料选自关节植入物、组织假体、血管支架、导管、皮肤敷料。
本发明另一个方面提供了抑制巨噬细胞向促炎方向极化的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到LPS促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤。
本发明另一个方面提供了促进巨噬细胞向促修复方向极化的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到LPS促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤。
本发明另一个方面提供了稳定巨噬细胞表型的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到LPS促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤。
在本发明的技术方案中，促进巨噬细胞向促炎方向进行的刺激选自任意已知促进巨噬细胞向M1方向进行极化化学、物理或生物刺激。例如采用极化干扰素-γ(γ-IFN)或脂多糖(LPS)刺激。
本发明另一个方面提供了抑制巨噬细胞释放促炎反应的细胞因子或效应因子的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤；所述细胞因子选自IL-6、IL-1、TNFα，效应因子选自iNOS、细胞表面蛋白TLR4或胱天蛋白酶4。
本发明另一个方面提供了促进巨噬细胞释放抑制炎症细胞因子的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤；所述细胞因子选自IL-10。
本发明另一个方面提供了抑制炎症引起的巨噬细胞焦亡的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤。
在本发明的技术方案中，所述想促炎方法极化指巨噬细胞向M1方向极化。促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激指促进巨噬细胞向M1方向极化的物理、化学或生物方法，例如采用极化干扰素-γ(γ-IFN)或脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞。
本发明再一个方面提供了一种制备调控巨噬细胞的表面的方法，所述方法包括在基底上形成上述颗粒晶体涂层的步骤。
进一步地，上述方法包含以下步骤：
1)配制二氧化硅微球与微纳球的分散液；
2)将分散液分散在基底表面，并使二氧化硅微球与微纳球在重力沉降作用下聚集在基板表面，并自然挥发溶剂，得到颗粒晶体涂层。
优选地，还包括步骤3)利用乙醇和甲苯混合溶剂使颗粒晶体涂层更加贴合于基底表面；并加热烘干。
本发明再一个方面提供了上述颗粒晶体涂层的用途，所述用途为用于制备抑制炎性反应的植入物的用途。
本发明通过颗粒自组装方法，快速实现多种表面物理形貌的构建，通过筛选不同的组合，研究其对鼠源和人源巨噬细胞炎症相关基因的表达调控以及炎症因子分泌的影响。最终，此表面涂层主要可用于抗炎，并作为未来生物材料表面修饰的一大利器。
有益效果
1)与现有的表面形貌制备方法(蚀刻法和翻印发)相比，本发明利用颗粒自组装技术通过调整颗粒种类及比例得到大量表面形貌组合，利用这些表面组合可以用来进行表面形貌的高通量筛选，找到对巨噬细胞炎性反应最敏感的表面。
2)该方法不引入其他化学成分，无化学残留风险。制备出的表面形貌应用于生物材料，可提高生物材料的抗炎效果，降低异物反应，提高生物相容性。
3)本发明的产品制备方法简单，制备原料经济且其不需要苛刻的保存条件，更有利于商品化。
附图说明
图1为cSAPs的表征分析，扫描电子显微镜(SEM)结果。
图2为部分cSAPs表面粗糙度和亲疏水结果。
图3为CCK8测量细胞增殖结果。
图4为RAW264.7细胞在LPS刺激后NO释放结果。
图5为RAW264.7细胞在LPS刺激后细胞免疫荧光染色后细胞形态图。
图6为cSAPs上RAW264.7细胞SEM图。
图7为RAW264.7细胞在cSAPs上的基因表达情况。
图8为人单核细胞THP-1分化的巨噬细胞在cSAPs上的细胞形态图。
图9为人单核细胞THP-1分化的巨噬细胞在cSAPs上的基因表达情况。
图10为本发明的实验分析流程示意图。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本发明一些具体实施例提供了一种具有抑制促炎作用的颗粒晶体涂层，所述颗粒晶体涂层由微球和微纳球通过在基底表面自组装制成；
所述的微纳球包含至少一种粒径的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微纳球；
所述的微球选自氧化无机微球或聚合物有机微球；
微球的粒径为1μm-6μm，优选为2μm-5μm；
微纳球的粒径选自50nm-500nm；优选为60nm-400nm。
在本发明的一些实施例中，氧化无机微球选自二氧化硅微球，聚合物有机微球选自聚苯乙烯微球、聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球。
在本发明的一些实施例中，所述微球和微纳球数量的比例为1:3000-70000。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为4.8μm-5.2μm的二氧化硅微球和粒径为60-400nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为5μm的二氧化硅微球和粒径为400nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成，二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球的数量比为1：3000-3500。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为5μm的二氧化硅微球和粒径为110nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成，二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球的数量比为1：150000-160000。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为5μm的二氧化硅微球和粒径为68nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成，二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球的数量比为1：660000-670000。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为1.8μm-2.2μm的二氧化硅微球和粒径为60-110nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为2μm的二氧化硅微球和110nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成，二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球的数量比为1：9000-11000。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为2μm的二氧化硅微球和粒径为65nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成，二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球的数量比为1：40000-50000。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为4.8μm-5.2μm的二氧化硅微球和粒径为350-450nm的聚甲基丙烯酸甲酯微纳球和粒径为350-450nm的聚苯乙烯微纳球通过在基底表面自组装制成。在一个更优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层由粒径为5μm的二氧化硅微球、粒径为400nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球和粒径为400nm的聚苯乙烯微纳球通过在基底表面自组装制成；二氧化硅微球和聚甲基丙烯酸甲酯微纳球以及聚苯乙烯微纳球的之间的数量比为1:3000-4000:3500-4500。
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层表面粗糙度为100nm-300nm
在本发明一个优选的实施例中，所述颗粒晶体涂层表面的为亲水表面，优选地，接触角小于70°，更优选为50°-70°。
本发明一些实施例提供了一种细胞培养的容器，所述容器中与细胞接触的表面具有本发明上述的颗粒晶体涂层的表面。
在本发明的一些实施例中，所述的容器种类选自细胞培养皿、细胞培养板、细胞爬片。
本发明一些实施例提供了一种生物材料，所述生物材料具有本发明上述的颗粒晶体涂层的表面。
在本发明的技术方案中，所述生物材料选自关节植入物、组织假体、血管支架、导管、皮肤敷料。
本发明一些实施例提供了抑制巨噬细胞向促炎方向极化的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向M1方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤。
在本发明一些优选的实施例中，所述的向促炎方向极化为巨噬细胞向M1方向极化。
本发明的一些实施例提供了促进巨噬细胞向促修复方向极化的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向M1方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤。
在本发明一些优选的实施例中，所述的向促修复方向极化为巨噬细胞向M2方向极化。
本发明的一些实施例提供了稳定巨噬细胞形态的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向M1方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤。
在本发明的一些实施例中，促进巨噬细胞向M1方向进行的刺激选自任意已知促进巨噬细胞向M1方向进行极化化学、物理或生物刺激。例如采用极化干扰素-γ(γ-IFN)或脂多糖(LPS)刺激。
本发明的一些实施例提供了抑制巨噬细胞释放促炎反应的细胞因子或效应因子的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向M1方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤；所述细胞因子选自IL-6、IL-1β、TNFα，效应因子选自iNOS、细胞表面蛋白TLR4或胱天蛋白酶4(CASP4)。
本发明的一些实施例提供了促进巨噬细胞释放抑制炎症细胞因子的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向M1方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤；所述细胞因子选自IL-10。
本发明的一些实施例提供了抑制炎症引起的巨噬细胞焦亡的方法，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向M1方向进行极化的刺激前，先与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤。
在本发明的技术方案中，所述的与本发明上述颗粒晶体涂层接触的步骤是指，将巨噬细胞在颗粒晶体涂层进行孵育、培养或增值的步骤。
本发明的一些实施例提供了一种制备调控巨噬细胞的表面的方法，所述方法包括在基底上形成上述颗粒晶体涂层的步骤。
进一步地，上述方法包含以下步骤：
1)配制二氧化硅微球与微纳球的分散液；
2)将分散液分散在基底表面，并使二氧化硅微球与微纳球在重力沉降作用下聚集在基板表面，并自然挥发溶剂，得到颗粒晶体涂层。
优选地，还包括步骤3)利用乙醇和甲苯混合溶剂使颗粒晶体涂层更加贴合于基底表面；并加热烘干。
本发明的一些实施例提供了上述颗粒晶体涂层的用途，所述用途为用于制备抑制炎性反应的植入物的用途。
实施例1自组装颗粒(cSAPs)表面的形貌的制备与表征分析
cSAPs的制备过程为分别将不同大小的无机微米级大颗粒和有机微纳级小颗粒组合混合于超纯水(18.2MΩ)中，然后加入细胞培养皿中使之自组装制成多级结构表面。水溶液完全蒸发后，将培养皿置于96℃烘箱中1小时，冷却后利用1:3比例的乙醇：甲苯溶液使cSAPs固定并更加贴合于培养皿上，即完成cSAPs的制备。
使用的大颗粒为2μm及5μm的二氧化硅颗粒(SiO2)，微纳球为0.065μm、0.1μm、0.2μm及0.4μm的聚苯乙烯(PS)；0.068μm、0.1μm及0.4μm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，0.065μm、0.1μm、0.2μm及0.4μm的羧基化聚苯乙烯(PSC)等多聚物纳米颗粒。编号以及采用的颗粒种类和数量如下表所示：
Figure BDA0002846034010000091
Figure BDA0002846034010000101
其自组装过程分为三个阶段：
第一阶段为颗粒在溶液中的沉降过程，颗粒在混合溶液中是一种无序状态，进入培养皿中静置后在重力作用下大颗粒先沉降到底部排列；
随着水溶液的挥发，溶液的减少使小颗粒与大颗粒接触，在这一过程中颗粒表面电荷相互作用，防止小颗粒聚集；
最后小颗粒填充在大颗粒周围形成多级结构材料。
在10-15nm金涂层后，使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)在20keV下分析cSAPs的表面结构。
使用扫描电子显微镜(SEM)分析cSAPs和对照(即空白孔板)的表面性质，结果见图1。cSAPs的表面形貌是局部高度有序的，形成了多级结构。
对部分cSAPs进行表面粗糙度和亲疏水测量，发现cSAP3表面粗糙度为300nm左右，水接触角为63°左右，cSAP10表面粗糙度为100nm左右，水接触角为52°左右，二者与TPC表面比(Flat，表面(水接触角70°)相比较小，表现较为亲水，结果见图2。
实施例2鼠源巨噬细胞样细胞RAW264.7的培养和增殖实验
鼠源巨噬细胞样细胞RAW264.7来源为中科院上海生物细胞所，采用含10％新生牛血清(Gibco)、DMEM高糖培养基(Gibco)于37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱中贴壁培养。细胞贴壁密度为70-80％时，将细胞轻轻吹打下来，以4×104cell/cm2的密度传代至新的培养皿中。
利用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)测定细胞增殖
将cSAPs分别制备在96孔板中，将1×104cell/孔的密度的RAW264.7细胞种于该96孔板中，置于37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱培养24小时后，一组加入200ng/mL内毒素刺激，另一组不做刺激，再培养24h，弃去原来的培养液，每个孔加入新的培养液200μL和20μLCCK-8试剂，置于培养箱孵育1小时后，用酶标仪于450nm波长处测吸光值。
实验结果见图3，实验结果显示RAW264.7细胞在不同表面上增殖速率一致，说明cSAPs对巨噬细胞增殖无明显影响。
实施例3鼠源巨噬细胞样细胞RAW264.7刺激后细胞形态一氧化碳释放，基因转录以及蛋白表达情况
RAW264.7细胞以2.5×104cell/cm2的密度接种在不同cSAPs表面，24h后加入200ng/mL内毒素(LPS)刺激，再过24h后分析细胞形态、一氧化碳释放，基因转录以及蛋白表达情况。
一氧化氮(NO)测量
利用2N盐酸配制4％(w/w)磺胺和0.4％(w/w)萘基乙烯基二胺，取上述接种培养细胞RAW264.7的培养基150μL与50μL磺胺溶液混合，静置10min，加入50μL萘基乙烯基二胺溶液，静置10min。用酶标仪于540nm波长处测吸光值。
实验结果见图4，实验结果显示在cSAP1/2/3/10/11/17上培养的RAW264.7的NO生成量相对TCP下降，且存在显著性差异(***)，说明cSAP1/2/3/10/11/17能抑制NO的释放，抑制巨噬细胞向M1极化。
免疫荧光法观察细胞形态
上述培养的细胞用PBS冲洗，使用4％多聚甲醛固定15分钟，再用PBS冲洗，接着使用0.1％Triton X-100透化处理细胞，PBS冲洗后用phalloidin–TRITC及DAPI(1:1000稀释)双染色4℃孵育，24小时后在荧光显微镜下观察并拍照。
实验结果见图5，结果显示在LPS刺激的环境下，TCP和cSAP4上的巨噬细胞形态拉长，cSAP1/2/3/10上培养的RAW264.7形态接近未进行LPS刺激的对照组，说明cSAP1/2/3/10可以稳定RAW264.7的细胞形态。通常认为巨噬细胞的形状与其极化以及促炎或促修复方向相关，对比cSAP1/2/3/10与TCP和cSAP4的LPS刺激后的细胞形态照片可知，TCP和cSAP4组中的细胞呈现梭型，两端出现伪足，显示了其更倾向于向M1极化，而cSAP1/2/3/10组中的细胞依然保持圆球状，实验结果说明，本发明的表面cSAP1/2/3/10具有抑制LPS诱导的巨噬细胞的M1极化。
扫描电镜观察细胞形态
通过扫描电镜观察上述细胞TCP和cSAP4/10组的细胞，实验结果见图6，在LPS刺激的环境下，TCP和cSAP4上的巨噬细胞形态拉长，cSAP10上培养的RAW264.7形态接近未进行LPS刺激的对照组，该结果与荧光显微镜结果相同，cSAP10具有更强的稳定细胞形态的作用，抑制巨噬细胞向M1极化的作用。
基因转录水平
分别采用不同的培养板培养巨噬细胞，并加入LPS刺激。其中TCP组为采用普通细胞培养板培养，TCP+DEX为采用普通培养板且加入地塞米松抑制炎性反应组，PMMA组指采用PMMA微球，且与本发明制备相同的方法制备具有PMMA微球表面的培养板组，Glass组为采用玻璃培养板培养巨噬细胞组。cSAP2/3/10/11组为分别采用以上表面覆盖的培养板培养细胞组。收集上述未LPS刺激前，以及LPS刺激后的细胞，用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录成cDNA，利用反转录后的cDNA进行实时定量荧光PCR。分析促炎因子iNOS基因、促炎因子IL-6基因基因转录情况。
实验结果见图7，在LPS刺激的环境下，cSAP2/3/10/11显著减低了促炎因子IL-6的表达，部分降低了iNOS的表达，说明cSAP2/3/10/11抑制巨噬细胞向M1极化。对比IL-6的转录情况可知，虽然地塞米松也可以降低促炎因子IL-6的释放，但是，远不及本发明的颗粒晶体涂层表面的效果。
实施例4实时定量荧光PCR检测人源巨噬细胞基因转录水平
人源单核细胞THP-1来源为ATCC细胞库，采用含10％新生牛血清(Gibco)、RIPM1640培养基(Gibco)于37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱中悬浮培养，细胞密度达到8×105cell/mL时稀释传代至新的培养皿中，传代后密度为3×105cell/mL。THP-1细胞加入50ng/mL PMA诱导分化为巨噬细胞，以1×105cell/cm2的密度分别接种在cSAPs表面以及PMMA，Glass和TCP表面，24h后加入200ng/mL内毒素刺激，在37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱中继续培养24h，利用相差显微镜拍照，接着将细胞用PBS冲洗，收集细胞用RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录成cDNA，利用反转录后的cDNA进行实时定量荧光PCR。分析促炎因子iNOS基因、抗炎因子IL-10基因、Toll样受体-4(TLR4)和细胞凋亡相关蛋白酶(Capase4)基因转录情况。
实验结果见图8，结果显示在LPS刺激的环境下，TCP和cSAP4上的巨噬细胞形态拉长，cSAP/2/3/10/11上培养的THP-1形态接近未进行LPS刺激的对照组，说明cSAP/2/3/10/11可以稳定THP-1的细胞形态。通常认为巨噬细胞的形状与其极化以及促炎或促修复方向相关，对比cSAP/2/3/10/11与PMMA、Glass以及TCP表面的LPS刺激后的细胞形态照片可知，PMMA、Glass以及TCP组中的细胞呈现梭型，两端出现伪足(黑色箭头标示)，显示了其更倾向于向M1极化，而cSAP/2/3/10/11组中的细胞依然保持圆球状，实验结果说明，本发明的表面cSAP/2/3/10/11具有抑制LPS诱导的巨噬细胞的M1极化，这与小鼠巨噬细胞RAW264.7在cSAPs上培养的表现一致。
实验结果见图9，结果显示在LPS刺激的环境下，在所有cSAPs1-10表面培养的巨噬细胞显著减低了促炎因子iNOS基因转录。所有cSAPs1-10表面培养的巨噬细胞明显增加了抗炎因子IL-10的转录(其中cSAP1/2/3/7增加最多，具有显著性差异)。说明所有cSAPs1-10具有显著的抑制巨噬细胞iNOS蛋白的表达的作用，进而有效降低一氧化氮产生量，这与鼠源巨噬细胞结果吻合。说明本发明的自组装颗粒可以有效抑制巨噬细胞向M1极化，具有优异的抑制促炎作用。同时，IL-10是巨噬细胞向M2方向极化的重要指标，证明本发明的自组装颗粒不仅抑制了巨噬细胞向M1方向的极化，而且还促进了巨噬细胞向M2方向极化的作用，进而实现促进组织修复再生的用途。
cSAP1/2/3/9/10显著降低了Toll样受体-4(TLR4)和细胞凋亡蛋白酶Caspase 4基因转录，说明cSAP1/2/3/10有显著的抗炎作用并且能抑制炎症引起的细胞焦亡。
综合上述结果可以得出，cSAP3/10可以有效抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7和人源单核细胞THP-1分化巨噬细胞的炎症反应，是最具有潜力的抗炎表面形貌。

Claims (12)

1.一种具有抑制促炎作用的颗粒晶体涂层，其特征在于，所述颗粒晶体涂层由微球和微纳球通过在基底表面自组装制成；
所述的微纳球包含至少一种粒径的聚甲基丙烯酸甲酯微纳球；
所述的微球选自氧化无机微球或聚合物有机微球；
所述颗粒晶体涂层由粒径为4.8μm-5.2μm的二氧化硅微球和粒径为60-400nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成；
或者所述颗粒晶体涂层由粒径为1.8μm-2.2μm的二氧化硅微球和粒径为60-110nm聚甲基丙烯酸甲酯微纳球通过在基底表面自组装制成；
或者所述颗粒晶体涂层由粒径为4.8μm-5.2μm的二氧化硅微球和粒径为350-450nm的聚甲基丙烯酸甲酯微纳球和粒径为350-450nm的聚苯乙烯微纳球通过在基底表面自组装制成。
2.一种细胞培养的容器，其特征在于，所述容器中与细胞接触的表面具有权利要求1所述的颗粒晶体涂层的表面。
3.根据权利要求2所述的容器，其特征在于，所述的容器种类选自细胞培养皿、细胞培养板、细胞爬片。
4.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料具有权利要求1所述的颗粒晶体涂层的表面。
5.权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料选自关节植入物、组织假体、血管支架、导管、皮肤敷料。
6.一种抑制巨噬细胞向促炎方向极化的方法或者促进巨噬细胞向促修复方向极化的方法，其特征在于，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与权利要求1所述的颗粒晶体涂层接触的步骤。
7.一种稳定巨噬细胞形态的方法，其特征在于，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与权利要求1所述的颗粒晶体涂层接触的步骤。
8.抑制巨噬细胞释放促炎反应的细胞因子或效应因子的方法，其特征在于，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与权利要求1所述的颗粒晶体涂层接触的步骤；所述细胞因子选自IL-6、IL-1、TNF，效应因子选自iNOS、细胞表面蛋白TLR4或胱天蛋白酶4。
9.促进巨噬细胞释放抑制炎症的细胞因子的方法，其特征在于，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与权利要求1所述的颗粒晶体涂层接触的步骤；所述细胞因子选自IL-10。
10.抑制炎症引起的巨噬细胞焦亡的方法，其特征在于，所述方法包括在巨噬细胞受到促进巨噬细胞向促炎方向进行极化的刺激前，先与权利要求1所述的颗粒晶体涂层接触的步骤。
11.权利要求1所述的颗粒晶体涂层的用途，其特征在于，所述用途为用于制备抑制炎性反应的植入物的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，所述植入物选自关节植入物、组织假体、血管支架、导管、皮肤敷料。
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