CN114641463A - 增强生物防治的制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于增强生物防治的组合物和方法，特别当种子种植时改善环境。更具体而言，本发明包括组合物，例如液体种子包衣组合物，其包含至少一种大量营养素和至少一种微生物，该大量营养素包括与磷结合的碱性L‑氨基酸形式的氮。本发明的组合物为种植的种子提供了改善的环境，例如通过以可长期使用的形式提供氮。此外，与现有技术产品相比，根据本发明提供的氮的形式已被证明在毒性方面对存在于植物周围土壤中的微生物更有利。该组合物有利地是液体缓释种子包衣组合物。此外，本发明包括一种经过处理以延长氮作用的持续时间而不对周围微生物造成致命影响的种子，以及一种处理种子以实现相同目的的方法。

Description

增强生物防治的制剂
技术领域
本发明涉及植物栽培领域，特别是利用生物制剂(例如微生物)直接或间接促进植物生长的植物栽培。根据本发明的制剂包括种子与微生物例如细菌结合的组合物；以及包含细菌与粘合剂、缓冲剂等的颗粒。其他制剂包括含有微生物例如细菌的组合物并且适用于种子的包衣。
背景技术
将土壤和生长基质作为生命系统，而非具有适合植物生长的物理化学特性的惰性材料进行管理，现在被广泛认为是农场、温室和森林长期价值创造最佳实践的一个组成部分。土传微生物和微生物群落(即所谓的土壤微生物组)与植物相关微生物(即植物微生物组)的汇合，通过添加具有增强生物防治潜力的有益微生物来提供管理干预点，以替代化学品杀虫剂(例如噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫胺(Clothianidin))和杀真菌剂(例如咯菌腈(Fludioxonil)、苯醚甲环唑(Difenoconazole))、应力保护(包括增加对原本无法获得的营养库的可及性)或导致作物产量提高的植物生长调节。
因此，微生物接种物产品的市场不断增长。这些产品可以直接提供给生长基质，如土壤、沙子、泥炭等，或者它们可以被引入种子或幼苗，因为种子或幼苗可被部署到各种生长环境中。这些产品的益处和残效性必然取决于微生物的生存能力，以及它们在所投入的环境中生存和生长的能力，以便实现任何潜在的益处。
氮是所有生命形式普遍需要的关键元素。在所有种植系统中，植物的成功生长以及良好的收成都取决于大量氮肥的投入，以增加土壤中氮的利用率。
已经提出了各种氮肥。例如，WO 2017/200468(Arevo AB)描述了一种肥料，其包含至少一种碱性L-氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸，其中大部分碱性L-氨基酸内容物以其单磷酸盐形式存在。碱性L-氨基酸磷酸盐可以与粘合剂结合和/或提供为最外层作为包衣。本发明还涉及一种通过使碱性L-氨基酸磷酸盐可用于植物来增强植物生长的方法。
在自然生态系统中，植物的氮利用率受到生物、化学反应和土壤过程的复杂网络的调节。然而，在农业系统中，通过施肥有意添加氮，已被证明会改变土壤过程，进而以依赖于氮形式的方式改变植物-土壤连续统一体。这种依赖于氮形式的变化包括从寡营养型的细菌(偶尔具有固定大气中二氮气体的能力)转向富营养型，其中一些对植物有害并因此可能对作物生产造成负面影响。
换言之，为了促进植物生长而添加的细菌可能会受到所添加的肥料的负面影响，施肥的结果可能会减弱生长而非提高。
如上所述，很明显，以肥料的形式有意添加氮，以及通过空气中氮污染物的沉积无意添加氮，与植物生长促进微生物的生存能力和可预测性之间存在内在冲突。因此，在任何种植系统中，寻找稳健、有效的氮和有益微生物接种物的联合施用最好的情况是难以预料的，最坏的情况是使管理工具不兼容。这意味着施肥土壤将不可避免地限制含有有益微生物的产品的功能。同样，在种子包衣中加入有益微生物并不总是与在同一包衣中加入氮完全兼容。此外，添加与植物(例如大豆、豌豆或菜豆等豆科植物)形成共生的固氮细菌的特定菌株与在发育早期(在建立固氮共生关系之前)添加氮以促进此类植物的生长是不相容的。
在一些研究综述中已经讨论并描述了上述作用，参见例如Zahran的Rhizobium-Legume Symbiosis and Nitrogen Fixation under Severe Conditions and in an AridClimate(Microbiology and Molecular Biology Reviews,Dec 1999,p.968-989)。
植物肥料领域对环境友好的其他技术不断产生。例如，WO 2017/222464(SweTreeNutrition AB)描述了一种肥料，用于减少生长缓慢的植物施肥所需的资源，因为可以避免重复供应养分以及氮的泄漏。更具体地，所提出的肥料组合物包含沸石，其中至少一种碱性L-氨基酸已被吸附到其孔中。
Carlos Eduardo Flores-Tinoco等人(“Co-catabolism of arginine andsuccinate drives symbiotic nitrogen fixation”，可获得自https://www.biorxiv.org/content/10.1101/741314v1？versioned＝true，August 21,2019)是一篇关于细菌与作物植物之间共生关系的文章，特别是关于共生固氮的代谢蓝图。基于植物提供的精氨酸和琥珀酸的共分解代谢驱动内共生根瘤菌共生固氮的能量需求过程的代谢网络被描述为CATCH-N。在这篇文章中，得出的结论是精氨酸和琥珀酸的共同提供会刺激固氮酶活性。
Zhang等人(Frontiers in Plant Science,发表于2019年10月22:“Organic orInorganic Nitrogen and Rhizobia Inoculation Provide Synergistic GrowthResponse of a Leguminous Forb and Tree”)提出了有机和无机氮如何影响植物生长和共生固氮根瘤菌性能的研究。Zhang等人得出结论，所研究的物种对有机或无机N形式(或各种形式的无机N)反应良好，表明结瘤反应可能取决于植物物种，以及N供应和结瘤可以是协同的。
US 2013/0255338(Agrinos)描述了提高作物产量、增加植物防御过程和/或降低植物病原体水平的组合物。所述组合物包含微生物组合物和液体肥料，优选至少含有可溶性氮的液体肥料。在一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种产乳酸细菌、一种或多种固氮细菌和包含可溶性氮的液体肥料。在优选的实施方案中，所述组合物包含液体肥料和HYTa，其是微生物的联合体，包括乳酸菌(Lactobacteria)、固氮细菌、溶解/矿化钾源、磷源和有机碳源的微生物、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)菌株HD-1和HD-73以及哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。或者，使用HYTd，其被描述为包含12重量％的L-氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和苏氨酸)和5重量％的葡萄糖胺和壳聚糖。HYTd还优选包含一种或多种或全部可溶性矿物质(P、Ca、Mg、Zn、Fe和Cu)、酶和来自甲壳素消化过程的乳酸以及其他多糖。
尽管如此，在生物防治领域仍然需要确定可以减轻含氮肥料可能对促进生长的细菌的生存能力产生的负面影响的手段和方法。
发明内容
本发明涉及至少一种种子与至少一种微生物的组合，该组合物还包含一种或多种大量营养素，其中一种此类大量营养素包含碱性L-氨基酸形式的氮。具体而言，本发明涉及适合用作液体种子包衣组合物的组合物，例如缓释组合物。
因此，更具体地，在第一方面，本发明包括包含至少一种大量营养素和至少一种微生物的组合物，该大量营养素包括与磷结合的碱性L-氨基酸形式的氮。
在另一个方面，本发明涉及用至少一种选定的微生物、包含碱性L-氨基酸形式的氮的大量营养素和磷处理的种子。
在另一方面，本发明涉及一种用液体组合物处理种子的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供至少一种微生物；
b)提供包括碱性L-氨基酸形式的氮的大量营养素；
c)将所述至少一种微生物和大量营养素施用于至少一粒种子。
在另一方面，本发明涉及一种制造生长添加剂，例如种子包衣组合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供微生物接种物，其用作生长添加剂时增强植物的生长；
b)提供包含氮和任选的附加营养物的大量营养素；
c)将接种物和大量营养素与粘合剂结合；
其中大量营养素包含碱性L-氨基酸形式的氮。
在又另一方面，本发明涉及植物栽培方法，其中根据第一方面的组合物；或根据第二方面的生长添加剂与种子一起；以适合所述种子的特定生长需要的量添加到种植地点。
附图简述
图1显示了在其上测试巨大芽孢杆菌(B.megaterium)(左)和慢生型大豆根瘤菌(B.japonicum)(右)对L-精氨酸磷酸盐的生长响应的琼脂平板。
图2显示了巨大芽孢杆菌(左)和慢生型大豆根瘤菌(右)对
Figure BDA0003621308670000041
Complete浓度增加的生长响应，仅含有L-精氨酸作为氮源。
图3显示了巨大芽孢杆菌(左)和慢生型大豆根瘤菌(右)对RIKA-S浓度增加的生长响应，含硝酸盐和铵作为氮源。
图4显示了巨大芽孢杆菌(左)和慢生型大豆根瘤菌(右)对不同氮源(L-精氨酸磷酸盐“4.1”、
Figure BDA0003621308670000051
Complete“4.2”和RIKA-S“4.3”)的生长响应，部分添加了沸石“+”。
图5显示了巨大芽孢杆菌(左)和慢生型大豆根瘤菌(右)对不同氮源(L-精氨酸磷酸盐“5.1”、
Figure BDA0003621308670000052
Complete“5.2”和RIKA-S“5.3”)的生长响应，部分添加了7.4mM琥珀酸“+”。
图6显示了种植后105天大豆的地上部干重，这些大豆在种植时用不同的氮源(
Figure BDA0003621308670000053
Complete和RIKA-S)施肥。
图7显示了大豆根瘤的数量(7.1)和干重(7.2)。植物生长90天，并在营养阶段用不同的氮源(
Figure BDA0003621308670000054
Complete和RIKA-S)施肥。
图8显示了大豆豆荚的数量(8.1)和干重(8.2)。植物生长105天，并在种植时用不同的氮源(
Figure BDA0003621308670000055
Complete和RIKA-S)施肥。
图9显示了20天后的沙生植物的结瘤田间豆根的百分比(9.1)。显示播种57天后在土壤中生长的植物的各结瘤的颜色(粉红色或白色)(9.2)。植物在种植时用不同的氮源(
Figure BDA0003621308670000056
Complete和RIKA-S)施肥。
图10显示了在滤纸上6天后(10.1)或在沙子中10天后(10.2)部分包被10mg L-精氨酸磷酸盐/种子的大豆种子的发芽率。
具体实施方式
本发明涉及旨在缓解用于改善植物生长条件的含氮肥料和微生物不相容性的技术。本发明人惊奇地发现，某些形式的氮及其衍生物不会对有益微生物产生负面影响。此外，这些形式的氮似乎也在大范围浓度或添加率时刺激此类微生物的生长。
因此，在第一方面中，本发明涉及包含至少一种大量营养素和至少一种微生物的组合物，该大量营养素包括与磷结合的碱性L-氨基酸形式的氮。该微生物最好是选定的微生物，即被定义为对特定植物的生长有利的一种或多种微生物。下文将更详细地讨论合适的微生物。
碱性L-氨基酸可通过强分子间相互作用(例如共价键或氢键)与磷结合。下面提供了一些通用的粘合强度，用于说明目的。在一些实施方案中，最突出的分子相互作用选自氢键，其可定义为10-40kJ/mol范围内的极性键H-偶极电荷；和离子-偶极相互作用，这可由在40-600kJ/mol范围内的离子电荷-偶极电荷来定义。在一些实施方案中，分子间相互作用选自通常较弱的力，例如偶极-偶极相互作用，其可以由5-25kJ/mol范围内的偶极电荷定义；离子诱导的偶极相互作用，其可以由3-15kJ/mol范围内的离子电荷极化电子云定义；偶极诱导的偶极相互作用，其可以由2-10kJ/mol范围内的偶极电荷极化电子云定义；和色散力，即伦敦相互作用，其可以由0.05-40kJ/mol范围内的可极化电子云定义。
因此，本发明涉及碱性L-氨基酸通过上述一种或多种相互作用与磷结合的实施方案，例如，其中结合定义为约50％、约75％、约80％、约90％或约95％为本文例示的一种或多种分子相互作用。说明性范围为50-60％、50-75％、50-95％或50-98％的结合是上述一种或多种相互作用。在一些实施方案中，该结合定义为本文例示的一种或多种分子相互作用的至少50％、至少80％、至少90％或至少95％。
如本领域技术人员将理解的，这种相互作用将受到pH值和本发明组合物周围的其他条件影响。
因此，在本文中，短语“结合”被理解为不同于碱性L-氨基酸和磷与许多其他组分一起添加到组合物中的情况，在这种情况下其他组分的联合作用将被削弱。具体而言，从功能的角度来看，术语“结合”在本文中被理解为一种连接，它在作为肥料提供给生长植物之前，防止大多数碱性L-氨基酸被酶(例如精氨酸酶)降解。在一些实施方案中，组合物中存在的至少约50％碱性L-氨基酸与本文定义的磷结合。在一些实施方案中，组合物中存在的至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％或基本上全部(例如超过约99％)碱性L-氨基酸与本文定义的磷结合。说明性范围为组合物中存在的碱性L-氨基酸的50-60％、50-70％、60-70％、60-80％、60-75％、70-80％、70-90％、70-85％、80-90％、80-95％、85-90％、85-95％、90-95％、90-98％、95-98％或98-99％与本文定义的磷结合。
因此，本发明利用与磷的结合来延长碱性L-氨基酸对源于种子的生长植物的积极作用的持续时间。因此，根据本发明的组合物提供了以碱性L-氨基酸形式提供的氮的长期作用，因此可以被认为是缓释组合物。在本文中，积极作用是指碱性L-氨基酸增强植物生长而没有致死作用(即，对已知增强植物生长的微生物的毒性)的能力。
本发明的组合物可以是肥料，例如液体肥料组合物。或者，所述组合物可以配制成固体组合物，例如固体肥料，或者其可以与水结合以提供液体组合物。根据本发明的液体组合物可以是种子包衣组合物，其适于通过任何期望的方式例如通过包衣(例如喷涂)或通过用其浸泡种子来施用于种子。
因此，如果碱性L-氨基酸是精氨酸，则与磷结合的碱性L-氨基酸可以是精氨酸磷酸盐，例如精氨酸单磷酸盐和/或精氨酸多磷酸盐。类似地，如果碱性氨基酸是赖氨酸，与磷结合的碱性L-氨基酸可以是赖氨酸磷酸盐，例如赖氨酸单磷酸盐和/或赖氨酸多磷酸盐。然而，正如技术人员所理解的，还有可以将碱性L-氨基酸与磷结合的其他静电相互作用。例如，通过共价偶联，与磷结合的碱性L-氨基酸可以是磷酸精氨酸或磷酸赖氨酸。
在本发明的组合物中，微生物可以选自任何固氮细菌，例如共生细菌，包括与豆科植物结合的根瘤菌属(Rhizobium)；与某些双子叶物种结合的弗兰克氏菌属(Frankia)，和与谷类草结合的某些固氮螺菌属(Azospirillum)物种；或独立生存的(非共生)细菌，包括蓝藻细菌项圈藻(cyanobacteria Anabaena)和念珠藻属(Nostoc)以及固氮菌属(Azotobacter)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)和梭菌属(Clostridium)。例如，微生物可属于芽孢杆菌属。
如上所述，本发明的组合物可以是固体或液体组合物，其中微生物可以以其各自发育阶段的任何所需形式存在。因此，本发明的组合物可以包括例如，一种或多种选定物种的休眠孢子或活细菌。有利地，组合物包含细菌，例如在孢子发育阶段，在接种物中，优选在载体例如聚合物或其他支撑结构中。这种结构在生物防治领域是众所周知的，包括具体的实例，例如藻酸盐。如本领域技术人员将理解的，例如，如果制备干燥组合物并提供用于之后在使用前溶于水中，干燥形式的微生物可是优选的。
根据本发明的组合物中存在的碱性L-氨基酸可以是任何碱性L-氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸；有利的是精氨酸。精氨酸可以是衍生化的或与另一种大量营养素反应。因此，根据本发明的组合物可包含精氨酸的磷酸盐，例如精氨酸多磷酸盐或精氨酸单磷酸盐。
虽然已知精氨酸是一种促进生长的大量营养素，但直到现在它还没有被认为是一种能够保护促进生长的微生物免受通常与含氮添加剂相关的毒性的物质。
将碱性L-氨基酸(例如精氨酸或精氨酸单磷酸盐)与缓冲剂(例如微孔铝硅酸盐矿物)结合似乎提供了额外的优点。因此，本发明的组合物可包括与沸石结合的有机含氮结构，例如精氨酸或精氨酸单磷酸盐。沸石可用天然材料或合成结构，本发明不限于任何特定形式的沸石。有利地，根据本发明的组合物包括能够装载精氨酸单磷酸盐的沸石，例如，如上述WO 2017/222464中所述。
在更广泛的方面，本发明还包括使用与不以碱性L-氨基酸形式存在的氮结合的沸石，如图4所示。因此，这种效果可用于包含任何化学结构的氮的组合物和颗粒，例如硝酸铵或碱性L-氨基酸与其他形式的氮的混合物。
本发明的另一个方面是用至少一种选定的微生物、包含碱性L-氨基酸的氮的大量营养素和磷处理的种子。根据本发明的种子可以用如上详细描述的组合物包衣或以其他方式处理，和/或如下所述的方式制备。
或者，根据本发明的种子可包含至少一层所述至少一种微生物和至少一层所述与磷结合的碱性L-氨基酸形式的氮。以上提供的关于这种结合的化学和有利效果的所有细节和实施例也适用于本发明的这一方面。
本发明的种子可以例如以任何合适的方式用所述至少一种微生物的水溶液浸泡、喷雾或处理。与磷结合的碱性L-氨基酸形式的氮可以作为单独的层施用，例如在水溶液中，其以任何其他合适的方式喷雾或施用到处理过的种子上。
如上所述，碱性L-氨基酸通过静电相互作用有利地与磷结合。本申请其他位置提供的关于这种结合类型的所有细节也适用于本发明的这一方面。因此，与磷结合的碱性L-氨基酸可以是精氨酸磷酸盐和/或磷酸精氨酸。或者，与磷结合的碱性L-氨基酸可以是赖氨酸磷酸盐和/或磷酸赖氨酸。
本发明的另一方面是一种用液体组合物处理种子的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供至少一种微生物，例如选定的微生物；
b)提供包括碱性L-氨基酸的形式的氮的大量营养素；
c)将所述至少一种微生物和大量营养素施用于至少一粒种子。
步骤c)可以包括将所述至少一种微生物和大量营养素与粘合剂结合以提供用于施用于所述至少一粒种子的液体组合物。在一个有利的实施方案中，将微生物与粘合剂结合的步骤包括造粒。
如上所述，微生物可以是固氮细菌，碱性L-氨基酸可以有利地是精氨酸或赖氨酸。如本领域技术人员将理解的，微生物是基于它们作为源于处理过的种子的植物的生长促进剂的性质来选择的。本申请其他位置提供的关于微生物的所有细节同样适用于本发明的这个方面。
步骤b的大量营养素可以有利地进一步包含磷，例如通过静电相互作用与碱性L-氨基酸结合的磷。上面提供的关于这种结合的化学和有利效果的所有细节和实施例也适用于本发明的这个方面。
本方法可以包括用磷处理种子的步骤，分别或与大量营养素同时处理。
根据本发明的方法可以是循环过程，包括如下的至少一个循环：施用大量营养素，例如，在水溶液中；施用磷，例如在水溶液中；以及在所述施用之间干燥种子的任选步骤。
微生物可以在大量营养素和磷之前施用于种子，例如通过用包含微生物的水溶液浸泡种子。或者，大量营养素和磷可在将其施用于种子之前混合，例如在水溶液中。
在另一方面，本发明涉及一种制造生长添加剂，例如上述组合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供微生物接种物，其用作生长添加剂时增强植物的生长；
b)提供包含氮的大量营养素和任选地附加大量营养素；和
c)将接种物和大量营养素与粘合剂结合；
其中大量营养素包含碱性L-氨基酸形式的氮。
本发明的生长添加剂可以在其制造过程中，或者在稍后的时间点例如在种植园结合一个或多个种子。如本领域技术人员将理解的，在本申请其他位置提供的涉及种子的所有细节也同样适用于这个方面，例如分层、添加成分的顺序等。
有利地，根据众所周知的方法，将接种物与粘合剂结合的步骤还可以包括造粒。
本发明的方法中提供的微生物因其有利的生长增强特性而被选定，并且可以是任何细菌，例如上述的固氮细菌。具体来说，微生物可属于根瘤菌属或芽孢杆菌属。
本方法中提供的碱性L-氨基酸可以是上述形式中的任何一种，例如精氨酸、精氨酸磷酸盐、例如精氨酸单磷酸盐。
碱性L-氨基酸的单磷酸盐可由技术人员根据众所周知的方法轻易地制备。这种氨基酸单磷酸盐可以是结晶的，即盐。或者，可使用共价偶联来制备氨基酸单磷酸盐。此外，本申请其他位置提供的所有细节，例如关于第一方面，关于碱性L-氨基酸与磷的结合的所有细节同样适用于本发明的这个方面。
适用于根据本发明的方法的粘合剂在该领域是众所周知的，并且技术人员可以轻易地选择合适的材料。因此，粘合剂可以例如选自聚合物，例如合成聚合物或天然聚合物，例如糖或碳水化合物；盐类；和矿物质。
制备碱性L-氨基酸的磷酸盐的方法可以是例如WO2017/200468和WO2017/200467中所述。
此外，本方法中提供的碱性L-氨基酸可与微孔铝硅酸盐矿物如沸石结合，如上文关于本发明的第一方面所讨论的。
在第三方面，本发明涉及植物栽培方法，其中根据第一方面的组合物或根据第二方面的生长添加剂与种子一起以适合所述种子的特定生长需要的量添加到种植地点。以上关于本发明的第一和第二方面讨论的所有细节也适用于该方面。
这种方法的效果是由于植物的生物防治得到提高，植物的整体生长得到提高，其中以不会干扰微生物有益效果的形式提供刺激生长的氮。这种方法也是一种环境友好的促进生长的方法，因为氮以从生长环境中泄漏最少的形式提供，并且可以避免化学制剂。
附图详述
图1表明了作为唯一氮源的L-精氨酸磷酸盐对两种不同细菌生存的影响。更具体而言，在LB琼脂上点样不同稀释度的巨大芽孢杆菌(左列)和慢生型大豆根瘤菌(右列)，OD600范围为10-1至10-6。LB琼脂含有不同浓度的精氨酸磷酸盐增补物，这里称为“处理1”。下表列出了不同的N增补物浓度:
处理 N增补物 N增补物浓度 N增补物形式
1 无 无 无
1.1 L-精氨酸磷酸盐 700mmol N/l 精氨酸单磷酸盐
1.2 L-精氨酸磷酸盐 600mmol N/l 精氨酸单磷酸盐
1.3 L-精氨酸磷酸盐 500mmol N/l 精氨酸单磷酸盐
1.4 L-精氨酸磷酸盐 400mmol N/l 精氨酸单磷酸盐
1.5 L-精氨酸磷酸盐 300mmol N/l 精氨酸单磷酸盐
1.6 L-精氨酸磷酸盐 200mmol N/l 精氨酸单磷酸盐
1.7 L-精氨酸磷酸盐 100mmol N/l 精氨酸单磷酸盐
通过观察圆形菌落的出现，分别在24小时(巨大芽孢杆菌)和3天(慢生型大豆根瘤菌)后分析细菌的生长。
处理1作为对照，因为在LB琼脂中不添加额外的N增补物。在巨大芽孢杆菌的10-1至10-3稀释度和慢生型大豆根瘤菌的10-1至10-4稀释度中观察到细菌的生长，可通过圆形白色菌落的出现观察到。在慢生型大豆根瘤菌斑点中，接近10-6标记的明显白色球形是污染物，通过微生物不同的形状和结构清晰可见。对于图1-4所示的结果，这个对照是相同的，因为实验是平行进行的。
测试的最高浓度，700mmol N/l的精氨酸磷酸盐(处理1.1)导致巨大芽孢杆菌的生长达到10-2稀释度，而慢生型大豆根瘤菌则完全没有生长。在处理1.2(600mmol N/l精氨酸磷酸盐)中，巨大芽孢杆菌仅在10-1稀释度生长，未观察到慢生型大豆根瘤菌生长。两种细菌菌株在处理1.3(500mmol N/l精氨酸磷酸盐)都显示出生长。巨大芽孢杆菌在稀释度10-3时表现出菌落生长，而慢生型大豆根瘤菌仅在10-1时表现出少量菌落。在处理1.4(400mmol N/l的精氨酸磷酸盐)中，细菌生长总体上更强，其中巨大芽孢杆菌的菌落生长高达10-3的稀释度以及慢生型大豆根瘤菌高达10-2稀释度。在处理1.5(300mmol N/l的精氨酸磷酸盐)中也出现了类似的观察结果，其中巨大芽孢杆菌的菌落生长达到10-3稀释度，而慢生型大豆根瘤菌的菌落生长达到10-2稀释度。处理1.6(200mmol N/l精氨酸磷酸盐)在10-4稀释度下减弱了两种菌株的细菌生长。降低处理1.7中的N浓度(100mmol N/l精氨酸磷酸盐)导致两种菌株直至10-4稀释度仍然生长。
总而言之，根据本发明的结果，精氨酸磷酸盐在最大测试浓度700mmol N/l时对巨大芽孢杆菌没有致命毒性。同样，在500mmol N/l精氨酸磷酸盐浓度时在慢生型大豆根瘤菌的培养过程中看不到致死效应。
图1显示了在LB琼脂上点样不同稀释度的巨大芽孢杆菌(左列)和慢生型大豆根瘤菌(右列)的结果，OD600范围为10-1到10-6。LB琼脂含有不同浓度的
Figure BDA0003621308670000121
Complete增补物(可从Arevo AB获得)，在此称为“处理2”。下表列出了不同的N增补物浓度：
Figure BDA0003621308670000122
通过观察圆形菌落的出现，分别在24小时(巨大芽孢杆菌)和3天(慢生型大豆根瘤菌)后分析细菌的生长。
处理2作为对照，因为没有向LB琼脂中添加额外的N增补物。在巨大芽孢杆菌的10-1至10-3稀释度和慢生型大豆根瘤菌的10-1至10-4稀释度中观察到细菌的生长，可通过圆形白色菌落的出现观察到。在慢生型大豆根瘤菌斑点中，接近10-6标记的明显白色球形是污染物，通过微生物不同的形状和结构清晰可见。对于图1-4所示的结果，这个对照是相同的，因为实验是平行进行的。
Figure BDA0003621308670000123
Complete的测试的N浓度范围为700mmol N/l(处理2.1)至400mmol N/l(处理2.4)，在两种菌株中均防止细菌生长。在处理2.5(300mmol N/l的
Figure BDA0003621308670000124
Complete)中可以观察到细菌的生长，其中巨大芽孢杆菌的菌落生长达到10-2稀释度，而慢生型大豆根瘤菌的菌落生达到10-1稀释度。与以10-1稀释度存在的真正慢生型大豆根瘤菌菌落部分重叠的明显白色菌落是污染的结果。处理2.6(200mmol N/l的
Figure BDA0003621308670000131
Complete)在10-5稀释度终止了巨大芽孢杆菌的细菌生长，在10-3稀释度终止了慢生型大豆根瘤菌的细菌生长。降低处理2.7中的N浓度(100mmol N/l的
Figure BDA0003621308670000132
Complete)导致两种菌株直至稀释度10-3仍然生长。总而言之，浓度直到300mmol N/l的
Figure BDA0003621308670000133
Complete不会对巨大芽孢杆菌和慢生型大豆根瘤菌产生致命毒性。
图2显示了在LB琼脂上点样不同稀释度的巨大芽孢杆菌(左列)和慢生型大豆根瘤菌(右列)的结果，OD600范围为10-1到10-6。LB琼脂含有不同浓度的RIKA-S增补物，在此称为“处理3”。下表列出了不同的N增补物浓度：
处理 N增补物 N增补物浓度 N增补物形式
3 无 无 无
3.1 RIKA-S 700mmol N/l 硝酸胺
3.2 RIKA-S 600mmol N/l 硝酸胺
3.3 RIKA-S 500mmol N/l 硝酸胺
3.4 RIKA-S 400mmol N/l 硝酸胺
3.5 RIKA-S 300mmol N/l 硝酸胺
3.6 RIKA-S 200mmol N/l 硝酸胺
3.7 RIKA-S 100mmol N/l 硝酸胺
通过观察圆形菌落的出现，分别在24小时(巨大芽孢杆菌)和3天(慢生型大豆根瘤菌)后分析细菌的生长。
处理3作为对照，因为没有向LB琼脂中添加额外的N增补物。在巨大芽孢杆菌的10-1至10-3稀释度和慢生型大豆根瘤菌的10-1至10-4稀释度中观察到细菌的生长，可通过圆形白色菌落的出现观察到。在慢生型大豆根瘤菌斑点中，接近10-6标记的明显白色球形是污染物，通过微生物不同的形状和结构清晰可见。对于图1-4所示的结果，这个对照是相同的，因为实验是平行进行的。
RIKA-S的测试N浓度为700mmol N/l(处理3.1)至200mmol N/l(处理3.6)，对两种菌株均有致命毒性，因此抑制了细菌生长。处理3.3中可见的点不是由细菌生长引起的，而是由LB琼脂中的空气夹杂物引起的。只有在处理3.7(100mmol N/l的RIKA-S)中才能观察到细菌生长，其中巨大芽孢杆菌的菌落生长达到10-3稀释度，慢生型大豆根瘤菌的菌落生长达到10-2稀释度。
总而言之，含有铵和硝酸盐作为氮源的典型商业肥料RIKA-S从已超过100mmol N/l的浓度开始对巨大芽孢杆菌和慢生型大豆根瘤菌产生致命毒性，因此显示出是测试的对巨大芽孢杆菌和慢生型大豆根瘤菌生存最致命的N增补物。
图3说明了在LB琼脂上点样不同稀释度的巨大芽孢杆菌(左列)和慢生型大豆根瘤菌(右列)的结果，OD600范围为10-1到10-6。LB琼脂含有不同浓度的各种N增补物形式以及200mg未装载的沸石，其只有部分添加(用“+”标记)。下表列出了不同的增补物(“处理4”)：
Figure BDA0003621308670000141
通过观察圆形菌落的出现，分别在24小时(巨大芽孢杆菌)和3天(慢生型大豆根瘤菌)后分析细菌的生长。
处理4和4+作为对照，因为没有向LB琼脂中添加额外的N增补物。处理4+还含有200mg沸石作为LB琼脂中的增补物。在处理4中，在巨大芽孢杆菌的10-1至10-3稀释度和慢生型大豆根瘤菌的10-1至10-4稀释度中观察到细菌的生长，可通过圆形白色菌落的出现观察到。在慢生型大豆根瘤菌斑点中，接近10-6标记的明显白色球形是污染物，通过微生物不同的形状和结构清晰可见。对于图1-4所示的结果，这个对照是相同的，因为实验是平行进行的。添加200mg沸石(处理4+)后，两种菌株均表现出相似的生长反应，巨大芽孢杆菌生长达到10-3稀释度，慢生型大豆根瘤菌生长达到10-4稀释度。
将400mmol N/l的L-精氨酸磷酸盐添加到LB培养基中导致巨大芽孢杆菌生长直到10-3稀释度以及慢生型大豆根瘤菌生长直到10-2稀释度(处理4.1)。补充200mg沸石(处理4.1+)增加了两种菌株对L-精氨酸磷酸盐的耐受性并促进细菌生长，分别直到10-3稀释度和10-4稀释度。在400mmol N/l的
Figure BDA0003621308670000151
Complete(处理4.2)上，两种菌株均未检测到生长。在补充400mmol N/l
Figure BDA0003621308670000152
Complete(处理4.2+)的LB培养基中可以看到沸石相似的积极作用。当加入沸石时，巨大芽孢杆菌生长直到10-2稀释度，以及慢生型大豆根瘤菌生长直到10-1稀释度。两种细菌都在补充100mmol N/l RIKA-S的LB琼脂上生长，达到10-3稀释度(巨大芽孢杆菌)和10-1稀释度(慢生型大豆根瘤菌)(处理4.3)。200mg沸石对细菌生长的积极作用抵消了RIKA-S的毒性作用，在处理4.3+中可见。巨大芽孢杆菌直到10-5稀释度显示出细菌生长，以及慢生型大豆根瘤菌直到10-2稀释度显示出细菌生长。
总而言之，观察到当LB琼脂中存在沸石时，由于高N浓度而导致的细菌总体致死性降低。
图5表明了在LB琼脂上点样不同稀释度的巨大芽孢杆菌(左列)和慢生型大豆根瘤菌(右列)的结果，OD600范围为10-1到10-6。LB琼脂中含有不同浓度的多种N增补物形式以及7.4mM琥珀酸(仅部分添加(“+”))。下表列出了不同的增补物(“处理5”)：
Figure BDA0003621308670000153
Figure BDA0003621308670000161
通过观察圆形菌落的出现，分别在24小时(巨大芽孢杆菌)和4天(慢生型大豆根瘤菌)后分析细菌的生长。
处理5和5+作为对照，因为没有向LB琼脂中添加额外的N增补物。处理4+还含有200mg沸石作为LB琼脂中的增补物。处理5+含有7.4mM无菌过滤的琥珀酸作为LB琼脂中的增补物。在处理5中，在巨大芽孢杆菌的10-1至10-4稀释度和慢生型大豆根瘤菌的10-1至10-5稀释度中观察到细菌的生长，可通过圆形白色菌落的出现观察到。添加琥珀酸(处理5+)后，两种菌株的生长均减弱。
将100mmol N/l的L-精氨酸磷酸盐添加到LB培养基中(处理5.1)导致巨大芽孢杆菌生长直到10-2稀释度，以及慢生型大豆根瘤菌生长直到10-5稀释度(处理5.1)。琥珀酸的补充(处理5.1+)阻止了两种菌株的生长。
LB培养基中添加100mmol N/l
Figure BDA0003621308670000162
Complete(处理5.2)导致巨大芽孢杆菌生长直到10-3稀释度，以及慢生型大豆根瘤菌生长直到10-2稀释度。补充琥珀酸(处理5.2+)阻止了两种菌株的生长。向LB培养基中加入50mmol N/l的RIKA-S(处理5.3)导致巨大芽孢杆菌生长直到10-3稀释度，以及慢生型大豆根瘤菌生长直到10-5稀释度(处理5.3)。补充琥珀酸(处理5.3+)阻止了两种菌株的生长。总而言之，观察到向细菌生长培养基中添加琥珀酸会损害细菌的生长，并且不会增强细菌的生存能力。
图6表明了温室条件下在低N盆栽基质
Figure BDA0003621308670000171
(Hasselfors Garden)中生长105天的大豆地上部干重。所有种子都接种了根瘤菌。显示的对照植物未施肥。如所示，其他植物用30kg N/ha
Figure BDA0003621308670000172
Complete或RIKA-S施肥。与未处理的对照相比，在种植时使用
Figure BDA0003621308670000173
Complete处理导致大豆的地上部生物量生产增加。与对照相比，RIKA-S施肥并未提高生物量生产。
因此，与对照相比，使用
Figure BDA0003621308670000174
Complete施肥导致在测试条件下产生了最高的生物量生产，并且是唯一增加大豆的地上部生物量的肥料。
图7表明了温室条件下在低N盆栽基质
Figure BDA0003621308670000175
(Hasselfors Garden)中生长90天的植物大豆根瘤数量和干重。所有种子都接种了根瘤菌。显示的对照植物未施肥。如所示，在营养生长阶段，其他植物用30kg N/ha
Figure BDA0003621308670000176
Complete或RIKA-S施肥。
与对照相比，大豆植株的施肥增加了根瘤的数量(图7.1)。用
Figure BDA0003621308670000177
Figure BDA0003621308670000178
Complete处理导致每个根产生229个结瘤，而用RIKA-S处理导致每个根产生129个结瘤。此外，用
Figure BDA0003621308670000179
Complete施肥后，根瘤干重也大大增加(图7.2)。
可以得出结论，
Figure BDA00036213086700001710
Complete表现为根瘤发育方面最佳的肥料，因为
Figure BDA00036213086700001711
Complete导致与对照条件相比根瘤数量增加4倍，根瘤干重增加16倍。
图8表明了温室条件下在低N盆栽基质
Figure BDA00036213086700001712
(Hasselfors Garden)中生长105天的植物的大豆豆荚数量和干重。所有种子都接种了根瘤菌。显示的对照植物未施肥。如所示，其他植物在种植时用30kg N/ha
Figure BDA00036213086700001713
Complete或RIKA-S施肥。
大豆植物的施肥仅在使用
Figure BDA00036213086700001714
Complete施肥时才会增加豆荚数量(图8.1)。这种处理导致每株植物产生45个豆荚，而用RIKA-S处理产生22个豆荚。此外，仅在使用
Figure BDA00036213086700001715
Complete施肥后，豆荚干重显著增加(图8.2)。
可以得出结论，
Figure BDA0003621308670000181
Complete表现为植物产量方面最佳的肥料，因为与对照条件相比，
Figure BDA0003621308670000182
Complete导致大豆豆荚数量和干重增加1,3倍。
图9.1表明了显示根瘤的田间豆类植物的百分比。植物在温室条件下在沙子中生长20天。所有种子都接种了根瘤菌。显示的对照植物未施肥。如所示，其他植物在种植时用30kg N/ha
Figure BDA0003621308670000183
Complete或RIKA-S施肥。对照和RIKA-S处理的植物均未在早期植物发育阶段表现出任何根瘤。只有使用
Figure BDA0003621308670000184
Complete处理才能在80％的植物根部形成结瘤。
在低N盆栽基质
Figure BDA0003621308670000185
(Hasselfors Garden)中生长的57天龄植株在该时间点都显示出根瘤形成(图9.2)。在对照植物以及
Figure BDA0003621308670000186
Complete处理的植物中，对结瘤进行解剖后显示只有粉红色的结瘤组织，但在RIKA-S处理的植物中，显示白色和粉红色混合的结瘤组织。结瘤组织的颜色(红色表示有活性的，白色表示没有活性的)表明细菌能够从空气中有活性地固定二氮的能力。因此，仅在RIKA-S处理中观察到有活性的和没有活性的根瘤的混合。
因此，可以得出结论，与对照相比，
Figure BDA0003621308670000187
Complete的处理通过在更早的时间点促进结瘤从而明确影响结瘤的形成。此外，
Figure BDA0003621308670000188
Complete与RIKA-S相反，似乎对结瘤活性没有负面影响。
图10显示了根据本发明的组合物的结果。大豆种子包被10mg L-精氨酸磷酸盐和根际细菌。与未包衣但经过接种的种子相比，评估了包衣种子的发芽情况。评估在滤纸上6天后(图10.1)或在沙子中10天后(图10.2)的种子发芽情况。在这两种情况下，与对照相比，当种子包被L-精氨酸磷酸盐时，发芽率都增加了。
总而言之，L-精氨酸磷酸盐包衣层对大豆种子发芽具有有益作用。
试验性
提供以下实施例仅用于说明目的，不应解释为限制本发明，本发明由所附权利要求限定。在本申请的下文或其他位置提供的所有参考文献在此通过引用纳入本文。
实施例1：不同氮源对细菌生存的影响
市售的巨大芽孢杆菌MVY-011(从BACTO-K，Bioenergy分离)和慢生型大豆根瘤菌(从RhizoFix RF-10，Feldsaaten Freudenberger分离)细菌菌株在3ml无菌、液体LB培养基(pH 7.0)中于28℃和200rpm下过夜生长。培养过夜后，通过分析光密度(OD600)来检查细菌的生长。用纯化和无菌水将细菌培养物调节至OD600为10-1。进行一系列稀释，最终至10-6稀释度，分别对巨大芽孢杆菌和慢生型大豆根瘤菌培养物进行总共6个稀释步骤。
在无菌条件下制备固体15ml LB琼脂平板。部分添加不同的氮(N)源(表1)。阳性对照不含任何添加的氮源。用不同的N源补充所有其他琼脂平板(表1)。
表1：将不同的氮增补物添加到固体LB琼脂中以监测巨大芽孢杆菌和慢生型大豆 根瘤菌的生长。
Figure BDA0003621308670000191
将N增补物作为无菌过滤溶液(孔径为0.2微米)添加到之前在无菌条件下在层流中高压蒸汽处理的LB琼脂中。添加不同浓度的增补物，以在各培养皿中获得700mmol N/l、600mmol N/l、500mmol N/l、400mmol N/l、300mmol N/l、200mmol N/l和100mmol N/l的最终摩尔浓度。
随后通过在无菌条件下使用多通道移液管以不同的N浓度在琼脂上点接5μl的细菌稀释液。干燥平板后，将其密封并在28℃下培养。在24小时后对巨大芽孢杆菌进行拍照。在3天后对慢生型大豆根瘤菌进行拍照。
实施例2：通过沸石减少氮对细菌生长的毒性作用
市售的巨大芽孢杆菌MVY-011(从BACTO-K，Bioenergy分离)和慢生型大豆根瘤菌(从RhizoFix RF-10，Feldsaaten Freudenberger分离)细菌菌株在3ml无菌、液体LB培养基(pH 7.0)中于28℃和200rpm下过夜生长。培养过夜后，通过分析光密度(OD600)来检查细菌的生长。用纯化和无菌水将细菌培养物调节至OD600为10-1。进行一系列稀释，最终至10-6稀释度，分别对巨大芽孢杆菌和慢生型大豆根瘤菌培养物进行总共6个稀释步骤。在无菌条件下制备固体15ml LB琼脂平板。分别添加不同的氮源(表1)。N增补物作为无菌过滤溶液(孔径为0.2微米)添加到之前在无菌条件下在层流中高压蒸汽处理的LB琼脂中。添加不同浓度的增补物以在各培养皿中获得400mmol N/l和100mmol N/l的最终摩尔浓度。一些琼脂板含有200mg高压蒸汽处理的、精细研磨的沸石，这些沸石在制备板时混合在琼脂溶液中。
随后通过在无菌条件下使用多通道移液管以不同的N浓度在琼脂上点接5μl的细菌稀释液。干燥平板后，将其密封并在28℃下培养。在24小时后对巨大芽孢杆菌进行拍照。在3天后对慢生型大豆根瘤菌进行拍照。
实施例3：添加琥珀酸会阻碍细菌在测试氮源上的生长
市售的巨大芽孢杆菌MVY-011(从BACTO-K，Bioenergy分离)和慢生型大豆根瘤菌(从RhizoFix RF-10，Feldsaaten Freudenberger分离)细菌菌株在3ml无菌、液体LB培养基(pH 7.0)中于28℃和200rpm下过夜生长。培养过夜后，通过分析光密度(OD600)来检查细菌的生长。用纯化和无菌水将细菌培养物调节至OD600为10-1。进行一系列稀释，最终至10-6稀释度，分别对巨大芽孢杆菌和慢生型大豆根瘤菌培养物进行总共6个稀释步骤。
在无菌条件下制备固体15ml LB琼脂平板。部分添加不同的氮源(表1)。
将N增补物作为无菌过滤溶液(孔径为0.2微米)添加到之前在无菌条件下在层流中高压蒸汽处理的LB琼脂中。添加不同浓度的增补物以在各培养皿中获得100mmol N/l或50mmol N/l的最终摩尔浓度。在制备平板后，部分将溶解在水中的无菌过滤的(孔径为0.2微米)琥珀酸(Sigma-Aldrich，≥99.0％)混合到琼脂溶液中，至最终浓度为7.4mM。
随后通过在无菌条件下使用多通道移液管以不同的N浓度在琼脂上点接5μl的细菌稀释液。干燥平板后，将其密封并在28℃下培养。在24小时后对巨大芽孢杆菌进行拍照。在4天后对慢生型大豆根瘤菌进行拍照。
实施例4：
Figure BDA0003621308670000211
Complete对植物生物量、根瘤数量和植物产量的积极影响
根据制造商的说明用RhizoFix RF-10(Feldsaaten Freudenberger)处理大豆(variety Alexa，
Figure BDA0003621308670000212
AB)以接种种子。然后将一粒大豆种子种植在含有3升低N盆栽基质
Figure BDA0003621308670000213
(Hasselfors Garden)的盆中。添加了蛭石作为顶层，并使用Nemablom(Bionema)作为一次性处理剂对盆进行初始浇水。如所示，植物在温室中生长并每天浇水90或105天。通过添加
Figure BDA0003621308670000214
Complete或RIKA-S(表2)，用不同的氮源对植物施肥一次。选择两个不同的时间点施用肥料：播种时或大豆营养生长阶段(播种后33天)。对照植物被接种但未施肥。
表2：在种植时或营养生长阶段向大豆盆中添加了不同的氮增补物。
Figure BDA0003621308670000215
在收获植物后进行不同的测量。植物地上组织(不包括豆荚)在105天后收获，并在50℃下干燥两周。之后记录干燥植物材料的重量。提供的数据来自在种植阶段施肥的植物。
为评估与根相关的结瘤的数量和干重，将植物的根在水中清洗，并在90天后清洗掉泥土。计数整个根部的结瘤，然后从根部切下。收集的结瘤在50℃干燥2周，然后称重。提供的数据来自在营养阶段施肥的植物。
在种植后第105天计数出现的豆荚数。之后，收获豆荚，在50℃下干燥2周，然后称重。提供的数据来自种植时施肥的植物。
实施例5：
Figure BDA0003621308670000216
Complete对根瘤形成和活性的积极影响
根据制造商的说明，用RhizoFix RF-20(Feldsaaten Freudenberger)处理田间豆类(Vicia faba、Boxer、
Figure BDA0003621308670000221
)以接种种子。将五粒田间豆类种子种植在一个装有3升沙子的盆中，并在种植时用不同的氮源施肥(表2)。对照植物已接种但未施肥。20天后，计数沿根部生长结瘤的植物数量。
种植时未接种但根据表2施肥的田间豆类平行生长。在一个含有3升低N盆栽基质
Figure BDA0003621308670000223
(Hasselfors Garden)的盆中加入2粒种子。对照植物不施肥。57天后检查根部，并用剃刀片解剖已形成的结瘤。结瘤组织的颜色(红色表示有活性的，白色表示没有活性的)表明细菌从空气中有活性地固定二氮的能力。选择的图片是代表性图片，不显示定量测量。
实施例6：根据本发明的组合物的制备
使用带有Sp急速泵传动5206(Heidolph)泵连接用于粘合剂分配的ConceptML2000包衣机(Satec)对大豆(variety Alexa，
Figure BDA0003621308670000222
AB)种子按批次进行包衣。将L-精氨酸磷酸盐细粉(表1)称重至相当于每个大豆种子10mg L-精氨酸磷酸盐粉末的量。此外，添加1％羧甲基纤维素(CMC，AkucellAF 1505LV，Nouryon)作为粘合剂。使用RhizoFixRF-10(Feldsaaten Freudenberger)作为包衣过程的液体。
CMC粉末与L-精氨酸磷酸盐粉末充分混合。然后将种子放入包衣机并加入液体直至种子变湿。将粉末混合物添加到种子中直到它们不再发粘。然后加入更多的液体，直到种子再次变粘。重复这个循环，直到所有粉末都与种子结合。在添加最后的粉末后添加最后的液体喷雾。对照种子未包衣但根据制造商的说明用RhizoFix RF-10(FeldsaatenFreudenberger)接种。将种子彻底干燥并在滤纸上发芽。6天后，计算总共10粒种子的发芽率。同时，将20粒种子种植在沙子中并在温室中生长。10天后评估发芽率。

Claims (31)

1.一种包含至少一种大量营养素和至少一种微生物的组合物，该大量营养素包括与磷结合的碱性L-氨基酸形式的氮。
2.根据权利要求1所述的组合物，其为液体种子包衣组合物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其为缓释组合物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述至少一种微生物是选定的微生物，例如固氮细菌。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述至少一种微生物以孢子的形式存在。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述至少一种微生物存在于接种物中，优选存在于载体例如聚合物或其他支撑结构内。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述碱性L-氨基酸是精氨酸或赖氨酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述碱性L-氨基酸通过静电相互作用与磷结合。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述与磷结合的碱性L-氨基酸是精氨酸磷酸盐，例如精氨酸单磷酸盐和/或精氨酸多磷酸盐。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述与磷结合的碱性L-氨基酸是磷酸精氨酸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述与磷结合的碱性L-氨基酸以与微孔铝硅酸盐矿物例如沸石的混合物存在。
12.一种用至少一种选定的微生物、包含碱性L-氨基酸形式的氮的大量营养素和磷处理的种子。
13.根据权利要求12所述的种子，其中所述处理包括将至少一层选定的微生物、至少一层所述碱性L-氨基酸形式的氮和至少一层包含磷，任选地在其之间的中间层施用到种子上。
14.根据权利要求12所述的种子，其已经被处理过，例如包被根据权利要求1至11中任一项所述的组合物。
15.根据权利要求12中任一项所述的种子，其包含至少一层所述至少一种微生物和至少一层所述与磷结合的碱性L-氨基酸形式的氮。
16.根据权利要求12所述的种子，其中所述处理包括用所述至少一种微生物的水溶液浸泡种子并在一层或多层中施用碱性L-氨基酸和磷。
17.根据权利要求16所述的种子，其中所述碱性L-氨基酸形式的氮施用在与含磷层分开的层中。
18.根据权利要求16所述的种子，其中所述碱性L-氨基酸形式的氮与一层或多层中的磷结合。
19.根据权利要求12、15-16或18所述的种子，其中所述与磷结合的碱性L-氨基酸是精氨酸磷酸盐和/或磷酸精氨酸。
20.一种用液体组合物处理种子的方法，该方法包括以下步骤:
a)提供至少一种微生物，例如选定的微生物；
b)提供包括碱性L-氨基酸形式的氮的大量营养素；
c)将所述至少一种微生物和大量营养素施用于至少一粒种子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述步骤c)包括将所述至少一种微生物和大量营养素与粘合剂结合以提供液体组合物，所述液体组合物施用于所述至少一粒种子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述将微生物与粘合剂结合的步骤包括造粒。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述至少一种微生物是固氮细菌。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述碱性L-氨基酸是精氨酸或赖氨酸。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述大量营养素还包含磷。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述碱性L-氨基酸与磷结合，例如通过静电相互作用。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述与磷结合的碱性L-氨基酸为精氨酸磷酸盐，例如精氨酸单磷酸盐和/或精氨酸多磷酸盐；和/或磷酸精氨酸。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其包括用磷处理种子的步骤。
29.根据权利要求28所述的方法，该方法包括如下的至少一个循环：施用包含大量营养素的液体；施用包含磷的液体；以及在所述施用之间干燥种子。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种微生物在大量营养素和磷之前被施用于种子，例如通过用包含微生物的水溶液浸泡种子。
31.根据权利要求30所述的方法，其中将所述至少一种微生物、大量营养素和磷作为液体溶液混合，然后将其施用于种子。
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