CN114641582A - 用于确定肿瘤的侵袭和/或转移潜力的方法 - Google Patents

用于确定肿瘤的侵袭和/或转移潜力的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114641582A
CN114641582A CN202080076313.9A CN202080076313A CN114641582A CN 114641582 A CN114641582 A CN 114641582A CN 202080076313 A CN202080076313 A CN 202080076313A CN 114641582 A CN114641582 A CN 114641582A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ran
marker
sample
biomarker
tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080076313.9A
Other languages
English (en)
Inventor
穆罕默德·埃尔-塔纳尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Bradford
Original Assignee
University of Bradford
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Bradford filed Critical University of Bradford
Publication of CN114641582A publication Critical patent/CN114641582A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96486—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • G01N2333/96491—Metalloendopeptidases (3.4.24) with definite EC number
    • G01N2333/96494—Matrix metalloproteases, e. g. 3.4.24.7
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供了用于确定受试者中肿瘤状态的方法，包括以下步骤：(i)确定取自受试者的样品中第一生物标志物的定量值，所述第一生物标志物选自由Ran、Ran结合蛋白1、Ran蛋白的活性片段、编码Ran的核酸序列、编码Ran结合蛋白1的核酸序列、编码Ran的活性片段的核酸序列和编码Ran结合蛋白1的活性片段的核酸序列组成的组；(ii)将样品中第一生物标志物的定量值与第一生物标志物的选定的预定阈值进行比较；(iii)确定来自同一受试者的样品中选自由MMP2、MMP2的活性片段、编码MMP2的核酸序列和编码MMP2的活性片段的核酸序列组成的组的第二生物标志物的定量值；(iv)将样品中第二生物标志物的定量值与第二生物标志物的选定的预定阈值进行比较；其中样品中第一标志物和第二生物标志物的定量值与它们各自的选定的预定阈值的比较指示肿瘤样品是否具有侵袭和/或转移潜力。

Description

用于确定肿瘤的侵袭和/或转移潜力的方法
本发明总体上涉及用于确定人体或动物体的癌症的转移风险的方法。本发明具体地但不排外地涉及用于从取自人体或动物体的样品确定肿瘤的转移和/或侵袭潜力的方法。然而，它还涉及一种用于从样品确定转移的风险和转移潜力并监测从手术切除肿瘤后的人体或动物体中取出的转移潜力的方法。
RAN是RAS癌基因家族的成员，是编码GTP结合核蛋白Ran的基因。对GEO乳腺癌数据集(200例患者(GSE2034))的分析指示，高水平的Ran与具有PIK3CA突变基因标志的患者的较短的生存期显著相关(P＝0.018)，但与具有PIK3CA野生型基因标志的患者的较短的生存期无显著相关(P＝0.186)；Yuen H-F.等人，于J Natl Cancer Inst.2013,105,475-488和Yuen H-F.等人，于Clin Cancer Res.2012,18,380-391)。其原发肿瘤具有较高百分比的Ran染色恶性细胞核的乳腺癌患者比具有小于1％的Ran染色恶性细胞核的乳腺癌患者具有更短的中位生存期(P<0.001)(Yuen H-F.等人，于JNatl Cancer Inst.2013,105,475-488和Yuen H-F.等人，于Clin Cancer Res.2012,18,380-391)。还已知，肺癌患者中较高水平的Ran与较短的生存期显著相关。RAN基因过表达在许多癌症中被观察到，并且这种过表达已经与患者预后不良关联。例如，RAN过表达已经显示与癌细胞在体外和体内的侵袭性增加有关(Kurisetty W.等人,于Oncogene 2008,27(57),7139-7149)，即，观察到RAN过表达的癌细胞生长迅速，并显示出高转移潜力。相比之下，通过siRNA或shRNA使RAN沉默降低了体外细胞粘附、迁移和侵袭以及体内转移。此外，本发明的发明人之一已经在EP2082225B1中描述了基于癌细胞中RAN过表达的测定用于预测癌症患者的生存的用途。
许多已知在人类癌症中过表达的其他蛋白包括c-Myc、c-Met和MMP2。c-Myc是一种人类原癌基因，在调节细胞生长中起重要作用。MMP2(基质金属蛋白酶-2)是，参与正常生理过程中细胞外基质(ECM)的分解的IV型胶原酶。MMP的表达和活性水平的改变与许多形式癌症的进展和转移密切相关。MMP2活性增加已经与多种形式癌症的不良预后关联(
Figure BDA0003622217590000021
M.和Koivunen E.于Bichimica et Biophysica Acta 2005)。还已知，Ran、c-Met、c-Myc和MMP2中的每一种与转移性乳腺癌造成的患者死亡独立地显著相关。
许多用于预测雌激素受体阳性和人类表皮生长因子受体2阴性(ER+ve/HER2-ve)乳腺癌转移风险的测定(Oncogene
Figure BDA0003622217590000022
和
Figure BDA0003622217590000023
)已被批准在英国临床使用。这些未被批准用于任何其他癌症或事实上任何其他乳腺癌亚型的测定是基于ER+ve/HER2-ve肿瘤细胞内一系列基因水平的确定，以及与ER+ve/HER2-ve乳腺癌患者的历史患者队列中的水平进行比较，这些患者与未发生转移的患者统计学相关。
这种相关性表现为负百分率响应(NPR)，可以提供患者不会继续发展为转移的高置信度，并可能意味着患者可以避免手术、化疗或放疗等使人虚弱的癌症治疗。
尽管这些测定的NPR高于90％和甚至约95％，但仍需要改进的测定来预测ER+ve/HER2-ve乳腺癌患者的转移风险。还需要可靠的测定来预测其他癌症患者，尤其是ER+ve/HER2-ve乳腺癌以外的乳腺癌患者或卵巢癌、结肠癌或肺癌患者的转移风险。
对于诊断为ER+ve/HER2-ve乳腺癌或其他癌症的患者，即使提供略微高的NPR的测定也可能非常重要，因为知晓该癌症不具有侵袭和/或转移潜力可能意味着患者可以避免使人虚弱的癌症治疗，诸如手术、化疗或放疗，否则该患者可能已经进行了这样的癌症治疗。
本发明的新发现是Ran参与含有c-Met、c-Myc和MMP2的细胞信号传导通路，并且这与培养的细胞的转移特性增加有关。发明人还已经发现，与死于转移性疾病的风险较低的乳腺癌患者的肿瘤中的c-Met、c-Myc和MMP2水平相比，死于转移性疾病的风险较高的乳腺癌患者的肿瘤中的Ran、c-Met、c-Myc和MMP2水平增加了5倍和10倍之间。还已经发现，在涉及Ran过表达的乳腺癌中，患者的生存与Ran水平和MMP2水平比与单独Ran水平有更好的相关性。
因此，本发明有利地提供了可以确定肿瘤状态的简单测定，包括预测不仅ER+ve/HER2-ve乳腺癌的转移风险，而且其他癌症，包括其他乳腺癌亚型的转移风险。在所有乳腺癌亚型中，这些测定可以提供大于或等于97％的NPR，例如97.5％或98％或甚至更多(以及其间的任何数值和小数)。
在本发明的第一方面中，提供了一种用于确定受试者中肿瘤状态的方法，包括以下步骤：
(i)确定取自受试者的样品中第一生物标志物的定量值，第一生物标志物选自由Ran、Ran结合蛋白1、Ran蛋白的活性片段、编码Ran的核酸序列、编码Ran结合蛋白1或其衍生物的核酸序列、编码Ran的活性片段或其衍生物的核酸序列和编码Ran结合蛋白1的活性片段的核酸序列组成的组；
(ii)将样品中第一生物标志物的定量值与第一生物标志物的选定的预定阈值进行比较；
(iii)确定样品中第二生物标志物的定量值，第二生物标志物选自由MMP2、MMP2的活性片段、编码MMP2或其衍生物的核酸序列、编码MMP2的活性片段或其衍生物的核酸序列和编码MMP2蛋白的活性片段的核酸组成的组；
(iv)将样品中第二生物标志物的定量值与第二标志物的选定的预定阈值进行比较；
其中样品中第一生物标志物和第二生物标志物的定量值与它们各自的选定的预定阈值的比较指示肿瘤样品是否具有侵袭和/或转移潜力。
本文提及“肿瘤状态”包括初步诊断、监测手术后和/或化疗或放疗期间的转移、一组癌症受试者的分层和/或预测生存概率。
本文提及“定量值”包括从受试者获得的样品中表达第一和第二生物标志物的细胞数量、从样品获得的生物样品中表达第一和第二生物标志物的细胞的水平或能够确定从受试者获得的生物样品中第一和第二生物标志物的定量值/水平的任何其他方法。
“生物样品”是可能包含第一和第二生物标志物二者的生物样品或生物材料。生物材料可以来源于通过本领域普通技术人员熟知的标准方法从癌症患者取出的任何生物来源。
本文提及“样品”包括从以下任何一个或更多个来源获得的样品：实体肿瘤活检、液体肿瘤活检、肿瘤细胞、血液中的循环肿瘤细胞和血浆中的循环肿瘤细胞。它还包括从体液诸如血清、血浆、血液、淋巴、滑膜、胸膜、腹膜或脑脊液、粘液、胆汁、尿液、唾液、眼泪和汗液获取的样品。应当理解，本发明的方法涵盖从上述生物来源之一获取样品并定量测量第一生物标志物，并进行第一定性确定，并且第二生物标志物的定量确定可以从相同或不同的生物来源进行，但总是从相同的个体和同期(contemporaenously)进行。因此，例如但不限于，第一生物标志物定量值可以作为实体肿瘤中的细胞数量来测量，而第二生物标志物可以作为血浆中的循环水平来定量测量。因此，第一生物标志物的定量测量可以通过与第二生物标志物不同的定量方法来确定。因此，第一生物标志物的定量值可以通过细胞数量来确定，而第二生物标志物可以通过循环血浆水平来定量评价。所有这样的排列都被涵盖在本发明的精神中。
本文提及“同期”意味着，第一和第二生物标志物的样品可以同时(simultaneously)或在特定时间段内诸如数分钟、数小时、数天或数周内获取。应当理解，本发明的实质是，第一和第二生物标志物提供了优于每种生物标志物本身的改进的预测值，并且因此每种生物标志物的定量值应当在水平将处于几乎相同时间点的时间段内评估。
本文提及“生物标志物”或“标志物”是可互换的并且指一个过程、事件或状况的独特的生物指示物或生物衍生的指示物。预测性生物标志物是指可以在干预/治疗之前或回顾性地使用的生物标志物，以估计患者在特定治疗中的响应和/或生存。
本文提及“选定的预定阈值”是指一个截止值，低于该值，受试者患有具有转移/侵袭潜力的肿瘤的风险最小。与之相比，如果第一和第二生物标志物定量值中的任一或二者大于或高于阈值，则指示转移/侵袭潜力。
本文提及“参考值”是从具有转移性/侵袭性癌症的个体获得的定量值。参考值可以是第一和/或第二生物标志物的组织病理学评估中阳性染色细胞的数值，或者可以是体液中第一和/或第二生物标志物水平的表达水平。
本文提及“预测”是指预见一种状态或事件的行为，并且指发现个体具有显著提高或降低具有给定状态或经历某一事件的概率。
优选地，第一生物标志物的选定的预定阈值至少在样品中肿瘤细胞总数的0.5％和5.0％之间，例如1.0％或其间的任何其他整数。更优选地，该整数是样品参考值的至少1.0％。
优选地，第二标志物的阈值数目至少在样品参考值的总数的1％-10.0％之间，例如并且优选地至少5.0％。
在一种实施方案中，样品参考值是已知具有侵袭性和/或转移性肿瘤的受试者中表达第一和第二生物标志物的细胞数量。
优选地，免疫组织/免疫细胞化学地评估细胞数量，并通过手动细胞计数、自动细胞计数和/或间接细胞计数进行计数。例如，但不限于该方法包括手动细胞计数(计数室中的数量；计数铺板和CFU计数)；自动细胞计数(电阻、流式细胞术、图像分析和体视细胞计数)和；间接细胞计数(光度测量法或阻抗微生物学)。
在本发明的一些实施方案中，样品参考值是具有侵袭性和/或转移性肿瘤的受试者中第一和/或第二生物标志物的表达水平。
优选地，其中通过ELISA、免疫沉淀或免疫印迹来评估第一和第二生物标志物的表达水平。
优选地，当样品中第一标志物的定量值低于第一标志物的选定的预定阈值并且样品中第二标志物的定量值低于第二标志物的选定的预定阈值时，指示肿瘤不具有侵袭和/或转移潜力。
优选地，当样品中第一标志物的定量值高于第一标志物的选定的预定阈值并且样品中第二标志物的定量值高于第二标志物的选定的预定阈值时，指示肿瘤确实具有侵袭和/或转移潜力。
优选地，当样品中第一标志物的定量值低于第一标志物的选定的预定阈值并且第二标志物的定量值高于第二标志物的选定的预定阈值时，指示肿瘤可能具有侵袭和/或转移潜力，并且需要进一步监测。
优选地，当样品中第一标志物的定量值高于第一标志物的选定的预定阈值并且第二标志物的定量值低于第二标志物的选定的预定阈值时，指示肿瘤可能具有侵袭和/或转移潜力，并且需要进一步监测。
优选地，肿瘤选自包括人类乳腺癌，并且特别是雌激素受体阳性和人类表皮生长因子受体2阴性的乳腺癌细胞或三受体阴性乳腺癌(TRNBC)细胞的肿瘤的组。
优选地，肿瘤状态包括初步诊断后、监测手术后和/或化疗或放疗期间的转移、一组癌症受试者的分层和/或预测生存概率。
肿瘤的初步诊断包括确定肿瘤是否是真正癌性的，肿瘤是否是良性的或非癌性的生长，或者肿瘤是否是恶性的。
在本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，包含第一试剂和第二试剂，分别用于评估样品中第一标志物和第二标志物的水平。试剂盒还可以包含关于如何进行本发明的测定的说明。
试剂盒可用于确定受试者中的肿瘤是否具有侵袭和/或转移潜力的方法。
优选地，提供了如以上描述的试剂盒用于确定受试者中的肿瘤是否具有侵袭和/或转移潜力的用途。
在一些实施方案中，该方法可以通过对样品进行免疫组织化学(IHC)染色来确定表达第一标志物和第二标志物的肿瘤细胞的数量。
表达标志物的肿瘤细胞的选定的阈值数目是肿瘤细胞的一定百分数，低于该百分数的样品被认为不显著表达该标志物(阴性结果)，并且在该百分数或高于该百分数的样品被认为显著表达该标志物(阳性结果)。
如本文所用，表述“指示肿瘤细胞不具有侵袭或转移潜力”意味着，肿瘤细胞不是侵袭性的和/或转移性的(或不向侵袭性和/或转移性进展)的概率等于或大于90％，例如95％和优选地96％或更多，例如97％、98％、99％或100％。
在一种实施方案中，本发明提供了一种确定从受试者获得的样品是否在整个肿瘤样品中具有侵袭性和/或转移性的方法，通过首先进行染色，并通过与活检中细胞数量的预定阈值水平和染色的肿瘤细胞的截止数量进行比较来对标志物进行评分。
如本文所用，术语“肿瘤”意在与术语“癌症”可互换地使用，并指多细胞肿瘤以及个体赘生性细胞或赘生前细胞，并指包括但不限于以下的受试者中任何组织的原发和转移的实体瘤和癌二者：乳腺；结肠；直肠；肺；口咽；下咽；食道；胃；胰腺；肝脏；胆囊；胆管；小肠；尿路，包括肾脏、膀胱和尿路上皮；女性生殖道，包括子宫颈、子宫、卵巢(例如绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)；男性生殖道，包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤；内分泌腺，包括甲状腺、肾上腺和垂体；皮肤(例如血管瘤和黑色素瘤)、骨骼或软组织；血管(例如卡波西肉瘤)；脑、神经、眼睛和脑膜(例如星形细胞瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、神经鞘膜瘤和脑膜瘤)。
在另一实施方案中，本发明提供了一种用于确定受试者生存概率的方法。
在另一实施方案中，该方法提供一组受试者的分层，以当所确定的表达第一标志物的肿瘤细胞数量高于或低于表达第一标志物的细胞阈值数量并且所确定的表达第二标志物的肿瘤细胞数量低于表达第二标志物的肿瘤细胞阈值数量，指示肿瘤不具有侵袭和/或转移潜力时，鉴定受试者的亚组。
患者可区分为手术切除肿瘤后应当进行化疗或放疗的患者与不需要进行化疗或放疗的患者。
将理解，本发明的方法在体外、离体或计算机模拟执行。样品可以是取自人类或动物受试者的组织或细胞材料。在一些实施方案中，该方法可以从单个组织样品，并且特别是组织样品的一个或更多个部分确定第一标志物和第二标志物的水平。
在一些实施方案中，肿瘤是原发性和恶性癌症。在优选实施方案中，肿瘤是源自人类乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、脑癌、颈部癌、胰腺癌或结肠癌的原发性癌症。在特别优选的实施方案中，肿瘤是源自ER+ve/HER2-ve乳腺癌或三受体阴性乳腺癌(TRNBC)的原发性癌症。
本领域技术人员将知道用于确定样品中每种标志物表达的合适试剂、抗体和方案。
在一些实施方案中，通过检测编码Ran或Ran结合蛋白1的转录的多核苷酸(或其部分)和检测编码MMP2的转录的多核苷酸(或其部分)来确定样品中标志物的表达。转录的多核苷酸可以是mRNA或cDNA。在确定之前，可以例如使用聚合酶链式反应(PCR或RT-PCR)扩增转录的多核苷酸。在这些实施方案中，通过检测在严格杂交条件下可与转录的多核苷酸(或其部分)结合的相应多核苷酸来确定每种标志物的存在。
在其他实施方案中，通过检测Ran或Ran结合蛋白1(或其片段)和检测MMP2(或其片段)来确定标志物的表达。每种标志物的确定可以使用各自的试剂，诸如抗体、抗体衍生物或抗体片段，它们特异性地结合这些蛋白中的一种或其他。具体地，该确定可使用例如由放射性标记、荧光团标记或酶标记进行标记的相应抗体。它可以使用包括与基底或配体缀合的抗体的相应抗体衍生物，或者包括单链抗体或分离的抗体高变结构域的相应抗体片段。
在本发明的另一实施方案中，本发明提供了一种用于确定癌症受试者的生存概率的方法，通过确定从受试者获得的肿瘤细胞内的第一和第二生物标志物的定量值，并将其与选定的预定水平进行比较。
当在单个肿瘤细胞内确定每种标志物的细胞内水平时，所确定的第一标志物的水平可以是第一标志物的参考/正常水平的至少四、五、六、七、八或九倍低。可选地，或者另外，所确定的第二标志物的水平可以是第二标志物的参考水平的至少四、五、六、七、八或九倍低。
例如，可以使用标准比色法确定受试者和参考肿瘤细胞中每种标志物的水平。还可以通过与标准参考样品中每种标志物的各自绝对量或浓度进行比较来确定受试者肿瘤细胞中的标志物水平。
在一些实施方案中，通过检测编码Ran或Ran结合蛋白1的转录的多核苷酸(或其部分)和检测编码MMP2的转录的多核苷酸(或其部分)来确定标志物的水平。转录的多核苷酸可以是mRNA或cDNA。在确定之前，可以例如使用聚合酶链式反应(PCR或RT-PCR)扩增转录的多核苷酸。
在这些实施方案中，通过检测在严格杂交条件下可与转录的多核苷酸(或其部分)结合的相应参考多核苷酸的结合来确定每种标志物的水平。
参考多核苷酸可以结合到固体基底，或者例如通过生色团、荧光团、酶或酶辅因子标记，从而允许通过杂交来确定主题多核苷酸。可选地，PCR或其他技术，例如，利用各自的单核苷酸多态性，可以用来确定每种标志物的水平。
在其他实施方案中，通过检测Ran或Ran结合蛋白1(或其活性片段)和检测MMP2(或其活性片段)来确定标志物的水平。每种标志物的确定可以使用各自的试剂，诸如抗体、抗体衍生物或抗体片段，它们特异性地结合这些蛋白中的一种或其他。具体地，该确定可使用例如由放射性标记、荧光团标记或酶标记进行标记的相应抗体。它可以使用包括与基底或配体缀合的抗体的相应抗体衍生物，或者包括单链抗体或分离的抗体高变结构域的相应抗体片段。
在本发明的一种实施方案中，提供了一种用于监测受试者中肿瘤的侵袭和/或转移潜力的方法。在最初确定第一和第二标志物的水平的时间点和稍后的时间点之间，可以向患者提供治疗，例如药物治疗、手术干预等，并且该方法将提供关于该治疗是否对肿瘤的侵袭和/或转移潜力产生影响的指示。
该方法可以允许评价不同的测试剂及其抑制或导致侵袭和/或转移的能力。
该方法可以包括比较每个等份中每种标志物的确定水平，其中与未暴露于测试剂的等份相比，暴露于测试剂的等份中两种标志物的水平显著更高指示测试剂引起侵袭和/或转移。在任何情况下，该方法还可包括将样品的另外等份暴露于另外的相应测试剂。
该方法还可以提供用于选择抑制样品中肿瘤细胞的侵袭和/或转移的剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供样品的至少第一和第二等份，其中每个等份包含至少一个肿瘤细胞，
(ii)将样品的第一等份暴露于第一测试剂，
(iii)将样品的第二等份暴露于第二测试剂；和
(iv)确定每个等份中来自肿瘤细胞的第一标志物和第二标志物的水平；
其中第一标志物选自由Ran、Ran结合蛋白1、Ran的活性片段、编码Ran的核酸序列、编码Ran结合蛋白1的核酸序列、编码Ran的活性片段的核酸序列和编码Ran结合蛋白1的活性片段的核酸序列组成的组；和
第二标志物选自由MMP2、MMP2的活性片段、编码MMP2的核酸序列和编码MMP2的活性片段的核酸序列组成的组；和
(v)比较每个等份中每种标志物的确定水平；以及
(vi)选择测试剂，该测试剂在具有该测试剂的等份中提供与具有另一测试剂的等份相比至少第二标志物的较低确定水平。
该方法可以包括选择测试剂，该测试剂，在具有测试剂的等份中提供与具有另一测试剂的等份相比至少第二标志物的较低确定水平。在任何情况下，该方法还可包括将样品的另外等份暴露于另外的相应测试剂。
选择在具有该测试剂的等份中提供与具有其他测试剂的其他等份相比第二标志物或两种标志物的较低水平的测试剂可用于向患者提供药物。
该方法还可用于鉴定抑制受试者中肿瘤的侵袭或转移的剂，包括以下步骤：
(i)从受试者的肿瘤获取样品；
(ii)提供样品的至少第一和第二等份，其中每个等份包含至少一个肿瘤细胞，
(ii)将第一等份暴露于第一测试剂，
(iii)将第二等份暴露于第二测试剂，
(iv)确定来自每个等份的肿瘤细胞的第一标志物和第二标志物的水平，
其中第一标志物选自由Ran、Ran结合蛋白1、Ran的活性片段、编码Ran的核酸序列、编码Ran结合蛋白1的核酸序列、编码Ran的活性片段的核酸序列和编码Ran结合蛋白1的活性片段的核酸序列组成的组；和
第二标志物选自由MMP2、MMP2的活性片段、编码MMP2的核酸序列和编码MMP2的活性片段的核酸序列组成的组；和
(v)比较每个等份中每种标志物的确定水平，和(vi)选择测试剂，该测试剂在具有该测试剂的等份中提供与具有另一测试剂的等份相比至少第二标志物的较低水平；以及
(vi)向患者施用治疗有效量的所选测试剂。
该方法可以包括选择测试剂，该测试剂在具有该测试剂的等份中提供与具有另一测试剂的等份相比每种标志物的较低确定水平。在任何情况下，该方法还可包括将样品的另外等份暴露于另外的相应测试剂。
在本发明的一个方面，提供了一种药物，该药物包含治疗量的Ran抑制剂和MMP2抑制剂。
在另一方面，本发明还提供了用于执行前述方法的试剂盒。本发明可以提供一种用于确定受试者的肿瘤状态的试剂盒，该试剂盒包含用于分别评估肿瘤样品中第一标志物和第二标志物的水平的第一试剂和第二试剂。
试剂盒还可以包含试剂的合适的可视指示剂，例如，能够结合试剂和/或试剂和标志物复合物的每种试剂的标记抗体。试剂盒可任选地包含液体，诸如适于检测样品中第一和第二标志物水平的缓冲液，例如提供结合Ran和/或MMP2特异性抗体的缓冲液。
在实施方案中，用于测量第一和第二标志物水平的抗体、抗体衍生物或抗体片段可以用放射性标记、荧光团标记或酶标记进行标记。抗体衍生物可包含与基底或配体缀合的抗体或抗体片段。抗体片段可以是例如单链抗体或分离的抗体高变结构域。
注意，考虑到上述方法，除非上下文另有要求，否则关于一种方法的任何特征的描述也是关于其他方法的描述。属于本发明方面的一个实施方案的每一个特征，加以必要的修改，适用于本发明的每一个其他方面。
现在参照以下实施例和附图更详细地描述本发明，在附图中：
图1是绘制对取自181名未经筛选的人类乳腺癌患者的原发肿瘤切片的回顾性免疫组织化学研究确定的生存患者的累计比例与生存期的图表，这些患者根据Ran蛋白和MMP2蛋白的阳性和/或阴性染色分类(a至d)；
图2是显示继续发展为转移的238名未经筛选的乳腺癌患者血浆中RAN表达的程度的图表，并与没有继续发展为转移的患者相比较；和
图3是绘制通过回顾性Elisa测定238名癌症患者血浆中的RAN水平(阳性和阴性)确定的无远处转移生存率(DMFS)的比例与时间的图表。
实施例1
使用181例未经筛选的乳腺癌患者的原发肿瘤样品的(-/+)IHC染色进行了回顾性统计研究，以确定Ran、c-Met、c-Myc和MMP2之间的关系。
该研究按照先前对Ran描述的方法进行(de Silva Rudland S.等人，于Am.J.Pathol.2011,79,1061-1072和Rudland P.S.等人，于Am.J.Pathol.2010,176,2935-2947)。简而言之，患者没有接受包括激素治疗在内的辅助治疗，并且仅纳入可手术乳腺癌(T1-4,N0-1)患者。患者随访时间范围从14.5年至19.4年(平均16.4±0.1年)，并且平均值±SE生存期为9.0±0.5年。伦理批准从NRES Committee North West REC Ref 12/NW/0778,Protocol no.UoL000889,IRAS no 107845获得。将样品保存在中性缓冲的福尔马林中，并包埋在石蜡中，如前所述(Rudland P.S.等人于Cancer Res.2000,60,1595-1603)。
材料和方法
IHC染色.将以4μm切割的组织切片封固在载玻片上，用甲醇中0.05％v/v H2O2处理以抑制内源性过氧化物酶(Rudland P.S.等人,于Cancer Res.2000,60,1595-1603)，并与试剂盒(DAB)(Dako Ltd,Ely,UK)中相关的一级和辣根过氧化物酶标记的抗体/聚合物一起孵育，如前所述(de Silva Rudland S.等人,于Am.J.Pathol.2011,79,1061-1072和IsmailT.M.等人,于Cancer Res.2017,77,780-789)。阳性染色对应于二氨基联苯胺(DAB)的氧化棕色沉淀。载玻片最后封固于Glycergel封固介质(Dako)中。通过混合1mg/ml相关阻断肽/蛋白制备的阻断抗体消除了这种染色。适当的免疫血清也导致不染色。乳腺细胞系的蛋白质印迹通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上产生适当大小的分子量条带来验证使用的所有抗体的特异性。
IHC评分分析.IHC染色的切片由两个独立的观察者使用光学显微术根据每个样本的2个分离良好的切片(每个切片10个视野，200x放大时，并且每个视野至少200个细胞)中染色癌细胞的百分比进行分析和评分，如前所述(de Silva Rudland S.等人,于Am.J.Pathol.2011,79,1061-1072和Ismail T.M.等人,于Cancer Res.2017,77,780-789)。
染色数据分析用Excel(Microsoft,Redmond,WA)和SPSS 22版(SPSS,Chicago,IL)进行。
所有蛋白的染色已经被分为两个类别组，一个阴性组和一个阳性组，并且截止值为癌细胞染色的1％或5％，根据哪种截止值产生更显著差异和更大的相对风险：Ran、cMyc、Ki67、CK5/6为1％截止值，并且cMet、MMP2、ERα、c-erbB-2、PgR为5％截止值(de SilvaRudland S.等人,于Am.J.Pathol.2011,79,1061-1072；Yuen H-F.等人,于Clin.CancerRes.2012,18,380-391；Yuen H-F.等人,于J.Natl.Cancer Inst.2013,105,475-488；YuenH-F.等人,于Oncotarget 2016,7,75854-75864；和Ismail T.M.等人,于Cancer Res.2017,77,780-789)。
根据使用Kaplan Meier图从生存数据构建的生命表计算这组患者中单独的每种蛋白染色的关联，并通过Wilcoxon(Gehan)统计进行分析(Rudland P.S.等人,于CancerRes.2000,60,1595-1603)。删剪死于癌症以外原因的患者。使用Cox的单变量分析计算生存的未调整相对风险(RR)及95％置信区间(95％CI)(Rudland P.S.等人，于Am.J.Pathol.2010,176,2935-2947)。
Ran或MMP2的IHC染色与其他肿瘤变量的关联通过交叉制表进行评估，使用Fishers精确检验(双边)，使用1％或5％的截止值。对于多重比较，所得的P值用Holm-Bonferroni公式I-(I-P)n校正，其中n是肿瘤变量的数量。
用二元Logistic回归计算组中一种蛋白与其余蛋白染色的相对独立关联(RA)。为了确定患者生存与Ran、MMP2等的关联在一组蛋白质内是否显著，对181名患者进行了Cox多元分析，不完整的数据主要是由于缺乏采样(de Silva Rudland S.等人,于Am.J.Pathol.2011,79,1061-1072)。
各个肿瘤变量与患者生存期的关联
如上所述研究了人类乳腺癌中肿瘤变量包括标志物Ran、c-Met、c-Myc、MMP2、Ki67、ERα、c-erbB-2和CK5/6与因为转移性乳腺癌的患者死亡的关系。
统计分析的结果在表1中示出。可以看出，在本组181名患者中，相对风险(RR)的最大显著差异如下：Ran(χ2＝35.4,RR＝14.9)，cMet(χ2＝32.9,RR＝10.7)，cMyc(χ2＝40.3,RR＝9.5)，MMP-2(χ2＝64.8,RR＝7.7)和CK5/6(χ2＝43.3,RR＝5.6)。
在这组患者内没有发现ERα(χ2＝1.24,RR＝0.81),c-erbB-2(χ2＝1.93,RR＝1.33)和Ki67(χ2＝1.6,RR＝1.3)的相对风险的差异显著——尽管有报道称在更大的患者组中它们差异显著(de Silva Rudland S.等人,于Am.J.Pathol.2011,79,1061-1072)。
不同于此报告，本组患者的结大小(累及或不累及淋巴结)显示的显著RR为2.3(χ2＝14.64,1df,P<0.001)。未发现肿瘤大小和组织学分级与患者生存显著相关。
Ran和MMP2与其他肿瘤变量的关联
如上所述研究了人类乳腺癌中，Ran与其他肿瘤变量以及MMP2与其他肿瘤变量的关联。结果总结在表2中。
可以看出，Ran与c-Met(P＝6.6x10-5)、cMyc(P＝4.4x10-5)、MMP2(P＝5.7x10-6)和CK5/6(P＝5.5x10-5)非常显著地相关但与Ki67、ERα、c-erbB-2、肿瘤大小及组织学分级毫无关系(P≥0.34)。
Ran与TRNBC的关联(未校正的P＝0.06)具有临界显著性，并且仅累及淋巴结(未校正P＝0.037)。发现最显著的Ran与其他肿瘤标志物之间的关联是Ran与MMP2之间的关联。
MMP2与Ran与相同的肿瘤标志物即c-Met(P＝6.4x10-9)、c-Myc(P＝1.8x10-7)、CK5/6(P＝7.5x10-7)以及RAN本身(P＝5.7x10-6)强烈地显著相关并且与其余肿瘤变量无关(P≥0.35)。
注意，在Ki67染色的情况下，对Ran没有明显的染色，这表现为与在Ran转染的细胞中观察到的细胞增殖几乎没有增加的事实一致。
此外，Ran、c-Met、c-Myc和MMP2的染色都与CK5/6的染色极为显著相关，而与ERα或c-erbB-2的染色无关的事实表明，Ran、c-Met、c-Myc和MMP2主要存在于乳腺癌的基底细胞类型中。
这个乳腺癌亚组与三受体阴性乳腺癌(TRNBC)亚组有相当大的重叠(de SilvaRudland S.等人,于Am.J.Pathol.2011,79,1061-1072)，这可能解释了Ran染色与三受体阴性乳腺癌的边缘关联。
Figure BDA0003622217590000161
表1.肿瘤变量与患者生存期的关联
a阴性染色vs阳性染色，1％截止值，除非有说明。b X2和概率(P)使用广义Wilcoxon(Gehan)统计确定。c RR和95％CI使用Cox一元分析与1df确定。d阴性染色vs.阳性染色，5％截止值。e三受体阴性乳腺癌(TRNBC-vs TRNBC+)。f无淋巴结vs.1个或更多个淋巴结；1df的P。g组织学分级：1、2 vs 3；1df的P。1级vs 2级的RR＝2.74(95％CI,1.45–5.19)，1级vs 3级的RR＝2.83(1.42–5.66)；全部1df。h肿瘤大小，直径<5cm vs>5cm，T1,T2 vs T3,T4；1df的P。T1,T2 vs T3,T4的RR；T1 vs T2＝1.54(95％CI,0.67-3.58)，T1 vs T3＝1.76(0.69-5-4.51)，T1 vs T4＝2.68(0.86-8.32)，全部1df。
Figure BDA0003622217590000171
表2.Ran和MMP2的IHC染色与其他肿瘤变量的关联
a分子变量的IHC阴性染色vs阳性染色，使用1％的截止值，除非有说明。b患者数量来自最初的181。c使用Holm-Bonferroni校正计算为1-(1-P)n的Fisher精确检验的概率P，其中n＝11。d阴性染色vs阳性染色，5％截止值。e三受体阴性乳腺癌。f无Bonferroni校正P＝0.061。g肿瘤大小，直径<5cm vs>5cm。h组织学分级1、2 vs 3。i无淋巴结累及vs 1个或更多个淋巴结累及。j无Bonferroni校正，Ran的P＝0.037，并且MMP2的P＝0.039。
Ran、c-Met、c-Myc、MMP2和Ki67的相对独立关联
如上所述研究了人类乳腺癌中Ran、c-Met、c-Myc和Ki67彼此独立关联的概率。
结果在表3中示出。可以看出，发现Ran与cMet和与MMP2的相对独立关联(RA)最强(RA＝3.0至3.4)，而发现Ran与Ki67的相对独立关联不显著(RA＝1.12,P＝0.81)。
Figure BDA0003622217590000181
表3.Ran染色与其他分子标志物独立关联的概率
a使用在表1、表2中定义的截止值，原则IHC-染色变量与其他肿瘤变量相关的概率。b将其他IHC染色变量的组纳入二元Logistic回归分析，使用表1、表2中定义的截止值来分离阳性和阴性染色组。c二元Logistic回归分析中系数β的值(Coeffβ)及其标准差(SE)。
c-Met显示与Ran(RA＝3.41,P＝0.019)和与MMP2(7.9,P<0.001)的相对独立关联最强。
c-Myc与MMP2的相对独立关联最强，并且MMP2与cMet的相对独立关联最强。
Ran、cMet、cMyc和MMP2与患者生存期的关联
如上所述研究了Ran、cMet、cMyc和MMP2的染色与患者生存期的相对独立关联。
结果在表4中示出。可以看出，Ran、c-Met、c-Myc和MMP2的染色组显示出显著的独立程度(P≤0.036)，并且患者死亡的相对风险(RR)相似，为3.1倍至3.7倍。这些RR比表1中报告的单变量分析中显示的7倍至15倍下降少得多。
Ran和c-Met染色组与Ran和MMP2染色组显示患者死亡的RR比单独Ran染色降低(从14.9倍到7.6至7.8倍之间)。Ran和c-Myc染色组显示患者死亡的RR比单独Ran染色降低(从14.9倍到9.8倍)。
Figure BDA0003622217590000191
表4.癌症相关死亡的Cox比例危险结果概要
a在A组中，比较Ran、cMet、cMyc和MMP2染色的肿瘤患者的生存期时长；总体χ2＝96.21,4df,P<0.001。在B组中，比较Ran和cMet染色的肿瘤患者；总体χ2＝52.4,2df,P<0.001。在C组中，比较Ran和cMyc染色的肿瘤患者；总体χ2＝60.6,2df,P<0.001。在D组中，比较Ran和MMP2染色的肿瘤患者；总体χ2＝96.5,2df,P<0.001。IHC截止值如表1、表2所述。bβ系数值(＝logeRR)和Cox多元回归分析中的标准差(SE)。c Cox统计χ2。d Cox统计χ2的概率P，每种情况下1df。e生存期的相对风险(RR)和95％置信区间(95％CI)，来自多元分析。
注意到，MMP2、c-Met和c-Myc染色之间的相对独立关联强于Ran染色，表明肿瘤中MMP2表达的增加不仅仅是由于Ran的增加，而且可能来自其他信号传导机制。
此外，Ran的RR的混杂的部分性质表明，其他不涉及Ran的途径也参与导致患者死亡。
注意到，c-Met染色或MMP2染色与Ran染色二元联合的Ran染色的RR下降(分别为49％和48％)大于Met或MMP2染色与Ran二元联合的c-Met染色或MMP2染色的RR下降(均为32％)，表明Met和MMP2在该信号通路中比Ran为更近端的成员。
Ran和MMP2与患者生存期的关联
表5和图1显示了根据以下几组分类的癌症呈现后，每年(直至大约20年)生存患者占总数的分数的累计比例：
a组(实线)：Ran阴性(-ve)染色和MMP2阴性(-ve)染色；b组(点线)：Ran阳性(+ve)染色和MMP2阴性(-ve)染色；c组(虚线)：Ran阴性(-ve)染色和MMP2阳性(+ve)染色；和d组(虚-点线)：Ran(+ve)和MMP2(+ve)二者阳性染色。
可以看到，在a组中中位生存期(ms)大于228个月，最终累计生存率(fcs)为0.97。其中删剪观察39例(其他原因死亡8例)；b组中ms大于216个月，并且fcs为0.6。其中删剪观察44例(其他原因死亡19例)。在c组中，ms大于216个月，并且fcs为0.60。其中删剪观察3例(其他原因死亡1例)。在d组中，ms为46.2个月，并且fcs为0.06。其中删剪观察8例(其他原因死亡4例)。
对由这些组中的两组组成的染色组的统计分析显示，Ran染色和MMP2染色可以协同作用，并且使RR分别从17.1倍和23.1倍提高到82.1倍(比较a染色组和d染色组)。在患者生存率方面，染色可显示患者生存率在近20年后分别从64％和60％下降到仅6％。
Figure BDA0003622217590000211
表5.染色组间生存差异
a MMP2和Ran的免疫细胞化学染色类别分为染色(+；+ve)或未染色(-；-ve)。bWilcoxon统计(χ2)和概率(P)使用广义Wilcoxon(Gehan)检验和1df确定。c相对风险(RR)和置信区间(95％CI)使用Cox一元分析和1df确定。d使用从生存数据构建的生命表评价的以月计的中位生存期和生存患者的累计比例。
发现双染色的d组(Ran+ve/MMP2+ve)比单染色的b组(Ran+ve/MMP2-ve；P<0.001)的患者生存期显著下降，而没有发现双染色的d组(Ran+ve/MMP2+ve)比单染色的b组(Ran-ve/MMP2+ve；P＝0.21)的患者生存期显著下降。
当将每一染色组的生存患者的累计比例对生存期作图时，这尤其明显。从图1中可以看出，注意到每年呈现的患者数量列在该图下方，对应于每个染色组的曲线彼此之间有高度显著的差异。
注意到，表5显示，在原发癌细胞中，当将MMP2染色数据添加到Ran染色数据中时，患者生存期显著减少——但当将Ran染色数据添加到MMP2染色数据中时，患者生存期没有显著增加。如此支持了这样一个观点，即在导致患者死亡的途径中，c-Met和MMP2是比Ran更近端的成员，并且与导致培养的细胞转移特性增加的蛋白质的顺序一致。
Figure BDA0003622217590000221
表6.单独和组合的Ran和MMP2在IHC测定中的灵敏度、特异性、NPR和PPR
本研究显示，将MMP2染色数据添加到Ran表达的染色数据揭示了人类乳腺癌细胞的转移潜力的更准确图画。
在这项研究中，当将MMP2表达的染色数据加入Ran表达的染色数据时，患者死亡的RR从最初的14.9倍增加到82.1倍。
可以看出，实施例1提供了一种基于Ran和MMP2的免疫组织化学测定，与仅基于Ran的免疫组织化学测定相比，基于Ran和MMP2的免疫组织化学测定与患者生存更好地相关(比较NPR为97.5％与93.3％)。NPR的改进强烈表明，肿瘤细胞和血浆中Ran和MMP2水平的测定与单独Ran的测定相比的相应改进。
上面的表6总结了本发明人对以下的知识：在经筛选的人类乳腺癌亚型(ER+ve/HER-ve(ER+/HER-)和三阴性(Triple-VE))中以及在未经筛选的(所有)人类乳腺癌中，与单独Ran相比，IHC测定中Ran表达和MMP2表达的灵敏度、特异性、阴性响应百分比(NPR)和阳性响应百分比(PPR)。
实施例2
对238名未经筛选的人类乳腺癌患者(9236队列)的血浆中Ran水平进行了回顾性队列研究。这项研究使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定来确定患者首次诊断为乳腺癌时采集的血浆样品中Ran的水平。
表7显示了与没有发展转移的患者相比，发展转移的患者中Ran的平均表达。
Figure BDA0003622217590000231
表7.转移/无转移时Ran的平均表达
对Ran的确定水平与患者生存进行统计分析，以确定Ran的截止水平，其与MMP2的测定的联合被认为可能提供NPR为约98％的临床有用的测试。
图2描绘了在这个队列中，与没有发展转移的患者相比，继续发展转移的患者中Ran表达的变化。
在一系列截止水平分析血浆Ran水平，在截止水平，血浆中Ran水平高一个百分比整数被认为是阳性(+ve)，即指示患者会继续发展转移。
表8显示了在0.5和2.0之间的不同的半整数截止水平的Ran表达的灵敏度分析。
可以看出，当截止水平为0.5时，Ran+ve的患者数量相对于真正阳性的数量(61例，表10所示)非常高(在216)。此外，灵敏度和NPR高，并且特异性可接受，但Ran-ve的患者数量非常低(在总真阴性的30％)。
Figure BDA0003622217590000241
表8.在不同Ran表达截止值的灵敏度分析
虽然0.5的截止水平表现为提供了相对安全的测试，因为在22名不进行化疗的患者中，90％(20名)不会发展转移，但这并不是一个那么有用的测试，因为其余39名不发展转移的患者将会进行化疗。
在选择最佳的截止水平时，灵敏度(％真阳性)数据是最重要的，因为它给出了有多少继续发展为转移的患者具有+ve RAN评分的量度。如果灵敏度低于约95％，那么较大数量被评分为RAN-ve的患者将不会进行化疗，并将继续发展为转移。
特异性(％真阴性)数据没那么重要，因为它与没有继续发展为转移的患者有关。如果特异性较低，例如60％，则大量患者(100名中有40名)将评分为Ran+ve，但不会继续发展为转移。虽然这不一定是一个问题，因为临床医生不会改变对评分为Ran+ve的患者的治疗，但高选择性是优选的。
鉴于这些考虑，可以看出，将截止水平设置为2会导致测试不佳，因为该水平过高。在63名评分为Ran+ve的患者中，只有23名为真阳性，该测试具有低灵敏度(37.7％)，仅仅是因为大量真阳性具有低于2的值，这意味着他们被归类为阴性。
Figure BDA0003622217590000251
表9.当Ran表达截止值等于1时的2x2列联表
看起来截止水平为1是该数据集的最佳值，尽管它不具有对于Ran水平测定足够高的NPR和灵敏度，无法为所有类型的乳腺癌提供可靠的预测性测试。
表9显示了当Ran表达截止值等于1时，这组患者的Ran表达的2x2列联表。
图3显示了Ran阳性患者和Ran阴性患者的无远处转移生存率(DMFS)与时间的图表。可以看出，生存5年以上的Ran阴性患者的比例高于Ran阳性患者的比例。然而，生存5年以上的Ran阴性患者的比例表现为下降到生存71/2年以上的50％，并且下降到生存10年以上的50％以下。
实施例1显示，在肿瘤样品的RanDx IHC测试中添加第二生物标志物(MMP2)显著改进了NPR和％灵敏度二者，并且达到了相当于或优于Oncotype的水平，并且重要的是这是对于所有乳腺癌亚型。
因此，预期Ran表达和MMP2表达二者的血浆测定将为临床医生提供有用的和准确的预测患者发展转移的概率的测试。
如从标准基因组测试Oncotype可以预期的，如果概率低，则临床医生将不向患者提供化疗，并且如果概率高，则临床医生将建议患者接受化疗。
因此，血液测试本身可以减轻那些不需要化疗的患者的化疗负担，为卫生服务节省大量开支，并为患者提供更好的生活质量。
它还可允许临床医生在手术后或化疗治疗期间监测患者。患者血液中Ran和/或MMP2水平随时间的变化可以指示他们从休眠癌细胞发展转移的风险的变化。Ran或MMP2血液水平的增加可以指示风险的变化，并且然后临床医生可以开一定疗程的化疗以意图降低风险。这样的测试目前无法从常规测试获得。
注意，本文对Ran的提及是对Ran蛋白的提及，并且对RAN的提及是对RAN基因的提及，除非上下文另有要求。对MMP2的提及是对MMP2蛋白的提及，或者在上下文要求的情况下，是对MMP2基因的提及。
贯穿本说明书的描述和权利要求书，词语“包括/包含(comprise)”和“含有(contain)”及它们的变化形式意指“包括但不限于”，并且它们不意图(并且不)排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。除非上下文另外要求，否则贯穿本说明书的描述和权利要求书，单数涵盖复数。具体地，在使用不定冠词时，应理解本说明书设想多于一个以及单个，除非上下文另有要求。
结合本发明的特定方面、实施方案或实例所描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为可应用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实例，除非与该方面、实施方案或实例不相容。在本说明书(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或这样公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合进行组合，除了其中这样的特征和/或步骤中的至少某些相互排斥的组合之外。本发明并不被任何前述实施方案的细节限制。本发明扩展至在本说明书(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖特征或任何新颖组合，或这样公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖的步骤或任何新颖的组合。
读者的注意被引导到与本说明书同时提交或在此之前提交的与本申请有关的、并且与本说明书一起向公众开放供查阅的所有论文和文献，并且所有此类论文和文献的内容通过引用并入本文。

Claims (20)

1.一种用于确定受试者中肿瘤状态的方法，包括以下步骤：
(i)确定取自受试者的样品中第一生物标志物的定量值，所述第一生物标志物选自由Ran蛋白、Ran结合蛋白1、Ran蛋白的活性片段、编码Ran的核酸序列、编码Ran结合蛋白1的核酸序列、编码Ran的活性片段的核酸序列和编码Ran结合蛋白1的活性片段的核酸序列组成的组；
(ii)将所述样品中所述第一生物标志物的定量值与所述第一生物标志物的选定的预定阈值进行比较；
(iii)确定来自同一受试者的样品中第二生物标志物的定量值，所述第二生物标志物选自由MMP2蛋白、MMP2蛋白的活性片段、编码MMP2的核酸序列和编码MMP2的活性片段的核酸序列组成的组；
(iv)将所述样品中所述第二生物标志物的定量值与所述第二生物标志物的选定的预定阈值进行比较；
其中所述样品中所述第一标志物的定量值和所述第二生物标志物的定量值与它们各自的选定的预定阈值的比较指示所述肿瘤样品是否具有侵袭和/或转移潜力。
2.根据权利要求1所述的方法，其中为确定所述第一生物标志物的定性值而获得的样品与用于确定所述第二生物标志物的定量值的样品相同或不同。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品选自包括实体肿瘤活检、液体活检、肿瘤细胞、血液中的循环肿瘤细胞、血浆中的循环肿瘤细胞和体液中的生物标志物的循环水平的组。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一生物标志物的选定的预定阈值至少在所述第一生物标志物的样品参考值的0.5％和5.0％之间。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一生物标志物的选定的预定阈值为所述第一生物标志物的样品参考值的至少1.0％。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第二生物标志物的选定的预定阈值至少在所述第二生物标志物的样品参考值的1.0％和10.0％之间。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二生物标志物的选定的预定阈值为所述第二生物标志物的样品参考值的至少5.0％。
8.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述样品参考值是具有侵袭性和/或转移性肿瘤的受试者中表达所述第一生物标志物和/或所述第二生物标志物的细胞的数量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中免疫组织/免疫细胞化学地或其他类似平台评估细胞数量。
10.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述样品参考值是具有侵袭性和/或转移性肿瘤的受试者中所述第一生物标志物和/或所述第二生物标志物的表达水平。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一标志物和所述第二标志物的表达水平通过ELISA、免疫沉淀或免疫印迹或其他蛋白质检测平台来评估。
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，当所述样品中所述第一标志物的定量值低于所述第一标志物的选定的预定阈值并且所述样品中所述第二标志物的定量值低于所述第二标志物的选定的预定阈值时，指示所述肿瘤不具有侵袭和/或转移潜力。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，当所述样品中所述第一标志物的定量值高于所述第一标志物的选定的预定阈值并且所述样品中所述第二标志物的定量值高于所述第二标志物的选定的预定阈值时，指示所述肿瘤具有侵袭和/或转移潜力。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，当所述样品中所述第一标志物的定量值低于所述第一标志物的选定的预定阈值并且所述样品中所述第二标志物的定量值高于所述第二标志物的选定的预定阈值时，指示所述肿瘤可能具有侵袭和/或转移潜力，并且需要进一步监测。
15.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，当所述样品中所述第一标志物的定量值高于所述第一标志物的选定的预定阈值并且所述样品中所述第二标志物的定量值低于所述第二标志物的选定的预定阈值时，指示所述肿瘤可能具有侵袭和/或转移潜力，并且需要进一步监测。
16.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述肿瘤选自包括人类乳腺癌，并且特别是雌激素受体阳性和人类表皮生长因子受体2阴性乳腺癌细胞或三受体阴性乳腺癌(TNBC)细胞的组。
17.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述肿瘤状态包括，在手术后和/或在化疗或放疗期间监测转移，对一组癌症受试者进行分层和/或预测受试者的生存概率/转移潜力。
18.一种试剂盒，所述试剂盒包含用于分别评估肿瘤样品或血浆样品中第一标志物和第二标志物的水平的第一试剂和第二试剂，
其中所述第一标志物选自由Ran、Ran结合蛋白1、Ran蛋白的活性片段、Ran结合蛋白1的活性片段、编码Ran的核酸序列、编码Ran结合蛋白1的核酸序列、编码Ran的活性片段的核酸序列和编码Ran结合蛋白1的活性片段的核酸序列组成的组；和
所述第二标志物选自由MMP2蛋白、MMP2蛋白的活性片段、编码MMP2的核酸序列和编码MMP2的活性片段的核酸序列组成的组。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，所述试剂盒用于确定受试者中的肿瘤是否具有侵袭和/或转移潜力的方法。
20.根据权利要求18或19所述的试剂盒用于确定受试者中的肿瘤是否具有侵袭和/或转移潜力的用途。
CN202080076313.9A 2019-10-28 2020-10-27 用于确定肿瘤的侵袭和/或转移潜力的方法 Pending CN114641582A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB201915598A GB201915598D0 (en) 2019-10-28 2019-10-28 Methods for determining the invasive and/or metastic potential of a tumour
GB1915598.5 2019-10-28
PCT/GB2020/052718 WO2021084242A1 (en) 2019-10-28 2020-10-27 Methods for determining the invasive and/or metastatic potential of a tumour

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114641582A true CN114641582A (zh) 2022-06-17

Family

ID=68768868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080076313.9A Pending CN114641582A (zh) 2019-10-28 2020-10-27 用于确定肿瘤的侵袭和/或转移潜力的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220404365A1 (zh)
EP (1) EP4052039A1 (zh)
CN (1) CN114641582A (zh)
GB (1) GB201915598D0 (zh)
WO (1) WO2021084242A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113502328A (zh) * 2021-05-27 2021-10-15 深圳市人民医院 检测样本中标志物表达水平的试剂在制备用于检测或诊断乳腺癌的试剂盒中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1110799A (en) * 1997-10-29 1999-05-17 Warner-Lambert Company Method of inhibiting metastases of cancer cells
DK2082225T3 (da) * 2006-09-20 2014-04-07 Univ Belfast Fremgangsmåde til bestemmelse af, om en tumorcelle har invasivt og/eller metastatisk potentiale, og midler tilmodulering af malign transformation
US11913957B2 (en) * 2011-12-21 2024-02-27 Biodesix, Inc. Compositions, methods and kits for diagnosis of lung cancer
WO2018065771A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 University Of Bradford Inhibitor of ran at transcriptional level for use in the treatment of cancer
GB2554703A (en) * 2016-10-05 2018-04-11 Univ Bradford Compound for use in medicine

Also Published As

Publication number Publication date
EP4052039A1 (en) 2022-09-07
US20220404365A1 (en) 2022-12-22
GB201915598D0 (en) 2019-12-11
WO2021084242A1 (en) 2021-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2115472B1 (en) Cancer biomarkers
Yang et al. Differences in the expression profiles of claudin proteins in human gastric carcinoma compared with non‑neoplastic mucosa
Hermann et al. TIMP1 expression underlies sex disparity in liver metastasis and survival in pancreatic cancer
WO2014062845A1 (en) Compositions and methods for detecting sessile serrated adenomas/polyps
US20160169897A1 (en) Assay methods for the determination of fkbpl expression level in the context of breast cancer
Hatipoğlu Extragastrointestinal stromal tumor (EGIST): a 16-year experience of 13 cases diagnosed at a single center
Hanamura et al. Clinical significance of serum PSA in breast cancer patients
Kidd et al. Q RT-PCR detection of chromogranin A: a new standard in the identification of neuroendocrine tumor disease
Kobierzycki et al. Correlation of pyruvate kinase M2 expression with clinicopathological data in ovarian cancer
CN114641582A (zh) 用于确定肿瘤的侵袭和/或转移潜力的方法
Li et al. RETRACTED ARTICLE: Octamer transcription factor 1 mediates epithelial-mesenchymal transition in colorectal cancer
Moar et al. Potential diagnostic and prognostic biomarkers for breast cancer: A compiled review
EP2680003A1 (en) Serum biomarker for diagnosing colorectal cancer
WO2019115679A1 (en) A signature to assess prognosis and therapeutic regimen in liver cancer
JP6691337B2 (ja) 膀胱癌患者の予後を予測するための方法
US11994513B2 (en) Diagnostic and prognostic methods for estrogen-induced cancers
EP3816627B1 (en) Eukaryotic translation initiation factors (eifs) as novel biomarkers in endometrial cancer
US20240255513A1 (en) Eukaryotic translation initiation factors (eifs) as novel biomarkers in bladder cancer
Xing et al. Inherited Cancer Syndromes
KR20220002002A (ko) 직장 신경내분비종양의 예후 예측 방법
Butterbaugh Microgenomic approaches to identify clinically relevant gene signatures that discriminate histologic types of breast carcinomas.
Hussien Prognostic Role of β-catenin/PTEN Expressions and Braf/Kras Mutations in Papillary Thyroid Carcinoma: Correlation with Response to Radioactive Iodine Therapy
Janik Evaluation of a series of antibodies to distinguish the ovarian surface epithelium vs fallopian tube as the origin of serous papillary carcinoma

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination